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Gepaarter Cisterna Magna Nanoinjektions- und Laser-Speckle-Kontrastbildgebungs-Assay zur Untersuchung der Regulierung des zerebralen Blutflusses in vivo

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DOI:

10.3791/67544

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8. Juli 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die Regulierung des zerebralen Blutflusses in vivo zu untersuchen, sind traditionelle pharmakologische Methoden invasiv und schädigen oft den Schädel, die Dura und die Leptomeninge. In dieser Arbeit haben wir eine minimal-invasive Technik entwickelt, die die Nanoinjektor-gesteuerte intrazisternale Magna (ICM) Injektion mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung kombiniert, um die Integrität des Schädels und der Leptomeninge zu erhalten.

Zusammenfassung

Die Regulierung des zerebralen Blutflusses (CBF) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der kognitiven Funktionen, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind nach wie vor wenig verstanden. Die Untersuchung der zellulären und molekularen Prozesse, die an dieser Regulation beteiligt sind, erfordert einen pharmakologischen Ansatz, der eine präzise Verabreichung des Wirkstoffs in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (CSF) ermöglicht und gleichzeitig eine Echtzeitüberwachung der Dynamik des zerebralen Blutflusses ermöglicht. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation in vivo vor, indem wir die Nanoinjektor-basierte intrazisternale Magna (ICM) Injektion mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung kombinieren.

Die auf Nanoliter-Injektoren basierende ICM-Injektionstechnik ermöglicht eine präzise Wirkstoffabgabe in einem dynamischen Bereich von nL/min bis μL/min. In unseren Experimenten reduzierte dieser Ansatz das Injektionsvolumen signifikant von herkömmlichen 5-10 μl auf nur 1,5 μl, wodurch der normale Hirndruck aufrechterhalten wurde. In Kombination mit der Laser-Speckle-Kontrastbildgebung waren wir in der Lage, die Dynamik des zerebralen Blutflusses (CBF) vor, während und nach ICM-Injektionen in Echtzeit zu überwachen.

Mit dieser Methode untersuchten wir die CBF-Veränderungen als Reaktion auf die ICM-Injektion von drei verschiedenen Vasodilatatoren: (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG), Acetylcholin und Adenosin. Während alle drei Vasodilatatoren die basale CBF erhöhten, hatten sie deutliche Auswirkungen auf die CBF-Dynamik. Zum Beispiel war die Wirkung von Adenosin vorübergehend, während DHPG und Acetylcholin lang anhaltende Wirkungen hervorriefen. Mit ihren einzigartigen Vorteilen stellt diese Methode eine wertvolle Ergänzung des Werkzeugkastens zur Untersuchung der CBF-Regulation von Nagetieren in vivo dar.

Einleitung

Der zerebrale Blutfluss (CBF) sorgt für eine kontinuierliche Versorgung des Gehirns mit Sauerstoff und Nährstoffen und entfernt gleichzeitig Stoffwechselabfälle, die für die Aufrechterhaltung normaler kognitiver Funktionen unerlässlich sind 1,2. Unter homöostatischen Bedingungen bleibt CBF trotz Schwankungen des Perfusionsdrucks relativ stabil, ein Prozess, der als Autoregulation bekannt ist 3,4,5. Zusätzlich zur Autoregulation kann die lokale CBF als Reaktion auf die nahe gelegene neuronale Aktivität dynamisch angepasst werden, ein Phänomen, das als neurovaskuläre Kopplung bezeichnet wird 6,7. Sowohl die Autoregulation als auch die neurovaskuläre Kopplung werden von einer Gruppe von Zellen reguliert - Endothelzellen, Wandzellen, Astrozyten, Fibroblasten und Neuronen, die zusammen als neurovaskuläre Einheitszellen bekannt sind 4,7. Die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die sich diese verschiedenen Zelltypen koordinieren, um CBF zu modulieren, sind jedoch noch weitgehend unbekannt.

