Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern mittels HeLa-Zellen und Immunzytochemie mit Lichtmikroskopie

Idiopathische inflammatorische Myopathien (IIM), allgemein als Myositis bezeichnet, sind eine heterogene Gruppe von Autoimmunerkrankungen, die durch chronische Muskelentzündungen, variable klinische Manifestationen und unterschiedliche therapeutische Ergebnisse gekennzeichnet sind. Häufige Symptome sind Muskelschwäche, verminderte Ausdauer und Myalgie¹. Zu den primären Subtypen der IIM gehören Polymyositis (PM) und Dermatomyositis (DM), während sich die klinisch amyopathische Dermatomyositis (CADM) durch charakteristische Hautausschläge auszeichnet, die denen bei DM ähneln, jedoch mit minimaler oder keiner Muskelbeteiligung. Eine der Hauptkomplikationen bei PM, DM und CADM ist die interstitielle Lungenerkrankung (ILD), von der etwa 40 % der Patienten betroffen sind und die mit einer erhöhten Mortalität einhergeht².

Der klinische Verlauf und die Prognose der ILD bei IIM sind sehr unterschiedlich. ILD, die mit DM und CADM (DM-/CADM-ILD) assoziiert sind, sind tendenziell therapieresistenter und haben eine schlechtere Prognose im Vergleich zu PM-assoziierten ILD. Unter diesen ist die akute oder subakute ILD, die innerhalb von drei Monaten schnell fortschreitet³, besonders schwerwiegend, mit einer berichteten Fünf-Jahres-Überlebensrate von nur 52 %, verglichen mit 87 % bei chronischer ILD, die langsam fortschreitet oder stabil bleibt. Die schnell progrediente ILD (RP-ILD), ein Subtyp der akuten/subakuten ILD, ist gekennzeichnet durch ein schnelles Auftreten von Dyspnoe und ausgedehnte Alveolarschäden, die in der Thoraxbildgebung sichtbar sind. RP-ILD ist eine lebensbedrohliche Erkrankung mit schlechter Prognose, was die dringende Notwendigkeit einer frühzeitigen Diagnose und eines raschen Eingreifens unterstreicht, um die Ergebnisse für die Patienten zu verbessern ^4,5,6.

Myositis-spezifische Autoantikörper (MSAs) haben sich als kritische Biomarker bei Myositis-assoziierter ILD herausgestellt, wobei Anti-MDA5-Autoantikörper eine besonders wichtige Rolle spielen. Diese Autoantikörper werden häufig bei Patienten mit PM-/DM-/CADM-ILD nachgewiesen und dienen als wichtige prognostische Indikatoren für RP-ILD ^7,8,9. MDA5 (Melanoma differentiation-associated gene 5) ist ein zytosolischer Mustererkennungsrezeptor, der von einem Interferon-induzierbaren Gen kodiert wird, das virale und mitochondriale doppelsträngige RNA erkennt und Interferon-vermittelte Immunantworten auslöst¹⁰. Obwohl die genauen pathogenen Mechanismen unklar bleiben, wird angenommen, dass Anti-MDA5-Autoantikörper die MDA5-Funktion stören und damit zur Autoimmunpathogenese beitragen.

Der rechtzeitige Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern ist für die frühzeitige Identifizierung und Behandlung von RP-ILD unerlässlich. Traditionell gilt die radioaktiv markierte Immunpräzipitation (IP) unter Verwendung von ³⁵S-Methionin-markierten K562-Zellextrakten als Goldstandard für den Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern¹¹. Für den routinemäßigen klinischen Einsatz ist diese Methode jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten, der Abhängigkeit von Spezialgeräten und geschultem Personal, der strengen Vorschriften zur Entsorgung radioaktiver Abfälle und der begrenzten Haltbarkeit von radioaktiv markierten Reagenzien unpraktisch. In der klinischen Praxis werden häufig Blot-Assays als Alternativen eingesetzt; Sie sind jedoch mit einer hohen falsch-positiven Rate für Anti-MDA5-Autoantikörper verbunden^12,13, was Bedenken hinsichtlich der diagnostischen Genauigkeit aufkommen lässt. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem zuverlässigen, nicht-radioaktiven Bestätigungstest, um positive Ergebnisse zu validieren und die diagnostische Sicherheit zu verbessern.

