Wir bieten eine Schritt-für-Schritt-Methode der Immunzytochemie (ICC) zum Nachweis von Anti-MDA5 an. Dieser Ansatz umfasst Zellfixierung, Permeabilisierung, Antikörperinkubation und bildgebende Verfahren, die den genauen Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern ermöglichen und die Diagnose einer schnell fortschreitenden interstitiellen Lungenerkrankung bei Myositis-Patienten unterstützen.
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Methodenartikel
Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern mittels HeLa-Zellen und Immunzytochemie mit Lichtmikroskopie
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Anti-MDA5-Autoantikörper sind wichtige Biomarker für Dermatomyositis (DM), amyopathische Dermatomyositis (CADM) und Polymyositis (PM), insbesondere bei der Identifizierung von Patienten mit einem Risiko für eine schnell fortschreitende interstitielle Lungenerkrankung (RP-ILD). Die frühzeitige Erkennung dieser Autoantikörper ist für die Verbesserung der Patientenergebnisse unerlässlich, da eine verzögerte Diagnose oft zu schlechten Prognosen führt. Derzeit ist der Radioimmunoassay der Goldstandard für den Nachweis von Anti-MDA5, aber sein Einsatz ist durch hohe Kosten, langwierige Verfahren und den Bedarf an spezialisiertem Fachwissen eingeschränkt. Darüber hinaus weist der Blot-Test, ein weit verbreitetes klinisches Instrument, eine hohe Falsch-Positiv-Rate für MDA5-Autoantikörper auf, was die diagnostische Genauigkeit beeinträchtigen kann. Um diese Einschränkungen zu beheben, schlagen wir eine nicht-radioaktive, hochempfindliche und standardisierte Bestätigungstestmethode mit Hilfe der Immunzytochemie (ICC) vor. Dieses Protokoll umfasst die Behandlung von HeLa-Zellen mit einem MDA5-Konstrukt, die Permeabilisierung der Zellen mit Triton X-100, um die Bindung von primären Anti-MDA5-Autoantikörpern zu erleichtern, und den Nachweis gebundener Antikörper unter Verwendung von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Meerrettichperoxidase) mit DAB-Chromogen für die Mikroskopie-Bildgebung. ICC bietet einen praktischen, kostengünstigen und hochempfindlichen Ansatz zur Visualisierung von Anti-MDA5-Autoantikörpern in zellulären Strukturen. Durch die Integration von ICC als ergänzendes Bestätigungsverfahren zielt diese Studie darauf ab, die Zuverlässigkeit des Anti-MDA5-Nachweises zu erhöhen und dadurch die diagnostischen und prognostischen Strategien für RP-ILD bei DM-, CADM- und PM-Patienten zu verbessern.
Einleitung
Idiopathische inflammatorische Myopathien (IIM), allgemein als Myositis bezeichnet, sind eine heterogene Gruppe von Autoimmunerkrankungen, die durch chronische Muskelentzündungen, variable klinische Manifestationen und unterschiedliche therapeutische Ergebnisse gekennzeichnet sind. Häufige Symptome sind Muskelschwäche, verminderte Ausdauer und Myalgie1. Zu den primären Subtypen der IIM gehören Polymyositis (PM) und Dermatomyositis (DM), während sich die klinisch amyopathische Dermatomyositis (CADM) durch charakteristische Hautausschläge auszeichnet, die denen bei DM ähneln, jedoch mit minimaler oder keiner Muskelbeteiligung. Eine der Hauptkomplikationen bei PM, DM und CADM ist die interstitielle Lungenerkrankung (ILD), von der etwa 40 % der Patienten betroffen sind und die mit einer erhöhten Mortalität einhergeht2.
Der klinische Verlauf und die Prognose der ILD bei IIM sind sehr unterschiedlich. ILD, die mit DM und CADM (DM-/CADM-ILD) assoziiert sind, sind tendenziell therapieresistenter und haben eine schlechtere Prognose im Vergleich zu PM-assoziierten ILD. Unter diesen ist die akute oder subakute ILD, die innerhalb von drei Monaten schnell fortschreitet3, besonders schwerwiegend, mit einer berichteten Fünf-Jahres-Überlebensrate von nur 52 %, verglichen mit 87 % bei chronischer ILD, die langsam fortschreitet oder stabil bleibt. Die schnell progrediente ILD (RP-ILD), ein Subtyp der akuten/subakuten ILD, ist gekennzeichnet durch ein schnelles Auftreten von Dyspnoe und ausgedehnte Alveolarschäden, die in der Thoraxbildgebung sichtbar sind. RP-ILD ist eine lebensbedrohliche Erkrankung mit schlechter Prognose, was die dringende Notwendigkeit einer frühzeitigen Diagnose und eines raschen Eingreifens unterstreicht, um die Ergebnisse für die Patienten zu verbessern 4,5,6.