Methoden zur Untersuchung der CBF-Regulation werden im Allgemeinen in in vitro und in vivo Modelle unterteilt. In-vitro-Studien, häufig mit akuten Hirnschnitten, werden in der Regel mit elektrophysiologischen oder pharmakologischen Techniken kombiniert, um zu untersuchen, wie Neuronen und Gliazellen die Erweiterung oder Verengung einzelner Blutgefäße regulieren 8,9,10. Die Haupteinschränkung von In-vitro-Modellen besteht darin, dass sie die In-vivo-Bedingungen, insbesondere das Fehlen eines physiologischen Blutdrucks, nicht replizieren. In-vivo-Modelle zur Untersuchung der CBF-Regulation reichen von makroskaligen bis hin zu mikroskaligen Ansätzen. Makroskalige Techniken wie die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) sind nicht-invasiv, weisen jedoch eine geringe räumliche und zeitliche Auflösung auf 11,12,13,14.

Die primäre mikroskalige Methode zur Untersuchung von CBF in vivo ist die Zwei-Photonen-Bildgebung, die eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung bietet 9,15,16,17,18. Diese Technik erfordert jedoch die Entfernung des Schädels und der Dura mater, und wenn sie mit pharmakologischer Manipulation kombiniert wird, wird sie noch invasiver, was zu Blutungen führen kann, das Hirngewebe schädigt und den Hirndruck verändert19. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine Methode zur Manipulation und Überwachung von CBF in vivo zu haben, die bestimmte Kriterien erfüllt: Sie sollte nicht-invasiv sein (die Integrität des Schädels, der Leptomeninge und der Gefäße erhalten), eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung bieten und eine präzise pharmakologische Manipulation von CBF ermöglichen. In dieser Arbeit stellen wir eine neue Methode vor, die Nanoliter-Injektor-basierte intrazisternale Magna (ICM) Injektion und Laser-Speckle-Kontrastbildgebung kombiniert und all diese Anforderungen erfüllt.

Traditionelle pharmakologische Ansätze zur Untersuchung der CBF-Regulation beinhalten häufig die Entfernung des Schädels und der Hirnhäute, um das Hirngewebe für die lokale Wirkstoffabgabe freizulegen. Im Gegensatz dazu vermeidet die ICM-Injektion diese Schäden, indem Medikamente direkt in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (CSF) verabreicht werden, so dass sie dem natürlichen Fluss des Liquors folgen und dadurch physiologische Bedingungen besser nachahmen können. Eine Herausforderung bei der ICM-Injektion besteht darin, dass sie in der Regel große Mengen an Flüssigkeit benötigt - bei Mäusen oft 5 μl oder mehr20. Angesichts der Tatsache, dass das Gesamtvolumen des Liquors bei erwachsenen Mäusen etwa 36 μl beträgt, kann die Injektion von 5 μl den intrakraniellen Druck erhöhen und die CBF-Dynamik verändern. Unser Nanoinjektorsystem, das Glaspipetten verwendet, fördert Flüssigkeit mit präziser Kontrolle über Volumen und Geschwindigkeit, ohne dass Liquor an der Injektionsstelle austritt.

Urethan und Alpha-Chloralose werden in unserer Studie verwendet, da sie eine stabilere physiologische Grundlage des zerebralen Blutflusses bieten und die neurovaskuläre Kopplung (GFK) besser erhalten als häufig verwendete Alternativen wie Isofluran oder Ketamin/Xylazin (KX). Mit diesem System haben wir drei verschiedene Vasodilatatoren getestet - (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG), Acetylcholin und Adenosin - und bestätigt, dass es eine präzise Manipulation und Überwachung der CBF-Dynamik in vivo ermöglicht.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt. Alle Experimente entsprachen dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Für die Experimente wurden sechs männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 10-14 Wochen verwendet. Die chirurgischen Verfahren sind in Abbildung 1A dargestellt.

