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Methodenartikel

Mechanische Abbildung von Sphäroiden mittels Brillouin-Spektroskopie

2K Ansichten

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DOI:

10.3791/67538

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12. Dezember 2025

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1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur mechanischen Charakterisierung lebender Sphäroide innerhalb einer 3D-Matrix mittels Brillouin-Mikrospektroskopie. Diese vollständig optische Methode ermöglicht sphäroide Visualisierung mit mikroskaliger Auflösung und quantitativen mechanischen Eigenschaften. Dieser Ansatz hat Auswirkungen auf die mechanische Phänotypisierung; zum Beispiel die Bestimmung pathologischer Zustände von Tumorsphäroiden innerhalb einer 3D-Mikroumgebung.

Zusammenfassung

Brillouin-Spektroskopie, eine aufkommende Technik, die in der biomedizinischen Wissenschaft großes Interesse erregt, ermöglicht es Forschern, Informationen zu Mechanik und Struktur zu sammeln, indem sie die viskoelastischen und architektonischen Eigenschaften von Proben auf zerstörungsfreie, kontaktfreie Weise untersucht. Dieser Ansatz bewertet die mechanischen Eigenschaften von 3D-Proben, indem die Wechselwirkung von sichtbarem Licht mit thermisch induzierten akustischen Wellen/Phononen gemessen wird. Die Informationen, die die Brillouin-Spektroskopie liefert, bieten Potenzial für die in-vivo-Bewertung der Biophysik und die mögliche Diagnose von Krankheitspathologien. Ein wesentlicher Vorteil der Brillouin-Spektroskopie ist die Möglichkeit, mikroskopische Mechanik innerhalb einer biologischen Probe zu bewerten; andere konventionelle Techniken, die diese Auflösung erreichen können, wie die Atomkraftmikroskopie, können Proben nur in 2D untersuchen, da sie direkten Kontakt erfordern. Diese Arbeit beschreibt die Anwendung der Brillouin-Mikrospektroskopie zur Untersuchung der Biomechanik lebender Sphäroide, die in eine 3D-Hydrogelmatrix eingebettet sind. Die Einkapselung zellulärer Sphäroide in einer 3D-Mikroumgebung etabliert ein sphäroides System, das die Schnittstelle zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix in vivo eng rekapituliert. In unserem Protokoll beschreiben wir die Vorbereitung von Sphäroidproben und Messungen der Brillouin-Spektren mit sequentieller Fluoreszenzbildgebung. Zusätzlich besprechen wir Verfahren zur Spektraldatenanalyse und technische Details zum optischen System.

Einleitung

Die Kultivierung von Zellen in 3D-Modellen ist im Vergleich zu den typischen 2D-Zellkulturmethoden vorteilhaft, da sie Gewebestrukturen und Zell-Interaktionen, die in vivo gefunden werden, besser repapituliert. Sphäroide sind 3D-Zellaggregate, die komplexe Zell-zu-Zell-Interaktionen ermöglichen; Diese Wechselwirkungen werden in Zellen beeinträchtigt, die als Monoschicht auf Gewebekulturplastik gewachsen sind. Sphäroide können in einem Gerüst gezüchtet werden, das die Mikroumgebung nachahmt, aus der die Zelle stammt. Zum Beispiel sind Hydrogele ein beliebtes Biomaterial zur Kultivierung von Zellen/Sphäroiden, da sie eine präzise Steuerung von Parametern wie Steifigkeit, Abbaubarkeit, Porengröße und der Einbindung von Wachstumsfaktoren1 ermöglichen (Abbildung 1A). Mechanische Hinweise gehen oft biochemischen Veränderungen in Krankheitspathologien wie Krebs und Fibrosevoraus 2,3, daher ist das Erfassen der biomechanischen Signatur in klinisch relevanten 3D-Krankheitsmodellen entscheidend für die Entwicklung diagnostischer Interventionen, die die therapeutische Praxis informieren und die zugrunde liegende Pathophysiologie verstehen4.