Myositis-spezifische Autoantikörper (MSAs) haben sich als kritische Biomarker bei Myositis-assoziierter ILD herausgestellt, wobei Anti-MDA5-Autoantikörper eine besonders wichtige Rolle spielen. Diese Autoantikörper werden häufig bei Patienten mit PM-/DM-/CADM-ILD nachgewiesen und dienen als wichtige prognostische Indikatoren für RP-ILD 7,8,9. MDA5 (Melanoma differentiation-associated gene 5) ist ein zytosolischer Mustererkennungsrezeptor, der von einem Interferon-induzierbaren Gen kodiert wird, das virale und mitochondriale doppelsträngige RNA erkennt und Interferon-vermittelte Immunantworten auslöst10. Obwohl die genauen pathogenen Mechanismen unklar bleiben, wird angenommen, dass Anti-MDA5-Autoantikörper die MDA5-Funktion stören und damit zur Autoimmunpathogenese beitragen.
Der rechtzeitige Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern ist für die frühzeitige Identifizierung und Behandlung von RP-ILD unerlässlich. Traditionell gilt die radioaktiv markierte Immunpräzipitation (IP) unter Verwendung von 35S-Methionin-markierten K562-Zellextrakten als Goldstandard für den Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern11. Für den routinemäßigen klinischen Einsatz ist diese Methode jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten, der Abhängigkeit von Spezialgeräten und geschultem Personal, der strengen Vorschriften zur Entsorgung radioaktiver Abfälle und der begrenzten Haltbarkeit von radioaktiv markierten Reagenzien unpraktisch. In der klinischen Praxis werden häufig Blot-Assays als Alternativen eingesetzt; Sie sind jedoch mit einer hohen falsch-positiven Rate für Anti-MDA5-Autoantikörper verbunden12,13, was Bedenken hinsichtlich der diagnostischen Genauigkeit aufkommen lässt. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem zuverlässigen, nicht-radioaktiven Bestätigungstest, um positive Ergebnisse zu validieren und die diagnostische Sicherheit zu verbessern.
Um diese Lücke zu schließen, schlagen wir die Verwendung der Immunzytochemie (ICC) als ergänzenden Bestätigungstest für Anti-MDA5-Autoantikörper vor. Bei diesem Ansatz werden HeLa-Zellen mit einem MDA5-Konstrukt transfiziert, die Zellen mit Patientenplasma inkubiert und gebundene Anti-MDA5-Autoantikörper unter Verwendung von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Meerrettichperoxidase) in Kombination mit einem chromogenen Substrat zur Visualisierung unter Lichtmikroskopie nachgewiesen. ICC bietet eine nicht-radioaktive, hochempfindliche und standardisierte Plattform für die Visualisierung von Anti-MDA5-Autoantikörpern in zellulären Kompartimenten. Durch die Integration von ICC in den Blot-Assay zielt diese Methode darauf ab, die Falsch-Positiv-Raten zu reduzieren, die diagnostische Genauigkeit zu verbessern und letztendlich das klinische Management und die Ergebnisse für die Patienten zu verbessern.
Das Ziel dieser Studie ist es, ein robustes, nicht-radioaktives Protokoll für den Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern zu etablieren, das die Grenzen der derzeitigen Nachweismethoden überwindet und Ärzten ein praktisches und zuverlässiges Werkzeug für die Frühdiagnose von RP-ILD bei Patienten mit PM, DM und CADM bietet. In der begleitenden Videoerzählung wird dieser lebensbedrohliche Verlauf umgangssprachlich als "schneller Tod" bezeichnet; Wissenschaftlich entspricht es der schnell fortschreitenden ILD (RP-ILD). Diese Arbeit baut auf bestehenden Erkenntnissen auf und hat das Potenzial, die prognostische Bewertung und therapeutische Entscheidungsfindung in der klinischen Praxis erheblich zu verbessern.
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Protokoll
1. Zellkultur und Transfektion
- Bewahren Sie HeLa-Zellen mit Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 auf.
- Durchgang der Zellen alle 2-3 Tage oder wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % bis 100 % erreichen.
