Quantifizierung von Polybutylenadipat-Terephthalat-basierten Mikro- und Nanokunststoffen aus dem Boden mittels Protonenkernspinresonanzspektroskopie

Zusammenfassung

Hier wird eine Methode zur Quantifizierung von Mikro- und Nanoplastik aus Polybutylenadipatterephthalat im Boden mittels Kernspinresonanzspektroskopie beschrieben. Diese Technik verbessert die bestehende Methodik, da sie sich auf die Quantifizierung von Nanoplastik erstreckt und leicht für die Verarbeitung von Umweltproben in großen Mengen angepasst werden kann.

Zusammenfassung

Eine Methode zur Rückgewinnung und Quantifizierung von Mikro- und Nanoplastik (MP und NPs), das sich während des biologischen Abbaus im Boden gebildet hat, ist erforderlich, um den Abbau und die Umweltauswirkungen von biologisch abbaubaren Kunststoffprodukten genau zu bewerten. Das Vorhandensein von MP und NP im Boden kann Bodeneigenschaften wie das Aggregationsverhalten verändern oder toxische Auswirkungen auf die Bodenbiota haben. Bestehende MP-Rückgewinnungsmethoden sind nicht immer für die Messung von biologisch abbaubaren Polymeren wie Polybutylenadipatterephthalat (PBAT) geeignet. Einige gängige Aufschlussverfahren mit Säuren oder Oxidationsmitteln können PBAT-basierte biologisch abbaubare MP zerstören. Identifizierungsmethoden wie Mikro-FTIR- und Mikro-Raman-Spektroskopie sind auch durch die Mindestgröße der Partikel begrenzt, die zurückgewonnen und analysiert werden können. Daher wurde diese Methode entwickelt, um PBAT aus dem Boden zu extrahieren und zu quantifizieren, um den Massenanteil von MP und NP im Boden zu bewerten, ohne PBAT chemisch umzuwandeln. In dem Protokoll wird eine Chloroform-Methanol-Lösung verwendet, um PBAT selektiv aus dem Boden zu extrahieren. Das Lösungsmittel wird aus dem Extrakt verdampft und dann wieder in deuteriertem Chloroform gelöst. Der Extrakt wird mittels Protonenkernspinresonanzspektroskopie (¹H-QNMR) unter quantitativen Parametern analysiert, um die Menge an PBAT in jeder Probe zu quantifizieren. Die Lösungsmittelextraktionseffizienz für PBAT reicht von 76 % in einem schattigen Lehmboden bis zu 45 % in einem sandigen Elkhorn-Lehmboden. Die PBAT-Rückgewinnung kann bei photooxidierten Materialien im Vergleich zu unberührten Materialien reduziert sein und bei Böden mit hohem Tongehalt reduziert sein. Die Extraktionseffizienz hängt nicht von der PBAT-Konzentration innerhalb des Testbereichs ab, aber es wurden niedrigere Extraktionseffizienzen für NPs als für MP beobachtet. Die Ergebnisse der PBAT-Quantifizierung waren vergleichbar mit der Quantifizierung des Kunststoffabbaus durch Messung der kumulativen Bodenatmung in einer Laborinkubationsstudie.

Einleitung

Methoden zur Messung der MP-Kontamination im Boden sind notwendig, um das Ausmaß der Plastikkontamination in globalen Böden¹, die Quellen der Plastikkontamination² und mögliche Lösungen³ zu verstehen. Landwirtschaftliche Böden sind in besonderer Weise der Kontamination durch Kunststoffe ausgesetzt: Im Jahr 2021 wurden jährlich mehr als 15 Millionen Tonnen Kunststoff in der Landwirtschaft^{verwendet 4}, darunter 2,5 Millionen Tonnen Kunststoffmulch⁵. Kunststoffmulch wird in engem Kontakt mit dem Boden verwendet, ein- oder mehrmals pro Jahr erneut ausgebracht⁶ und kann nach seiner Nutzungsdauer nur schwer vollständig aus dem Boden zu entfernen^{sein 7}. Ein wichtiger Bereich, in dem MP-Messmethoden benötigt werden, ist die Bewertung von biologisch abbaubaren Kunststoffprodukten wie biologisch abbaubaren Kunststoffmulchen für den Einsatz in pflanzlichen Systemen⁸.

