Methodenartikel

Identifizierung funktionell relevanter Lentivirus-Integrationsstellen in einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek

DOI:

10.3791/67552

⸱

10. Januar 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insertionsmutagenese ist ein wesentliches Werkzeug in der Vorwärtsgenetik zur Identifizierung funktioneller genomischer Elemente. Hier beschreiben wir den Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), eine Methode zum Nachweis von Lentivirus-Integrationsstellen innerhalb einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ausmaß funktioneller Sequenzen innerhalb des menschlichen Genoms ist ein zentrales, aber umstrittenes Thema in der Biologie. Obwohl Hochdurchsatz-Reverse-Gen-Screens bei der Erforschung dieses Themas Fortschritte gemacht haben, beschränken sie ihren Anwendungsbereich oft auf bekannte genomische Elemente und können unspezifische Effekte mit sich bringen. Dies unterstreicht den dringenden Bedarf an neuartigen Werkzeugen für die funktionelle Genomik, die ein tieferes, unvoreingenommenes Verständnis der Genomfunktionalität ermöglichen. Dieses Protokoll führt den Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET) ein, eine Methode zur Identifizierung von Lentivirus-Integrationsstellen innerhalb einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek. InSET erleichtert die Erfassung genomweiter lentiviraler Integrationsstellen, wobei Next-Generation-Sequencing zum Nachweis und zur Quantifizierung flankierender Sequenzen eingesetzt wird. Das Design von InSET ermöglicht die Analyse von Variationen der Abundanz an der Integrationsstelle in phänotypischen Screens in großem Maßstab und etabliert es als robustes Werkzeug für die Vorwärtsgenetik und zur Identifizierung funktioneller genomischer Elemente. Ein wesentlicher Vorteil von InSET ist seine Fähigkeit, bisher unidentifizierte genomische Elemente aufzudecken, einschließlich neuartiger funktioneller Exons sowohl proteinkodierender als auch nicht-kodierender RNAs, unabhängig von vorheriger Annotation. Insgesamt ist InSET von großem Wert für die Untersuchung der komplexen Komplexität des menschlichen Genoms und Transkriptoms, bei dem viele genomische Elemente auf ihre funktionelle Charakterisierung warten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die funktionelle Genomik bleibt ein entscheidendes und herausforderndes Gebiet, auch in der Post-Genom-Ära, da ein erheblicher Teil der genomischen Regionen noch nicht funktionell charakterisiert ist. Ein Hauptgrund für diese Herausforderungen liegt in der komplizierten Natur des menschlichen Genoms und Transkriptoms, die durch eine allgegenwärtige Transkription und universelles alternatives Spleißen sowohl in proteinkodierenden als auch in nicht-kodierenden Regionen gekennzeichnet sind1,2,3,4,5. Diese Komplexität wurde durch RNA-gezielte Anreicherungsstudien ausführlich hervorgehoben6,7,8,9. Es wird zunehmend erkannt, dass zahlreiche neuartige genomische Elemente neben den gut annotierten Segmenten des menschlichen Genoms noch nicht kartiert und funktionell nicht annotiert sind10,11,12.

In den letzten Jahren wurden Fortschritte bei Reverse-Genetics-Tools wie RNA-Interferenz (RNAi) und CRISPR/Cas-Systemen erzielt13,14,15,16,17,18,19,20,21. Diese Methoden haben jedoch erhebliche Nachteile, einschließlich unspezifischer Effekte und hoher Kosten im Zusammenhang mit der Generierung komplexer Bibliotheken von kurzen Haarnadel-RNAs (shRNAs) oder Single Guide RNAs (sgRNAs)22,23,24,25. Darüber hinaus konzentrieren sich diese Methoden überwiegend auf annotierte genomische Elemente. Im Gegensatz dazu hat die Vorwärtsgenetik den Vorteil, dass sie neue, unannotierte funktionelle genomische Elemente identifiziert. Angesichts der Komplexität des menschlichen Genoms und Transkriptoms sowie der großen Anzahl neuer genomischer Elemente ist diese Fähigkeit der Vorwärtsgenetik von erheblicher Bedeutung.

