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Methodenartikel

Ein nicht-viraler Ansatz zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen unter Verwendung von mRNA für die Krebsimmuntherapie

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DOI:

10.3791/67548

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21. Februar 2025

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1ProMab Biotechnologies

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen unter Verwendung von nicht-integrierender mRNA für die Krebsimmuntherapie und bietet zuverlässige Methoden zur Bewertung von CAR-T-Zellen und ihrer zytotoxischen Funktion.

Zusammenfassung

Die T-Zelltherapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) hat sich zu einer bahnbrechenden Krebsbehandlung entwickelt und erzielte beispiellose Erfolge bei der Behandlung bestimmter hämatologischer Malignome wie Lymphome und Leukämien. Da jedoch immer mehr Krebspatienten CAR-T-Zelltherapien erhalten, werden zunehmend behandlungsassoziierte sekundäre Malignome berichtet, die zum Teil auf unerwartete CAR-Transgen-Insertion zurückzuführen sind, was ernsthafte Sicherheitsbedenken aufwirft. Um dieses Problem zu lösen, beschreiben wir hier einen nicht-viralen, nicht-integrierenden Ansatz zur Erzeugung transienter CAR-T-Zellen mit mRNA. Wir elektroporierten T-Zellen mit modifizierter mRNA, die für ein humanes epidermales Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)-spezifisches CAR kodiert, und erzeugten transiente HER2-gerichtete CAR-T-Zellen. Die CAR wurde 1 Tag nach der Elektroporation effizient auf der T-Zelloberfläche exprimiert, stieg bis zum zweiten Tag an und sank bis zum 5. Tag dramatisch ab. Die transienten CAR-T-Zellen zeigten eine starke Zytotoxizität gegen HER2-positive SKOV-3-Eierstockkrebszellen und sezernierten hohe Spiegel von IFN-Υ. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entwicklung kleiner transienter CAR-T-Zellen ohne permanente CAR-Transgen-Integration und beschreibt detaillierte Verfahren für die Präparation von CAR-mRNA, die Aktivierung und Transfektion von T-Zellen, die Bewertung der CAR-Expression und die In-vitro-Analyse der CAR-T-Zellfunktion. Diese Methode eignet sich sowohl in präklinischen als auch in klinischen Studien für die transiente Erzeugung von CAR-T-Zellen.

Einleitung

Krebs ist eine immer wichtigere Bedrohung für die menschliche Gesundheit, mit jährlich schätzungsweise 23,6 Millionen neu diagnostizierten Fällen und 10 Millionen Todesfällen weltweit1. Die chirurgische Behandlung in Kombination mit Bestrahlung und Chemotherapie ist nach wie vor der Goldstandard in der Behandlung verschiedener Arten von lokalisierten nicht-invasiven und invasiven Krebsarten 2,3,4. Obwohl die traditionelle systematische Behandlung bei der Behandlung von Krebserkrankungen im Frühstadium enorme Erfolge erzielt hat, ist sie sehr toxisch und hat nur eine begrenzte Wirkung auf metastasierende und hämatologische Krebserkrankungen5. Patienten mit diesen Krebsarten werden häufig behandelt und ertragen eine erhebliche Toxizität in der Hoffnung, das Fortschreiten der Krankheit zu stabilisieren und zu verzögern. Die T-Zelltherapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) hat sich in jüngster Zeit als revolutionäre zielgerichtete Therapie erwiesen, die eine starke Wirksamkeit bei hämatologischen B-Zell-Krebserkrankungen zeigt und diesen verzweifelten Patienten Hoffnung gibt6.

