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Methodenartikel

Optimierte intravenöse Injektion bei adulten Zebrafischen

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DOI:

10.3791/67463

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20. Dezember 2024

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1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein optimiertes und effektives Protokoll für die intravenöse Injektion von Zellen oder pharmakologischen Wirkstoffen in adulte Zebrafische, die zu einer verbesserten Zelltransplantation und erhöhten Überlebensraten der behandelten Zebrafische führen.

Zusammenfassung

Die intravenöse (IV) Injektion ist in Säugetierforschungsmodellen weithin als die effektivste und am häufigsten verwendete Methode zur systemischen Verabreichung von Substanzen anerkannt. Seine Anwendung bei erwachsenen Zebrafischen für die Verabreichung von Medikamenten, Stammzelltransplantationen sowie regenerative und Krebsstudien war jedoch aufgrund der Herausforderungen, die ihre geringe Körpergröße und ihre komplizierten Blutgefäße mit sich bringen, begrenzt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden in der Vergangenheit alternative Injektionstechniken wie die intrakardiale und retroorbitale (RO) Injektion für die Stammzelltransplantation in erwachsene Zebrafische erforscht. Diese Techniken haben jedoch ihre Nachteile, einschließlich der Notwendigkeit sorgfältiger Injektionstechniken oder eines erhöhten Mortalitätsrisikos.

In dieser Studie haben wir ein verfeinertes und optimiertes IV-Injektionsverfahren entwickelt, das speziell auf erwachsene Zebrafische zugeschnitten ist und die Herausforderungen berücksichtigt, die mit ihrer einzigartigen Anatomie verbunden sind. Um die Wirksamkeit dieser Technik zu demonstrieren, führten wir erfolgreiche intravenöse Injektionen von ganzen Nierenmarkzellen von Tg(mpo: EGFP)-Fischen und FITC-Dextran-Farbstoff in adulte Casper-Fische durch. Die anschließende Visualisierung der injizierten Zellen und Farbstoffe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops bestätigte deren erfolgreiche Verabreichung und Transplantation im Zebrafisch. Darüber hinaus zeigten wir, dass die intravenöse Injektion im Vergleich zu den intrakardialen und RO-Injektionen zu verbesserten Überlebensraten und Transplantationseffizienz bei behandelten Zebrafischen führte. Dieser Ansatz ermöglicht die präzise Verabreichung und Lokalisierung von Substanzen und birgt ein großes Potenzial für groß angelegte Wirkstoff- und Chemikalienscreenings mit erwachsenen Zebrafischen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, die injizierten Zellen und Farbstoffe visuell zu verfolgen, unschätzbare Einblicke in ihre Transplantation, Migration und Wechselwirkungen mit dem Wirtsgewebe und ermöglicht eine umfassendere Bewertung der therapeutischen Effekte und biologischen Prozesse in Zebrafischmodellen.

Einleitung

Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich in der biomedizinischen Forschung zu einem wertvollen Modellorganismus entwickelt, vor allem aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen, wobei mehr als 70 % der menschlichen Gene Zebrafisch-Gegenstücke aufweisen 1,2. Diese genetische Ähnlichkeit, kombiniert mit der kompakten Größe, dem schnellen Entwicklungszyklus und der Fähigkeit zu umfangreichen genetischen Manipulationen des Zebrafisches, macht ihn zu einem leistungsstarken Werkzeug für die wissenschaftliche Forschung. Diese Eigenschaften sind besonders vorteilhaft für Experimente mit Zelltransplantation, Wirkstoffverabreichung und Zellverfolgung. Darüber hinaus ermöglicht die optische Klarheit von transparenten Larven und spezifischen Pigmentierungsmutanten, wie z. B. dem Casper-Zebrafisch, eine präzise Visualisierung von transplantierten Zellen oder Substanzen und bietet eine effizientere und kostengünstigere Alternative zu herkömmlichen Tiermodellen.

Zebrafische werden häufig zur Entwicklung von Krebstransplantationsmodellen und zur Durchführung von Medikamentenscreenings für schwere Krankheiten wie Gliome, Melanome, Bauchspeicheldrüsentumoren und Leukämie verwendet 3,4,5,6,7,8,9,10. In der Regel werden diese Modelle im Larvenstadium initiiert, um das unausgereifte Immunsystem und die inhärente Transparenz der Larven zu nutzen, was den Injektionsprozess vereinfacht und die Durchführbarkeit von Kurzzeitstudien erhöht. Die Verwendung von Larven begrenzt jedoch die Dauer für die Beurteilung von Transplantationen und therapeutischen Eingriffen 7,11. Die Umstellung dieser experimentellen Protokolle auf adulte Zebrafische bringt Herausforderungen mit sich, wie z. B. komplexere Injektionsverfahren, eine verringerte Transplantationseffizienz, höhere Sterblichkeitsraten und eine erhöhte Variabilität der individuellen Reaktionen. Diese Herausforderungen unterstreichen den dringenden Bedarf an verbesserten Injektions- und Substanzverabreichungstechniken, insbesondere für Studien mit erwachsenen Zebrafischen, die längere Beobachtungszeiträume erfordern.