Brillouin-Mikroskopie (BM) ist eine Bildgebungstechnik, die es ermöglicht, die mechanischen Eigenschaften biologischer Materialien in 2D-Ebenen 5,6,7 zu messen. BM hat einige wichtige Vorteile gegenüber anderen, gebräuchlicheren Methoden wie der Atomkraftmikroskopie (AFM) und Elastographie. Es ist gut dokumentiert, dass AFM eine hohe räumliche mechanische Auflösung erreichen kann und dass Elastographie die Mechanik in Proben 8,9 untersuchen kann. BM erfordert keinen direkten Kontakt mit dem untersuchten Material, was sie zu einer idealen Technik gegenüber AFM für schwer zugängliche Proben/Zellen macht, wie etwa Sphäroide in Hydrogelen. Ein weiterer wichtiger Vorteil von BM ist, dass keine Markierung der Proben erforderlich ist und eine mikroskopische Auflösung in biologischen Proben bereitgestellt werden kann, was bei gängigen Elastographiemethoden 7nicht erreichen können; Fortschrittlichere optische Elastographietechniken können mit mikroskaliger Auflösung10 arbeiten. Es sollte beachtet werden, dass die genaue effektive Auflösung in der Brillouin-Bildgebung heterogener biologischer Proben nicht trivial zu definieren ist. Erstens hängt sie für eine gegebene Beleuchtungswellenlänge von den optischen Eigenschaften ab, die die Brennpunktgröße (numerische Apertur, NA, der Objektivlinse und die Opazität der Probe) beschreiben. Zusätzlich wird die Genauigkeit, mit der die mechanischen Eigenschaften der Probe untersucht werden können, sowie die Form des Brillouin-Spektrums von den akustischen Eigenschaften des Materials (Phononwellenlänge und Ausbreitungslänge) beeinflusst11,12. Das zugrunde liegende Phänomen hinter der Brillouin-Spektroskopie ist die Brillouin-Streuung, bei der das einfallende monochromatische Laserlicht mit spontanen, thermisch induzierten akustischen Phononen im biologischen Medium interagiert. Dies führt zu inelastischer Streuung von Licht und (Brillouin-Frequenzverschiebung, BFS) in Abbildung 1B und liegt typischerweise in der Größenordnung mehrerer GHz; je nachdem, ob das Photon Energie verliert oder gewinnt, werden Brillouin-Stokes- bzw. Anti-Stokes-Peaks im Spektrum des gestreuten Lichts detektiert. Durch seine Abhängigkeit von der lokalen Schallgeschwindigkeit im Medium steht das BFS in Beziehung zum elastischen Längsmodul, der wiederum empirisch mit dem Young-Modul 7,13 korreliert ist; allerdings ist beim Vergleich dieser Moduli Vorsicht geboten, da (i) sie nicht direkt miteinander verbunden sind, (ii) der Youngsche Modul üblicherweise im Pa-kPa-Bereich für biologische Proben und weiche Substanz liegt, während der Longitudinalmodul aus Brillouin im GPa-Bereich liegt, und (iii) Parameter wie Änderungen des Brechungsindex und Materialdichte7 berücksichtigen müssen. Die Brillouin-Linienbreite (in Abbildung 1B) ist ein weiteres Maß, das aus BM gewonnen wird. Er steht im Zusammenhang mit dem Längsverlustmodul und liefert Einblicke in die Viskosität der Probe; Diese Eigenschaften können mit der Viskoelastizität14 korreliert werden. Daher ermöglicht BM die Bewertung der viskoelastischen Eigenschaften, wobei ein größeres BFS ein steiferes Material und eine größere Linienbreite ein viskoseres Material bedeutet (Abbildung 1B). Es sollte beachtet werden, dass elastische (Rayleigh-)Streuung, bei der die Photonen keine Frequenzverschiebung durchlaufen, eine deutlich höhere Wahrscheinlichkeit hat als die Brillouin-Streuung. Daher müssen Brillouin-Spektrometer ausgerüstet sein, um das Rayleigh-Signal zu unterdrücken.

BM wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften verschiedener Gewebe, Biomaterialien und 3D-Zellkulturmodelle zu charakterisieren. Zum Beispiel wurde BM verwendet, um zwischen Melanom und dem umgebenden gesunden Gewebe zu unterscheiden und zeigte, dass das nicht-krebsartige Gewebe deutlich weicher war als das Melanom15. Rad et al. zeigten, dass die Erhöhung der Polymerkonzentration von Hydrogelen zu einer erhöhten BFS und Linienbreite führte. Bei den niedrigsten Polymerkonzentrationen zeigten Hydrogele mit Zellzellen größere Abnahmen der Brillouin-Frequenzverschiebungen über sieben Tage im Vergleich zu leeren Hydrogelen, was auf eine zelluläre Umstrukturierung des Hydrogels zurückzuführen ist. Dies wurde bei einer Polymerkonzentration von 10 % nicht beobachtet, was eine mögliche mangelnde Zelllebensfähigkeit in diesen Hydrogelenunterstrich.