CAR-T-Zellen sind manipulierte T-Lymphozyten, die auf der Zelloberfläche ein CAR exprimieren, das spezifisch tumorassoziierte Antigene (TAAs) erkennt und die Zellen aktiviert, ohne dass eine antigene Präsentation von Haupthistokompatibilitätskomplexproteinen (MHCs) erforderlich ist7. Bei der Aktivierung sezernieren die CAR-T-Zellen eine Reihe von Zytokinen und lysieren Tumorzellen unabhängig von MHCs, wodurch die Zerstörung von Tumoren verbessert wird, selbst wenn MHCs aufgrund der immunsuppressiven Tumormikroumgebung herunterreguliert oder verloren gehen 8,9. CARs bestehen aus mindestens drei verschiedenen Domänen – einer extrazellulären Einzelkettenfragmentvariante (scFv), die die antigenerkennenden variablen Regionen eines TAA-spezifischen Antikörpers enthält, einer Transmembrandomäne, die das CAR an der Zelloberfläche verankert, und einer intrazellulären Domäne, die die Rekrutierung von Adapterproteinen und die nachgeschaltete Signalübertragung vermittelt10. Basierend auf Variationen in den intrazellulären Domänen haben sich die CAR-Strukturen bisher über fünf Generationen entwickelt, wobei die erste Generation nur die CD3ζ-Aktivierungsdomäne enthält und die nachfolgenden Generationen eine oder mehrere zusätzliche kostimulatorische Domänen von Molekülen wie 4-1BB und CD28besitzen 11. Diese intrazellulären Domänen beeinflussen die Signalgebungsmechanismen, die Proliferation, das Überleben und die Toxizität der CAR-T-Zellen, die zusammen die klinische Wirksamkeit von Antitumoren bestimmen. Der klinische Erfolg der CAR-T-Zelltherapie beruht auf CAR-T-Zellen der zweiten Generation, die spezifisch auf CD19 abzielen, einen Biomarker, der auf Zellen der B-Linie stark exprimiert wird, zur Behandlung von B-Zell-Leukämien und Lymphomen12,13. Bisher hat die Food and Drug Administration (FDA) sechs CAR-T-Zelltherapien der zweiten Generation zugelassen, die entweder auf CD-19 oder das B-Zell-Reifungsantigen (BCMA) bei rezidivierten oder refraktären hämatologischen Malignomen abzielen, einschließlich des großzelligen B-Zell-Lymphoms, des Mantelzell-Lymphoms und des multiplen Myeloms 6. Die neueren Generationen von CAR-T-Zellen durchlaufen derzeit intensive präklinische und klinische Studien14,15.

Die klinische Herstellung von CAR-T-Zellen ist ein komplexer, teurer und zeitaufwändiger Prozess. Derzeit stammen die Leukozyten, die für die Herstellung von CAR-T-Zellen verwendet werden, von den Patienten selbst, um allogene Reaktionen zu vermeiden, obwohl sich von Spendern stammende universelle (oder handelsübliche) CAR-T-Zellen in aktiver Entwicklung und klinischer Bewertung befinden16. Nach der Isolierung der Leukozyten aus dem peripheren Blut des Patienten durch Leukapherese wird ein fremdes Genfragment, das für das CAR kodiert, entweder mit viralen oder nichtviralen Ansätzen in die aktivierten T-Zellen eingeführt 17,18,19. Retroviren und Lentiviren sind die gebräuchlichsten viralen Vektoren für den CAR-Gentransfer, was zu einer zufälligen und dauerhaften Integration der CAR-kodierenden DNA in das T-Zell-Genom führt20. Nichtvirale Ansätze, einschließlich mRNA-Lipid-Nanopartikel, Transposon-Systeme und CRISPR/Cas9-Genomeditierung, sind weniger verbreitet21. Anschließend werden die CAR-exprimierenden T-Zellen ex vivo in großem Maßstab vermehrt und dann gesammelt und den Patienten wieder infundiert22,23. Die Herstellung von viralen Vektoren, die den strengen GMP-Standards (Good Manufacturing Practice) entsprechen, ist sehr schwierig, komplex und kostspielig und stellt eine erhebliche Belastung für Hersteller, Zulassungsbehörden und Patienten dar, wodurch die breite klinische Anwendung eingeschränkt wird.