Biologisch abbaubare Kunststoffprodukte aus der Erde sind vielversprechende Alternativen zu herkömmlichen landwirtschaftlichen Kunststoffen, da sie die Kontamination des Bodens durch Kunststoffmulchen beseitigen könnten, wenn sie wie vorgesehen funktionieren. Im Jahr 2022 wurden weltweit weniger als 1 Million Tonnen biologisch abbaubarer Kunststoff produziert, wobei für die Branche ein schnelles Wachstum erwartet^{wird 9}. Die vier gebräuchlichsten biologisch abbaubaren Polymere, Polymilchsäure (PLA), polymerisierte Stärke, Polyhydroxyalkanoate (PHA) und Polybutylenadipatterephthalat (PBAT), werden alle kommerziell oder experimentell in landwirtschaftlich abbaubaren biologisch abbaubaren Kunststoffmulchen verwendet¹⁰. Trotz ihres Versprechens ist der Abbau dieser biologisch abbaubaren Kunststoffprodukte unter Feldbedingungen variabel¹¹. Während sich einige Studien über den Abbau von biologisch abbaubarem Kunststoffmulch im Feld auf makroplastische Fragmente konzentriert haben¹¹, erfordert die Bewertung des vollständigen Abbaus von Kunststoffmaterialien die Fähigkeit, MP und NP aus dem Boden zurückzugewinnen. Die Quantifizierung von Mikroplastik aus dem Boden ist auch wichtig, um das Potenzial für negative Auswirkungen auf die Bodenökosysteme durch MP-Verschmutzung^{abzuschätzen 12}.

Zu den häufig verwendeten Techniken zur Identifizierung und Quantifizierung von MP gehören die visuelle Analyse, die Mikro-Fourier-transformierte Infrarotspektroskopie (μFTIR), die Mikro-Raman-Spektroskopie (μRaman), die Gaschromatographie-Massenspektroskopie (GCMS einschließlich Pyrolyse-GCMS und thermischer Extraktionsdesorptions-GCMS) und die thermogravimetrische Analyse¹³. Zu den weiteren sich entwickelnden Techniken gehören die Nahinfrarotspektroskopie für die In-situ-MP-Messung ^{in Böden 14}, die Extraktion der Fettsäuremethylveresterung für die GCMS-Analyse¹⁵ und die Kernspinresonanzspektroskopie¹⁶. Bis zu 90 % der Studien, in denen MP im Boden quantifiziert wurden, verwendeten visuelle Analysen (allein oder in Kombination mit anderen Techniken), um Kunststoffpartikel zu identifizieren, während 77 % FTIR-, Raman- oder GCMS-Spektroskopietechniken verwendeten¹⁷. Die Entwicklung und Harmonisierung einer Vielzahl von MP-Quantifizierungstechniken kann dazu beitragen, die Fähigkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu erweitern, verschiedene Fragen der Mikroplastikforschung zu beantworten¹⁸. Es gibt drei generische Ansätze zur Aufbereitung von Bodenproben zur Quantifizierung von Mikroplastik: 1) Abtrennung unveränderter einzelner Mikroplastikpartikel aus dem Boden (z. B. durch Dichtetrennung), 2) Extraktion von transformiertem Kunststoff- oder Polymermaterial (z. B. durch Auflösung) oder 3) Analyse von Schüttgut. Sowohl die μFTIR- als auch die μRaman-Spektroskopie erfordern, dass einzelne MP vom Boden getrennt werden, bevor sie chemisch identifiziert werden können^19, während Pyro-GCMS an isolierten Kunststoffpartikeln durchgeführt werden kann, die vom Boden oder Schüttgut abgetrennt wurden²⁰. Die Trennung von biologisch abbaubaren MP aus dem Boden kann schwierig sein, da einige Aufschlüsse zur Entfernung von organischer Substanz im Boden biologisch abbaubare Polymere, einschließlich PBAT²¹, abbauen oder anderweitig chemisch verändern können. Sowohl die Mikro-Raman- als auch die μFTIR-Spektroskopie haben ebenfalls eine räumliche Auflösungsgrenze: Partikel müssen größer als 10-20 μm für μFTIR und 1 μm für μRaman sein (wenn einzelne Partikel so klein für die Analyse vorbereitet werden können)^19,22. Diese Techniken können die chemische Identifizierung von MP-Polymeren ermöglichen, und spektroskopische Bildgebung kann zur Messung der MP-Größe²² eingesetzt werden. Alle Arten von Pyro-GCMS sind insofern begrenzt, als Proben während der Analyse zerstört werden.

NMR wurde erfolgreich zur Charakterisierung von Bodenbestandteilen und Schadstoffen²³, zur Quantifizierung von MPs 16,24,25,26 und zur Bewertung des Abbaus von PBAT und einem anderen Polymer, Polystyrol ^27,28, eingesetzt. Bei quantitativen Parametern erzeugt die ¹H-NMR-Spektroskopie Spektren, bei denen die Fläche jedes spektralen Peaks direkt proportional zur Anzahl der beitragenden Wasserstoffatome in der Probe ist. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Bestandteile in einer Probe²⁹. Die NMR ist eine wertvolle Analysetechnik für die Quantifizierung einiger MP, einschließlich PBAT, im Boden, da sie eine gleichzeitige Quantifizierung und Identifizierung ermöglicht, für komplexe und unreine Gemische geeignet ist und keine chemisch identischen Referenzstandards benötigt ^30,31. Die NMR-Spektroskopie eines Lösungsmittelextrakts könnte MPs oder NPs quantifizieren, die kleiner sind als solche, die für die μFTIR-, μRaman- oder GCMS-Quantifizierung verarbeitet werden können. Trotz dieser Vorteile bieten quantitative NMR-Ansätze immer noch eine geringere Empfindlichkeit als destruktive massenspektroskopie-basierte Ansätze³².

