Äquibiaxiales Stretching-Gerät für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen mit hoher Vergrößerung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein vielseitiges äquibiaxiales Streckgerät, das pneumatisch betätigt wird und mit der hochauflösenden Mikroskopie kompatibel ist.

Zusammenfassung

Zellen sind in physiologischen und pathologischen Situationen kontinuierlich mechanischen Kräften ausgesetzt, darunter eine Vielzahl von Zug- und Druckbelastungen. Es gibt eine sehr aktive Forschung, die untersucht, wie Zellen und Gewebe auf solche Belastungen reagieren und sich daran anpassen und wie sich diese Reaktionen mit mechanochemischen Signalen integrieren. Dies hat zu einem Bedarf an ausgefeilten Werkzeugen geführt, die mit Standard-Zellkulturprotokollen und Mikroskopiemethoden kompatibel sind und physiologische Belastungen in In-vitro-Studien reproduzieren. Diese Studie stellt das Design, die Funktion und die Charakterisierung eines Streckgeräts vor, das mit hochauflösender optischer und Fluoreszenzmikroskopie kompatibel ist. Zahlreiche Reckvorrichtungen, entweder pneumatisch oder motorisch, wurden entwickelt und im Feld eingesetzt. Wir stellen eines dieser Systeme im Detail vor, einschließlich Designrichtlinien, einer Vielzahl von Anwendungen und allen Werkzeugen, um ein ähnliches Setup herzustellen. Das System basiert auf einer verformbaren Polydimethylsiloxan (PDMS)-Membran, die bei Vakuumanwendung äquibiaxial gedehnt wird, um eine homogene, reproduzierbare und kontrollierte Probendehnung zu ermöglichen. Es bietet eine Vielzahl von Zugspannungen, von pünktlicher und sofortiger Dehnung bis hin zu wiederholten Dehnungs- und Freigabezyklen mit kontrollierter Amplitude und Frequenz. Die Substratbeschichtung mit Adhäsionsproteinen ermöglicht die Aussaat von Zellen mit fluoreszierenden Reportern in der Streckvorrichtung und die Durchführung von Live-Bildgebung dieser Zellen nach der Dehnung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopen mit hoher Vergrößerung. Druckspannungen können auch aufgebracht werden, indem man die Probe an die Dehnung anpassen lässt und sie anschließend freigibt oder indem die Probe vor der Streckung auf ein vorgedehntes Substrat gesät wird. Eine zusätzliche topographische Strukturierung des PDMS-Substrats ermöglicht die Abbildung derselben Probe in verschiedenen Mikroskopiemodi (z. B. Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie). Polyacrylamid-Gele können auch an die PDMS-Membran gebunden werden, was zu einer Dehnung der Zellen führt, die auf Substraten unterschiedlicher Steifigkeit ausgesät sind. Insgesamt kann dieses Streckgerät durch kontrollierte Zugspannungen an lebenden Proben in Verbindung mit einer hochwertigen Fluoreszenzmikroskopie eine Vielzahl von Fragestellungen in der Mechanobiologie beantworten.

Einleitung

Dünne verformbare Polydimethylsiloxan (PDMS)-Membranen werden häufig in einer Vielzahl von kundenspezifischen Dehnungsvorrichtungen ^1,2,3 verwendet, da PDMS ein gut etabliertes biokompatibles inertes Material ist, das mit der Mikroskopie kompatibel ist. Hier, wie bei vielen anderen 4,5,6,7,8,9, wird das einfache Konzept des Anlegens eines Vakuums verwendet, um die Membran zu verformen, um eine robuste und steuerbare äquibiaxiale Dehnungsvorrichtung zusammenzubauen. Durch das Einklemmen der Membran in einen kreisförmigen Ring und das Abdichten des Rings auf einem "Streckpfosten" (Abbildung 1A-C) wird eine gleichmäßige und isotrope Verformung erreicht. Die biologische Probe befindet sich in der Mitte des Rings auf der freistehenden PDMS-Membran, die eine Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Hier werden zwei maßgeschneiderte Aufbauten vorgestellt, die mit zwei Mikroskoptischmodellen kompatibel sind (Abbildung 1D-F) und in Bezug auf biologische Anwendungen sehr vielseitig sind. Während das Gesamtdesign einfach und auf andere Tische übertragbar ist, müssen die Abmessungen des Setups sorgfältig ausgewählt werden, um den Bildgebungsanforderungen gerecht zu werden. Sobald dies erreicht ist, muss das Dehnungsprofil des Geräts charakterisiert und validiert werden.

Neben dem Aufbau selbst wird eine einfache Methode vorgestellt, die von einem Matlab-Code begleitet wird, um Dehnungsgröße, Homogenität und Isotropie zu charakterisieren. Die Streckvorrichtung kann anschließend verwendet werden, um äquibiaxiale Zugspannungen auf synthetische Systeme¹⁰, Einzelzellen^{11, 12} oder Monoschichten¹³ aufzubringen, während mit hoher raumzeitlicher Auflösung die biologische Reaktion der Probe mittels Fluoreszenzmikroskopie aufgezeichnet wird. Die Membran kann mit verschiedenen Adhäsionsproteinen der extrazellulären Matrix^{beschichtet sein 14,15}. Zusätzliche Funktionen können je nach den Bedürfnissen der biologischen Studie hinzugefügt werden. Zum Beispiel können Polyacrylamidgele an die PDMS-Membran gebunden werden, um die Substratsteifigkeit während der Dehnung^13,16 abzustimmen, und die PDMS-Membranen können mit einem Referenznummerngitter für die posteriore Abbildung desselben interessierenden Bereichs innerhalb einer Probe¹² hergestellt werden. Fixiert gestreckte Proben können auch durch Immunfärbung verarbeitet und anschließend für die Fluoreszenzbildgebung wieder gestreckt werden¹⁷. Das angewendete Dehnungsmuster kann gesteuert werden und reicht von einem einzelnen unmittelbaren Dehnungsimpuls bis hin zu zyklischen Dehnungen unterschiedlicher Größen, Frequenzen oder Formen^14,16.