Trotz des aufregenden Erfolgs der CAR-T-Therapie gibt es wachsende Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit. Aufgrund der zufälligen Natur der Integration von CAR-Transgenen in das T-Zell-Genom während der Virus- oder Transposontransduktion kann es zu einer Störung von Tumorsuppressorgenen oder einer Aktivierung von Onkogenen kommen, was zu einer malignen Transformation der T-Zellen führt24,25. Seit der Zulassung des ersten CAR-T-Zelltherapieprodukts durch die FDA im Jahr 2017 zeigen Folgestudien, dass bis zu 15 % der Patienten, die die Therapie erhalten, sekundäre primäre Malignome (SPMs) wie T-Zell-Lymphom (TCL), nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) und Hautkrebs entwickeln 26,27,28,29. Auffallend ist, dass CAR-Transgene in einigen SPMs in hohem Maße nachgewiesen wurden30,31, und einige Fälle von TCL wurden direkt durch eine abnormale Expansion der CAR-T-Zellen verursacht 24,32,33, was auf eine direkte Rolle der CAR-T-Produkte bei der Induktion einiger SPMs hinweist. Andere Studien identifizierten außerdem CAR-Transgen-Insertionen in kritischen Genen wie TET234, JAK135 und PBX236 in den SPM-Tumorzellen. Angesichts der zunehmenden Evidenz von T-Zell-Malignomen nach CAR-T-Zelltherapie kam die FDA kürzlich zu dem Schluss, dass für alle derzeit zugelassenen CD19-gerichteten und BCMA-gerichteten CAR-T-Zelltherapien eine Warnung erforderlich ist, die auf ein ernsthaftes Risiko von T-Zell-Malignität hinweist37. Studien mit großen Kohorten, die den Langzeitwirkungen der CAR-T-Behandlung folgten, berichten jedoch von einer Inzidenz von SPMs zwischen 3,8 % und 15 % bei behandelten Patienten 26,27,28,38,39. Die Inzidenz ist nicht signifikant höher als bei Blutkrebspatienten, die eine traditionelle systematische Behandlung erhalten40,41, was auf ein relativ sicheres Profil für die CAR-T-Zelltherapie hindeutet. Nichtsdestotrotz besteht ein dringender Bedarf, sichere und wirksame CAR-T-Zellen zu entwickeln, die das Risiko von SPMs durch kostengünstigere Ansätze minimieren.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für einen nicht-viralen, nicht-integrierenden Ansatz zur Erzeugung von CAR-T-Zellen. Ziel ist es, eine einfache Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung kleiner, effektiver CAR-T-Zellen mit transienter CAR-Expression bereitzustellen, um eine Insertionsmutagenese zu vermeiden und das Risiko von SPMs zu minimieren. Wir zeigen, dass die Elektroporation von T-Zellen mit modifizierter mRNA, die für ein CAR kodiert, das spezifisch für TAA HER2 ist, zu einer robusten und transienten Expression des Anti-HER2-CAR auf der T-Zelloberfläche führte. Während der Expression des CAR töteten die T-Zellen HER2-positive Tumorzellen stark ab und sezernierten einen hohen Spiegel an IFN-Υ. Das Protokoll wird in vier separaten, aber kontinuierlichen Abschnitten beschrieben, die die Vorbereitung von CAR-mRNA, die Aktivierung und Elektroporation von T-Zellen, die Bewertung der CAR-Expression und die Analyse der CAR-T-Zellfunktion umfassen. Dieser Ansatz eignet sich für die Entwicklung und Herstellung transienter CAR-T-Zellen sowohl für die akademische Forschung als auch für klinische Zelltherapien.

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Protokoll

Die hier verwendeten PBMCs wurden zuvor aus Vollblut aus dem Stanford Hospital Blood Center gemäß dem vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll (13942) unter Verwendung des vor42 beschriebenen Ficoll-Paque-Dichtegradienten isoliert. Die Einverständniserklärung der Teilnehmer war nicht anwendbar, da das Blut, das wir zur Entnahme der PBMCs verwendeten, kommerziell vom Stanford Hospital Blood Center bezogen wurde.