Die vorgeschlagene Methode, die in Abbildung 1 dargestellt ist, beschreibt einen Arbeitsablauf zur Verarbeitung und Analyse von PBAT-haltigen Bodenproben, einschließlich PBAT-Kunststoffen in Nanogröße. Bei der Methode wird PBAT-Polymer aus Bodenproben extrahiert, indem der Boden mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol geschüttelt wird. Die Lösungsmittelextrakte, die PBAT enthalten, werden getrocknet und dann in deuteriertem Chloroform unter Zugabe eines internen Kalibrants wieder gelöst. Die NMR-Spektroskopie wird an den Extrakten anhand quantitativer Parameter durchgeführt. Die resultierenden Spektren werden analysiert, um PBAT zu quantifizieren, indem die Fläche der angepassten Peaks, die den Wasserstoffatomen der PBAT und den kalibrierenden Molekülen entspricht, verglichen wird. Diese Methode wendet den von Nelson et al. demonstrierten Ansatz der Lösungsmittelextraktion und der Protonenkernspinresonanzspektroskopie (¹H-NMR) ^an33. Ziel war es, eine Methode anzuwenden, die geeignet ist, Proben im Umweltmaßstab (~100 g Boden) zu verarbeiten und eine Reihe von Proben parallel ohne spezielle Extraktionsgeräte zu verarbeiten.

Protokoll

1. Sammlung und Aufbereitung des Bodens

HINWEIS: Probenahme- und Verarbeitungsgeräte sollten das Polymer PBAT oder seine Bestandteile nicht enthalten, um eine Kontamination der Probe zu vermeiden. Andere Polymermaterialien beeinträchtigen nicht unbedingt die Quantifizierung von PBAT aus dem Boden. Zum Beispiel erzeugen Polyethylen und Polypropylen keine spektralen Peaks in Chloroform ¹H-NMR, die die Quantifizierung von PBAT³⁴ beeinträchtigen, aber Polyethylenterephthalat mit seiner Terephthalatgruppe würde^{höchstwahrscheinlich 35} stören, ebenso wie andere Polyester. Referenztexte wie Brandolini und Hills³⁴ können verwendet werden, um die ¹H-NMR-Spektren verschiedener Polymere zu bestimmen und auf überlappende Peaks mit den zur Quantifizierung verwendeten PBAT-Peaks zu suchen (siehe unten).

1. Für jede Probe sind mindestens 100 g äquivalentes Trockengewicht des Bodens zu entnehmen. Bestimmen Sie die Größe der Bodenprobe auf der Grundlage der erwarteten Konzentration von Kunststoffen, um eine repräsentative Probe zu entnehmen, und homogenisieren Sie den Boden, um bei Bedarf eine Teilprobe zu entnehmen³⁶.
   ANMERKUNG: Bodensysteme sind von Natur aus heterogen³⁷, ebenso wie die Schadstoffverteilungen (z. B. MP) in ihnen³⁸. Es gibt auch Variabilität im Zusammenhang mit Methoden, die zur Messung von Schadstoffkonzentrationen verwendet werden³⁹. Daher wird empfohlen, ein Probenahmedesign oder ein Versuchsdesign zu erstellen, das Replikatproben als Werkzeug zur Abschätzung der Unsicherheit und zur Entnahme repräsentativer Probenvolumina auf der Grundlage der Kunststoffkonzentration⁴⁰ enthält. Es wurde dokumentiert, dass die MP-Konzentrationen im Boden zwischen nahezu Null und 1 x 10⁷ Items pro kg Boden liegen, wobei die meisten Standorte weniger als 10.000 Items pro kg Boden enthalten⁴¹. Ein theoretisch repräsentatives Elementarvolumen könnte von 23^m2 bei einer MP-Konzentration von 10 Items pro Quadratmeter bis zu 0,02^m2 reichen, wenn die MP-Konzentrationen 10.000 Items pro Quadratmeter betragen³⁶.
   1. Um die effektive Probenahmefläche von einem Feldstandort zu vergrößern und gleichzeitig die Menge an zu verarbeitender Erde zu minimieren, sammeln Sie Erde von einer großen Fläche (z. B. 1 m²) und verwenden Sie dann die Viertelmethode, um die Probe zu homogenisieren und zu konsolidieren (z. B. auf 500 g Erde)³⁶.
   2. Bei der Viertelmethode die Erde großflächig auf eine Plane oder eine andere Oberfläche häufen, mit einer Schaufel gründlich mischen und dann in Viertel teilen. Ein Viertel der Probe wird aufbewahrt und die anderen drei Viertel verworfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Probe die gewünschte Größe hat.
2. Sieben Sie die Erde durch ein 2-mm-Maschensieb. Reinigen Sie das Sieb und die Auffangwanne zwischen den Bodenproben vollständig.
3. Trocknen Sie den Boden an der Luft und lagern Sie ihn dann in versiegelten Probenbeuteln. Trockener Boden kann vor der PBAT-Extraktion in diesem Zustand gelagert werden.