Protokoll

1. Gestaltung der Bühne und des Streckpfostens (Abbildung 1)

1. Entwerfen Sie einen Streckpfosten, der in den Abmessungen mit der Tischgröße/den Halterungen und der Objektivkonfiguration kompatibel ist. Die beiden spezifischen Dehnungspfosten sind in Abbildung 1A,D dargestellt.
   HINWEIS: Die FreeCAD-Dateien, die in diesem Protokoll (Ergänzungsordner 1) bereitgestellt werden, sind kompatibel mit den folgenden Nikon-Mikroskopen und -Tischen: Eclipse Ni-E aufrecht mit einem NI-SH-E Tisch und Eclipse Ti-E/B invertiert mit einem TI-S-ER Tisch, Abbildung 1D. Der Pfosten kann dreidimensional (3D) gedruckt werden, kann sich aber nach mehrmaligem Gebrauch verformen; Pfosten auf Aluminiumbasis leiden nicht unter diesem Nachteil. Achten Sie darauf, Pfosten auf Aluminiumbasis zu eloxieren, um Oxidation zu vermeiden. Die aufrechte Konfiguration ermöglicht eine größere Bewegungsamplitude. Darüber hinaus ermöglicht eine aufrechte Konfiguration eine direkte Abbildung der Probe ohne Grenzfläche, was im Falle des verformbaren PDMS-Membransubstrats optisch günstig ist. Stattdessen geht der Beleuchtungsstrahl in einer umgekehrten Konfiguration durch die PDMS-Membran (Abbildung 1F); Da sich die PDMS-Membran beim Dehnen bewegt, sollte das Immersionsmedium für das Objektiv sorgfältig ausgewählt werden (empfohlene Wasserimmersionsarten, Luft oder Glycerin; Ölimmersion wird aufgrund der Unverträglichkeit mit PDMS-Substraten nicht empfohlen). Handelsübliche Halterungen können mit zusätzlichen Schraubenlöchern modifiziert werden; Achten Sie darauf, keine Schraube auf Kunststoff- oder Teflonbasis zu verwenden, um Staub beim Schrauben zu vermeiden. Es kann zweckmäßig sein, einen Halter zu entwerfen, der es ermöglicht, den Streckpfosten oben auf dem Tisch zu montieren, wie in Abbildung 1E gezeigt. Die FreeCAD-Datei, die in diesem Protokoll bereitgestellt wird, ist kompatibel mit dem Tisch eines Eclipse Ni-E aufrechten Mikroskops.
2. Entwerfen Sie Spannringe (Abbildung 1C), die in der Größe mit dem Spannpfosten kompatibel sind (Abbildung 1A,B). Die FreeCAD-Dateien, die in diesem Protokoll bereitgestellt werden, sind mit den entsprechenden Pfosten kompatibel (um die Ringe beim Umgang mit Proben abzudecken, kann ihr Durchmesser so gewählt werden, dass er mit der Größe einer Petrischale kompatibel ist).
   HINWEIS: Der Ring kann auch auf Aluminiumbasis (eloxiert) oder 3D-gedruckt sein. Fügen Sie Dichtungen mit ausreichenden Durchmessern hinzu, um den Streckpfosten und die Ringe vakuumdicht zu machen.
3. Optional: Stellen Sie einen Vakuumregler her. Eine elektrische Karte des in diesem Protokoll verwendeten Vakuumsteuerkastens ist in den ergänzenden Informationen enthalten (siehe Zusatzmappe 2). Es ermöglicht die manuelle Steuerung des an die Streckvorrichtung angelegten Vakuumniveaus.
   HINWEIS: Kommerzielle Vakuumregler können ebenfalls ähnliche Funktionen bieten und können in der Regel von einer Steuerungssoftware begleitet werden, die die Anwendung einer Vielzahl von Signaltypen (sinusförmig, dreieckig usw.) ermöglicht. (Fließend, Kobalt).

2. Herstellung der dehnbaren Membran

1. Design runde Platten (empfohlenes Material: Polymethacrylat, PMMA). Stellen Sie sicher, dass diese Platten breiter als die Ringe und in der Größe mit dem Spin Coater kompatibel sind (Abbildung 2A). Siehe Tabelle 1 für vorgeschlagene Abmessungen und ergänzende Mappe 3.
   HINWEIS: Für Pfosten 1 wurde ein Durchmesser von 12 cm verwendet; für Pfosten 2 einen Durchmesser von 18-21 cm. Vor und zwischen jedem Gebrauch sollten die Platten sorgfältig mit Vliestüchern und 96 % Ethanol gereinigt werden. Es ist wichtig, PDMS-Ansammlungen in den Platten sowie an den Rändern und darunter zu vermeiden.
2. PDMS 1:10 zubereiten und gut mischen, um eine sehr homogene Emulsion zu erhalten (empfohlene Rührlöffel verwenden).
   HINWEIS: Für 12 cm 4,5 g pro Teller vorbereiten; Für 18 cm Teller, 8 g pro Teller. Bereiten Sie für die Vorbereitung mehrerer Platten zusätzliches PDMS vor, z. B. 10 ml mehr als für 10 Platten erforderlich. Für 10 Platten à 12 cm 50 g Komponente A und 5 g Komponente B vorbereiten. Es ist praktisch, große Gefäße zu verwenden, um das Pipettieren zu erleichtern. Der Behälter darf keinen Staub oder anderen Schmutz enthalten, der das ordnungsgemäße Schleudern und Aushärten von PDMS behindern könnte. Verwenden Sie Handschuhe aus kompatiblem Material (vermeiden Sie Latex; Vinylhandschuhe sind geeignet), um die Aushärtung von PDMS zu gewährleisten.
3. Entgasen Sie mindestens 1 Stunde lang in einer Vakuumkammer.
   HINWEIS: Alternativ kann das PDMS mit einem 50-ml-Röhrchen 5 Minuten lang bei 0,2 × g zentrifugiert werden, aber beachten Sie, dass es kompliziert ist, das PDMS-Gemisch mit der Dosierspritze aus einem Röhrchen abzusaugen (erforderlich für Schritt 2.4). Entgasen Sie nicht zu lange (nicht länger als 2 Stunden) mit direktem Licht, um eine Vorhärtung von PDMS zu vermeiden.
4. PDMS-Schleuderbeschichtung auf den PMMA-Platten
   1. Geben Sie 4,2 mL oder 7,5 mL entgastes PDMS auf die PMMA-Platten.
   2. Schleudern Sie die Platten mit den folgenden empfohlenen Einstellungen:
      1. Schleudermantel für 5 s bei 500 U/min mit einer Beschleunigung von 100 U/min/s.
      2. Schleudermantel für 1 min bei 500 U/min mit einer Beschleunigung von 300 U/min/s.
         HINWEIS: Es kann zweckmäßig sein, die Mitte der PMMA-Platte auf ihrer Unterseite zu markieren, um die Zentrierung der Platten während des Schleuderns und eines homogenen Schleuderns zu gewährleisten. Schritt 2.4.2.1 ist nicht obligatorisch, insbesondere wenn der Beschleunigungsparameter nicht eingestellt werden kann. Es hilft, das PDMS vor dem Schleudern zu verbreiten. Dieses Protokoll liefert PDMS-Membranen mit einer Dicke von etwa 140 μm (gemessen mit Interferometrie; siehe ergänzende Abbildung 1 und Tabelle 2). Kalibrierungen müssen vor den Experimenten durchgeführt werden, falls das Modell oder die Parameter des Spin-Coaters zu unterschiedlichen Membraneigenschaften führen.
5. Lagern Sie jede Platte in einer Petrischale, um Staubansammlungen zu vermeiden, und polymerisieren Sie über Nacht bei 65 °C im Ofen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, temperaturbeständiges Geschirr zu verwenden. Die Aushärtungsbedingung wirkt sich auf die PDMS-Verformbarkeit für ein bestimmtes angewendetes Vakuumniveau aus.