1. Vorbereitung der Operation

  1. Positionieren Sie ein Heizkissen auf dem stereotaktischen Rahmen und heizen Sie es ~20 min vor der Operation auf 37 °C vor. Bereiten Sie frisches Urethan (750 mg/kg) und Chloralose (50 mg/kg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für die Anästhesie vor.
    HINWEIS: Für die Herstellung der Alpha-Chloralose-Lösung in PBS haben wir die Lösung in einem 40 °C warmen Wasserbad erhitzt und alle 10-15 min gewirbelt, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Sowohl die Urethan- als auch die Alpha-Chloralose-Lösung wurden vor der Verwendung mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter filtriert.
  2. Sammeln Sie vor der Operation alle notwendigen chirurgischen Werkzeuge, einschließlich Scheren, Pinzetten, Mikronadelhalter, Hämostaten, Wattestäbchen, Wischtücher und Nähte. Sterilisieren Sie die Instrumente durch Autoklavieren (121 °C bei 15 psi für 60 min).
  3. Glaskapillarrohre (Außendurchmesser 1,14 mm, Innendurchmesser 0,53 mm, Länge 88,9 mm) vorbereiten. Verwenden Sie einen Glasabzieher, um Glaspipetten für die Injektion herzustellen21. Der bevorzugte Pipettenwiderstand liegt bei ca. 80 - 100 MΩ. Sterilisieren Sie die Glaspipetten und bewahren Sie sie in einem sauberen Behälter auf.
  4. Bereiten Sie einen Nanoinjektor mit dem richtigen Injektionsvolumen (25 nL - 4,5 μL) und der richtigen Geschwindigkeit (6 nL/s - 644 nL/s) vor.
  5. Bereiten Sie die folgenden gefäßerweiternden Lösungen in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) vor: (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) bei 5 mM, Acetylcholin bei 0,5 mM und Adenosin bei 10 mM.
  6. Bereiten Sie Meloxicam (4,0 mg/kg) zur Schmerzlinderung während der Operation vor. Verabreichen Sie den Mäusen etwa 30 Minuten vor der Operation subkutan Meloxicam, um eine angemessene Analgesie zu gewährleisten.