1. Herstellung von CAR-mRNA

  1. Vorbereitung der Vorlage
    HINWEIS: Entweder ein linearisiertes Plasmid oder ein PCR-Fragment können als Template für die Synthese von CAR-mRNA in vitro dienen, vorausgesetzt, sie enthalten einen geeigneten 5'-SP6- oder T7-Promotor, eine 5'-untranslatierte Region (UTR), ein CAR-Transgen und eine 3'UTR mit einem geeigneten Poly(A)-Schwanz. In dieser Studie verwendeten wir ein CAR-Plasmid-DNA-Konstrukt, das einen SP6-Promotor, ein kurzes humanes Beta-Globin 5'UTR, ein CAR-Transgen und ein 3'UTR enthielt, das aus zwei Tandem-Beta-Globin-3'UTRs bestand, gefolgt von einem 112-bp-Poly(A)-Schwanz43. Die UTRs, die kodierende Sequenz und der Poly(A)-Schwanz beeinflussen die RNA-Stabilität und die Translationseffizienz 43,44,45. Es wurde gezeigt, dass ein Poly(A)-Schwanz von 120 bp die Proteinausbeute in Zellkultur im Vergleich zu kürzeren Poly(A)-Schwänzen erhöht43.
    1. Bereiten Sie die Plasmid-DNA des CAR-Konstrukts mit einem Plasmidvorbereitungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Hochwertige Plasmid-DNA ist essentiell für die Erzeugung einer hohen Ausbeute an CAR-mRNA.
    2. Linearisieren Sie die CAR-Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BglII. Wählen Sie ein Restriktionsenzym, das nach dem Poly(A)-Schwanz schneidet, vorzugsweise in der Nähe des Endes des Poly(A)-Schwanzes. 10 μg (oder 10.000 ng) des mit einem Spektralphotometer quantifizierten Plasmids werden in einem 100-μl-Reaktionsgemisch mit 10 μl des Enzyms, 10 μl Aufschlusspuffer und nukleasefreiem Wasser über Nacht bei 37 °C aufgeschlossen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Restriktionsenzym nicht in das CAR-Transgen und seine flankierenden Promotor-, UTR- und Poly(A)-Schwanzsequenzen schneidet. Eine vollständige Linearisierung des CAR-Plasmids ist für eine effiziente CAR-mRNA-Transkription erforderlich.
    3. 200 μg/ml Protease K und 0,5 % w/v SDS in die Aufschlussmischung geben und 1 h bei 50 °C inkubieren.
    4. Reinigen Sie die linearisierte CAR-Plasmid-DNA. Geben Sie ein gleiches Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1, v/v) zur Aufschlussreaktion. Etwa 15 s lang kräftig vortexen. Die Probe wird in einer Tischzentrifuge 5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur (RT) gedreht.
    5. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht, die die DNA enthält, in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie die Übertragung einer der mittleren und unteren Schichten, die Protein- und Phenolverunreinigungen enthalten. Führen Sie eine zweite Extraktionsrunde mit Chloroform durch, um Verunreinigungen zu reduzieren.
    6. 1/10Volumen 7,5 M Ammoniumacetat oder 3 M Natriumacetat zugeben und vorsichtig mischen. Fügen Sie 2,5 Volumen Ethanol hinzu, um die DNA auszufällen. Lagern Sie die Probe mindestens 30 Minuten lang bei -20 °C.
    7. Schleudern Sie die Probe 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C, um die DNA zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig. Fügen Sie 500 μl 70%iges Ethanol hinzu, um das DNA-Pellet zu waschen.
    8. Die Probe nochmals 2 min bei 4 °C schleudern. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Lassen Sie eine kleine Menge Lösung in der Tube.
    9. Wiederholen Sie den Schleudervorgang für 2 min bei 4°C. Entfernen Sie vorsichtig den restlichen Überstand. Trocknen Sie das DNA-Pellet bei RT etwa 10 Minuten lang in einer sterilen Haube an der Luft, bis am Boden des Röhrchens keine Ethanollösung mehr sichtbar ist.
      HINWEIS: Vermeiden Sie ein Übertrocknen des DNA-Pellets, da es schwierig sein kann, es aufzulösen.
    10. Fügen Sie 20 μl nukleasefreies Wasser hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die DNA aufzulösen. Zentrifugieren Sie die Probe kurz bei maximaler Drehzahl. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
    11. Lagern Sie die Probe für den sofortigen Gebrauch auf Eis oder für die zukünftige Verwendung bei -20 °C. Laden Sie 100 ng der gereinigten DNA auf ein Agarosegel und überprüfen Sie die Größe und Unversehrtheit. Die DNA sollte als einzelne, eindeutige Bande der erwarteten Größe erscheinen. Es sollten keine zusätzlichen oder verschmierten Bänder beobachtet werden.
      HINWEIS: Die Qualität der Matrizen-DNA ist entscheidend für eine effiziente mRNA-Transkription. Vermeiden Sie die Verwendung von unreiner, fragmentierter und abgebauter DNA als Vorlage für die mRNA-Transkription.
  2. In-vitro-Transkription (IVT)
    1. Synthetisieren Sie die CAR-mRNA in vitro. Achten Sie darauf, während des gesamten Eingriffs nukleasefreie Reagenzien, Röhrchen und Pipettenspitzen zu verwenden.
    2. Tauen Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien bis RT auf, mit Ausnahme des SP6-RNA-Polymerase-Gemisches, das bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden sollte. Die Transkriptionsreaktion wird in der in Tabelle 1 gezeigten Reihenfolge bei RT vorbereitet. Vorsichtig mischen und mindestens 2 Stunden lang bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Reaktion kann je nach benötigter mRNA-Menge nach oben oder unten skaliert werden. Die oben gezeigte Reaktion ergibt typischerweise mindestens 100 μg (oder 100.000 ng) gedeckelte mRNA, wenn hochwertige Matrizen-DNA verwendet wird. Eine längere Inkubation, d. h. über Nacht, kann die mRNA-Ausbeute erhöhen.
    3. 2 μl RNase-freie DNase I zur Reaktion hinzufügen, vorsichtig mischen und 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, um die Matrizen-DNA abzubauen.
    4. Aufreinigen Sie die transkribierte CAR-mRNA mit einem RNA-Cleanup-Kit (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie die Anweisungen des Kit-Herstellers für die Reinigung. Eluieren Sie die mRNA in nukleasefreiem Wasser.
      HINWEIS: Die mRNA kann auch mit der oben gezeigten Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode (Schritt 1.1.4) aufgereinigt werden.
    5. Messen Sie die mRNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Laden Sie mindestens 200 ng der mRNA auf ein Agarosegel und überprüfen Sie dessen Größe und Integrität. Die mRNA sollte als dominante Bande der erwarteten Größe erscheinen, ohne zusätzliche oder verschmierte Banden. Lagern Sie die mRNA bis zur Verwendung bei -80 °C.