3. Membran-Sandwiching in Ringen

1. Ausführung des Montagematerials.
   1. Entwerfen Sie PMMA-Ringe mit Innen-/Außendurchmesser, um die spinnbeschichtete PDMS-Kreismembran zu verlegen (Abbildung 2A). Siehe die vorgeschlagenen Abmessungen in Tabelle 1 und Ergänzungsmappe 3.
   2. Entwerfen Sie eine Montagestütze (Abbildung 2B), auf die der Ring passt, und die Höhe bestimmt auch die Vordehnung bei der Montage der Membran im Ring.
      HINWEIS: Die Montagehalterung kann eine einfache Lösung sein, die auf vorhandenen Laborgeräten (z. B. einer Petrischale) basiert. Eine elegantere Lösung ist der 3D-Druck der Stütze (siehe FreeCAD-Datei dieses Teils in diesem Protokoll, siehe Ergänzungsordner 3), da die Höhe benutzerdefiniert und leicht variiert werden kann (in diesem Protokoll wurde eine Höhe von 10 mm für die kleinen Ringe verwendet). Die Mittelteilhöhe des Trägers sollte kleiner als die Halbringhöhe gewählt werden, damit das PDMS-Substrat bei der Montage den Träger nicht berührt (siehe weitere Verwendung in Schritt 3.4.2). Hierfür eignet sich ein 3D-Drucker mit Polymilchsäure (PLA)-Filamenten (siehe Materialtabelle). Es kann auch ein Schneidring entworfen werden, der ebenfalls in 3D gedruckt wird und als Führung für das Skalpell dient (Abbildung 2A).
   3. Entwerfen und fertigen Sie Messinggewichte, die in der Größe kompatibel sind, um bei der Montage der Membran Gewicht auf den Ring auszuüben (Abbildung 2C) und zu einer reproduzierbaren Vorspannung zu führen.
      HINWEIS: Die hier bereitgestellten FreeCAD-Dateien (siehe Ergänzungsordner 3) entsprechen den Ringabmessungen, die in diesem Protokoll dargestellt werden.
2. Entfernen Sie die PDMS-Membran von der PMMA-Platte.
   1. Bereiten Sie PMMA-Ringe auf einem Blatt weißem Bankpapier vor.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Werkbank und das Papier flach bleiben, um zu vermeiden, dass das Papier während der Montage die PDMS-Membran berührt.
   2. Gehen Sie vorsichtig mit einer Klinge (ein- oder zweimal) um den Rand der Platte herum und zeichnen Sie dann mit einer scharfen Pinzette dieselbe Kante nach, um sicherzustellen, dass das PDMS über seinen gesamten Umfang einen sauberen Schnitt aufweist (Abbildung 2A).
   3. Hebe die Membran vorsichtig mit einer Pinzette an einer Kante an. Schälen Sie dann vorsichtig die Kante des PDMS-Blattes mit den Daumen, um die Membran gleichmäßig an der Kante anzuheben. Lösen Sie den Rand der Membran entlang der Hälfte des Plattenumfangs von der Platte (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Das Gießen einiger Tropfen 96%iger Ethanol unter die PDMS-Membran hilft, die Membran anzuheben, ohne sie zu beschädigen.
3. Trocknen Sie die PDMS-Membran.
   1. Die gesamte Oberseite des zuvor vorbereiteten PMMA-Rings (Schritt 3.2.1) mit 96 % Ethanol abwischen und mit den Fingern gleichmäßig verteilen.
   2. Entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Membran, heben Sie sie von der zuvor angehobenen Kante ab (siehe Schritt 3.2.3) und platzieren Sie sie symmetrisch auf dem mit Ethanol bedeckten PMMA-Ring. Entfernen Sie alle Falten aus dem PDMS, aber achten Sie darauf, die Membran nicht zu dehnen; Richten Sie es nur aus.
      HINWEIS: Das Anwenden von Pre-Stretch in dieser Phase wirkt sich auf die PDMS-Verformbarkeit für ein bestimmtes angewendetes Vakuumniveau aus.
   3. Sobald das Ethanol vollständig getrocknet ist, stellen Sie sicher, dass die PDMS-Membran fest mit dem PMMA-Ring verbunden ist.
4. Montieren Sie den Dehnungsring.
   1. Nehmen Sie einen weiteren leeren PMMA-Ring. Platzieren Sie es auf dem Montagering und verwenden Sie Metallclips, um sie miteinander abzudichten, indem Sie die PDMS-Membran zwischen den beiden Ringen einklemmen (PDMS-Membransandwich, Abbildung 2B).
   2. Setzen Sie die untere Hälfte des Spannrings auf die in Schritt 3.1.2 entworfene Montagehalterung (Abbildung 2B).
   3. Legen Sie das PDMS-Ringsandwich auf den Dehnungsring und drücken Sie es fest nach unten, bis es ganz nach unten reicht. Das PDMS-Substrat berührt die Montagehalterung nicht. Befestigen Sie die Dichtung in der richtigen Position (Abbildung 2B).
   4. Platzieren Sie die kreisförmigen Messinggewichte auf der Probe (Abbildung 2C). Dadurch wird eine feste Vorspannung ähnlich der aller montierten Ringe angewendet, was eine weitere Reproduzierbarkeit bei der Kalibrierung des Systems gewährleistet.
   5. Platzieren Sie die obere Hälfte des Metall-Stretchrings mit ausgerichteten Schraubenlöchern darauf, platzieren Sie alle Schrauben und ziehen Sie sie fest (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt weist die PDMS-Membran Löcher auf, versuchen Sie also nicht, das Protokoll auszuhängen oder rückwärts zu gehen.
   6. Schneiden Sie das PDMS vorsichtig mit einer Klinge um den Ring herum ab (Abbildung 2C).
   7. Abdeckung (z. B. mit einer Petrischale), um die Membran vor Staub zu schützen (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Wenn das PDMS mit einem Polyacrylamid-Gel funktionalisiert werden muss, fahren Sie mit Abschnitt 5 fort. Für erste Kalibrierungsmessungen fahren Sie mit Abschnitt 6 fort. Wenn der PDMS-Ring für das Cell Seeding verwendet werden soll, fahren Sie mit Abschnitt 7 fort.

4. Variation der Herstellung von PDMS-Membranen: Muster eines Referenzgitters

1. Bereiten Sie eine PMMA-Platte (vor der PDMS-Schleuderbeschichtung) vor, die mit einem SU8-basierten Gitter "strukturiert" ist, das mittels Fotolithografie erstellt wurde (Abbildung 2D). Entwerfen Sie dazu ein interessantes Muster, um einen Fotomaskenfilm (Acetatmaske) zu erstellen.
   HINWEIS: Die PDF-Datei, die in diesem Protokoll zur Verfügung gestellt wird (siehe Zusatzordner 4), erstellt ein Raster mit alternativen Zahlen; siehe Abbildung 2D. Das Raster kann mit einfacher Software wie Inkscape erstellt werden, je nach Größe des Musters (oder Alternativen wie Clewin oder FreeCAD). Das Motiv kann von externen Firmen auf Fotofilme gedruckt werden (siehe Materialtabelle).
2. Photolithographieprotokoll auf der PMMA-Platte (siehe Zusatzmappe 3 für die optischen Eigenschaften von PMMA).
   1. Führen Sie eine Sauerstoffplasmabehandlung der PMMA-Platten für 20 min bei 7 W mit einem konstanten Sauerstofffluss von 0,8 bar durch.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der mögliche Kunststoffschutz der Platten entfernt wurde und die PMMA-Platten vollständig transparent sind.
   2. 5 min bei 95 °C backen.
   3. Kühlen Sie die PMMA-Platte mit einer Stickstoffpistole ab und geben Sie dann 4 ml SU-8 2100 Harz auf die 12 cm PMMA-Platte (passen Sie das Volumen an, wenn Sie unterschiedliche Plattengrößen verwenden).
   4. Drehen Sie mit den folgenden Parametern (oder passen Sie die Spin-Parameter an, um eine etwa 10 μm hohe Schicht zu erzeugen): 5 s bei 500 U/min mit einer Beschleunigung von 100 U/min/s, gefolgt von 30 s bei 4000 U/min mit einer Beschleunigung von 300 U/min/s.
   5. 2,5 min bei 95 °C backen.
   6. Platzieren Sie die PMMA-Platte auf einem Masken-Aligner in Gegenwart der Acetatmaske und verwenden Sie die folgenden Parameter: ohne I-Linie. Breitbandige Belichtung (zwischen 260 und 460 nm), 25 mW/cm², Belichtung von 7,5 s.
   7. 3,5 min bei 95 °C backen.
   8. Entwickeln Sie das Muster für 1 Minute mit Propylenglykolmonomethyletheracetat.
   9. Ausgiebig mit Isopropanol waschen.
   10. Führen Sie eine visuelle Überprüfung der Musterqualität mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (2-10x) in einem Hellfeldmikroskop durch.
       HINWEIS: Die Silanisierung der gemusterten PMMA-Platte erhöht die Langlebigkeit des Modells bei wiederholter Verwendung. Aktivieren Sie dazu die gemusterte PMMA-Platte für 30 s mit Sauerstoff-Plasma-Behandlung und führen Sie dann eine 1-stündige Behandlung mit Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan unter Vakuum in einer chemischen Haube durch.
3. Verwenden Sie die gemusterte PMMA-Platte wie in den Schritten 2.2 bis 2.5, um die dehnbare PDMS-Membran zu schleudern.
   HINWEIS: Das strukturierte PDMS kann, wie bereits erwähnt, sowohl in einem Hellfeldmikroskop als auch in einem Rasterelektronenmikroskop visualisiert werden (Abbildung 2D). Achten Sie darauf, welche Seite des Musters nach oben zeigt, wenn Sie die PDMS-Membran in den Dehnungsring montieren, um das Muster in der gewünschten Ausrichtung zu erhalten.