2. Chirurgischer Eingriff

  1. Wiegen Sie sechs männliche C57BL/6-Mäuse (10-14 Wochen alt) und betäuben Sie sie durch intraperitoneale Injektion von Urethan (750 mg/kg) und Chloralose (50 mg/kg). Legen Sie die Mäuse in eine Anästhesiekammer mit 1% Isofluran, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Dieser Vorgang dauert ca. 40 min bis 1 h.
    HINWEIS: Isofluran kann die Einleitung der Anästhesie beschleunigen.
  2. Nehmen Sie die Mäuse vorsichtig aus der Anästhesiekammer und beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie das Fehlen des Zehenkneifreflexes bestätigen. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen Haarentfernungscreme auf die Oberseite des Schädels und den Nacken auf, um das Fell zu entfernen.
  3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden, und tragen Sie sie während des gesamten Eingriffs bei Bedarf erneut auf. Überwachen Sie das Experiment regelmäßig und verabreichen Sie bei Bedarf zusätzliche Salbe.
  4. Positionieren Sie die Maus in Bauchlage innerhalb des stereotaktischen Rahmens, um eine ausreichende Beatmung mit medizinischer Luft bei einer Durchflussrate von 1 bis 2 l/min zu gewährleisten. Befestigen Sie die Maus mit Ohrstangen für eine korrekte Fixierung und neigen Sie dann den Kopf vorsichtig nach unten, um einen 120°-Winkel mit dem Körper zu bilden, wodurch die Cisterna Magna freigelegt wird.
    HINWEIS: Isofluran wird ausschließlich zur Anästhesieeinleitung und nicht während der Erhaltungsphase verwendet.
  5. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit mindestens drei abwechselnden Anwendungen von 70%igem Alkohol und einem chirurgischen Peeling (z. B. Chlorhexidin oder Povidon-Jod), um eine angemessene Hautsterilisation zu gewährleisten.
  6. Lokalisieren Sie den Hinterhauptkamm unter einem Operationsmikroskop. Heben Sie die darüber liegende Haut mit einer Pinzette an und machen Sie einen 1 cm langen Schnitt in der Mittellinie. Kontrollieren Sie Blutungen mit Wattestäbchen.
  7. Legen Sie die Nackenmuskulatur frei und schneiden Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette entlang der Mittellinie ein und trennen Sie sie. Verwenden Sie zwei gebogene Pinzetten, eine in jeder Hand, um die Muskeln sanft zurückzuziehen und die Dura mater freizulegen, die die äußere Begrenzung der Cisterna magna bildet.
  8. Passen Sie die Kopfposition an, indem Sie ihn nach unten neigen, um einen 150°-Winkel mit dem Körper zu bilden, um die Cisterna magna optimal zu belichten.
  9. Machen Sie einen 5-mm-Schnitt entlang der sagittalen Naht, der sowohl die Lambda- als auch die Bregma-Punkte abdeckt. Ziehen Sie mit zwei gebogenen Pinzetten die Haut vorsichtig zur Seite und reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass keine Haare auf dem freiliegenden Schädel zurückbleiben.
  10. Tragen Sie nach der Reinigung mit Wattestäbchen eine Schicht Ultraschallgel mit einer Dicke von ~1 mm auf den freiliegenden Schädel auf, um die Feuchtigkeit in dem Bereich zu halten. Da Ultraschallgel Luftblasen enthalten kann, stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen vor der Bildgebung entfernt werden.
  11. Positionieren Sie die Maus unter der Linse des Laser-Speckle-Kontrastbildsystems. Schalten Sie das System und die zugehörige Software ein. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn der Maus innerhalb des Bildgebungsfelds zentriert ist, und verwenden Sie dann die Autofokus-Funktion, um den richtigen Fokus für die Bildgebung zu erzielen. Entfernen Sie bei Bedarf vorsichtig mit einer Pinzette verbleibende Haare oder Luftblasen aus dem Bildfeld.

3. Aufbau der Nanoinjektion

  1. Befestigen Sie die Pumpe am stereotaktischen Manipulatorarm und verbinden Sie das Kabel mit der Steuerung. Schalten Sie den Controller ein und wählen Sie die Zielpumpe aus. Stellen Sie in der Systemsteuerung DIRECTION auf INFUSE ein. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 2 μl pro Minute und das Volumen auf 4,5 μl ein.
    HINWEIS: Das Nanoinjektionssystem besteht aus zwei Hauptkomponenten: der Einspritzpumpe und der Steuerung. Jede Steuerung kann zwei Pumpen gleichzeitig betreiben. Für die ICM-Injektion verwenden wir nur eine Pumpe.
  2. Nachdem der INFUSE fertig ist, nehmen Sie eine Glaspipette aus dem Behälter und füllen Sie sie mit einer flexiblen 34-G-MicroFil-Nadel oder einem ähnlichen Nadeltyp mit farblosem, geruchlosem Mineralöl. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Glaspipette mit Öl gefüllt ist.
  3. Schrauben Sie die Spannzange der Pumpe ab, setzen Sie die Glaspipette ein und ziehen Sie die Spannzange fest. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Glaspipette befinden.
  4. Ändern Sie die RICHTUNG in der Systemsteuerung für WITHDRAW. Stellen Sie die Drehzahl auf 2 μ L/min und die Lautstärke auf 4,5 μ ein.
  5. Bewegen Sie den stereotaktischen Arm, um die Pipette vorsichtig in die vorbereitete Lösung einzuführen und das gewünschte Volumen zu entnehmen.