Forward Genetics Zellbibliotheken werden häufig durch zufällige retrovirale Integration generiert, was den effizienten Nachweis von genomweiten Integrationsstellen entscheidend für einen Forward Genetics Assay macht. Die Erkennung dieser Integrationsstellen erfordert in der Regel Genom-Walking-Tools26. Obwohl es bei diesen Tools erhebliche Fortschritte gegeben hat, sind nur wenige für Next-Generation-Sequencing-Anwendungen (NGS) optimiert und anschließend in Insertionsmutagenese-Studien eingesetzt. Bei der Insertionsmutagenese in Zelllinien werden häufig Methoden wie die inverse PCR (I-PCR) oder die lineare amplifikationsvermittelte PCR (LAM-PCR) verwendet, um Integrationsstellen zu detektieren27,28,29. Diese Methoden erfordern jedoch in der Regel einen Restriktionsenzymverdau oder Ligationsschritte, die die Effizienz verringern und zu Verzerrungen in den Ergebnissen führen können.

Um die effiziente Detektion genomweiter Integrationsstellen in Vorwärtsgenetik-Screenings zu verbessern, wurde hier eine Methode namens Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET) Methode eingeführt. Durch die Integration von Genome-Walking mit NGS ermöglicht InSET die Hochdurchsatz-Identifizierung von Lentivirus-Integrationsstellen in Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Bibliotheken. Im Vergleich zu bestehenden Methoden27,28,29 ist InSET relativ unkompliziert und einfach, da es die Verdau- oder Ligationsschritte des Restriktionsenzyms eliminiert und somit bequemer und zugänglicher wird. Obwohl das bestehende Forward-Genetik-Screening in Säugetierzellen auf sehr wenige haploide oder nahezu haploide Zelllinien beschränkt ist27,28,29,30,31, hat sich InSET in aneuploiden Zelllinien bewährt32.

Diese Studie bietet ein detailliertes, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Implementierung der InSET-Methode. Darüber hinaus wird die Anwendung von InSET in Insertionsmutagenese-Studien demonstriert. InSET dient als leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung neuartiger Exons innerhalb genomischer Elemente, die sowohl proteinkodierende als auch nicht-kodierende RNAs in menschlichen Zelllinien umfassen.

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Protokoll

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Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die InSET-Methode. Für eine optimale Abdeckung bereiten Sie fünf parallele Bibliotheken aus 1 μg genomischer DNA vor und bündeln sie dann für die Sequenzierung der nächsten Generation. Dieses Verfahren wurde in früheren Tests kontinuierlich erfolgreich abgeschlossen, obwohl Benutzer nach eigenem Ermessen Pausenpunkte einführen können. Detaillierte Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Erfassung von Lentivirus-Integrationsstellen im Genom