Für die vorliegende Studie am relevantesten ist, dass BM zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Sphäroiden 17,18,19,20 verwendet wurde. Insbesondere kann der Einfluss der lokalen Mikroumgebung auf die Sphäroidmechanik mit BM20 nachgewiesen werden. Im Vergleich zu Tumorsphäroiden, die in kompilanten Hydrogelen kultiviert wurden, zeigten Sphäroide, die in steifen Hydrogelen gezüchtet wurden, einen höheren BFS, was auf einen erhöhten Elastizitätsmodul20 hinweist. Die räumliche Variation mechanischer Eigenschaften innerhalb eines Sphäroids kann ebenfalls mit BM charakterisiert werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass der BFS von Tumorsphäroiden in Richtung des sphäroidenKerns 20,21 ansteigt. Darüber hinaus korreliert eine Abnahme des BFS mit einer erhöhten Invasivität der Tumorsphäroide20. BM wurde verwendet, um die mechanischen Veränderungen von Tumorsphäroiden als Reaktion auf den osmotischen Schock22 zu untersuchen. In der Studie wurde das Sphäroidwachstum über 5 Tage überwacht, wobei festgestellt wurde, dass die anfänglichen mechanischen Unterschiede zwischen Krebs und gesunden Sphäroiden, die bei der Stuhlung beobachtet wurden, mit der Zeit verloren gingen. Eine weitere Studie fand eine Zunahme des BFS des Sphäroids nach 7 Tagen, was auf eine größere Zellgröße und Zellanzahl zurückzuführenwar.

Darüber hinaus wurden multimodale Untersuchungen durchgeführt, bei denen Brillouin-Mikroskopie neben AFM und Rheologie eingesetzt wurde, um die mechanischen Eigenschaften von Zellen und Hydrogelenzu untersuchen. Rad et al. nutzten die Rheologie, um die mit BM gemessenen Trends zu kontextualisieren und stellten eine starke positive Korrelation zwischen dem Longitudinalmodul und dem Speicherschermodul in Bezug auf die Polymerkonzentration der Hydrogele16 fest. Brillouin-Mikroskopie und optische Pinzett-Mikrorheologie wurden verwendet, um die Mechanik von Krebszellen zu messen, die in 3D-Hydrogelen23 kultiviert wurden. In dieser Studie wurde eine verminderte mechanische Heterogenität unter Zellen in Sphäroiden im Vergleich zu einzelnen Zellen, die in Hydrogelen suspendiert sind, festgestellt.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften lebender Sphäroide, die in Hydrogelen eingebettet sind, mit einem kommerziellen Brillouin-Mikroskop beschrieben (Abbildung 1). Berghaus et al. beschrieben ein Protokoll, das die Schritte zum Bau eines hochauflösenden Brillouin-Spektrometers und eine Methode zur Kalibrierung mit Referenzmaterialien detailliert beschreibt25. Darüber hinaus beschreibt ein Protokoll von Shi et al. die Verwendung der Brillouin-Mikroskopie zur Überwachung der Veränderungen der mechanischen Eigenschaften embryonalesGewebes 26. Wir verwenden mesenchymale Stammzellen (MSCs)-Sphäroide in Poly(Ethylen-)Glykol (PEG)-Maleimid-Hydrogelen, um die Knochenmarknische nachzuahmen und die mechanischen Eigenschaften dieser Umgebung zu untersuchen. Dieses 3D-Modell hat das Potenzial, die mechanische Signatur von Knochenmarkerkrankungen wie Leukämie, multiplem Myelom und sekundärem Knochenkrebs aufzudecken. Das Protokoll ist daher direkt auf 3D-Modelle anderer Krankheiten übertragbar, bei denen die gestörte Mechanobiologie eine wichtige Rolle in der Pathologie spielen kann. Die Sphäroid- und Hydrogelpräparation, die Fluoreszenzbildgebung sowie die Brillouin-Mikroskopietechniken werden detailliert beschrieben. Die empfohlenen Verfahren, mögliche Nachteile und mögliche Verbesserungen der Technik werden besprochen. Die detaillierte Beschreibung des experimentellen Aufbaus ist in Abbildung S1 und im Abschnitt "Ergänzende Materialien und Methoden" im Zusammenhang mit dem experimentellen Aufbau dargestellt.

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Protokoll

1. 2D-Zellkultur

HINWEIS: Wo möglich, stellen Sie sicher, dass alle Zellkulturarbeiten in einer sterilen Umgebung mit einer Standard-laminaren Flusshaube durchgeführt werden, um Kontaminationen zu vermeiden. MSCs wurden im vorliegenden Protokoll verwendet, aber je nach den spezifischen Zielen der Studie können auch andere Zelltypen zur Bildung von Sphäroiden verwendet werden.

  1. Kultur von MSCs im Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Zellkulturmedium mit ausreichendem Volumen, um die Zellen zu bedecken, enthalten 4,5 g/L D-Glukose + L-Glutamin, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 100 μM Natriumpyruvat, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 % Penicillin und Streptomycin. Zellen bei 37 °C und 5 %CO2 inkubieren.
  2. Passagezellen bei 70-80 % Konfluenz durch Inkubation mit 0,05 % Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (das zugesetzte Trypsinvolumen sollte 1/3 des DMEM-Volumens betragen) für 3 Minuten bei 37 °C und 5 %CO-2 , um die Zellen von der Platte abzutrennen. Um die Reaktion zu stoppen, füge Kulturmedien hinzu, die FBS enthalten (zumindest entsprechend der Menge des hinzugefügten Trypsins). Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

2. Präparation von Sphäroiden

HINWEIS: Wo möglich, stellen Sie sicher, dass alle Zellkulturarbeiten in einer sterilen Umgebung mit einer Standard-laminaren Flusshaube durchgeführt werden, um Kontaminationen zu vermeiden. In dieser Studie wurden Mikrowellplatten verwendet, um MSC-Sphäroide zu erzeugen. Diese Platten bestehen aus 24 Bohrungen, und jede Bohrung enthält 1200 Mikrobohrungen mit einem Durchmesser von 400 μm. Dies ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl von Kugeln (Abbildung 2).