4. Injektion von Vasodilatatoren in die Cisterna magna und Überwachung der CBF

  1. Stellen Sie sicher, dass die Pumpe sicher am stereotaktischen Manipulatorarm befestigt ist. Stellen Sie den Winkel des stereotaktischen Manipulatorarms auf 45° in der anterior-posterioren Ebene ein.
  2. Mit einer gebogenen Pinzette unter dem Präpariermikroskop die Cisterna magna vorsichtig freilegen. Reinigen Sie den Bereich mit Kochsalzlösung, um jegliches Blut zu entfernen. Verwenden Sie den stereotaktischen Mikromanipulator, um die Glaspipette in der Nähe der Dura mater der Cisterna magna zu positionieren.
  3. Sobald die Glaspipette die Dura berührt, manövrieren Sie sie vorsichtig in das Zentrum der Cisterna magna und vermeiden Sie ein Eindringen in das Kleinhirn oder die Medulla. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Glaspipette bis zu einer Tiefe von 1-2 mm eingeführt ist, bevor Sie die Pinzette loslassen.
    HINWEIS: Ein digitaler stereotaktischer Rahmen ist unerlässlich, um die Eindringtiefe der Glaspipette in die Cisterna magna zu überwachen.
  4. Ändern Sie die RICHTUNG in der Systemsteuerung in INFUSE. Stellen Sie die Injektionsgeschwindigkeit auf 300 nL/min und das Volumen auf 1,5 μL ein.
  5. Starten Sie die Software für die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) und passen Sie den Fokus an, um ein möglichst klares Bild der Blutgefäße zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass sich keine Haare oder Luftblasen im Sichtfeld befinden.
  6. Stellen Sie das Imaging-Intervall in der LSCI-Systemsteuerung auf 5 s ein. Zeichnen Sie den CBF-Ausgangswert etwa 10 Minuten lang auf und stellen Sie sicher, dass der Ausgangswert stabil bleibt. Wenn es Schwankungen in der Basislinie gibt, setzen Sie die Aufzeichnung für einen längeren Zeitraum fort, bis die Stabilität erreicht ist.
  7. Nach 10 Minuten stabiler Baseline-Aufzeichnung initiieren Sie die Nanoinjektion und notieren Sie die Startzeit der Injektion im LSCI-Aufzeichnungssystem. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, markieren Sie die Endzeit und setzen Sie die Aufzeichnung für weitere 20 Minuten oder länger fort. Nach Abschluss des Experiments wird die transkardiale Perfusion der Mäuse mit PBS durchgeführt und Hirngewebe für die histologische Analyse entnommen.

Ergebnisse

Nach Abschluss der Operation befestigten wir die Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit einer digitalen Anzeige (Abbildung 1A,B). Für die Messung des zerebralen Blutflusses (CBF) zogen wir die Haut über dem Schädel nach dem Schnitt vorsichtig auseinander und trugen ein transparentes Ultraschallgel auf, um die Feuchtigkeit auf der Schädeloberfläche zu halten (Abbildung 1C). Um die intrazisternale Magna (ICM)-Injektion zu erleichtern, präparierten wir die Halsmuskulatur um den Hinterhauptkamm, um die Cisterna magna freizulegen. Danach entnahmen wir die Ziellösung mit einer Glaspipette und führten die Glaspipette mit dem Mikromanipulator so, dass sie die Membranen der Cisterna magna bis zu einer Tiefe von 1-2 mm durchdringte (Abbildung 1D,E). Der stereotaktische Arm wurde in einem Winkel von 45° geneigt, um das Einführen zu erleichtern.

Als nächstes untersuchten wir die dynamischen CBF-Veränderungen als Reaktion auf drei verschiedene Vasodilatatoren: (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG), Acetylcholin und Adenosin 22,23,24,25. Wir zeichneten zunächst einen 10-minütigen Ausgangswert auf, bevor wir 1,5 μl jedes Vasodilatators mit einer Geschwindigkeit von 300 nL/min über 5 Minuten injizierten. Nach der Injektion zeichneten wir weitere 20 Minuten Daten auf. Unsere Ergebnisse zeigten, dass alle drei Vasodilatatoren die CBF erhöhten, wenn auch mit unterschiedlicher Dynamik. DHPG induzierte einen starken Anstieg des CBF, gefolgt von einem allmählichen Rückgang nach der Injektion (Abbildung 2A,B). Im Gegensatz dazu führte Acetylcholin während des gesamten Aufzeichnungszeitraums zu einem allmählichen Anstieg der CBF (Abbildung 2C,D). Adenosin führte auch zu einem vorübergehenden Anstieg des CBF, der etwa 15-20 Minuten nach der Injektion auf das Ausgangsniveau zurückkehrte (Abbildung 2E, F).