In der Vergangenheit waren intrakardiale12 und retroorbitale (RO) Injektionen13 die primären Methoden für die Verabreichung von Medikamenten und die Zelltransplantation bei erwachsenen Zebrafischen. Die intrakardiale Injektion, bei der Substanzen direkt in das Herz injiziert werden, gewährleistet eine sofortige systemische Zirkulation von Arzneimitteln, ist jedoch mit erheblichen Risiken verbunden, einschließlich möglicher Herzschäden und hoher Sterblichkeit. Auf der anderen Seite fördert die RO-Injektion, bei der das Material in die venöse Sinushöhle hinter dem Auge gelangt, ebenfalls eine schnelle systemische Verteilung, kann aber für die Fische stressig sein und erfordert eine hohe Präzision bei der Ausführung14. IV-Injektionen, die für die systemische Substanzverabreichung bei Mäusen und Ratten gut etabliert sind, sind für pharmakokinetische Studien, die Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und therapeutische Interventionen in diesen Modellen von entscheidenderBedeutung 15,16,17,18. In jüngster Zeit haben intravenöse Injektionen in der Zebrafischforschung an Bedeutung gewonnen, insbesondere in Studien über angeborene Immunantworten19,20 und akute Nierenschäden21 bei Zebrafischlarven. Ihre Anwendung bei erwachsenen Zebrafischen ist jedoch nach wie vor begrenzt.

In dieser Studie haben wir ein speziell auf adulte Zebrafische zugeschnittenes IV-Injektionsverfahren entwickelt und optimiert, das die Überlebensraten, die Präzision und die Verabreichungseffizienz deutlich verbessert. Wir demonstrieren diese Methode visuell und stellen ein detailliertes Protokoll mit dieser verfeinerten Technik zur Verfügung. Wir verabreichten erfolgreich intravenöse Injektionen von Zellen des ganzen Nierenmarks (WKM) von Tg(mpo: EGFP)-Fischen und FITC-Dextran-Farbstoff in adulte Casper-Fische , wobei die Bestätigung der Entbindung und die Transplantation durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt wurden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die verfeinerte IV-Injektionstechnik im Vergleich zu den traditionellen intrakardialen und RO-Methoden effizienter und konsistenter ist. Da die Verwendung von Zebrafischen in der wissenschaftlichen Forschung weiter zunimmt, wird die Einführung dieser verbesserten IV-Injektionstechnik wahrscheinlich unser Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern und die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beschleunigen.

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Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Committee of the Use of Laboratory and Research Animals (CULATR) an der Universität Hongkong (HKU) genehmigt.

1. Vorbereitung des Injektionsmaterials

  1. Bereiten Sie das Zellsuspensionsmedium vor: 0,9x PBS + 5 % fötales Rinderserum (FBS) + 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptomycin).
  2. Sterilisieren Sie die Hamilton-Spritze und die aufgesetzte Nadel (34 G, 10 mm Länge, 10 μl Kapazität, siehe Materialtabelle) unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 270-280 nm und belichten Sie die Gegenstände 2 h lang.
  3. Bereiten Sie sterilisierte Wattestäbchen, Schaumstoffpolster und Seidenpapier vor.
  4. Bereiten Sie die Anästhesiemischung vor, indem Sie Tricain mit sterilisiertem Fischwasser auf eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml verdünnen.
  5. Für die Transplantation von WKM-Zellen in Casperfischen ist 2 Tage vor der Transplantation eine subletale Bestrahlungsdosis von 25 Gy zu verabreichen, aufgeteilt in zwei Sitzungen von je 12,5 Gy, die am selben Tag mit einem Abstand von 7-8 Stunden zwischen den Dosen verabreicht wird. Für den Bestrahlungsprozess werden 5-10 erwachsene Fische in eine 100 mm Petrischale mit Fischwasser gelegt und in einem Gammastrahler belichtet.
    HINWEIS: Die Dosis wurde auf der Grundlage einer Überlebensanalyse als subletal bestimmt, nachdem Casper-Fische verschiedenen Bestrahlungswerten von bis zu 35 Gy ausgesetzt und über 30 Tage überwacht worden waren (Abbildung 1A). Die genaue Expositionsdauer sollte entsprechend den Einstellungen des Bestrahlungsgeräts kalibriert werden. Für Verfahren, bei denen nur das Medikament verabreicht wird, ist keine Bestrahlung erforderlich.
  6. Verwenden Sie einen Laborautoklav-Dampfsterilisator, um das Fischwasser zu sterilisieren, das für die Unterbringung behandelter Fische bestimmt ist (siehe Materialtabelle), um Infektionen zu vermeiden und eine sichere Erholungsumgebung für die Fische nach der Injektion zu gewährleisten.
    HINWEIS: Der Sterilisationsprozess ist auf die jeweilige verwendete Autoklaveneinheit zugeschnitten, und wir halten uns an die Richtlinien des Herstellers für das Autoklavieren von flüssigen Lösungen zur Vorbereitung des Fischwassers.
  7. Bereiten Sie den Nadelwaschpuffer vor: mehrere Röhrchen mit 75 % Ethanol und Reinstwasser in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  8. Bereiten Sie den Transplantationspuffer vor, indem Sie FITC-Dextran (Molekulargewicht: 10.000) in dem zuvor vorbereiteten Zellsuspensionsmedium (0,9x PBS mit 5 % FBS und 1 % Pen/Strepto) auflösen. Stellen Sie die Konzentration auf 100 μg/ml ein.
    HINWEIS: Dieser Puffer wird für die Injektionen mit einem geplanten Volumen von 2 μl pro Fisch verwendet.