  1. Verwenden Sie die genomische DNA, die aus einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek (1 μg) isoliert wurde, wie in einer früheren Studie beschrieben32, als Template für eine lineare PCR in einer 50-μl-Reaktion, die 1x Taq-Puffer, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase, 4 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM) und 0,3 μM biotinylierten Primer 3-LTR_prime (Tabelle 1) in einem PCR-Röhrchen enthält.
    HINWEIS: Der 3-LTR_prime-Primer glüht an der LTR-Region der Lentivirus-Sequenz an. Wenn es bis zur 5'-LTR anneht, enthält das amplifizierte Fragment die flankierende genomische Sequenz. Wenn es auf die 3'-LTR abgleitet, enthält das amplifizierte Fragment eine interne Lentivirussequenz, die nicht mit dem Wirtsgenom abgeglichen werden kann und daher bei der nachgeschalteten Sequenzierungsdatenanalyse herausgefiltert wird. Dieser Primer kann auch modifiziert werden, um sich an andere Arten von Vektoren anzupassen, die zur Erzeugung einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek verwendet werden.
  2. Führen Sie 50 Zyklen linearer PCR in einem Standard-PCR-Thermocycler durch und fügen Sie zu Beginn und unmittelbar nach 25 Zyklen 2,5 U Taq-DNA-Polymerase hinzu. Die PCR-Bedingungen sind wie folgt: 94 °C für 5 Minuten; 50 Zyklen von 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; 72 °C für 5 min.
    HINWEIS: Um die Aktivität der Taq-DNA-Polymerase während längerer Reaktionen aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, das Enzym sowohl zu Beginn als auch in der Mitte der Reaktion hinzuzufügen.
  3. Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein neues, sauberes 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen.
  4. Mischen Sie die PCR-Produkte gründlich mit 10 μl Biotin-Streptavidin-Magnetkügelchen.
  5. Die Mischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren und bei 400 U/min in einem Metallbad schütteln.
    HINWEIS: Nehmen Sie das Röhrchen heraus, um es alle 15 Minuten gut mit der Pipette zu vermischen.
  6. Verwende einen magnetischen Ständer, um die Perlen zu sammeln, und entferne dann vorsichtig den Überstand.
  7. Waschen Sie die Kügelchen 6 Mal mit 300 μl Binde-/Waschpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1 % Tween-20) und entsorgen Sie den Überstand.
  8. Mit 300 μL (65 °C) DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser zweimal waschen und den Überstand entsorgen.
  9. Für die Synthese des zweiten Strangs resuspendieren Sie die Kügelchen in einem 24-μl-Reaktionsvolumen, das 1x Klenow-Fragment-Puffer, 2 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM) und 6,25 μM P5_N6 Primer (Tabelle 1) in einem PCR-Röhrchen enthält.
    HINWEIS: Bereiten Sie eine 100 μM Stammlösung P5_N6 Grundierung vor. Der P5_N6 Primer besteht aus einer festen P5-Adaptersequenz am 5'-Ende und einer zufälligen Hexamersequenz am 3'-Ende. Das zufällige Hexamer kann an eine Vielzahl von Zielsequenzen binden und eignet sich daher für die Amplifikation verschiedener DNA-Fragmente, die durch lineare PCR erzeugt wurden.
  10. Die Mischung bei 15 °C für 20 min in einem PCR-Thermocycler vorinkubieren.
  11. Fügen Sie 2 U Klenow-Fragment (E.coli-DNA-Polymerase mit großem Fragment) hinzu.
  12. Inkubieren Sie die Mischungen in einem PCR-Thermocycler unter folgenden Bedingungen: langsam auf 0,5 °C/min von 15 °C auf 25 °C hochfahren, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation; dann langsam auf 0,5 °C/min auf 37 °C hochfahren, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation.
  13. Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein neues, sauberes 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen.
  14. Verwenden Sie einen magnetischen Ständer, um die Kügelchen einzufangen, und entsorgen Sie dann den Überstand.
  15. Waschen Sie die Kügelchen vorsichtig mit 300 μl 4 °C DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser. Sammle die Perlen ein und wirf den Überstand weg.