2. Aktivierung und Elektroporation der T-Zelle

  1. 1 x 106 kryokonservierte mononukleäre Zellen (PBMCs) des humanen peripheren Blutes werden in 1 ml CAR-T-Medium suspendiert (AIM-V-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin/Streptomycin und 10 ng/ml humanem rekombinantem IL-2). Aktivieren Sie die T-Zellen mit der gleichen Anzahl vorgewaschener humaner T-Aktivator CD3/CD28-Kügelchen (siehe Materialtabelle). Kultivieren und expandieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 für mehrere Tage.
    HINWEIS: Die Anzahl der PBMCs kann basierend auf der Anzahl der T-Zellen, die für nachfolgende Experimente benötigt werden, nach oben oder unten skaliert werden.
  2. Auftauen der vorbereiteten CAR-mRNA auf Eis. Geben Sie 1 ml CAR-T-Medium pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer 12-Well-Platte und äquilibrieren Sie das Medium, indem Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator stellen.
  3. Übertragen Sie 5 x 106 T-Zellen in ein steriles Röhrchen und entfernen Sie die Kügelchen, indem Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer setzen und die Zellsuspension vorsichtig in ein neues Röhrchen pipettieren.
  4. Das Röhrchen wird bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1 ml sterilem PBS resuspendiert.
  5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 200 μl Neonpuffer T resuspendieren (siehe Materialtabelle).
  6. 100 μl Zellen werden in ein neues Röhrchen pipetiert und 5 μg (oder 5.000 ng) CAR-mRNA in die Zellen gegeben46. Den Neonpuffer T auf insgesamt 125 μl ergänzen und durch Auf- und Abpipettieren mischen.
    HINWEIS: Die Menge an CAR-mRNA, die durch Elektroporation transfiziert werden soll, kann auf bis zu 8 μg (oder 8.000 ng) pro 1 x 106 T-Zellen erhöht werden, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen negativ zu beeinflussen, und eine höhere Menge an mRNA kann zu einer erhöhten CAR-Expression führen46.
  7. Fügen Sie 25 μl Neonpuffer T zu den restlichen 100 μl Zellen hinzu. Dies dient als Negativkontrolle.
  8. Elektroporate die T-Zellen. Verwenden Sie die Neon-Pipette, um das T-Zellen/CAR-mRNA-Gemisch oder die negativen Kontroll-T-Zellen in eine Neon 100 μL-Spitze zu aspirieren und die Zellen mit einem 10 ms Impuls von 1800 V zu elektropolieren.
  9. Die Zellen werden nach der Elektroporation sofort in das äquilibrierte Kulturmedium in der 12-Well-Platte (hergestellt in Schritt 2.2) überführt.
  10. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator und expandieren Sie die Zellen, bis sie einsatzbereit sind. Um ein gesundes und schnelles Wachstum der CAR-T-Zellen zu gewährleisten, halten Sie die Zelldichte zwischen 1-3 x 106 Zellen/ml mit frischem Medium, bis es benötigt wird.