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Abbildung 1: Zusammenfassung der chirurgischen Verfahren. (A) Schritt-für-Schritt-Anleitung der wichtigsten chirurgischen Verfahren für die Nanoinjektion + LSCI-Modell. (B) Schaltpläne, die das kombinierte Nanoinjektion + LSCI-System zeigen. Der Nanoinjektor ist stabil auf dem stereotaktischen Arm fixiert und der Arm ist um 45° geneigt, um die Penetration der Atlanto-Occipitalmembran in der Cisterna magna zu erleichtern. (C) Draufsicht auf den Schädel der Maus unter dem LSCI-System. Der Schädel wird mit Ultraschallgel bedeckt. (D) Rückansicht der Glaspipette, die in die zisternale Magna eindringt. Die Glaspipette wurde mit Evans-Blau gefüllt, um die Visualisierung zu erleichtern. Verwenden Sie für dieses Experiment den digitalen stereotaktischen Rahmen, damit die Eindringstrecke genau quantifiziert werden kann. (E) Schematische Darstellungen der Position der Glaspipettenspitze in der zisternalen Magna. Der Kopf der Maus wurde um 30° geneigt, um die zisternale Magna-Injektion zu erleichtern. Abkürzung: LCSI = Laser Speckle Contrast Imaging. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Erhöhter zerebraler Blutfluss nach Nanoinjektion von Vasodilatatoren. (A) Repräsentative Bilder, die Veränderungen des zerebralen Blutflusses vor und nach der DHPG-Injektion zeigen. Die Blutgeschwindigkeit ist farbcodiert. Blau steht für niedrige Geschwindigkeit und Rot für hohe Geschwindigkeit. (B) Echtzeit-Blutfluss in dem Bereich, der mit einer roten Linie markiert ist, die das Zeitfenster für die DHPG-Injektion anzeigt. (C) Repräsentative Bilder, die Veränderungen des zerebralen Blutflusses vor und nach der ACh-Injektion zeigen. Die Blutgeschwindigkeit ist farbcodiert. Blau und Rot stehen für niedrige bzw. hohe Geschwindigkeiten. (D) Echtzeit-Blutfluss in dem Bereich, der durch die rote Linie markiert ist, die das Zeitfenster für die ACh-Injektion anzeigt. (E) Repräsentative Bilder, die Veränderungen des zerebralen Blutflusses vor und nach der Adenosin-Injektion zeigen. Die Blutgeschwindigkeit ist farbcodiert. Blau und Rot stehen für niedrige bzw. hohe Geschwindigkeiten. (F) Echtzeit-Blutfluss in dem Bereich, der durch die rote Linie markiert ist, die das Zeitfenster für die Adenosin-Injektion anzeigt. Abkürzungen: DHPG = (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin; ACh = Acetylcholin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Wir stellen eine neuartige Methode zur Untersuchung der Regulation des zerebralen Blutflusses (CBF) in vivo vor, indem wir präzise zisternale Magna-Nanoinjektion mit Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung (LSCI) kombinieren. Dieser Ansatz ermöglicht eine genaue Verabreichung von Medikamenten in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (CSF) und ermöglicht gleichzeitig eine Echtzeitüberwachung der CBF, was die Beurteilung der zerebralen Gefäßreaktivität erleichtert.