- 7 × 104 HeLa-Zellen in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte (1,9 cm2/Well) 24 h vor der Transfektion säen, damit die Zellen eine Konfluenz von etwa 90 % erreichen.
- 500 ng Plasmid (pENTER-MDA5) und 1,5 μl Transfektionsreagenz werden in jeweils 25 μl reduziertem Serummedium verdünnt.
- Verdünnte DNA zum verdünnten Transfektionsreagenz hinzufügen (Verhältnis 1:1). Gut mischen und 5 min inkubieren.
- Geben Sie die Mischung zu den Zellen, die einen Tag zuvor ausgesät wurden, und rühren Sie, um den DNA-Lipid-Komplex sofort zu mischen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen zu 80 % bis 90 % konfluent sind.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 für 24 Stunden und fahren Sie mit der Durchführung der ICC fort.
HINWEIS: Wir haben einen kommerziell erhältlichen Vektor (pEnter-MDA5) verwendet. Weitere Informationen finden Sie in der Werkstofftabelle. Die Wirksamkeit der Transfektion beträgt ~50%.
Der Erfolg der Transfektion und Expression des Zielproteins kann bestimmt werden, indem die Zellen mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Plasmid transfiziert und ein Western Blot durchgeführt wird, um die Expression des Zielproteins sichtbar zu machen.
2. Fixierung der Zellen
- Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation 2x mit PBS, um alle Medienreste zu entfernen.
HINWEIS: Das Waschen kann durch Schütteln der Platte auf einem Orbitalschüttler durchgeführt werden. - Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig. Verwenden Sie geeignete Handhabungsrichtlinien. - Aspirieren Sie das Fixierreagenz und verwenden Sie PBS, um die Zellen 2x zu waschen.
3. Permeabilisierung der Zellen
- Geben Sie Triton X-100 Reagenz (0,3% PBS) hinzu und lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen.
- Nach 10 Minuten das Reinigungsmittel entsorgen.
- Fügen Sie PBS hinzu, um die Zellen einmal zu waschen.
4. Zell-Blockierung
- Führen Sie eine Blockierung mit 10 % fötalem Rinderserum in PBS (1x) durch und inkubieren Sie die Zellen 1 h lang bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie das Blockierungsreagenz und fügen Sie dann PBS hinzu, um die Zellen einmal zu waschen.
5. Hybridisierung des Antikörpers des Patienten
- Geben Sie das verdünnte Patientenplasma in die Zellen. Achten Sie darauf, die Patientenprobe (1:5.000 Verdünnung in PBS) vor der Anwendung in PBS zu verdünnen.
HINWEIS: Passen Sie die Verdünnung an, um das Signal zu verstärken oder den Hintergrund nach Bedarf zu reduzieren. Um unverfälschte Ergebnisse zu gewährleisten, wussten die Mitarbeiter, die die Tests durchführten, nicht, welche Proben zu den Patienten gehörten und welche von gesunden Personen stammten. - Die Probe wird bei 4 °C für 12-16 h (über Nacht) inkubiert.
- Nach der Inkubationszeit die Patientenprobe entnehmen und die Zellen 3x mit PBS waschen.
6. Hybridisierung von Sekundärantikörpern
- Behandeln Sie die Zellen mit verdünntem Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG (1:250 Verdünnung in PBS) und lassen Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur stehen.
- Eine Stunde später entsorgen Sie die Sekundärantikörper.
- Spülen Sie mit PBS 3x.
7. Zellfärbung
- Färben Sie die Zellen nach dem Waschen der Zellen mit 300 μl DAB-Arbeitslösung/-Vertiefung.
HINWEIS: Diese Lösung wurde durch Mischen von DAB-Chromogenkonzentrat und DAB-Verdünnungsmittel gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. - Nachdem Sie die Zellen 5 Minuten lang gefärbt haben, entfernen Sie den Farbstoff, spülen Sie ihn mit entionisiertem destilliertem Wasser ab und schütteln Sie ihn 5 Minuten lang.
8. Gegenfärbung von Zellen
- Den Zellkern mit verdünntem Hämatoxylin gegenfärben.
HINWEIS: Wir verwenden Hämatoxylin Gill II in einer 10-fachen Verdünnung und warten 5 Minuten auf den Färbeprozess. - Nach 5 min das Hämatoxylin entsorgen, anschließend 2 x 5 min mit entionisiertem destilliertem Wasser waschen.
9. Beobachtung
- Beobachten Sie das Färbeergebnis mit einem optischen Mikroskop.