3. Bewertung der CAR-Expression

  1. Mischen Sie die CAR-T-Zellen, indem Sie in jeder Vertiefung mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren und mindestens 1 x 105 Zellen in ein 5-ml-FACS-Röhrchen überführen.
  2. Geben Sie 3 ml Kaltwaschpuffer (PBS mit 2 mM EDTA und 0,5 % w/v BSA) in das Röhrchen. Das Röhrchen bei 500 x g 5 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig entfernen.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl Waschpuffer. Geben Sie 2 μl des CAR-Nachweisreagenzes Allophycocyanin (APC)-konjugierten Ziegen-Anti-Human-IgG F(ab')2-Antikörpers (siehe Materialtabelle) und 2 μl eines Lebensfähigkeitsfarbstoffs 7-AAD in die suspendierten Zellen.
    HINWEIS: Das CAR kann auch mit einem entsprechend markierten Zielantigen oder einem Anti-Tag-Antikörper nachgewiesen werden, wenn das CAR ein Tag (d. h. FLAG) enthält. Wenn ein unmarkierter Antikörper für den CAR-Nachweis verwendet wird, ist eine Inkubation mit einem geeigneten fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper nach Schritt 3.4 erforderlich.
  4. Mischen Sie die Probe, indem Sie das Röhrchen leicht schütteln und 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Vermeiden Sie Licht während der Inkubation. Waschen Sie die Zellen mit 3 mL Kaltwaschpuffer und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei RT.
  5. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 100 μl Waschpuffer resuspendieren. Analysieren Sie die Zellen sofort mit einem Durchflusszytometer. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzmarkierung des Nachweisreagenzes und der Viabilitätsfarbstoff mit geeigneten Positiv- und Negativkontrollen ordnungsgemäß kompensiert werden.
  6. Werten Sie die CAR-Expression mit der folgenden Gating-Strategie aus: Gate auf den Zellen mit dem Diagramm FSC-A vs. SSC-A; Gate auf den einzelnen Zellen unter Verwendung des Diagramms FSC-A vs. FSC-H; Gate auf die lebenden Zellen mit der 7-AAD-Färbung.
  7. Berechnen Sie den Prozentsatz der lebenden T-Zellen, die mit dem Anti-Human-IgG-Antikörper F(ab')2 gefärbt wurden. Vergleichen Sie die CAR-T-Zellen mit den T-Zellen der Negativkontrolle, die eine minimale Färbung aufweisen sollten.