  1. Um die Mikrowellplatte vorzubereiten, werden die Brunnen vorbehandelt, indem man jedem Bohrloch 500 μL Anti-Adhärenz-Spüllösung hinzufügt. Zentrifugiere die Platte bei 1.300 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Prüfen Sie unter einem Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung, ob Luftblasen vorhanden sind. Falls ja, wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Entferne die Anti-Haftungs-Spüllösung.
  2. Zum Waschen der Platte geben Sie 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und aspirieren Sie. Machen Sie dies zweimal, um sicherzustellen, dass die Spüllösung vollständig entfernt wurde.
  3. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Sphäroid und die Anzahl der Sphäroide pro Gel. Das hängt von den einzelnen Forschungsfragen ab. Zum Beispiel haben wir 100 Zellen pro Sphäroid und 100 Sphäroide pro Gel verwendet. Daher war für dieses Protokoll nur ein Brunnen der Mikrowellplatte erforderlich, da dies insgesamt 1200 Sphäroide erzeugt. Um die Anzahl der benötigten Zellen für einen Brunnen zu berechnen, führten wir folgende Berechnung durch: 1200 x 100 = 1,2 x 105. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension mit 1,2 x 105 Cellen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie das Supernatantant.
  4. Die Zellen werden in 1 mL DMEM (+4,5 g/L D-Glukose + L-Glutamin) wieder suspendiert, ergänzt mit 100 μM Natriumpyruvat, 1 % NEAA, 1 % Penicillin und Streptomycin. Gib 1 ml Zellsuspension in einen Brunnen der Mikrowellplatte und pipette vorsichtig auf und ab, um die Zellen gleichmäßig im Bohrloch zu verteilen. Achte darauf, keine Luftblasen einzubringen. Zentrifugiere die Platte bei 100 g für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: In dieser Phase fügen wir FBS nicht in die Medien ein. Dies soll verhindern, dass sich die Zellen an den Kunststoff der Gewebekultur anheften.
  5. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind und bis zum Boden der Mikrobrunnen eingesunken sind. Zellen bei 37 °C und 5 %CO2 inkubieren. Beobachte die Sphäroidenbildung 24 Stunden später.
    HINWEIS: Sphäroide können je nach Zelltyp und gewünschter Kompaktheit bis zu 48 Stunden in der Platte verbleiben.
  6. Um die Kugeloide von der Platte zu entnehmen, entfernen Sie zunächst langsam und vorsichtig das Kulturmedium, wobei Sie darauf achten, die Sphäroide nicht zu stören. Um zu verhindern, dass Sphäroide an Kunststoffwaren haften, beschichten Sie Pipettspitzen und -tuben mit PBS und 1 % FBS. Um zu verhindern, dass die Kugeln in den Pipettenspitzen stecken bleiben, schneiden Sie die Spitze ab, um die Öffnung zu vergrößern. Maximale Erholungstipps können während dieser Schritte als zusätzliche Maßnahme verwendet werden, um den Verlust von Sphäroiden zu verhindern. Fügen Sie 500 μL PBS zu jedem Brunnen der Mikrowellplatte hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die Sphäroide zu lösen. Sammeln Sie das PBS mit aufgehängten Sphäroiden in einem Röhrchen (Abbildung 2).
  7. Betrachten Sie die Platte unter dem Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die meisten Kugeln erfolgreich entfernt wurden.
  8. Um die Anzahl der Sphäroide in der Suspension zu zählen, übertragen Sie 50 μL von der Suspension in einen Brunnen einer 96-Well-Platte. Zählen Sie die Anzahl der Sphäroide in den 50 μL. Zur Unterstützung des Zählens kann mit einem permanenten Marker ein Kreuz auf den Boden des Brunnens gezeichnet werden. Berechnen Sie die Anzahl der Sphäroide mit Gleichung (1):
    figure-protocol-1

3. Herstellung von PEG-Hydrogeln

HINWEIS: Wo möglich, stellen Sie sicher, dass alle Zellkulturarbeiten in einer sterilen Umgebung mit einer Standard-laminaren Flusshaube durchgeführt werden, um Kontaminationen zu vermeiden. In dieser Studie wurden PEG-Malemid-Hydrogele verwendet, aber auch andere Typen können verwendet werden. PEG-Maleimid-Hydrogele wurden durch die Thiol-Michael-Additionsreaktion27 gebildet. Die verwendeten Quervernetzer waren eine Mischung aus PEG-Dithiol und proteaseabbaubarem Peptid, flankiert von zwei Cysteinresten (VPM-Peptid, GCRDVPMSMRGGDRCG). Die Gele in der vorliegenden Studie verwendeten 70 % PEG-Dithiol und 30 % abbaubare VPM-Peptide.