5. Anbringen eines Polyacrylamid (PAA)-Gels auf der PDMS-Membran

HINWEIS: Dieser Schritt kann entweder an der PDMS-Membran durchgeführt werden, die an der PMMA-Platte befestigt ist (siehe Abschnitt 2) oder an den zuvor montierten Dehnungsringen (siehe Abschnitt 3). Arbeiten unter einer chemischen Haube; Für die Schritte zum Erhitzen ist es zweckmäßig, einen kleinen Ofen unter der chemischen Haube zu verwenden, siehe Materialtabelle; Andernfalls bewahren Sie die Proben in einer hermetischen Box im Ofen auf).

1. PDMS-Membran-Vorbeschichtung (Abbildung 2E)
   1. Bereiten Sie die Beschichtungslösung vor, indem Sie 96 % Ethanol mit 10 % (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen (z. B. 20 μl APTES in 180 μl Ethanol).
   2. Aktivieren Sie die PDMS-Membranen mit einem Korona-Plasma-Entlader für 1 min (oder aktivieren Sie sie für 30 s mit einem Sauerstoff-Plasma-Reiniger).
   3. Geben Sie 200 μl der APTES/Ethanol-Lösung in die Mitte der Membran.
   4. Die Membran bei 65 °C 1 h im Ofen ruhen lassen.
   5. Zweimal mit PBS waschen. Für die zweite Wäsche lassen Sie den PBS 10 Minuten lang unter Schütteln.
   6. Bereiten Sie die 3%ige Glutaraldehyd (GA)-Lösung in PBS vor. Platzieren Sie 200 μl GA pro Membran auf denselben Bereich der Membran, der mit APTES behandelt wurde.
   7. Warten Sie 25 Minuten (nicht länger als 30 Minuten).
   8. Zweimal mit PBS waschen, das zweite Mal unter Schütteln.
   9. Saugen Sie die Flüssigkeit an und stellen Sie den Ring in eine abgesenkte Position, bis PBS vollständig getrocknet ist.
2. Silanisierung von Deckglas
   1. Bereiten Sie 6 ml Repel Silan vor und gießen Sie es in eine Petrischale.
   2. Legen Sie quadratische 18-mm-Glasdeckgläser vorsichtig nacheinander in die Flüssigkeit.
   3. Inkubieren Sie die Deckgläser 5 Min. lang.
   4. Bereiten Sie zwei Becher vor; einer mit 96 % Ethanol und der andere mit Reinstwasser.
   5. Entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette vom Repel Silane und waschen Sie es zuerst in 96% Ethanol, gefolgt von einem Waschen in Reinstwasser (das Deckglas sollte "trocken" aus der Wasserwäsche kommen).
   6. Weitere 30 Minuten am Rand einer Petrischale trocknen lassen.
3. Polyacrylamid (PAA)-Gel-Bindung an die PDMS-Membran
   1. Ordnen Sie die Hälfte der mit Repel Silan behandelten Deckgläser auf dem Boden einer Petrischale an.
   2. Bereiten Sie eine PAA-Gelmischung mit der gewünschten Steifigkeit ^16,18 vor.
   3. Geben Sie einen Tropfen mit 10 μl Gelmischung auf jedes Deckglas.
   4. Legen Sie ein weiteres mit Repel Silane behandeltes Deckglas darauf, um das Gel zu verteilen. Richten Sie die beiden Deckgläser nicht aus. Achten Sie darauf, dass sie sternförmig angeordnet sind, um eine einfache Trennung zu ermöglichen. Drücken Sie vorsichtig, so dass das Gel abgeflacht wird, aber nicht über den Deckglasbereich hinausragt.
   5. Warten Sie 45 Minuten bis 1 Stunde.
   6. Trennen Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, dass das Gel an einem der Deckgläser haftet.
   7. Nehmen Sie das Deckglas, an dem das Gel befestigt ist, und bringen Sie das Gel in Kontakt mit dem PDMS-Bereich, der zuvor mit GA behandelt wurde (Abbildung 2E).
   8. Mit zwei Fingern von unten und von oben 5 s drücken.
   9. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   10. Am nächsten Tag den Ring 30 Minuten lang mit PBS füllen.
   11. Lösen Sie das obere Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette.
   12. Zeichnen Sie den Umfang des PAA-Gels mit einem Permanentmarker von der anderen Seite der PDMS-Membran ein. Dies hilft bei der Lokalisierung der Probe in den folgenden Schritten.
   13. Aspirieren Sie das PBS.
   14. Führen Sie einen Funktionalisierungsschritt durch, um die Bindung des gewünschten extrazellulären Matrixproteins an das Gel¹⁵ zu erleichtern.