2. Extraktion von PBAT aus Böden

ACHTUNG: Chloroform ist flüchtig und giftig. Lagern Sie es im Dunkeln in Braunglas, fern von Oxidationsmitteln. Tragen Sie bei der Arbeit damit geeignete Handschuhe, Augenschutz und Schutzkleidung. Fassen Sie es nur in einem Abzug an. Methanol ist brennbar, flüchtig und giftig. Lagern Sie Methanol in einem feuerfesten Schrank. Tragen Sie bei der Arbeit mit Methanol geeignete Handschuhe, Augenschutz und Schutzkleidung. Verarbeiten Sie Methanol nur in einem Abzug. Glaswaren können zerbrechen und Verletzungen verursachen. Tragen Sie beim Umgang mit Glaswaren einen Augenschutz. Vermeiden Sie es, Glasscherben mit bloßen Händen zu berühren. Reinigen Sie stattdessen Glasscherben mit schnittfesten Handschuhen, einer Zange, einem Besen oder einem anderen Werkzeug.

HINWEIS: Chloroform ist mit den meisten Kunststoffen oder Metallen nicht kompatibel. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien kompatibel sind (z. B. Glas oder Polytetrafluorethylen, PTFE-Kunststoff).

1. Bereiten Sie in einem Abzug 100 ml eines 90:10 V/V-Gemischs aus Chloroform (Trichlormethan; CHCl₃) und Methanol (CH₃OH) pro zu extrahierender Probe. Um beispielsweise aus 5 Proben zu extrahieren, mischen Sie 450 mL Chloroform mit 50 mL Methanol.
2. Geben Sie 100 g trockene Erde, 100 ml Chloroform-Methanol-Lösung und 20 Glasperlen in ein Extraktionsglas aus Glas. Verschließen Sie die Extraktionsgläser mit PTFE-ausgekleideten Deckeln, so dass kein Lösungsmitteldampf aus den Gläsern austreten kann.
   HINWEIS: PBAT ist in Chloroform gut löslich; Es wurde ein Chloroform-Methanol-Gemisch verwendet, da Methanol Wasserstoffbrückenbindungen mit gelösten Stoffen bilden kann, die mit mineralischen und organischen Bestandteilen des Bodens konkurrieren und die Rückgewinnung von PBAT aus dem Boden erhöhen³³.
3. Verwenden Sie einen Schütteltisch, um die Extraktionsgläser 8 Stunden lang bei 200 U/min zu schütteln. Lassen Sie die Erde in den Extraktionsgläsern nach dem Schütteln mindestens 4 h ruhen.
4. Trennen Sie den Extrakt vom Boden. Öffnen Sie im Abzug einen Deckel für ein Extraktionsgefäß und geben Sie die Flüssigkeit per Pipette durch einen qualitativen Papierfilter mit einer Porengröße von 11 μm in ein beschriftetes, sauberes Glasgefäß. Notieren Sie die Menge des aus dem Extraktionsgefäß zurückgewonnenen Lösungsmittels. Vermeiden Sie die Übertragung von Bodenfeststoffen mit dem Extrakt; Lassen Sie bei Bedarf einige ml Lösungsmittel zurück.
   HINWEIS: Das Filterpapier ist dazu bestimmt, große Stücke organischer Substanz aus der Lösungsmittellösung zu entfernen.
5. Trocknen Sie die Extrakte, indem Sie sie im Abzug belassen, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft ist. Dies kann bis zu 24 Stunden dauern. Trocknen Sie die Erde auch im Abzug. Sobald die Erde vollständig trocken ist, entsorgen Sie sie.
6. Sobald die Extrakte getrocknet sind, verschließen Sie jedes Probenglas und lagern Sie sie bis zur Verwendung an einem kühlen, dunklen und trockenen Ort.

3. Sammlung von NMR-Spektren

VORSICHT: Deuteriertes Chloroform birgt die gleichen Risiken und erfordert die gleichen Vorsichtsmaßnahmen wie das oben beschriebene protonierte Chloroform.