  1. Stellen Sie eine 200 mg/mL Standardlösung aus VPM-Peptid her und fügen Sie pro Gel 2,4 μL Peptid hinzu. Stellen Sie eine 200 mg/mL Fondlösung aus PEG-Dithio her und fügen Sie 5,6 μL pro Gel hinzu.
  2. Suspendieren Sie die Sphäroide erneut in PBS, bevor Sie sie mit den Querverbindern mischen (Abbildung 2). Mische die sphäroide Suspension mit dem PEG-Dithiol (5,6 μL pro Gel) und VPM (2,4 μL pro Gel). Diese Lösung wird als Lösung B bezeichnet.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurden pro Gel 100 Sphäroide hinzugefügt.
  3. Stellen Sie eine 250 mg/mL PEG-Maleimid-Brühlösung her. Fügen Sie 50 μg Fibronektin pro Gel hinzu. Mischen Sie die PEG-Maleimid- und Fibronectinlösung; dies wird als Lösung A bezeichnet. Pipettlösung A (40,3 μL für 100 μL-Gele) auf die Unterseite einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Fügen Sie Lösung B (59,7 μL für 100 μL Gel) mit einem molaren Verhältnis von 1:1 Malimid:Thiol hinzu, um eine vollständige Vernetzung sicherzustellen; Stellen Sie sicher, dass die Gelierung sofort erfolgt. Das Endvolumen der Hydrogele beträgt 100 μL.
  4. Gele 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 %CO2 inkubieren, um die Gelation zu ermöglichen. Fügen Sie vollständiges Kulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS, 100 μM Natriumpyruvat, 1 % NEAA und 1 % Penicillin und Streptomycin) zum Brunnen hinzu, um sicherzustellen, dass das Gel vollständig untergetaucht ist (Abbildung 2). Inkubieren Sie das Gel bei 37 °C und 5 %CO2 , bis es bereit ist, unter dem Brillouin-Mikroskop zu messen.
    HINWEIS: Die Dauer der sphäroiden Kultur in den Hydrogelen vor den Brillouin-Messungen hängt vom Zelltyp und der Forschungsfrage ab. In dieser Studie werden die Sphäroide beispielsweise typischerweise bis zu 7 Tage in Hydrogelen kultiviert, während der sie mit einer Brillouin-Mikroskopie überwacht werden. Die viskoelastischen Eigenschaften der Hydrogele mit oder ohne sphäroide Einkapselung wurden charakterisiert und zeigen keinen signifikanten Einfluss der Sphäroide auf die Gelmechanik (Abbildung S2).

4. Fluoreszenzfärbung und Bildgebung von Sphäroiden in Hydrogelen

HINWEIS: In dieser Studie wurden Zellkerne und Aktinfilamente, die das Zytoskelett bilden, vor den Brillouin-Messungen fluoreszierend gefärbt und abgebildet.

  1. Um Actin zu färben, fügen Sie Live-Actin-Flecken 3 Stunden vor der Bildgebung mit 1 zu 500 Verdünnung in das Kulturmedium auf. Halte die Probe aus dem Licht, indem du sie in Folie wickelst. Inkubieren Sie das Gel bei 37 °C und 5 %CO2.
  2. Um die Kerne zu färben, geben Sie 40 Minuten vor der Bildnahme 2 Tropfen/ml lebende nukleare Färbung in das Kulturmedium um das Gel herum. Bringen Sie die Proben zurück in den Inkubator.
  3. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder so bald wie möglich nach Abschluss der Inkubationszeit der Färbung auf. Überprüfen Sie, dass der passende optische Weg (zur Belichtung der Mikroskopkamera) und die korrekte Position des Filterrads ausgewählt sind. Dimmen Sie das Licht im Raum und fangen Sie den Hintergrund ein. Schalten Sie die Lichtdiode (LED) ein und wählen Sie die Wellenlänge je nach Färbeprotokoll (hier wurden 385 nm für Kerne und 621 nm für die Aktinbildgebung verwendet). Nehmen Sie fluoreszierende Bilder von Sphäroiden mit 20-facher Vergrößerung mit bevorzugter Software auf. Schalte die LED-Quelle aus, wenn du fertig bist.