4. Analyse der Funktion der CAR-T-Zellen

  1. Analyse der Zytotoxizität
    1. Stellen Sie sicher, dass die Zieltumorzellen das Antigen in einer Konformation exprimieren, die vom CAR erkannt werden kann. Um die Antigenexpression zu bestätigen, analysieren Sie die Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des Mutterantikörpers, von dem das CAR abgeleitet wurde. Wenn das CAR die Tumorzellen nicht erkennen kann, können die CAR-T-Zellen die Tumorzellen nicht abtöten.
    2. Bereiten Sie Zieltumorzellen vor, die das CAR-Antigen auf der Zelloberfläche exprimieren. Trypsinisieren Sie die adhärenten Tumorzellen mit 0,05%iger Trypsin-EDTA-Lösung für 1 min bei 37 °C und bereiten Sie eine Einzelzellsuspension mit geeignetem Kulturmedium bei 1-4 x 105 Zellen/ml vor.
      HINWEIS: Die Tumorzellen sollten gut adhärent sein, um eine genaue Analyse in den nachfolgenden Schritten zu gewährleisten. Wenn die Tumorzellen schlecht haften, sich leicht ablösen oder in Suspension wachsen, beschichten Sie die Vertiefungen der im folgenden Schritt verwendeten Platte mit einem geeigneten Antikörper, einem polykationischen Polymer oder biologischem Material wie Fibronektin oder Kollagen, um die Zellanheftung zu erleichtern.
    3. Bereiten Sie eine E-Plate vor (siehe Materialtabelle). Entwerfen Sie den Versuchsaufbau. Geben Sie 50 μl vorgewärmtes Tumorzellkulturmedium in jede Vertiefung und setzen Sie die E-Platte in das RTCA-Instrument (Real-Time Cell Analysis) ein, um die Hintergrundimpedanz zu messen. Messen Sie die Impedanz bei 1 min pro Messung (oder Sweep) für 3 Sweeps.
      HINWEIS: Die Hintergrundimpedanz wird verwendet, um den Zellenindex auf Null zu setzen. Ohne Hintergrundimpedanzmessung können die Wells nicht miteinander verglichen werden, so dass die Ergebnisse nicht interpretierbar sind.
    4. Entfernen Sie die E-Plate aus dem RTCA-Instrument und geben Sie 100 μl der Tumorzellsuspension in jede Vertiefung. Daher enthält jede Vertiefung 1-4 x 104 Zellen in 150 μl Gesamtvolumen.
      HINWEIS: Die Anzahl der Tumorzellen, die in jeder Vertiefung ausgesät werden sollen, sollte vor dem Experiment bestimmt werden. Bestücken Sie die E-Plate mit einer Reihe von Zellnummern und überwachen Sie dann die Zellindizes in den nächsten 24-48 Stunden. Die gewünschte Anzahl von Zellen sorgt für einen stetigen Anstieg des Zellindex für mindestens 24 Stunden ohne Plateau. Eine übermäßige Zellaussaat kann den Nährstoffmangel und die Versauerung des Mediums beschleunigen, was zu einem frühen Plateau des Zellindex führt. Darüber hinaus sollten für jede Gruppe Replikationsbohrungen einbezogen werden, um potenzielle Ausreißermessungen zu identifizieren.
    5. Äquilibrieren Sie die E-Plate 30 min lang bei RT. Dieser Schritt ermöglicht es den Tumorzellen, sich am Boden der Vertiefungen anzusiedeln und zu haften.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist für eine genaue Messung des Zellindex erforderlich. Das Überspringen dieses Schritts führt in der Regel zu einer Variabilität der Zellindexmessungen und einer ungleichmäßigen Adhäsion der Tumorzellen innerhalb der Wells, was zu einem erhöhten Rauschen im Assay führt.
    6. Setzen Sie die E-Plate wieder in das RTCA-Gerät ein und überwachen Sie die Zellindizes etwa 24 Stunden lang, wobei alle 5-15 Minuten Sweeps durchgeführt werden.
    7. Bereiten Sie am nächsten Tag die CAR-T-Zellsuspension vor. Die CAR-T-Zellen (die Effektorzellen) aus Schritt 2.10 in RPMI 1640 Medium plus 10 % FBS werden auf eine Konzentration suspendiert, die durch die Tumorzelle (die Zielzelle) und das gewünschte Effektor:Zielzell-Verhältnis (E:T) bestimmt wird. Wenn beispielsweise die Tumorzellsuspension eine Dichte von 2 x 105 Zellen/ml aufwies und ein E:T-Verhältnis von 10:1 gewünscht ist, dann sollten die CAR-T-Zellen auf 2 x 106 Zellen/ml suspendiert werden. Fügen Sie geeignete Kontrollen ein, wie z. B. Tumorzellen allein (keine Effektorzellen) und Kontroll-T-Zellen (T-Zellen, die ohne mRNA oder mit Kontroll-mRNA elektroporiert werden).
      HINWEIS: Für optimale Ergebnisse verwenden Sie die CAR-T-Zellen 1-2 Tage nach der Elektroporation, wenn die CAR-Expression auf der Oberfläche hoch ist. Um das optimale E:T-Verhältnis zu ermitteln, kann eine Reihe von E:T-Verhältnissen (z. B. 3:1 bis 20:1) getestet werden. Sofern die CAR-T-Frequenz nicht sehr niedrig ist, d.h. unter 10%, ist in der Regel ein E:T-Verhältnis von 10:1 oder 20:1 ausreichend, um eine nahezu vollständige Abtötung der Tumorzellen zu erreichen.
    8. Pausieren Sie die Zellindexaufzeichnung und entfernen Sie die E-Plate aus dem RTCA-Instrument.
    9. Kippen Sie die Platte leicht, entnehmen Sie vorsichtig 50 μl Kulturmedium aus jeder Vertiefung, ohne die Tumorzellen zu berühren, und geben Sie 100 μl der CAR-T-Zellen oder Kontroll-T-Zellen in jede Vertiefung.
    10. Setzen Sie die E-Plate wieder in das RTCA-Gerät ein und setzen Sie die Überwachung des Zellindex für mindestens 24 Stunden fort, wobei alle 5-15 Minuten Sweeps durchgeführt werden.
      HINWEIS: Die Dauer der Zellindexüberwachung hängt davon ab, wie schnell die CAR-T-Zellen auf die Tumorzellen abzielen. Eine Inkubationszeit von 24 h ist in der Regel ausreichend, damit die CAR-T-Zellen eine maximale zytotoxische Wirkung entfalten können.
    11. Stoppen Sie die Überwachung des Zellindex, entfernen Sie die E-Plate aus dem RTCA-Gerät und analysieren Sie das Zytotoxizitätsergebnis. Berechnen Sie die Zytotoxizität als Prozentsatz der Tumorzellen, die von den CAR-T-Zellen abgetötet wurden. Berechnen Sie die mittlere Zytotoxizität der CAR-T-Zellen und kontrollieren Sie die T-Zellen mit der RTCA-Software. Um die Zytotoxizität manuell zu berechnen, verwenden Sie die Formel
      Zytotoxizität = ((Zellindex von Tumorzellen) − (Zellindex von Tumorzellen plus Effektorzellen)) / (Zellindex von Tumorzellen) × 100%.
  2. Analyse der Zytokinsekretion
    1. Um die Zytokine wie IFN-Υ zu analysieren, die von den CAR-T-Zellen während der Zytotoxizitätsanalyse sezerniert werden, überträgt man den Überstand von der E-Platte auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden oder V-förmig.
      HINWEIS: Wenn eine Zeitverlaufsanalyse der Zytokinsekretion gewünscht wird, unterbrechen Sie die Zellindexüberwachung bei Schritt 4.1.10, entnehmen Sie einen kleinen Teil des Überstands aus jeder Vertiefung, geben Sie die E-Plate wieder an das RTCA-Gerät zurück und setzen Sie die Überwachung fort.
    2. Die 96-Well-Platte bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Die Überstände vorsichtig auf eine neue 96-Well-Platte übertragen, ohne die Zellpellets zu stören.
    3. Messen Sie die Zytokinspiegel in den Überständen mit kommerziellen ELISA-Kits (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Überstände müssen in der Regel vor der Messung verdünnt werden, manchmal über 100-fach, abhängig von den zu analysierenden Zytokinen.
    4. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Absorptionswerte der Probe gegen eine Standardkurve interpolieren, die aus seriell verdünnten Standards generiert wurde. Bereiten Sie Diagramme mit Fehlerbalken vor, die den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) mit geeigneter Software darstellen. Um den Unterschied zwischen den Behandlungen zu vergleichen, kann ein Student's t Test durchgeführt werden. Ein p-Wert kleiner als 0,05 wird in der Regel als statistisch signifikant angesehen.
      HINWEIS: Datenpunkte, bei denen es sich um klare Ausreißer handelt, die wahrscheinlich auf experimentelle Fehler zurückzuführen sind, sollten von der Analyse ausgeschlossen werden.