1. Der Probe wird ein internes Kalibrant⁴² zugesetzt. Verwenden Sie eine Waage, um 1,00 mg 1,4-Dimethoxybenzol (DMB; C₆H₁₄O) in jedes Probengefäß mit einem getrockneten Extrakt geben.
2. Die Probe wird in deuteriertem Chloroform (CDCl₃; Trichlor(deutero)methan resuspendiert. Geben Sie im Abzug mit einer Mikropipette 500 μl deuteriertes Chloroform in das Glas mit dem getrockneten Probenextrakt.
3. Verschließen Sie das Glas und schütteln Sie, um den getrockneten Extrakt aufzulösen, indem Sie das Glas vorsichtig gegen eine Hand oder eine Tischplatte klopfen, etwa 10x auf jeder Seite. Verwenden Sie dann eine saubere Pipettenspitze, um die Flüssigkeit in ein NMR-Röhrchen zu übertragen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 mit zusätzlichen 500 μl deuteriertem Chloroform und geben Sie den zweiten Teil der Probe in dasselbe NMR-Röhrchen wie das erste. Die zweite Spülung dient dazu, die vollständige Auflösung und Rückgewinnung des getrockneten Extrakts aus dem Behälter zu gewährleisten.
5. Verschließen Sie das NMR-Röhrchen und lagern Sie es 3 Tage lang, bevor Sie die NMR-Spektren sammeln. Die geeignete Lagerzeit hängt von der Verdampfungsrate des Lösungsmittels aus dem NMR-Röhrchen ab. Analysieren Sie die Proben kurz nach der Aufbereitung mit deuteriertem Chloroform.
6. Um NMR-Röhrchen zum Spektrometer zu transportieren, verwenden Sie eine Halterung, die für die Halterung der langen, empfindlichen Röhrchen ausgelegt ist. Diese haben in der Regel eine Stütze in der Nähe der Basis und der Oberseite des Rohrs. Halten Sie die Rohre während des Transports in einer aufrechten Position.
7. Mit einem 500 MHz NMR-Spektrometer wird ein ¹H-Protonenspektrum mit einem 90°-Pulswinkel²⁹, einer Pulsbreite von 8 μs³³, einer Verzögerungszeit von 25 s (bestimmt durch das Inversionswiederherstellungsexperiment^29,43), 262 K Punkten pro Scan und 32 Komposit-Scans^29,44 von 12 bis -2 ppm für eine Gesamtlaufzeit von 25 Minuten erfasst.
   HINWEIS: Wir haben ein Bruker Neo 500 MHz Spektrometer mit einer breitbandoptimierten Sonde und einem Autosampler bei einer kontrollierten Temperatur von 300 K verwendet. Andere ähnliche Spektrometer können verwendet werden. Bei Verwendung eines Geräts mit einer anderen Magnetfeldstärke kann die geeignete Verzögerungszeit auf der Grundlage der T1-Relaxationszeit für PBAT und 1,4-Dimethoxybenzol unter Verwendung eines Inversionswiederherstellungsexperiments berechnet werden^29,43.
8. Nachdem die Probe ausgeführt wurde, speichern, übertragen oder greifen Sie nach Bedarf auf die Spektraldaten zu.
   Überprüfen Sie Spektraldaten. Vergewissern Sie sich, dass alle bei der Quantifizierung verwendeten PBAT-Peaks eindeutig aufgelöst sind, falls vorhanden. Zur Quantifizierung werden die PBAT-Peaks 5 (8,10 ppm), 6 (4,44 ppm), 6' (4,38 ppm), 3' (4,15 ppm) und 3 (4,09 ppm) verwendet (Details in Tabelle 1). Verwenden Sie die DMB-Peaks A (6,84 ppm) und B (3,77 ppm) auch für die Quantifizierung (Details in Tabelle 2). Achten Sie besonders auf die 6, 6', 3' und 3 Peaks von PBAT, die sehr nahe beieinander liegen und sich überlappen können.
9. Wenn einige Peaks nicht eindeutig aufgelöst sind, verdünnen Sie die Probe. Kombinieren Sie 100 μl Probe und 500 μl deuteriertes Chloroform in einem sauberen NMR-Röhrchen und führen Sie die Probe unter denselben in Schritt 3.7 definierten Parametern erneut durch.

4. Analyse von NMR-Spektren zur Quantifizierung von PBAT

HINWEIS: Eine Spektralanalyse kann jederzeit nach der Entnahme durchgeführt werden. Die Analyse der Daten am selben Tag, an dem die Spektren erstellt werden, wird bevorzugt, um sicherzustellen, dass die Proben im Falle von Problemen immer noch für eine Wiederholung zur Verfügung stehen.