Pharmakologische Manipulations- und Verabreichungstechniken sind entscheidend für die Untersuchung von CBF und zerebraler Gefäßreaktivität in vivo. Traditionelle Methoden zur Anwendung von Medikamenten, wie die Verwendung von Vasodilatatoren oder Konstriktoren, erfordern oft die Entfernung des Schädels, was die Leptomeninge und sogar das Hirnparenchym schädigen kann 9,10,18. Diese invasiven Techniken können die Mikroumgebung des Gehirns stören, insbesondere indem sie Gefäßschäden und Blutungen verursachen, wodurch die tatsächlichen physiologischen Bedingungen nicht repliziert werden können. Im Gegensatz dazu bietet unsere Methode vier wesentliche Vorteile.

Erstens ist unser Ansatz für die Anwendung von Medikamenten nicht-invasiv und bewahrt die physiologischen Bedingungen. Zweitens beruhen klassische ICM-Injektionsmethoden in der Regel auf Spritzen oder Kanülen, was aufgrund der Größe der Spitzen zum Austreten von Medikamenten oder Spuren und Liquor führen kann. Diese traditionellen Methoden erfordern oft große Mengen an Medikamenten oder Spuren - in der Regel 5 μl oder mehr, die den Hirndruck verändern können. Im Gegensatz dazu benötigt unsere nanoinjektorgeführte ICM-Injektion nur ein geringes Volumen von nur 1,5 μl oder weniger. Darüber hinaus kann die Einspritzgeschwindigkeit über einen weiten Bereich von 1 nL/s bis 100 nL/s präzise gesteuert werden. In der Regel verwenden wir eine Geschwindigkeit von 5 nL/s (300 nL/min), da diese Rate den intrakraniellen Druck nicht beeinflusst. Drittens folgt unsere auf zisternalen Magna-Injektionen basierende Medikamentenverabreichung im Gegensatz zu pipettengesteuerten Medikamenteninjektionen in das Hirnparenchym oder der Arzneimittelperfusion auf der kortikalen Oberfläche dem natürlichen Fluss des Liquors und ahmt die physiologischen Bedingungen genau nach. Da unsere Methode die Integrität des Schädels und der Hirnhäute bewahrt, können wir Messungen an derselben Gruppe von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten durchführen, was Längsschnittvergleiche ermöglicht - etwas, das mit anderen Methoden zur Verabreichung von Medikamenten nicht möglich ist. Für Überlebensstudien und Längsschnittvergleiche müssen strenge aseptische Techniken befolgt werden, einschließlich der ordnungsgemäßen Vorbereitung der Haut, der Verwendung steriler Instrumente und Materialien und der Einhaltung der Richtlinien für die Tierhaltung in Einrichtungen. Für die Wundheilung sollte eine zweiwöchige Erholungsphase eingeplant werden.

Die Methode der Anästhesie kann den CBF erheblich beeinflussen. Zum Beispiel kann eine Ketamin-Xylazin-Anästhesie den CBF-Spiegel um über 50 % über den Ausgangswert anheben, während Isofluran den basalen CBF-Spiegel verdoppeln kann. In unseren Experimenten haben wir uns für Urethan und Chloralose entschieden, da sie nur minimale Auswirkungen auf das Herz-Kreislauf-System haben, was zur Aufrechterhaltung des physiologischen CBF-Spiegels beiträgt, wie er in der Praxis üblich ist26,27. Darüber hinaus haben wir die intraarterielle Kanülierung zugunsten einer wiederholten Blutgasmessung übersprungen, um nicht-invasiv zu sein, obwohl solche Verfahren mit unserer Methode kombiniert werden können26.

Unser Ansatz integriert zwei Systeme: das Nanoinjektions-basierte ICM-Injektionssystem28 und das Laser Speckle Contrast Imaging (LSCI)-System29. Die Experimentatoren müssen in beiden Systemen geschult sein, um das Verfahren erfolgreich durchführen zu können. Da das LSCI-System den gesamten Platz über dem Kopf der Maus einnimmt, erleichtert die Neigung des Arms um 45Grad nicht nur die ICM-Injektion, sondern gewährleistet auch die Kompatibilität zwischen den beiden Systemen. Dieser Aufbau ist entscheidend für den Erfolg des Experiments.