HINWEIS: Ein richtig positives Ergebnis zeigt eine starke braune Färbung in HeLa-Zellen, die MDA5 exprimieren; dies bestätigt die Anti-MDA5-Autoantikörper in der Probe des Patienten. Ein negatives Ergebnis zeigt HeLa-Zellen ohne braune Färbung, was auf keine Anti-MDA5-Autoantikörper hinweist. Ein falsch-positives Ergebnis zeigt eine ausgedehnte Braunfärbung in allen Zellen, unabhängig von der MDA5-Expression. Diese unspezifische Färbung, die bei anderen Autoimmunerkrankungen auftritt, muss von einer echten positiven Färbung unterschieden werden, um Fehldiagnosen zu vermeiden.
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Ergebnisse
Das Personal, das die Tests durchführte, wurde für die Identitäten der Proben, einschließlich der spezifischen Patienten, von denen sie gewonnen wurden, verblindet, um mögliche Verzerrungen im Bewertungsprozess zu minimieren. Die gesunden Kontrollproben wurden zwar keiner Verblindung unterzogen, lieferten aber durchweg klare und eindeutige Ergebnisse.
Abbildung 1A zeigt die erfolgreiche Expression v...
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Diskussion
Unsere ICC-basierte Technik zur Identifizierung von Anti-MDA5-Autoantikörpern bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden wie der Line-Blot-Analyse und dem Radioimmunoassay. Zuvor berichteten Nombel et al. über Sensitivitäts- und Spezifitätswerte von 96 % bzw. 100 %, indem sie die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) an MDA5-transfizierten Zellen mit ELISA in einer Kohorte von 23 Anti-MDA5-positiven Dermatomyositis-Patienten und 22 Anti-MDA5-negativen Kontrollen verglichen
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.
Teile dieses Manuskripts wurden mit Hilfe von GPT-4 von OpenAI erstellt. Die Autoren haben den Inhalt überprüft und überarbeitet, um Genauigkeit und Originalität zu gewährleisten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des taiwanesischen National Science and Technology Council unterstützt, die Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 und NSTC 113-2320-B-039-032) gewährt wurden. Diese Studie wurde auch teilweise durch Zuschüsse der China Medical University and Hospital unterstützt, die Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 und C1110812016-12) gewährt wurden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 24-Well-Platten (1,9 cm²/brunnen) | Corning | 354541 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum | Gibco | 15240062 | |
| Becher | PYREX | 1000-600 | |
| Konische Röhren (15 mL) | Corning | 430052 | |
| Konische Röhren (50 mL) | Corning | 430290 | |
| Deionisiertes destilliertes Wasser | Unser deionisiertes destilliertes Wasser wird intern mit einem Milli-Q-System produziert (Spalte 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Spalte 2: Prepak, SN: F1CB11442) | ||
| Charakterisiertes fetales Rinderserum | Cytiva | SH30396.03 | |
| Graduierte Zylinder (50 mL) | VITLAB | 64804 | |
| Hämatoxylin Gill II | Leica | 3801522 | |
| Hyclone Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium mit hohem Glukosespiegel | Cytiva | SH30243.02 | |
| Lipofectamin 2000 Transfektionsreagenz | Invitrogen | 11668019 | Transfektionsreagenz |
| MDA-5 (D74E4) Rabbit mAb | Zell-Signaltechnik | 5321 | |
| Mikrozentrifugenröhren (1,5 mL Eppendorf-Röhren) | AXYGEN | 142503 | |
| Opti-MEM I reduzierte Serummedium | Gibco | 31985070 | |
| Orbitalshaker (optional) | FIRSTEK | S300R | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 4 % in 1x PBS | |
| PBS | PRO TECH | ME222605 | |
| pENTER-MDA5 | Vigene Biosciences Inc. | CH863586 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-035-003 | |
| Pipettencontroller | Thermowissenschaftlich | 130165 | |
| Pipetten | GILSON | ||
| Pipetten und Pipettenspitzen (10 & Mikro; L) | QSP | 104-Q | |
| Pipetten und Pipettenspitzen (200 & Mikro; L) | QSP | T090-Q | |
| Pipetten und Pipettenspitzen (1000 & micro; L) | QSP | 111-Q | |
| Serologische Pipetten (5 mL) | SPL | 91005 | |
| Serologische Pipetten (10 ml) | SPL | 91010 | |
| Serologische Pipetten (25 ml) | SPL | 91025 | |
| SignalStain-DAB-Substrat-Kit | Zellsignalisierung | 8059 | 0,3 % in PBS |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