2. Vorbereitung des ganzen Nierenmarks für die Transplantation

  1. Die erforderliche Anzahl von Tg(mpo: EGFP)-Fischen wird eingeschläfert, indem sie in eine 0,4 mg/ml-Tricainlösung getaucht werden, wobei sichergestellt wird, dass sie nach Beendigung der operkulären Bewegung mindestens 10 Minuten lang in der Lösung verbleiben.
  2. Präparieren Sie den Tg(mpo: EGFP)-Fisch, um das Nierenmark (KM) zu isolieren und in das Zellsuspensionsmedium in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, wie zuvor beschrieben22.
  3. Disaggregieren Sie die KM-Zellen, indem Sie die Suspension durch ein 40 μm Nylon-Zellsieb pipettieren und filtrieren.
  4. Die Suspension wird bei 500 × g 8 min lang zentrifugiert.
  5. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 500 μl Zellsuspensionsmedium resuspendieren.
  6. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zähler mit einem Aliquot von 10 μl der Zellsuspension.
  7. Erneut bei 500 × g für 8 min zentrifugieren.
  8. Stellen Sie die Zellkonzentration mit dem Transplantationspuffer auf 150.000 Zellen/μl ein.

3. Ablauf der Injektion

  1. Waschen Sie die Hamilton Spritze vor der Injektion 3-4x gründlich mit 75%igem Ethanol. Spülen Sie die Spritze 3-4x mit Reinstwasser aus, um eventuelle Ethanolrückstände zu entfernen.
  2. Verabreichen Sie dem Zebrafisch eine Narkose, indem Sie ihn in die Anästhesiemischung eintauchen, bis er vollständig betäubt ist, was sich in verminderter Bewegung und Verlust der Reflexreaktionen zeigt. Sobald die Fische sediert sind, positionieren Sie sie mit der Rückenseite nach oben und dem Kopf nach links (Abbildung 1B). Lege den Fisch vorsichtig auf sauberes, feuchtes Seidenpapier, das ihn für die Injektion stabilisiert. Achten Sie darauf, dass das Taschentuch ausreichend feucht ist, um ein Austrocknen der Fische zu verhindern, aber nicht so nass, dass es zum Ausrutschen kommt.
  3. Fassen Sie die Hamilton-Spritze fest an und winkeln Sie die Nadel in einem Winkel von ~45° zum primären Gefäß (der Schwanzvene) an, um es effektiv zu treffen und gleichzeitig die Schädigung des umgebenden Gewebes zu minimieren. Bei Capser-Zebrafischen zielen Sie auf einen Abschnitt des Gefäßes, der durch seinen durchscheinenden Körper sichtbar ist, um eine genaue Platzierung der Nadel zu gewährleisten (Abbildung 1B). Bei Wildtyp-Zebrafischen (Tübingen, TU) mit pigmentierter Haut ist auf primäre Gefäße zu achten, die sich entlang der Körperachse und hinter dem Anus im Bereich der primären Gefäße befinden (Abbildung 1B). Führen Sie die Nadel vorsichtig und sanft in das dafür vorgesehene Gefäß ein, verabreichen Sie die Injektion (2 μl) langsam, um Stress zu minimieren, sorgen Sie für eine optimale Aufnahme der Substanz und üben Sie 10 s lang mit einem Wattestäbchen sanften Druck auf die Stelle aus, um eventuelle Blutungen nach der Injektion zu kontrollieren.
  4. Beobachten Sie unter einem Mikroskop, um das Vorhandensein von GFP-Signalen zu bestätigen und die Wirksamkeit der Injektion sicherzustellen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen oder Farbstoffe als grüne Signale im Gefäß erscheinen (Abbildung 2A).
  5. Lassen Sie den Fisch nach der Injektion 10 Minuten lang in frisch sterilisiertem Fischwasser erholen, bis er in ein statisches Aquarium umgefüllt wird.
  6. Reinigen Sie die Nadel wie zuvor beschrieben zwischen den Injektionen verschiedener Reagenzien.
  7. Um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern, schnippen Sie alle 10 Minuten mit der Zellsuspension, um die Zellen wieder zu suspendieren.
  8. Halten Sie für die Dauer der Behandlung maximal 15 umgepflanzte Fische in einem 4-Liter-Tank unter statischen Wasserbedingungen. Alternativ können Sie die umgepflanzten Fische einzeln in statischen 1-Liter-Tanks unterbringen. Rüsten Sie den Tank mit einer Sauerstoffpumpe aus und führen Sie tägliche Wasserwechsel durch, um das Infektionsrisiko zu minimieren.
  9. Überwachen und beurteilen Sie die GFP-Expression durch Durchflusszytometrie bei den Fischen etwa 14 Tage nach der Transplantation, um die Transplantationsrate zu bewerten. Erfassen Sie die tägliche Sterblichkeit von Fischen, um die Überlebensraten genau zu berechnen. Führen Sie eine unidirektionale ANOVA für die Transplantationsanalyse und den Log-Rank-Test für die Überlebensanalyse durch.