2. Aufbau einer NGS-Bibliothek mit verschachtelter PCR

  1. Resuspendieren Sie die Beads aus Schritt 1.15 in einem 25 μl PCR-Reaktionsvolumen, das 1x Taq-Puffer, 1,25 U Taq-DNA-Polymerase, 0,5 μM Primer P5 (Tabelle 1), 2 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM) und 0,5 μM Primer 3-LTR_Nest (Tabelle 1) in einem PCR-Röhrchen enthält.
  2. PCR-Reaktionen in einem PCR-Thermocycler werden unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94 °C für 3 Minuten; 20 Zyklen à 94 μC für 30 s, 55 ΰC für 30 s und 72 ΰC für 30 s; 72 ΰC für 7 Minuten.
  3. Verwenden Sie 5 μl der PCR-Produkte aus Schritt 2.2 als Template für die nächste PCR-Runde in einem Volumen von 50 μl, das 1x Taq-Puffer, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase, 4 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM), 0,4 μM Primer Illumina_P5 (Tabelle 1) und 0,4 μM Primer Illumina_P7-3 l (Tabelle 1) enthält.
  4. PCR-Reaktionen in einem PCR-Thermocycler werden unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94 °C für 3 Minuten; 15 Zyklen à 94 μC für 30 s, 55 ΰC für 30 s und 72 ΰC für 30 s; 72 °C für 7 Minuten.
  5. Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt pausiert werden, und die Proben können bei -20 °C gelagert werden.
  6. Aufreinigung der PCR-Produkte mit 1,2-fachen Volumina sauberer DNA-Kügelchen, wodurch das endgültige Volumen auf 21 μl < μl / > HINWEIS: Entnehmen Sie 10 μl PCR-Produkte aus jeder der 5 parallel hergestellten Bibliotheken, poolen Sie sie und reinigen Sie sie auf ein Endvolumen von 21 μl. Das Aufreinigungsprotokoll für die PCR-Produkte wurde von den Herstellerangaben für die DNA-Clean-Kügelchen übernommen (siehe Materialtabelle).
    1. Die Kügelchen 30 min lang von 2-8 °C auf Raumtemperatur äquilibrieren.
    2. Mischen Sie die Perlen gründlich, indem Sie sie umdrehen oder vortexen.
    3. Pipettieren Sie das 1,2-fache Volumen der Kügelchen in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    4. Geben Sie die PCR-Produkte in die Kügelchen und mischen Sie sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
    5. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die DNA-Bindung an die Kügelchen zu ermöglichen.
    6. Legen Sie die Proben auf ein magnetisches Stativ und entfernen Sie den Überstand, sobald die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten).
      7. Zum
    7. Waschen der Kügelchen werden 200 μl 80%iges Ethanol zugegeben, 30 s lang bei Raumtemperatur inkubiert und der Überstand entfernt.
      HINWEIS: Das 80%ige Ethanol sollte frisch zubereitet werden.
    8. Wiederholen Sie Schritt 2.6.7 einmal.
    9. Die Kügelchen bei Raumtemperatur bei geöffnetem Deckel ca. 5 min an der Luft trocknen lassen.
    10. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer, fügen Sie 22 μl DNase/RNase-freies destilliertes Wasser hinzu, mischen Sie gründlich, indem Sie es 10 Mal auf und ab pipettieren und lassen Sie es 2 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.
    11. Stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetstativ, bis die Lösung klar ist (ca. 2 min), und geben Sie dann 21 μl Überstand in ein sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt pausiert werden, und die Proben können bei -20 °C gelagert werden.
  7. Verwenden Sie 1 μl gereinigte PCR-Produkte, um die Konzentration mit dem Fluorometer mit dem kommerziell erhältlichen dsDNA-Fluoreszenznachweiskit zu messen (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Das Konzentrationsmessprotokoll folgt den Anweisungen des Herstellers für das dsDNA-Nachweiskit.
    1. Bereiten Sie die Vorbereitung der Arbeitslösung vor, indem Sie das Reagenz und den Puffer (im Kit enthalten) in einem Verhältnis von 1:200 mischen.
    2. Bereiten Sie die Assay-Standards vor, indem Sie 10 μl Standard #1 und 10 μl Standard #2 (im Kit enthalten) jeweils mit 190 μl Arbeitslösung mischen. Die Mischung 2-3 s lang vorsichtig einrühren.
    3. Bereiten Sie die Assay-Probe vor, indem Sie 1 μl der gereinigten PCR-Produkte mit 190 μl Arbeitslösung mischen. Die Mischung 2-3 s lang vorsichtig einrühren.
    4. Inkubieren Sie die Assay-Standards und Assay-Proben 2 Minuten lang bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht.
    5. Schalten Sie das Fluorometer ein.
    6. Wählen Sie das dsDNA-Programm für hohe Empfindlichkeit aus dem Hauptmenü aus.
    7. Setzen Sie zur Kalibrierung Norm #1 in das Gerät ein, drücken Sie die Taste Norm lesen, um die erste Norm zu messen, setzen Sie dann Norm #2 ein und drücken Sie die Taste Norm lesen, um die zweite Norm zu messen.
    8. Um eine Stichprobenmessung durchzuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche Stichproben ausführen, um zur Seite für die Stichprobenmessung zu gelangen. Führen Sie jedes Röhrchen mit der Assay-Probe ein und drücken Sie die Taste Röhrchen lesen, um die Konzentration zu ermitteln.
      HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt pausiert werden, und die Proben können bei -20 °C gelagert werden.
  8. Führen Sie NGS auf Illumina-Plattformen mit einer Paired-End-Strategie von 150 bp (PE150) auf einer Skala von 30 Giga-Basis (GB) durch.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird in der Regel an die Sequenzierungsunternehmen ausgelagert.