6. Betrieb des Streckgeräts, Dehnungskalibrierung und Auflösungsbewertung

1. Bereiten Sie einen PDMS-Stretchring mit fluoreszierenden Kügelchen für die Dehnungskalibrierung vor.
   1. Bereiten Sie eine Verdünnung von 0,1 μm oder 0,2 μm Fluoreszenzkügelchen im Maßstab 1:50000 (siehe Materialtabelle) in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) durch serielle Verdünnung vor (1:500 Zwischenlösung von 1 ml in PBS mit 2 μl der Beadsstammlösung, gefolgt von einer abschließenden Verdünnung von 10 μl aus der Zwischenlösung in 1 mL PBS).
      HINWEIS: Eine hohe Raupendichte auf der Membran ist optimal für den Kalibrierungsschritt; Beschallen Sie die Lösung nicht, da Raupenklumpen den Betrieb während der Kalibrierung erleichtern.
   2. Platzieren Sie einen Tropfen von 10-30 μl in der Mitte des PDMS.
      HINWEIS: Die Montagehalterung kann bequem mit einer Probenabscheidung von Kreuz zur Mitte gestaltet werden
   3. Bei nicht mehr als 40 °C trocknen lassen, um Verwirrungen beim Nachhärten zu vermeiden.
2. Bereiten Sie einen PDMS-Stretchring mit fluoreszierenden Kügelchen für die Auflösungsbeurteilung vor.
   1. Befolgen Sie das Protokoll von Cole und ^al.19 , um die Bead-Lösung mit Kügelchen mit Durchmessern kleiner als der Beugungsgrenze herzustellen, typischerweise Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 μm.
      (siehe Materialtabelle). Beschallen Sie die Bead-Lösungen bei jedem Zwischenschritt sorgfältig.
   2. Verwenden Sie eine Koronabehandlung in der Mitte des Rings, um das PDMS-Substrat zu aktivieren.
   3. Sofort 20 μl der Bead-Lösung auf den behandelten PDMS-Mittelbereich verteilen und trocknen lassen.
      HINWEIS: In diesem Fall wird die Bead-Lösung stark verdünnt und auf dem hydrophilen PDMS inkubiert, um eine ausgedehnte Spreizung zu gewährleisten und einfach getrennte 0,1 μm-Kügelchen zu erhalten, die auf dem Substrat adsorbiert werden.
3. Montage der Streckvorrichtung auf der Mikroskoptischhalterung (Abbildung 1F).
   1. Montieren Sie den Streckpfosten im Mikroskop.
   2. Tragen Sie großzügig Gleitmittel (Vaseline) auf die kreisförmige Fläche des Stifts auf (mittlerer Teil, Abbildung 1D, F).
      HINWEIS: Die Verwendung des Schmiermittels ist obligatorisch, damit das PDMS-Substrat Reibungen und Gleitvorgänge auf dem Stift überwindet, und es ist notwendig, das Schmiermittel zwischen jeder Probe aufzufrischen. Vaseline wird in dem in diesem Protokoll vorgestellten Setup als sehr praktisches Schmiermittel verwendet.
   3. Montieren Sie den in Schritt 6.1 vorbereiteten Streckring in den Reckpfosten und schrauben Sie die obere Kappe fest, um die Baugruppe abzudichten.
   4. Verbinden Sie den Vakuumregler mit der Vakuumquelle und dem Streckpfosten (Abbildung 3A).
      1. Verbinden Sie die Rückseite des Vakuumsteuerkastens mit der Vakuumquelle (Abbildung 3A).
      2. Verbinden Sie die Vorderseite der Box mit dem Stretchpfosten (Abbildung 1B, D, F).
         HINWEIS: Bei der Vakuumquelle kann es sich um die Vakuumleitung handeln, die in der Infrastruktur des Gebäudes verfügbar ist. Für eine ausreichende Dehnung ist ein moderates Vakuum erforderlich, das jedoch vom Durchmesser des Dehnungsrings abhängt (eine kleinere Dehnung wird bei gleichem Vakuumniveau für einen kleineren Durchmesser erreicht). Alternativ sind Vakuumpumpen im Handel erhältlich (Fluigent oder Elveflow bieten autonome Vakuumpumpen an); Befolgen Sie in diesem Fall die Anweisungen des Herstellers für den Anschluss an die Vakuumquelle. Verwenden Sie keine Vakuumversorgung ohne eine vakuumgesteuerte Quelle (wie z. B. die in diesem Protokoll vorgestellte kundenspezifische Vakuumsteuerbox oder die im Handel erhältlichen Systeme)
4. Kalibrierung der Dehnung
   1. Wählen Sie ein Interessenfeld, das eine hohe Wulstdichte über das gesamte Sichtfeld und für den Benutzer erkennbare Wulstklumpen aufweist (siehe Abbildung 3B).
   2. Erfassen Sie ein Bild "in Ruhe" des gewählten Sichtfelds (speichern Sie die Position).
   3. Wenden Sie die Dehnung bei niedrigem Vakuum an (in diesem Setup -20 mbar). Die Probe bewegt sich in alle Richtungen (X-Y-Z).
   4. Fokussieren Sie zuerst in der Z-Ebene neu.
   5. Bewegen Sie den Tisch in x-y-Richtung, um denselben Interessenbereich zu finden, der im Ruhezustand abgebildet wurde, schärfen Sie das Bild der Kügelchen im gestreckten Zustand fein und nehmen Sie ein Bild auf.
      HINWEIS: Wenn die Probe stark dezentriert ist, bewegt sich der interessierende Bereich je nach Dehnungsgröße erheblich. Die Verschiebung ist vom Zentrum weg größer, aber die Dehnungsgröße ist unabhängig von der Position der Probe auf dem Substrat. Nehmen Sie Bilder ohne Binning mit einer Auflösung von 2048 x 2048 auf.
   6. Lösen Sie die Spannung. Wiederholen Sie die Schritte 6.4.3-6.4.5 mit einem höheren Vakuumniveau (-30 mbar, -40 mbar usw.).
      HINWEIS: Kehren Sie zu Kalibrierungszwecken vor dem erneuten Strecken immer in den Ruhezustand zurück (siehe Ergänzende Abbildung 3A), da PDMS bei Verformung ein Hystereseverhalten aufweist.
   7. Montieren Sie einen zweiten Dehnungsring und wiederholen Sie die Schritte 6.4.1-6.4.6. Führen Sie diese Kalibrierung für mindestens 3 verschiedene Dehnungsringe durch.
   8. Speichern Sie die aufgenommenen Bilder in einem Ordner, der nach Proben geordnet ist.
   9. Benennen Sie in jedem Ordner das Referenzperlenbild, das im Ruhezustand aufgenommen wurde, reference_str1 und die Bilder, die bei zunehmendem Vakuum stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 usw. gestreckt wurden.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt die Kernkalibrierung des Systems dar. Je nach Bedarf des Anwenders sollte eine zusätzliche Kalibrierung mit ähnlichen Bead-Proben, aber unter Verwendung anderer Vakuumapplikationsprotokolle durchgeführt werden. Wenden Sie ein Dehnungsprotokoll an, das dem auf die biologische Probe angewendeten Stamm ähnelt (siehe Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse").
5. Verwenden Sie den Matlab-Code, um den Stamm²⁰ zu quantifizieren.
   1. Laden Sie den gesamten Matlab-Ordner unter folgendem Link herunter https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      HINWEIS: Der auszuführende Hauptcode heißt gel_strain und ruft andere Matlab-Codedateien auf, die wie angegeben aufbewahrt werden müssen und im selben Ordner wie der Hauptcode gespeichert sind.
   2. Öffnen Sie Matlab und öffnen Sie den Code gel_strain.
   3. Stellen Sie die Parameter ein (siehe Tabelle 3, Code_Parameter für empfohlene Einstellungen).
   4. Definieren Sie die Pfade des übergeordneten Ordners und des Experimentordners, wie im Code angegeben.
      HINWEIS: Wenn der Ordner nicht vorhanden ist, wird im Code ein Warn-Popup angezeigt. Wählen Sie Zum Pfad hinzufügen aus, und navigieren Sie zum experimentellen Ordner, in dem die Bilder gespeichert sind.
   5. Führen Sie den gel_strain Code aus.
   6. Öffnen Sie stretched_str1 , wie vom Code angefordert.
   7. Öffnen Sie reference_str1 , wie vom Code angefordert.
      HINWEIS: Es ist zweckmäßig, alle gestreckten Bilder auf einmal bei unterschiedlichen Vakuumstufen zu verarbeiten, wie in diesem Protokoll angegeben. Alle Dateien müssen im selben experimentellen Ordner gespeichert werden, aber der Code fordert nur das Öffnen des ersten gestreckten Bildes an. Image-Namen sollten mit strX-Namen enden, wobei X die Inkrementnummern 1, 2, 3 usw. sind, wie in Punkt 6.4.9 dieses Kapitels beschrieben.
   8. Stellen Sie sicher, dass der Ergebnisordner mit den 4 Unterordnern angezeigt wird: Zugeschnittene Daten, die die zugeschnittenen und ausgerichteten Daten enthalten; Verschiebungen , die die Raupenverschiebungsdatei enthalten; Bilder , die das Diagramm der radialen Verschiebungen und Dehnungen enthalten; Dehnungen , die die Tabelle der Dehnungsmatrix enthalten, die für jedes Vakuumniveau erhalten wurde.
      1. Berechnen Sie den Median der Dehnungsmatrix für jedes Vakuumniveau.
      2. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Probe (mindestens 3).
      3. Plotten Sie die mediane Dehnungsmatrix im Vergleich zum Vakuumniveau für die 3 Proben, um die Kalibrierkurve zu erhalten (Abbildung 3C).
         HINWEIS: Einige Parameter können geändert werden, falls das Raupenbild aus dem Code nicht richtig verarbeitet wird. Öffnen Sie dazu die in Matlab set_settings_stretch Datei und ändern Sie Settings.Resolution und Settings.Overlap gemäß den Empfehlungen in den Code-Kommentaren (siehe auch Tabelle 3). Je nach experimentellem Bedarf kann die auf die biologische Probe ausgeübte Dehnung variiert werden (zyklische Dehnung, größere Dehnung usw.): Eine Kalibrierung dieser Bedingungen wird empfohlen (siehe Beispiele in der ergänzenden Abbildung 2 und der ergänzenden Abbildung 3).
6. Bewertung der Auflösung (folgen Sie dem Protokoll von Cole et ^al.19)
   1. Montieren Sie den in Schritt 6.2 vorbereiteten Streckring.
   2. Stellen Sie sich ein Sichtfeld vor, das einzelne Perlenpunkte enthält (stellen Sie sich einen Stapel mit einem Z-Schritt-Abstand vor, der für das verwendete Objektiv relevant ist).
   3. Verwenden Sie MetroloJ (Fiji-Plugin), wie in Cole et al. angegeben, um die X-Y-Z-Auflösung des Dehnungsaufbaus zu charakterisieren (Abbildung 3D und ergänzende Abbildung 4).