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Ergebnisse

Um die Wirksamkeit und Präzision verschiedener Injektionsmethoden bei adulten Casper-Fischen zu bewerten, wurde eine vergleichende Analyse mit intrakardialen, RO- und IV-Techniken durchgeführt (Abbildung 2A). Es wurden unterschiedliche Mengen an WKM-Zellen aus Tg(mpo: EGFP)-Fischen injiziert, die jeweils mit FITC-Dextran-Farbstoff in Konzentrationen von 1 × 105 und 3 × 105 Zellen gemischt wurden. Der Erfolg jeder Methode wurde durch eine unmittelbare m...

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Diskussion

In dieser Studie haben wir ein intravenöses Injektionsprotokoll entwickelt, das auf erwachsene Zebrafische zugeschnitten ist, um die Präzision und Konsistenz der Verabreichung von Zellen oder Medikamenten zu verbessern. Ein kritisches Element dieser Methode ist die Fähigkeit, die Primärvene zu lokalisieren und sichtbar zu machen, was für die genaue Verabreichung von Substanzen entscheidend ist. Während der durchscheinende Casper-Zebrafischstamm für eine optimale Sichtbarkeit des...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken der Zebrafish Facility des Centre for Comparative Medicine Research (CCMR) an der Universität Hongkong. Wir danken Frau Jo Yiu Ling Wong für die tierische Hilfe. Die Arbeiten wurden unterstützt durch das Theme-based Research Scheme (T12-702/20-N), die Projekte Nr. 08192066 und Nr. 08193106 des Health and Medical Research Fund, das Joint Research Scheme 2021/22 N_HKU745/21 der National Natural Science Foundation of China (NSFC)/Research Grants Council (RGC), das National Key R & D-Programm Chinas (2023YFA1800100) und das Zentrum für Onkologie und Immunologie im Rahmen der von der Innovations- und Technologiekommission finanzierten Health@InnoHK-Initiative. die Regierung der Sonderverwaltungszone Hongkong, China (A.Y.H.L.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Autoklaven DampfsterilisatorHIRAYAMA HRG-140
Zentrifuge 5424Eppendorf
Countess 3 Automatisierter ZellzählerThermofisher
Countess II FLInvitrogen
Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat, Salz (Tricain)Sigma-aldrichMKCL9483
Falcon 40 µ m Cell StrainerCORNINGBlue, steril, einzeln verpackt, 50/Karton
FBS, qualifiziertGibco26140079
FITC-Dextran (MW 10000) MedChemExpress60842-46-8
InjektionsnadelHamilton HAMI20743434 G, 10 mm Länge
MikrospritzeHamilton 7635-01 10 & Mikro; L-Kapazität, Modell 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7,4 (1x)Gibco10010023
Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml)Gibco™15070063100x
PipettenspitzenEppendorf epTIPS
Einkanal-PipetteEppendorf 05-403-151
UltraPure destilliertes WasserInvitrogen10977015

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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