1. Öffnen Sie die vom Spektrometer erstellte FID-Datei in der NMR-FID-Verarbeitungssoftware (wir haben MestreNova von MestreLab verwendet, andere Optionen, aber andere Optionen sind verfügbar).
2. Linienverbreiterung auf die Spektren anwenden: Wählen Sie in der FID-Verarbeitungssoftware im Menü "Verarbeitung" die Option "Verarbeitungsvorlage " aus und navigieren Sie dann zum Abschnitt "Apodisierung". Wählen Sie ein Exponentialmodell mit einer Helligkeit von 0,5 Hz und einem ersten Punkt von 0,5 Hz aus.
3. Wenden Sie die automatische Phasenkorrektur an, indem Sie im Menü "Verarbeitung" auf die Schaltfläche "Automatische Phasenkorrektur" klicken. Wenden Sie die automatische Baseline-Korrektur an, indem Sie im Menü "Verarbeitung" auf die Schaltfläche "Automatische Baseline-Korrektur" klicken.
4. Verwenden Sie die Peak-Dekonvolution, um die gemessenen spektralen Peaks anzupassen: Klicken Sie auf der Registerkarte Analyse der Spektrenverarbeitungssoftware im Abschnitt Anpassung auf die Schaltfläche Neue Anpassung . Klicken Sie mit dem Cursor auf die Spektren bei einer Verschiebung von 8,5 ppm, ziehen Sie den Cursor dann auf eine Verschiebung von 3,0 und lassen Sie ihn los.
5. Klicken Sie unter dem Abschnitt Anpassung auf Linienanpassungstabelle , um alle angepassten Spitzen anzuzeigen.
6. Behalten Sie die für die Quantifizierung verwendeten Peaks bei, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben und in Abbildung 2 beschriftet. Zur Quantifizierung werden die PBAT-Peaks 5 (8,10 ppm), 6 (4,44 ppm), 6' (4,38 ppm), 3' (4,15 ppm) und 3 (4,09 ppm) zur Quantifizierung (Details in Tabelle 1) sowie die DMB-Peaks A (6,84 ppm) und B (3,77 ppm) verwendet. Die Wasserstoffatome, die jedem in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführten Peak entsprechen, sind in den Strukturdiagrammen in Abbildung 3 gekennzeichnet, wobei Abbildung 3A die Struktur der beiden PBAT-Dimere zeigt, Abbildung 3B zeigt, wie die Position der Dimere im Polymer interagiert, um die Peakverschiebung in Wasserstoffatomen aus dem 1,4-Butandiol-Monomer zu verändern, und Abbildung 3C, die die Struktur von DMB zeigt.
7. Löschen Sie alle anderen Peaks aus der Passung, indem Sie die unerwünschten Peaks auswählen und auf Peak löschen klicken.
8. Verwenden Sie die Anpassungstabelle, um die Fläche jedes Peaks für Berechnungen in ein Tabellenkalkulationsprogramm zu kopieren (wir haben uns für die Verwendung von Tabellenkalkulationen entschieden).
9. Um Peakflächen in eine Tabelle zu kopieren, wählen Sie zunächst alle Peakinformationen in der Linienanpassungstabelle aus. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Kopieren " aus dem Einblendmenü. Fügen Sie die Daten in die Tabelle ein.
10. Berechnen Sie die Anzahl der Mol DMB, die der Probe hinzugefügt wurden, n_DMB, mit der Gleichung
    
    wobei m_DMB die Masse von DMB ist, die der Probe zugesetzt wird, in Gramm (empfohlen 1,00 mg) und MM_DMB die molare Masse von DMB (138,17 g/mol).
11. Berechnen Sie die Anzahl der Mole des Butylenterephthalat-Dimers von PBAT in der Probe, n_BT, unter Verwendung der Gleichung
    
    Dabei ist A₅ die gemessene Fläche des PBAT-Peaks 5, A_A die gemessene Fläche des DMB-Peaks A und A_B die gemessene Fläche des DMB-Peaks B. Die von der Spektralanalysesoftware erzeugten Flächeneinheiten sind beliebig.
12. Berechnen Sie die Anzahl der Mole des Butylenadipat-Dimers von PBAT in der Probe, n_BA, unter Verwendung der Gleichung
    
    Dabei ist A₃ die gemessene Fläche des PBAT-Peaks 3, A_3' die gemessene Fläche des PBAT-Peaks 3', A₆ die gemessene Fläche des PBAT-Peaks 6 und A_6' die gemessene Fläche des PBAT-Peaks 6'. Die von der Spektralanalysesoftware erzeugten Flächeneinheiten sind beliebig.
13. Berechnen Sie die Masse von PBAT in der Probe, m_{PBAT, zurückgewonnen}, unter Verwendung der Gleichung
    
    wobei MM_BA die molare Masse eines BA-Dimers von PBAT (200 g/mol) und MM_BT die molare Masse eines BT-Dimers von PBAT (220 g/mol) ist.
14. Wenn eine bekannte Menge an PBAT in der Probe vorhanden war, kann die prozentuale Wiederfindung η für die Probe als Maß für die Extraktionseffizienz gemäß der Gleichung berechnet werden
    
15. Berechnen Sie die Konzentration von PBAT in einer Probe, C_PBAT, mit der Gleichung
    
    wobei m_{trockener Boden} die Masse des trockenen Bodens ist, die zur Herstellung des Extrakts verwendet wurde (0,1 kg), V_{zurückgewonnenes Lösungsmittel} das Volumen des in Schritt 2.4 aus dem Boden zurückgewonnenen Lösungsmittels und V_{sovlent die} anfängliche Menge an Lösungsmittel, die der Bodenprobe (100 ml) zugesetzt wurde.