7. Zellaussaat und -dehnung

1. Beschichtung des PDMS mit Zelladhäsionsprotein
   1. Sterilisieren Sie den PDMS-Ring, indem Sie ihn 15 Minuten lang UV-Licht aussetzen (Abbildung 4A). Führen Sie alle nachfolgenden Schritte des Protokolls unter der Biohaube durch, um die Sterilität zu gewährleisten.
   2. Spülen Sie die Platte unter der Haube mit sterilem PBS ab.
   3. Inkubieren Sie ein Zelladhäsionsprotein 11,14,15, indem Sie einen 100-200 μl Tropfen der Lösung in der Mitte des Rings ablegen (Abbildung 4A).
      HINWEIS: In der Regel ist eine Lösung von 10 μg/ml Fibronektin angemessen¹¹. Andere Adhäsionsproteine von Interesse können verwendet werden, um das PDMS zu beschichten (z. B. Laminin, Keratin¹⁵; spezifische Behandlungen/Protokolle könnten erforderlich sein). Die Inkubation für die Fibronektinbeschichtung wird über Nacht bei 4 °C empfohlen; Die alternative Methode ist 1 h bei 37 °C.
   4. Zeichnen Sie den Umfang des Tropfens mit einem Permanentmarker von der Unterseite der PDMS-Membran aus. Dies hilft bei der Suche nach dem Beispiel in den folgenden Schritten.
2. Zell-Seeding auf dem PDMS-Ring (Abbildung 4A).
   1. Falls erforderlich, transfizieren Sie die interessierenden Zellen vor dem Streckexperiment mit einem fluoreszierenden Protein (bei transienten Transfektionen 1-3 Tage vor dem Experiment, abhängig von der Transfektionsmethode und den Eigenschaften) oder verwenden Sie spezielle Protokolle, um die interessierenden Fluoreszenzmarker zu visualisieren.
      HINWEIS: Für erste Experimente ist es zweckmäßig, einen Plasmamembranmarker wie GFP-mem^11,12 zu verwenden, um die Reaktion der Zellmembran und mögliche Brüche sichtbar zu machen. Der Marker ist leicht zu transfizieren, und es wird empfohlen, die transfizierten Zellen bei steigender Dehnung zu dehnen, um die Dehnungsschwelle zu beurteilen, die zu einem Plasmamembranbruch führt. Siehe die Plasmidkarte im Zusatzordner 5. Dies hängt vom Zelltyp ab und ist in Einzelzellexperimenten im Vergleich zu Zellmonolayern geringer. Dieser Membranmarker ist mit der Zelldehnung kompatibel, im Gegensatz zu einigen membraneinfügenden Farbstoffen, bei denen beobachtet wurde, dass sie bei geringer Dehnung zu einem Plasmamembranriss führen.
   2. Am Tag des Experiments werden Zellmedien erwärmt und CO₂ -unabhängige Medien vorbereitet.
      HINWEIS: Wenn das Mikroskop über eine CO₂ -Kontrolle verfügt, die mit dem Stretch-System kompatibel ist, können die Experimente in normalen Zellkulturmedien durchgeführt werden (dies wäre ein notwendiger Aufbau für empfindliche Proben, die in CO₂ -unabhängigen Medien nicht überleben können). Es wird eine CO₂ -unabhängige Supplementierung mit einem Antibleichmittel empfohlen (z. B. für GFP-Proteine Rutin-Supplement²¹ in 10 mg/ml).
   3. Trypsinisieren Sie die Zellen und zählen Sie sie.
   4. Besäen Sie eine angemessene Anzahl von Zellen in einem kleinen Volumen (20-50 μl) mit Standard-Zellmedien, um die Zelladhäsion zu fördern, und bewahren Sie sie in einem CO 2-Feuchtigkeits-kontrollierten Inkubator auf.
      HINWEIS: Für flache und große Fibroblasten und Einzelzellexperimente 5000 Zellen; Die Anzahl hängt vom Zelltyp und dem Experiment selbst ab.
   5. Nach einer 20-30-minütigen Inkubation (Überprüfung der anfänglichen Zellanhaftung) geben Sie vorsichtig 500 μL Medium auf die Zellen. Legen Sie es zurück in den Inkubator, um eine weitere Zellausbreitung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Aussaatzeit hängt vom Zelltyp und von den experimentellen Anforderungen ab. Auch die Bildung einer Monoschicht mit Inkubation über Nacht ist möglich. Das Volumen des Kulturmediums muss entsprechend angepasst werden. Sekundäre Zellfärbung: Nach dem Anheften können die Zellen mit einem Farbstoff wie SpyDNA (siehe Materialtabelle) gefärbt werden, um die Zellkerne sichtbar zu machen (Ergänzende Abbildung 5), oder mit einer anderen Färbung, um eine beliebige Struktur von Interesse zu visualisieren. Achten Sie immer darauf, dass die Färbung lebender Zellen oder die Überexpression von Proteinen durch Transfektion die Zellreaktion auf Dehnung beeinträchtigen kann, insbesondere in der Zellrinde, der Plasmamembran oder mechanosensitiven Proteinen/Strukturen.
   6. Wechsel auf CO₂ -unabhängige Medien und sofortige Verwendung in der Reckvorrichtung.
      HINWEIS: Jetzt ist die Probe bereit für ein Streckungsexperiment.
3. Zelldehnungsexperiment: Beispiel für einen einzelnen Stretch-Release-Zyklus und Bildgebung der Plasmamembran (PM) zur Erfassung des dynamischen PM-Umbaus von Fibroblasten.
   1. Montieren Sie den Streckring auf dem Mikroskoptisch wie in Abschnitt 6, Schritt 6.2.
   2. Suchen Sie eine interessante Zelle, notieren Sie ihre Position, und machen Sie ein Bild der vorgedehnten Zelle (Abbildung 4B).
   3. Legen Sie das gewünschte Vakuum an, das gemäß der Kalibrierkurve der gewünschten Substratdehnung entspricht.
   4. Um die gestreckte Zelle zu finden, fokussieren Sie zuerst in Z und bewegen Sie sich dann in X-Y-Richtung, um die Zelle zu finden und wieder auf das Sichtfeld zu zentrieren.
   5. Nehmen Sie Bilder während der gewünschten Dauer auf (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Erste Experimente sind in der Regel erforderlich, um die Reaktion der Zelle auf Zugdehnung in Abhängigkeit von ihrer Art (im Durchschnitt) zu bestimmen. Dehnen Sie die Zellen bei verschiedenen Substratstämmen, um die maximale Zugbelastung zu bestimmen, die sie tragen können. Ein Plasmamembranriss tritt auf, wie durch den Fluoreszenzmembranmarker der Plasmamembran sichtbar gemacht, wenn die Belastung für die Zelle zu groß ist.
   6. Gehen Sie für die Zellfreigabe in die Ruheposition der Zelle zurück und schalten Sie den Aufnahmemodus des Mikroskops ein , um sicherzustellen, dass die Aufnahme beginnen kann, sobald die Probe neu fokussiert wurde.
   7. Lassen Sie die Dehnung los und fokussieren Sie schnell manuell in Z.
   8. Nehmen Sie Bilder der freigegebenen Zelle für die gewünschte Zeit auf (Abbildung 4B). Aufgrund der Flexibilität der PDMS-Membran lässt sich die Probe mit der Zeit leicht defokussieren. Passen Sie daher den Fokus während der gesamten Bildaufnahme manuell an.
      HINWEIS: Um während der Bildgebung nach der Veröffentlichung erfolgreich neu zu fokussieren, müssen die Bilder oft genug visualisiert werden. Eine 3-5-minütige Videoaufnahme alle 3 s ist sinnvoll. Das PDMS-Substrat ist nicht mit dem perfekten Fokussystem des Mikroskops kompatibel, so dass in der Regel eine manuelle Einstellung durch den Benutzer für eine schnelle Erfassung erforderlich ist. Die Software-Fokussierung kann geklärt sein, aber achten Sie auf mögliche Fehler und große Bühnenbewegungen, die das Objektiv beschädigen können, indem sie auf ein Stretch-Post-Teil treffen. Der Benutzer kann entscheiden, ob er je nach Experiment mehrere Dehnungen der Probe durchführen möchte.
4. Nachbearbeitung: Richten Sie die Bilder mit Fiji aus
   1. Öffnen Sie die Bilder im Ruhezustand und belasten Sie sie.
   2. Verwenden Sie den Fiji-Plug-in-Vorlagenabgleich und wählen Sie einen Bereich der Zelle aus, der ausgerichtet werden soll (Abbildung 4C).
      HINWEIS: Die relativen Verschiebungen des ausgerichteten Dehnungsbildes werden von Fiji gerendert, und die Bilder werden beschnitten und ausgerichtet. Laden Sie das template_matching-Plugin über diesen Link herunter: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. Zellaussaat auf einem vorgedehnten Substrat