5. Brillouin-Mikroskopie von Sphäroiden

  1. Einschalten der Geräte und Laseremission
    1. Schalten Sie die Geräte ein: den Computer, das Spektrometer, die Mikroskopkameras, das Mikroskop, den Laserkühllüfter und die Laseremission, indem Sie den Schlüssel am Controller drücken. Stellen Sie sicher, dass dies 15 Minuten vor der Spektrometeroptimierung geschieht, um sicherzustellen, dass der Laser thermalisiert ist. Überprüfen Sie mit einem Leistungsmessgerät, dass die emittierte Laserleistung wie erwartet ist (in unserem Experiment 100 mW).
  2. Aktivieren Sie die Temperaturregelungsanwendung (siehe Materialtabelle) und überprüfen Sie, ob die Temperatur des Etalons optimiert ist, indem Sie die Strahlleistung nach dem Etalon messen. Wenn sie deutlich niedriger als erwartet ist (nach Berücksichtigung des verwendeten optischen Dichtefilters (OD), ändern Sie die Zieltemperatur um 1 °C und beobachten Sie, ob die Leistung im Laufe der Zeit zunimmt. Wenn es eine Abnahme gibt, kehren Sie die Veränderungsrichtung um. Sobald die Leistung nahe am erwarteten Wert liegt, wird in kleinen Schritten (0,1 °C) abgestimmt, bis das Maximum erreicht ist.
  3. Einstellung des Objektivlinsen-Brennpunkts im Acrylwürfel
    HINWEIS: Die Unterdrückung elastischer Streuung und Kopplung vom "Pumpenkiller" zum Spektrometer wird mit einer Probe aus steifem, homogenem Referenzmaterial vor jedem Experiment optimiert. In dieser Studie wird ein Acrylwürfel verwendet.
  4. Öffne die SpectraLok-Software und warte, bis alle Geräte erkannt sind. Auf der linken Seite des Hauptfensters (Abbildung 3) wählen Sie die Spektrometerkamera.
    1. Installiere den Acrylwürfel auf dem Probenhalter des Mikroskops, wobei die klare Seite zur Objektivlinse zeigt. Senke das Objektiv so weit wie möglich und zentriere den Würfel darunter. Stellen Sie sicher, dass der optische Pfad im Mikroskop so gewählt wird, dass die Spektrometerkamera belichtet wird (stellen Sie den Drehortwahlschalter auf L ein).
      HINWEIS: In unserem Setup ist der L-Port mit dem konfokalen Zirkulator verbunden, während R mit dem Mikroskop-Kameraanschluss verbunden ist.
    2. Im SpectraLok-Kamerafenster stellen Sie die Belichtungszeit des Sensors auf 500 ms und die Softwareverstärkung auf 100 ms ein. Die Software-Verstärkungseinstellung verbessert den Kontrast nur für Visualisierungszwecke.
  5. Blockieren Sie den Laserverschluss.
    HINWEIS: Da die Laseremission aktiviert ist, achte darauf, niemals Kopf/Augen in den Laserstrahlpfad zu bringen.
    1. Drücken Sie auf Capture und bewegen Sie das Objektivobjektiv nach oben. Es wird eine deutliche Zunahme der Signalintensität geben, und ein gesättigtes Muster (Abbildung 4A) wird erscheinen. Dies wird durch eine starke Reflexion von Laserlicht an der Luft-Acryl-Kubus-Grenzfläche verursacht. Wenn die Linse weiter nach oben bewegt wird, nimmt die Signalintensität ab, und Brillouin-Spitzen werden sichtbar. Setzen Sie die Objektivlinse fort, bis die Intensität der Brillouin-Spitzen konstant ist (Abbildung 4B). Dies entspricht dem Fokuspunkt, der sich vollständig im Acrylwürfel befindet.
  6. Optimierung des Etalon-Drucks zur Minimierung des elastisch gestreuten Restlichts
    HINWEIS: Zweck der folgenden Schritte ist es, das elastisch gestreute Rayleigh-Signal so zu unterdrücken, dass nur das frequenzverschoben Brillouin-Licht die Spektrometerkamera erreicht.
  7. In der SpectraLok-Software öffnen Sie das Pump Killer (PK)-Steuerfenster (Abbildung 5).
  8. Zoomen Sie auf eine der hellsten Brillouin-Bestellungen heran und stellen Sie die Druckstellerposition in Schritten von 100 μm an, indem Sie auf Bewegungs-Relativ klicken, um die Rayleigh-Spitzenintensität zu minimieren. Wenn das Rayleigh-Signal zunimmt, kehren Sie die Änderungsrichtung um, indem Sie auf Rückwärts klicken. Anschließend wird der Etalon-Druck in Schritten von 10 μm feinjustiert.
    HINWEIS: Im Acrylwürfel kann das Rayleigh-Licht vollständig unterdrückt werden; Dies muss bei einer heterogenen biologischen Probe nicht der Fall sein.
  9. Optimierung des Streifen-Overlays, um spektrale Daten zu "entwickeln"
    HINWEIS: Das folgende Verfahren stellt sicher, dass die (x, y)-Pixelkoordinaten des Kamerasensors durch Anwendung der Nachschlagetabelle LUT angemessen auf die Wellenlänge abgebildet werden.
  10. Im Kamerafenster zoomen Sie auf eine der Brillouin-Bestellungen heran.
  11. Drücken Sie s, um Streifen zu visualisieren, über die der LUT auf das Kamerabild angewendet wird (Abbildung 6A). Öffne das Einstellungsfenster und drücke Schnellkalibrieren, um die optimale horizontale Versetzung der Streifen neu zu berechnen. Wenn der Sensor gesättigt ist, verkürze die Belichtungszeit vor diesem Schritt.