5. Erstellung einer Kalibrierkurve für die Quantifizierung der PBAT aus einem bestimmten Boden

HINWEIS: Eine Kalibrierungskurve, die auf der Grundlage von Bodenproben mit bekannten Mengen an PBAT erstellt wurde, liefert nützliche Informationen darüber, wie PBAT aus einem bestimmten Boden extrahiert und zurückgewonnen wird. Die Extraktion ist nicht für alle Böden oder alle Formen von PBAT gleich. Wir vermuten, dass die Extraktionseffizienz vom Gehalt an Boden, Ton und organischer Substanz abhängt³³, und empfehlen, eine Kalibrierungskurve für jede interessierende Bodenserie und jeden Horizont zu erstellen. Die Kalibrierkurve kann vor oder nach der Verarbeitung unbekannter Proben mit dieser Methode erstellt werden.

1. Sammeln und bereiten Sie das Äquivalent von 2,5 kg trockener Erde vor, wie in den Schritten 1.1-1.3 beschrieben.
2. Bestimmen Sie den Bereich, der von der Kalibrierkurve abgedeckt werden soll. Die in der Kalibrierkurve verwendete maximale PBAT-Konzentration sollte höher sein als die höchste PBAT-Konzentration unter unbekannten Proben.
3. Bereiten Sie ausreichend PBAT-Kunststoff vor oder besorgen Sie sich, um 5 dotierte Proben von 100 g Erde mit 0 %, 25 %, 50 %, 75 % und 100 % der maximalen Konzentration (insgesamt 25 Proben) herzustellen. Wenn beispielsweise 40 mg/kg die gewünschte Höchstkonzentration ist, werden insgesamt 50 mg PBAT benötigt, um die dotierten Proben zu erstellen.
4. Bereiten Sie 25 Proben à 100 g Erde vor. Spiken Sie die Proben, indem Sie PBAT-basierten Kunststoff wiegen und ihn in den vorgeschriebenen Mengen zu Bodenproben hinzufügen. Wenn beispielsweise 40 mg/kg PBAT die gewünschte maximale Konzentration ist, erstellen Sie 5 Proben ohne PBAT, 5 Proben mit 1 mg PBAT, 5 Proben mit 2 mg PBAT, 5 Proben mit 3 mg PBAT und 5 Proben mit 4 mg PBAT. Nachdem Sie PBAT in die Erde gegeben haben, mischen Sie gut.
5. Extrahieren Sie PBAT aus den 25 dotierten Proben, sammeln Sie dann NMR-Spektren aus den Extrakten und analysieren Sie die resultierenden Spektren, wie in den Schritten 2.1 bis 4.16 beschrieben.
6. Identifizieren Sie die Gleichung einer Kalibrierungskurve für PBAT in diesem Boden, indem Sie eine lineare Regression zwischen der gemessenen Menge an PBAT in jeder dotierten Probe und der tatsächlichen Menge an PBAT durchführen, die in einem statistischen Analysetool hinzugefügt wurde. Wir haben eine Tabelle verwendet. Wenn in den Spike-Stichproben keine PBAT erkannt wird, ohne dass PBAT hinzugefügt wurde, dann erzwingt b = 0 in der Regression.
   HINWEIS: Bei einem linearen Regressionstest wird die Stärke der linearen Beziehung zwischen zwei kontinuierlichen numerischen Variablen x und y entsprechend der Beziehung y = mx + b bewertet. Die Werte von m und b, die am besten zu den Daten passen, werden durch den Test berechnet. Der r^{2-Koeffizient} des Regressionstests beschreibt, wie eng die beiden Variablen miteinander korrelieren.
7. Testen Sie mit dem statistischen Analysetool auf einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Extraktionseffizienz und der PBAT-Konzentration. Berechnen Sie die Extraktionseffizienz von PBAT aus den dotierten Proben wie folgt:
   
8. Verwenden Sie das statistische Analysetool, um die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass die beobachteten Daten zufällig auftreten könnten, ohne dass eine Korrelation zwischen der Extraktionseffizienz und der PBAT-Konzentration besteht. Wenn dieser p-Wert größer als der vorgegebene Signifikanzschwellenwert α ist, kann die Nullhypothese, dass es keine Beziehung zwischen den beiden Variablen gibt, nicht zurückgewiesen werden. Ist dies der Fall, kann davon ausgegangen werden, dass die Extraktionseffizienz für alle PBAT-Konzentrationen innerhalb des untersuchten Bereichs konstant ist. Wenn die Nullhypothese verworfen wird, ist das hier beschriebene lineare Modell möglicherweise nicht die beste Methode zum Modellieren der Daten.
9. Verwenden Sie die lineare Regressionsgleichung der Kalibrierungskurve, um die Menge an PBAT in unbekannten Proben zu schätzen, die mit dieser Methode verarbeitet wurden. Wenn die Regressionsvariable x die tatsächliche Menge an PBAT in Stichproben mit Stichproben mit Schwerpunkten der Kalibrierungskurve war, war die Variable y die gemessene Menge an PBAT, und b wurde auf 0 gesetzt, dann
   