1. Montieren Sie den mit dem Adhäsionsprotein beschichteten Streckring in der Streckvorrichtung.
2. Strecken Sie das PDMS-Substrat auf die gewünschte Dehnungsstufe.
3. Säen Sie die Zellen wie in Abschnitt 7 aus.
   HINWEIS: In diesem Experiment wird die Aussaat nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt, so dass das Protokoll möglicherweise nicht für alle Zelltypen geeignet ist.
4. Nachdem die Zellen verklebt haben, tauschen Sie das Medium gegen ein CO₂ -unabhängiges Medium aus.
   HINWEIS: Wählen Sie schnell haftende Zellen, um die Adhäsionszeit zu minimieren.
5. Lassen Sie nach einer gewünschten Inkubationszeit die Dehnung los, und stellen Sie sich eine interessierende Zelle vor.
   HINWEIS: In diesem Schritt ist es schwierig, dieselbe Zelle nach der Stretch-Freigabe zu finden, da die Position der Zelle im Ruhezustand unbekannt ist und die Bewegung des PDMS-Substrats nicht leicht vorhersehbar ist.

9. Fixierung gedehnter oder entspannter Zellen

1. Fixieren Sie Zellen in gestreckten Zuständen (arbeiten Sie unter chemischer Haube)
   HINWEIS: Paraformaldehyd (PFA) ist ein Standard-Fixiermittel; Verwenden Sie es warm bei 37 °C, um eine schnelle Fixierung zu gewährleisten. Alternativ ermöglicht die Glyoxallösung²² eine schnelle Probenfixierung bei guter Probenkonservierung.
   1. Fixiermittel vorbereiten.
   2. Samenzellen auf den Ringen nach Schritt 7.2.
   3. Montieren Sie den Streckpfosten und die Steuerung in einer Chemikalienhaube und schließen Sie sie an die Vakuumversorgung an.
   4. Legen Sie den Ring mit den ausgesäten Zellen in den Streckpfosten.
   5. Um den gestreckten Zustand zu fixieren, dehnen Sie sich auf die gewünschte Dehnung. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und fixieren Sie es, indem Sie die 4%ige PFA-Lösung 10 Minuten lang bei 37 °C in die Zellen geben. Dann mit PBS waschen und dabei immer die Dehnung halten. Lassen Sie das Vakuum langsam los und waschen Sie es mit mehr PBS.
      HINWEIS: Vergessen Sie nicht, einen nicht dehnbaren Kontrollzustand vorzubereiten (dazu kann ein kleines PDMS-Stück geschnitten und mit einer kleinen Menge 96%iger Ethanollösung darunter auf einem Glasdeckglas getrocknet werden). Um die fixierte Probe abzubilden, wird empfohlen, die Probe auf die gleiche Größe zurückzustrecken. Da PFA giftig ist, müssen in diesem Schritt angemessene Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Es ist praktisch, einen kleinen Ofen zu verwenden, der unter der Haube aufbewahrt werden kann (siehe Materialtabelle).
   6. Bilden Sie die Probe ab, vorzugsweise erneut mit dem Vakuum, auf der gleichen Höhe, die beim Fixieren verwendet wurde, um ein "Reflatieren" der Probe zu gewährleisten (Abbildung 4D).
2. Fixieren Sie die Zelle nach dem Dehnen (arbeiten Sie unter chemischer Haube).
   1. Dehnen Sie die Zellen auf die gewünschte Dehnung und Zeit. Entfernen Sie kurz vor der Dehnungsfreigabe den größten Teil des Mediums, ohne die Probe vollständig zu trocknen, und geben Sie den Stamm ab. Alternativ können Sie eine zyklische Dehnung mit einer bestimmten Dauer anwenden.
   2. Medien schnell entfernen und sofort mit der Fixierlösung für 10 min fixieren. Mit PBS und Bild waschen.
      HINWEIS: Die Probe kann auch auf ein vorgedehntes Substrat gesät werden und nach einer benutzerdefinierten Aussaatzeit eine feste Freisetzung nach der Streckung wie in Schritt 9.2.2 erfolgen.
3. Immunfluoreszenz der fixierten Probe: Befolgen Sie die Standardprotokolle für die Immunfluoreszenz bei gedehnter oder freigegebener Probe; Das Blockieren mit Fischgelatine wird BSA¹⁷ vorgezogen.
4. Stellen Sie sich die Probe vor (Abbildung 4E).
5. Konservierung von Proben
   1. Bereiten Sie Einbettmedien für die Probenkonservierung vor (Mowiol oder Prolong).
   2. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie einen Tropfen (ca. 75 μl) Eindeckmedium hinzu.
   3. Nehmen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas und legen Sie es vorsichtig darauf (vermeiden Sie Blasen, die die Visualisierung behindern würden).
   4. Mindestens 48 h bei Raumtemperatur (RT) trocknen.
   5. Schneiden Sie um die PDMS-fixierte Probe herum und montieren Sie sie für die spätere Bildgebung auf ein weiteres Glasdeckglas.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht mit der Nachbearbeitung der Probe auf der gedehnten Membran kompatibel, da die Montage der PDMS-Membran auf einem Deckglas mit dem Konservierungsmedium die Konservierung der Membran nur in ihrem entspannten Zustand umfasst.

10. Fixierung mit dem Gitter zur Abbildung desselben Probenbereichs in verschiedenen Modi - REM-Bildgebung als Beispiel

HINWEIS: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um dieselbe einzelne Zelle in zwei verschiedenen Mikroskopen, der Fluoreszenzmikroskopie und der Rasterelektronenmikroskopie, abzubilden, wie hier vorgestellt. Die korrelative Bildgebung erfordert eine erweiterte Bildverarbeitung, die nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls fällt. Weitere nützliche Anwendungen können z. B. die Visualisierung der Probe im Live-Modus, die weitere Fixierung unter der Haube und die Visualisierung derselben Zelle nach der Immunfärbung sein (das Protokoll, das für die ergänzende Abbildung 5 verwendet wird).