    1. Im Kamerafenster überprüfen Sie, dass die violetten Streifen gut mit dem zentralen Bereich der Brillouin-Gipfel überlagert sind (Abbildung 6B).
  12. Optimierung der PK-Spektrometer-Kopplung
  13. Die Einstellung der Achsen der Kollimatorlinse ermöglicht es, die Effizienz der Lichtkopplung vom PK zum Spektrometer zu maximieren.
  14. Öffnen Sie das Spektrumfenster und klicken Sie auf Unwrap, um das Spektrum abzurufen (Abbildung 7).
  15. Öffne das PK-Kontrollfenster . Bei Schritten von 0,0005° werden die Kollimatorachsen 1 und 2 iterativ angepasst, um das Brillouin-Signal zu maximieren. Falls erforderlich, kann die Druckregelung des Etalons weiter optimiert werden. In einem homogenen Acrylwürfel kann das Rayleigh-Signal vollständig unterdrückt werden (Abbildung 7A). Während genaue Brillouin-Messungen mit einem Rest-Rayleigh-Signal möglich sind (Abbildung 7B), verdeckt bei schlechter Unterdrückung (Abbildung 7C) elastisch gestreutes Licht das Brillouin-Signal.
  16. Überprüfen Sie, ob das erreichte Brillouin-Signal mit der Referenzamplitude vergleichbar ist. Zum Beispiel beträgt in unserem System bei einer Belichtung von 500 ms und mit OD 0,3 die Brillouin-Spitzenintensitätsamplitude etwa 3000 Zählungen. Um Änderungen der PK-Parameter in der Konfigurationsdatei zu speichern, klicken Sie im PK-Fenster auf alle aktualisieren und alle speichern. Außerdem drücken Sie im Hauptfenster im Bereich Datei-I/O auf Speichern.
  17. Wechsel zur Scan-Software und Überprüfung der Optimierung der Parameter
  18. Schließen Sie SpectraLok und öffnen Sie die Scan-Software. Im vorliegenden Protokoll wurde LabVIEW-basierte Software verwendet, die in Abbildung S3 ausführlicher beschrieben wird. Um die Scan-Geometrie einzustellen, wird diese proprietäre Benutzeroberfläche (UI) verwendet, um die Prior XY-Z-Übersetzungsstufe zu steuern; Allerdings können auch andere Methoden angewandt werden.
    1. Installieren Sie die Glasboden-Petrischale mit der Hydrogel-Sphäroidprobe statt mit dem Acrylwürfel (Abbildung 8). Um eine Austrocknung des Gels zu verhindern, ist der Inkubator auf 37 °C und 95 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt. Nimm den Petrischalendeckel ab und füge ein Medium hinzu, um das Gel einzutauchen. Fügen Sie oben auf das Gel einen Deckdeckel hinzu, um das Bewegen des Gels zu verhindern.
    2. Lokalisieren Sie die Sphäroide. Wenn der Laserstrahl blockiert ist, schalten Sie den optischen Weg des Mikroskops auf das Okular um. Mach das weiße Licht an. Mit dem Joystick steuern Sie manuell die Sample-Stage, lokalisieren und fokussieren Sie die Sphäroide.
    3. Mach ein Hellfeldbild des Sphäroids. Stellen Sie die Helligkeit der Beleuchtung ein, indem Sie das Steuerrad drehen. Stellen Sie den optischen Weg auf R ein und belichten so die Mikroskopkamera. Die Belichtungszeit kann bei Bedarf angepasst werden, um ein Bild mit hohem Kontrast zu erhalten (d. h. 50 ms).
    4. Überprüfen Sie, dass das Spektrometer und die Unwrapping-Parameter weiterhin optimiert sind. Stelle den Mikroskopanschluss auf L und fange den Hintergrund mit dem Laser ab. Entblocken Sie den Laser, indem Sie das Rad zum Abfeuern drehen. Wählen Sie basierend auf dem gewünschten Signal-Rausch-Verhältnis die Belichtungszeit. Die typische Belichtungszeit für diese Messungen beträgt 200–500 ms.
    5. Wenn seit der Erstkalibrierung einige Zeit (d. h. mehrere Stunden) vergangen ist oder es eine mechanische Störung des Systems gab, ist die Etalon-Druckeinstellung oder die PK-Spektrometer-Kopplung möglicherweise nicht mehr optimal. Wiederholen Sie die Schritte 5.3-5.5, um die oben genannten Schritte gegebenenfalls neu zu optimieren.
    6. Wählen Sie aus dem unwrapped Spektrum die Brillouin Peak Fitting Range aus. Stellen Sie den Schwellenwert auf etwa die Hälfte der Intensität der Brillouin-Peaks ein. Ignorieren Sie die Brillouin-Spitzen mit Amplitude unterhalb dieser Schwelle. Korrigiere die Laserwellenlänge entsprechend allen identifizierten Brillouin-Peak-Paaren.
  19. Einstellung der multidimensionalen Scan-Geometrie
  20. Wählen Sie die Rasterscan-Geometrie, indem Sie die Breite des Scanbereichs und die Schrittlänge anpassen.
    HINWEIS: Für Sphäroide von etwa 70 μm verwenden wir für einen Scan mit niedriger Auflösung typischerweise eine Scanfläche von 150 μm × 150 μm und eine Schrittweite von 10 μm. Dies ergibt eine niedrigauflösende 2D-Karte in etwa 3,4 Minuten.
    1. Starte den Scan.
  21. Abschalten des Brillouin-Systems
    1. Schließen Sie die Software und schalten Sie den Computer aus. Schalten Sie die Laseremission mit dem Schlüssel am Controller aus. Lass das Verschlussrad in der blockierten Position. Schalten Sie die Kühlung des Laserlüfters aus. Schalten Sie das Mikroskop und die Spektrometerkameras aus. Zum Schluss schalten Sie das Mikroskop aus.