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Ergebnisse

Wir konstruierten ein HER2-zielgerichtetes CAR der zweiten Generation, das ein scFv enthält, das von dem humanisierten monoklonalen Anti-HER2-Antikörper (mAb) der Maus 4D547 abgeleitet ist, eine Transmembranregion und eine intrazelluläre 4-1BB-kostimulatorische Domäne, gefolgt von der CD3ζ-Aktivierungsdomäne (Abbildung 1A). Die DNA-Sequenz, die für das CAR kodiert, enthielt einen 5'-SP6-Promotor, um die Transkription der CAR-mRNA in vitro voranzutreiben (

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Diskussion

In dieser Studie beschreiben wir einen detaillierten nicht-viralen, nicht-integrierenden Ansatz zur Erzeugung transienter CAR-T-Zellen und stellen technische Verfahren zur Beurteilung der CAR-T-Zellfunktion zur Verfügung. Dieser Ansatz vermeidet die Verwendung herkömmlicher retroviraler und lentiviraler Vektoren für die permanente und zufällige Verabreichung von CAR-Transgenen und nutzt stattdessen die Elektroporation, um in vitro modifizierte CAR-mRNA effizient in T-Zellen einz...

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Offenlegungen

Die Autoren Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li und Vita Golubovskaya sind Mitarbeiter von ProMab Biotechnologies. Lijun Wu ist Mitarbeiter und Gesellschafter von ProMab Biotechnologies.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von ProMab Biotechnologies unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
7-AAD-Viabilitätsfarbstoff Biolegend420404
ACEA Novocyte DurchflusszytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V MediumGibco12055083
APC Ziegen Anti-Human-IgG F(ab')2 AntikörperJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII RestriktionsenzymNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog NEBS1411S
DMEM, hoher GlukosegehaltGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 KügelchenGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA-SynthesekitNew England BioLabs (NEB)E2070S
IL-2-Protein für humaneGibco15140122
Millennium RNA-MarkerInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μ g)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon-TransfektionsgerätInvitrogenMPK5000
Neon-Transfektionssystem 100-μ L KitInvitrogenMPK10096
Penicillin-Streptomycin (10000 U/ml)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0,05%), PhenolrotGibco25300120
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Instrument für die Echtzeit-Zellanalyse (RTCA)AgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201
Rekombinantes

Referenzen

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