Für Anfänger, die die Nanoinjektor-geführte ICM-Injektion anwenden, ist umfangreiche Übung erforderlich, um die Koordination des Trennens der Muskeln mit einer Pinzette in einer Hand zu beherrschen, während der Mikromanipulator zur Führung der Glaspipette mit der anderen Hand manövriert wird. Ein gutes Laserlicht und ein Gelenkarm-Stereomikroskop sind für eine optimale Visualisierung während des Eingriffs unerlässlich.

Mit dieser Methode untersuchten wir, wie klassische Vasodilatatoren wie DHPG, Acetylcholin und Adenosin CBF beeinflussen. Wie erwartet, erhöhten alle drei Vasodilatatoren die CBF; Sie induzierten jedoch unterschiedliche Dynamiken. DHPG verursachte einen starken Anstieg des CBF, gefolgt von einem langsamen Zerfall, während Acetylcholin einen allmählichen Anstieg auslöste. Im Gegensatz dazu führte Adenosin nur zu einem vorübergehenden Anstieg des CBF.

Diese Methode sollte auch auf Rattenmodelle anwendbar sein. Da die Dicke des Rattenschädels jedoch etwa 0,5-1 mm beträgt, muss er für die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung verdünnt werden. Darüber hinaus kann die derzeitige Methode zwar für kopffixierte, wache Mäuse angepasst werden, erfordert jedoch umfangreiches Training, um die Bewegungen der Tiere während der Experimente zu minimieren. Wir verwendeten eine begrenzte Anzahl von Mäusen, um unsere Methode zu demonstrieren; Daher ist unsere Studie statistisch begrenzt und es ist Vorsicht geboten, wenn aus unseren Ergebnissen allgemeine Schlussfolgerungen gezogen werden.

Für konsistente und zuverlässige CBF-Messungen ist es für die Experimentatoren wichtig zu erkennen, dass andere physiologische Parameter wie Körpertemperatur, Blutdruck und CO2 -Spiegel eine entscheidende Rolle bei einer umfassenden physiologischen Bewertung spielen und in zukünftigen Studien sorgfältig berücksichtigt werden sollten. Zusammenfassend stellen wir eine neue in vivo Methode zur Untersuchung der CBF-Regulation bei Mäusen vor. Dieser Ansatz ist präzise und minimalinvasiv und eignet sich daher gut für die Untersuchung der medikamenteninduzierten CBF-Dynamik.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(RS)-3,5-DihydroxyphenylglycinTocrisKat. Nr. 0342
AcetylcholinchloridSigmaA6625-25G
AdenosinSigmaA9251-25G
Alkoholtupfer 70% IsopropylalkoholVitrex Medical A/S520213
AmScope SM-8T Serie Gelenkarm Zoom StereomikroskopAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic Klares Ultraschall-ÜbertragungsgelAquasonicGelPLI 03-50
Digital Mouse StereotaxicInstruments Stoelting51730D
EthylalkoholSigma459836-2L
Fiber-Lite DC950 IlluminatorDolan-Jenner IndustriesDC950H
Glasersatz 1,14 MMWorld Precision Instruments504949
Kimtech Science Präzisionstücher GewebewischerKimberly Clark Professional5511
Laser Speckle Contrast Imagermoor instrumentsMOORFLPI-2
Lasik Augenspeer (100 pro Koffer) hospeqBV40815
MICROFIL FLEXIBLE NADELWorld Precision InstrumentsMF34G-5
MineralölSigmaM5904
Maus HeizkissenFisher scientific50-195-4000
Nair Kakaobutter Haarentferner LotionAmazonASIN ‏ : ‎
NANOLITER 2020 INJEKTORWorld Precision InstrumentsNANOLITER2020
P-2000 MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-2000
Puritan® Tupfer, Wattekopf, Holzschaft,Puritan Medical806-WC
Steriles AugengleitmittelMedi-Vet11897
UrethanSigmaU2500
Vetbond GewebekleberWorld Precision InstrumentsVETBOND
α-ChloraloseSigma23120
B000GCW5CS

Referenzen

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