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Ergebnisse

Dateien, die nach einem Scan erhalten werden, umfassen Spektren, Scan-Anpassungsparameter (.csv), Scan-Parameter und Analyse, BFS- und Linienbreitenkarten, ein Brightfield-Bild mit der identifizierten Scan-Region sowie einen Screenshot des UI-Fensters. Für jeden Punkt des mehrdimensionalen Brillouin-Scans wird ein BFS-Wert ermittelt. In Abbildung 9 wird ein Beispiel-Hochauflösungsscan neben dem Hellfeldbild sowie Fluoreszenzbilder mit Aktinfilamenten und -Ke...

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Diskussion

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um die Brillouin-Mikroskopie zur biomechanischen Bildgebung von Sphäroiden, eingebettet in Hydrogelen mit mikroskaliger Auflösung, zu verwenden. Das Hydrogel kann vom lebenden Sphäroid durch Unterschiede in den erhaltenen BFS-Werten unterschieden werden. In den repräsentativen Ergebnissen verwendeten wir MSC-Sphäroide und PEG-Malelimid-Hydrogele; Dieses Protokoll ist jedoch weitgehend auf andere Zelltypen (z. B. Krebszelllinien) anwendbar. Die Zellen i...

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Offenlegungen

Die Autoren weisen darauf hin, dass T. Allen und G. Wardle Mitarbeiter von LightMachinery sind, das das in dieser Studie verwendete Brillouin-Spektrometer herstellt und verkauft. Das Unternehmen könnte von der Veröffentlichung dieses Werks profitieren. Alle anderen Autoren geben keine konkurrierenden Interessen an.

Danksagungen

Die Autoren erkennen die Finanzierung aus dem MechanoMeds Phase-2-Stipendium, UKRI/EPSRC, Fördernummer EP/X033554/1, zur Unterstützung der Entwicklung dieser Methode an.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-Arm PEG-Maleimide (20 kDa)Kreative PEGWorksPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
AggreWell 400-PlattenSTEMCELL-Technologien34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Luftraum-EtalonLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Anti-Adhärenz-SpüllösungSTEMCELL-Technologien7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Bold Line Top-Stage-InkubatorOkolabH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Cobolt Flamenco-100 660 nm LaserHuebner0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Konfokaler ZirkulatorLightMachineryHF-13311N/A
D-LEDi Fluoreszenzbeleuchtungssystem NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
EPI-FL-ModulNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Fibronektin (Mensch)YoProteine663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
HyperFine Brillouin-SpektrometerLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
LED-DA/FI/TR/Cy5-B Vierfachband-FilterwürfelNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Mesenchymale Stammzellen (MSCs)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Motorisierte Übersetzungsphase Frühere wissenschaftliche TätigkeitH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagenz (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Ziel: S Plan Fluor 20X NA 0,45, LuftNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
ORCA-Fusion CMOS-KameraHamamatsuC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-Ditholiel, 2 kDaKreative PEGWorksPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS-Kamera Teledyne Vision Solutions01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-actin SpirochromCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppTemperaturregelungssoftware
VPM-Peptid, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptN/AN/A
Eclipse Ti-2A-MikroskopNikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

Referenzen

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