3. Datenanalyse

HINWEIS: Die Analyse in menschlichen Zelllinien wurde in diesem Abschnitt als Beispiel verwendet.

  1. Kartierung von Lentivirus-Integrationsstellen
    1. Filtern Sie Sequenzier-Reads mit mehr als 50 % minderwertigen Basen (Phred-Score <20), mehr als 15 'N' Basen oder kürzeren als 150 Basen mit fastp tool33 heraus (siehe Materialtabelle).
    2. Wählen Sie nur Lesevorgänge mit gekoppeltem Ende aus, wobei der Lesevorgang 2 mit dem LTR-Tag "GCCTTGTGTGTGTGTTAGATCCACAG
      beginnt. ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      HINWEIS: Diese Sequenz hängt von der Sequenz des Vektors ab, der zur Generierung der Insertionsmutagenese-Zellbibliothek verwendet wird.
    3. Kürzen Sie die LTR-Tag-Sequenz aus den in Schritt 3.1.2 ausgewählten Lesevorgängen.
    4. Richten Sie die getrimmten Lesevorgänge mit BWA-MEM 34 (siehe Materialtabelle) mit den Standardeinstellungen an der GRCh37/hg19 aus.
    5. Behalten Sie nur Lesepaare bei, bei denen sowohl Lesevorgang 1 als auch Lesevorgang 2 eindeutig auf das Genom mit korrekter Konfiguration und korrektem Abstand abgebildet sind, angezeigt durch FLAG 147 und FLAG 163.
    6. Definieren Sie die Einfügeposition als die erste ausgerichtete Basis des getrimmten Lesevorgangs 2.
    7. Normalisieren Sie die Leseanzahl an jeder eindeutigen Einfügestelle auf die Gesamtzahl der eindeutig ausgerichteten Lesevorgänge in jeder Stichprobe.
  2. Identifizierung von Insertionen, die die zelluläre Fitness beeinflussen (IACFs)
    HINWEIS: Bei der statistischen Analyse ist es ratsam, paarweise Vergleiche zwischen den drei biologischen Replikaten sowohl der Kontroll- als auch der behandelten Proben durchzuführen, um signifikant angereicherte oder erschöpfte Positionen zu identifizieren. Die oben erwähnte Anzahl von Replikaten ist minimal. Es wird empfohlen, so viele Wiederholungen wie möglich zu verwenden, um die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
    1. Konvertieren Sie die normalisierten Lesezahlen jeder Position, um10 Werte zu protokollieren.
    2. Legen Sie die Logarithmuswerte10 von Positionen mit null Lesevorgängen auf −5 fest.
    3. Führen Sie einen zweiseitig gekoppelten Student-t-Test für die logarithmischen10-Werte durch.
    4. Passen Sie die p-Werte für Mehrfachvergleiche mit der Benjamini-Hochberg-Methode in der R-Umgebung an.
    5. Wählen Sie Positionen mit einem Schwellenwert für die False Discovery Rate (FDR) von 25 % als IACF aus.
  3. Identifizierung von Clustern, die die zelluläre Fitness beeinflussen (CACFs)
    HINWEIS: Für diese Analyse wurden drei biologische Replikate von Kontroll- und behandelten Proben empfohlen.
    1. Identifizieren Sie die signifikant angereicherten oder abgereicherten Insertionscluster zwischen Kontroll- und behandelten Proben mit SICER35 (siehe Materialtabelle) mit einem FDR-Schwellenwert von 1%. Der Befehl für die SICER-Analyse lautet "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      HINWEIS: Die Bedeutung der Parameter im obigen Befehl ist wie folgt: ["InputDir"] ["behandelte Probeneinfügestellen Bettdatei"] ["Kontrollprobeneinfügestellen Bettdatei"] ["OutputDir"] ["Spezies"] ["Redundanzschwelle"] ["Fenstergröße (bp)"] ["Fragmentgröße"] ["effektive Genomfraktion"] ["Lückengröße (bp)"] ["E-Wert"].