   HINWEIS: Der PBAT-Gehalt von Replikatproben, die unter Verwendung einer Kalibrierungskurvengleichung geschätzt wurden, kann verwendet werden, um ein Konfidenzintervall für die PBAT-Menge in einem bestimmten Boden zu generieren, oder wenn ein Mittelwert und ein Konfidenzintervall für die PBAT-Konzentrationen in Replikatextrakten berechnet werden konnten, könnte die Kalibrierkurve zur Schätzung der PBAT-Konzentration im Boden angewendet werden. Beide Arbeitsgangsreihenfolgen ergeben das gleiche Konfidenzintervall für den PBAT-Gehalt im Boden. Betrachten Sie beispielsweise Extrakte aus 10 Wiederholungsproben mit PBAT-Konzentrationen von 10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 und 5 mg/kg und die Kalibrierkurvengleichung y _{(gemessene PBAT im Extrakt)} = 0,75 x _{(wahre PBAT im Boden).} Die PBAT-Konzentrationen im Boden in jedem Replikat könnten auf 13, 7, 3, 5, 13, 15, 3, 8, 11 und 7 mg/kg geschätzt werden. Dann würde die mittlere PBAT-Konzentration im Boden auf 8,4 mg/kg mit einer Standardabweichung von 4,4 mg/kg geschätzt. Wenn zunächst ein Mittelwert und eine Standardabweichung für die PBAT-Konzentrationen von Extrakten (10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 und 5) berechnet werden, wird ein Mittelwert von 6,3 mg/kg und eine Standardabweichung von 3,3 mg/kg berechnet. Dann könnte die Kalibrierkurve sowohl auf den Mittelwert als auch auf die Standardabweichung angewendet werden, um die PBAT-Konzentration im Boden zu schätzen: Mittelwert von 8,4 mg/kg, Standardabweichung von 4,4 mg/kg.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit dieser Methode bei der Quantifizierung von PBAT-Polymer aus dem Boden zu bewerten, wurden Kalibrierungskurven erstellt, indem PBAT aus dotierten Proben extrahiert wurde, die aus drei verschiedenen Böden hergestellt wurden. Für jeden der drei Böden (Details in Tabelle 3) wurde der Boden durch ein 2-mm-Sieb geleitet und anschließend an der Luft getrocknet. Die Spike-Proben wurden durch Zugabe von 0, 9, 18, 27 oder 36 mg MP auf PBAT-Basis zu 100 g trockener Erde (jeweils 5 Wiederholungen)...

Diskussion

Wir schlagen eine Methode zur Lösungsmittelextraktion von PBAT aus dem Boden vor, die mit ¹H-NMR gekoppelt ist, um PBAT im Extrakt zu quantifizieren. Zu den Schlüsselelementen des Extraktionsprozesses gehören die Extraktionstechnik und -ausrüstung, das für die Extraktion verwendete Lösungsmittel und der Zeitaufwand. Wir haben uns für eine Extraktionstechnik entschieden, die im Vergleich zur von Nelson et al. demonstrierten Soxhlet-Extraktion und der beschleunigten Lösungsmitte...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,4-Dimethoxybenzol	Arcos Organics 99%+	AC115411000	1 mg pro Probe
Braunglasflasche mit PTFE-ausgekleidetem Deckel (1 L)	Kimble	5223253C-26	wiederverwendbares
Chloroform; Trichlormethan	Fisher Chemical AA43685M6		90 mL pro Probe; Fisher Optima
Deuteriertes Chlorform; Trichlor(deuterio)methan	Sigma Aldrich	1034200025	1 mL pro Probe; mindestens 99,8 % deuteriert; stabilisiert mit Silber
Glasperlen (3 mm Durchmesser)	Propper Manufacturing	3000600	20 pro Probe
Extraktionsgläser aus Glas mit PTFE-ausgekleidetem Deckel (~250 mL Volumen)	Kimble	5510858B	2 pro Probe, wiederverwendbar
Messzylinder, 1 L, Polypropylen	Nalgene	3662-1000	wiederverwendbar
Messzylinder, 500 mL, Polypropylen	Nalgene	3662-0500	wiederverwendbar
Methanol	Fisher Chemical	A412-4	20 mL pro Probe; ACS-zertifiziert
Mikropipette mit einem Bereich von 0,5 - 1 mL	Fisher Scientific	3123000063	wiederverwendbares
NMR-Spektrometer	Bruker	n/a	500 MHz Instrument
NMR-Röhrchen (7 Zoll Höhe, hoher Durchsatz)	Wilmad	WG-1000-7	1 pro Probe
Plattformschüttler	Eppendorf, Excella E5	M1355-0000	wiederverwendbare
Pipettenspitze aus Polyethylen (10 ml Volumen)	Eppendorf	22492098	1 pro Probe,
Einweg-Mikropipettenspitzen aus Polypropylen (1 ml Volumen)	Fisher Scientific	02-707-510	3 pro Probe,
Einweg-Mikrowaage	Mettler Toledo	30532226	wiederverwendbar