1. Bereiten Sie einen Stretchring mit den gemusterten PMMA-Platten aus Abschnitt 4 vor.
2. Säen Sie die Zellen wie in Schritt 7.2 aus.
   HINWEIS: Beachten Sie, dass die Beschichtungslösung sorgfältig aufgetragen werden muss, um eine vollständige Abdeckung des PDMS zu gewährleisten, auch in den kleinen Rasterlöchern.
3. Fixieren Sie wie in Abschnitt 8 beschrieben, jedoch unter Verwendung eines geeigneten Fixiermittels und Protokolls, das mit der Proben- und Elektronenmikroskopie-Bildgebung kompatibel ist.
   HINWEIS: Bei Verwendung einer Mischung aus PFA + Glutaraldehyd (z. B. 2 %-2,5 %) ist auf Autofluoreszenz zu achten, die durch das Vorhandensein von Glutaraldehyd-Reagenz entsteht, und schließlich einen Abschreckschritt²³ durchführen.
4. Bilden Sie die Probe im Fluoreszenzmodus ab und notieren Sie die Zellposition (drucken Sie das Raster aus und notieren Sie die Position z. B. mit einem Kreuz).
5. Sobald alle Bilder aufgenommen wurden, bereiten Sie die Probe für die EM vor, indem Sie zuerst das PDMS um die Probe herum schneiden (zuvor das Schmiermittel entfernen).
6. Verarbeiten Sie die PDMS-Membran + Probe für die Rasterelektronenmikroskopie (die ein Standardprotokoll für Probendehydratisierung und Metallsputtern umfasst)¹².
7. Bei der Bildgebung im REM-Mikroskop finden Sie die Gitterpositionen und suchen Sie nach den Zellen, die zuvor im Fluoreszenzmodus abgebildet wurden (Abbildung 4F,G).

Ergebnisse

Kalibrierung und Radialität
Die korrekte Charakterisierung des erhaltenen Stammes ist eine Garantie für die Reproduzierbarkeit und Kontrolle der Experimente. Während jeder Probe fluoreszierende Kügelchen hinzugefügt werden können, um die Dehnung genau aufzuzeichnen, gewährleistet ein vorheriger Kalibrierungsschritt die richtige Planung des Experiments, da die Größe der Dehnung bekannt ist, die der Experimentator vor der eigentlichen Dehnung auf die Probe anwenden möchte. Die Dehnung hängt nicht nur vo...

Diskussion

Eine große Anzahl von Dehnungsgeräten wurde verwendet, um biologische Proben mechanisch zu dehnen^und die physiologischen Bedingungen im Körper nachzuahmen ^24,25. In der Literatur sind zahlreiche Aufbauten verfügbar, und die Beobachtung der Probenantwort erfolgt in der Regel durch Kopplung von Dehnungsvorrichtungen an die Rasterkraft²⁶ oder die Fluoreszenzmikroskopie ^27,11...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetat-Maske	JD Photodaten
Acrylamid	Biorad	161-0140	40% Acrylamid-Lösung
APS	Sigma Aldrich	Nr. A3678	Ammoniumpersulfat für die Elektrophorese, ≥ 98%
Aptes	Sigma Aldrich	281778	(3-Aminopropyl)triethoxysilan
Autonome mikrofluidische Pumpe	Elveflow Kobalt	Kobalt Dual	Kobalt Dual
Bisacrylamid	Biorad	161-0142	2%ige Bis-Lösung
Klinge	Fisher Scientific	11733919	Didaktische Gruppe Hoja tatá ctica X100 LAME BISTOURI STERIL N° 23  LAMD23
Clips	Sprinter	AKXX000001	Bull Dog Clips, 32 mm, aus Metall, Fassungsvermögen 10 mm, vernickelt
Corona-Behandler	Elektrotechnische Produkte	BD-20AC, Artikel-Nr.:12051A	BD-20AC KORONA-BEHANDLER FÜR LABORS
Tassen	VWR	611-1368	VWR, Becherbecher, Einweg, 250 mL
DAPI	Roche	10236276001	DAPI-Färbung
Ethanol 96%	Panreac Quí Glimmer, SLU	131085-1212	Etanol 96% v/v para aná lisis, ACS- 2,5 L
Fibronektin	Sigma	Nr. F0895	Fibronektin, aus menschlichem Plasma, flüssig; 0.1%
FluoSpheres Carboxylat-modifizierte Mikrosphären, 0,1 & Mikro; m	Lebenstechnik	F8801, F8803	Gelbe, grüne und rote fluoreszierende Kügelchen zur Beurteilung der Auflösung
FluoSpheres Carboxylat-modifizierte Mikrosphären, 0,2 & Mikro; m	Fisher Scientific	F8809, F8810	Gelbe, grüne und rote fluoreszierende Kügelchen für die Dehnungskalibrierung
Glutaraldehyd	Sigma Aldrich	Nr. G6403	Glutaraldehydlösung 50% in H2O
Interferometer	Veeco	Wyko NT1100	Interferometer zur Messung der Dicke von PDMS-Membranen
Isopropanol	Panreac Quí Glimmer, SLU	131090-1212	2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para aná lisis, ACS, ISO
Laiton wiegt			Sonderanfertigung
Fusselfreies Taschentuch	Berkshire	DURX670, DR670090920	Vlies-Tücher
Schmiermittel (Vaseline)	Sigma	16415	Vaseline
Masken-Aligner	Sü ss MicroTec	MJB4	Mask Aligner für die Fotolithographie auf PMMA-Platten
Mowiol	Calbiochem - Merck	475904	MOWIOL 4-88 Reagenz
NIKON Mikroskop Spinning Disk konfokal	Nikon	Eclipse Ti-E/B	ausgestattet mit Nikon Ti-S-ER  Bühne
NIKON Mikroskop aufrecht	Nikon	Eclipse Ni-E	ausgestattet mit Nikon NI-SH-E Tisch
Objektiv 60x	Nikon	CFI Apo NIR 60X W	NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
PBS-Lösung	Gibco	14200067	DPBS, 10x
PDMS	Dow Corning	2401673921	Sylgard - 184 Silikon-Elastomer-KIT DN 109
Petrischalen-Ringabdeckung (groß)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP Artikelnummer: 07177925 diametro 100
Petrischale Ringabdeckung (klein)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP Artikelnummer: 07177924
Plasma-Reiniger	Harrick	PDC-002	Sauerstoff-Plasma-Generator
PMMA-Platten und -Ringe			Siehe Excel-Spezifikationstabelle in ergänzenden Dokumenten
Verlängern	Invitrogen	P36930 /P36934	ProLong Gold Antifading-Reagenz
Abwehr-Silan	GE Gesundheitswesen	17-1332-01	PlusOne Repel-Silan ES
Ringe / Gummiring	Tecnifil		Sonderanfertigung
Schleuder-Coater	Lorbeer	WS-650Sz	Schleuder-Coater
SPY650-DNA	Spirochrom	SC 501	SPY650-DNA
Lenklöffel	VWR	231-0416	Eco kurzer Einwegspatel, doppelseitiger Löffel und Schaufel, PP und EcoPure-Additiv
SU8 Harz 2100	Mikrochemie	Y111075	SU8-2100
SU8-Entwickler	Sigma-Aldrich	484431	Propylenglykolmonomethyletheracetat
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin, Bioreagenz geeignet. Reagenz für Elektrophorese
Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan	Sigma Aldrich	448931	Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan
Pinzette	IESMAT	T5039	Dumont HP Pinzette 7 Edelstahl. 0,17 x 0,10 mm Spitze. (Agar Scientific GmbH)
Vakuum-Regler	GARCAP/Parker	990-005203-005	Controlador de vacio
Vakuumregler fluigent	Fließend	LU-FEZ-N800	LineUp Flow EZ (n800mbar)
Weißes Bankpapier	Raima	931.1001	Papier Raima 42 x 52