    2. Rufen Sie Cluster-Regionen ab, die von mindestens zwei biologischen Replikaten gemeinsam genutzt werden, mit der Funktion "intersect" der BEDTools-Suite36 (siehe Materialtabelle) und bezeichnen Sie diese Cluster-Regionen als CACFs.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qualitätskontrolle einer NGS-Bibliothek, die typischerweise vom Sequenzierungsanbieter durchgeführt wird, dient als Standard-Qualitätsprüfung vor der Sequenzierung. Um den Einfluss der Bibliotheksqualität zu demonstrieren, wurden zwei Stichproben verglichen. Die hochwertige Bibliothek mit der Bezeichnung s2-20-15 wurde unter Verwendung des Standard-Nested-PCR-Protokolls hergestellt, das aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationsschritten besteht: der erste mit 20 Zyklen, gefolgt von dem zweiten mit 15 Zyklen. Im Gegens...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In der Vorwärtsgenetik ist das Genom-Walking für die Profilierung von Integrationsstellen in Insertionsmutagenese-Zellbibliotheken unerlässlich. Klassische Genome-Walking-Methoden wie I-PCR und LAM-PCR erfordern häufig einen Restriktionsenzymverdau und eine Ligation, was die Komplexität der Bibliothek reduzieren und zu Verzerrungen aufgrund der Abhängigkeit von der Enzymstelle führen kann 27,28,29. Die InSET-Methode überwindet d...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren machen keine Angaben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (32000441), der Natural Science Foundation der Provinz Fujian, China (2023J01130), den Fundamental Research Funds for the Central Universities of Huaqiao University (ZQN-924) und den Scientific Research Funds der Huaqiao University (18BS205). P.K. wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (32170619), dem Forschungsfonds für internationale leitende Wissenschaftler der National Natural Science Foundation. Science Foundation of China (32150710525) und die Natural Science Foundation der Provinz Fujian, China (2020J02006).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTAInvitrogenAM9260GZur Herstellung von Binde-/Waschpuffer
1 M Tris-HCl (Ph 8,0)Invitrogen15568025Zur Herstellung von Binde-/Waschpuffer
10-mal; Klenow-Fragment-Puffer Takara2140A
10 mal; Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Zur Herstellung von Binde-/Waschpuffer
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 μ m
BEDToolsSoftware, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMSoftware, v0.7.12
dNTP MixtureTakara4030je 2,5 mM
Equalbit dsDNA HS Assay KitVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaSY-412-1001Illumina-Plattform, ausgelagert an Novogene Corporation (Peking)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850Illumina-Plattform, ausgelagert an Novogene Corporation (Peking)
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNA PolymeraseTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328Zur Herstellung von Binde-/Waschpuffer
UltraPure DistilledWater Invitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01

Referenzen

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