Um diese Lücke zu schließen, schlagen wir die Verwendung der Immunzytochemie (ICC) als ergänzenden Bestätigungstest für Anti-MDA5-Autoantikörper vor. Bei diesem Ansatz werden HeLa-Zellen mit einem MDA5-Konstrukt transfiziert, die Zellen mit Patientenplasma inkubiert und gebundene Anti-MDA5-Autoantikörper unter Verwendung von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Meerrettichperoxidase) in Kombination mit einem chromogenen Substrat zur Visualisierung unter Lichtmikroskopie nachgewiesen. ICC bietet eine nicht-radioaktive, hochempfindliche und standardisierte Plattform für die Visualisierung von Anti-MDA5-Autoantikörpern in zellulären Kompartimenten. Durch die Integration von ICC in den Blot-Assay zielt diese Methode darauf ab, die Falsch-Positiv-Raten zu reduzieren, die diagnostische Genauigkeit zu verbessern und letztendlich das klinische Management und die Ergebnisse für die Patienten zu verbessern.

Das Ziel dieser Studie ist es, ein robustes, nicht-radioaktives Protokoll für den Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern zu etablieren, das die Grenzen der derzeitigen Nachweismethoden überwindet und Ärzten ein praktisches und zuverlässiges Werkzeug für die Frühdiagnose von RP-ILD bei Patienten mit PM, DM und CADM bietet. In der begleitenden Videoerzählung wird dieser lebensbedrohliche Verlauf umgangssprachlich als "schneller Tod" bezeichnet; Wissenschaftlich entspricht es der schnell fortschreitenden ILD (RP-ILD). Diese Arbeit baut auf bestehenden Erkenntnissen auf und hat das Potenzial, die prognostische Bewertung und therapeutische Entscheidungsfindung in der klinischen Praxis erheblich zu verbessern.

1. Zellkultur und Transfektion

1. Bewahren Sie HeLa-Zellen mit Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ auf.
2. Durchgang der Zellen alle 2-3 Tage oder wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % bis 100 % erreichen.
3. 7 × 10⁴ HeLa-Zellen in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte (1,9 cm²/Well) 24 h vor der Transfektion säen, damit die Zellen eine Konfluenz von etwa 90 % erreichen.
4. 500 ng Plasmid (pENTER-MDA5) und 1,5 μl Transfektionsreagenz werden in jeweils 25 μl reduziertem Serummedium verdünnt.
5. Verdünnte DNA zum verdünnten Transfektionsreagenz hinzufügen (Verhältnis 1:1). Gut mischen und 5 min inkubieren.
6. Geben Sie die Mischung zu den Zellen, die einen Tag zuvor ausgesät wurden, und rühren Sie, um den DNA-Lipid-Komplex sofort zu mischen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen zu 80 % bis 90 % konfluent sind.
7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ für 24 Stunden und fahren Sie mit der Durchführung der ICC fort.
   HINWEIS: Wir haben einen kommerziell erhältlichen Vektor (pEnter-MDA5) verwendet. Weitere Informationen finden Sie in der Werkstofftabelle. Die Wirksamkeit der Transfektion beträgt ~50%.
   Der Erfolg der Transfektion und Expression des Zielproteins kann bestimmt werden, indem die Zellen mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Plasmid transfiziert und ein Western Blot durchgeführt wird, um die Expression des Zielproteins sichtbar zu machen.

2. Fixierung der Zellen

1. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation 2x mit PBS, um alle Medienreste zu entfernen.
   HINWEIS: Das Waschen kann durch Schütteln der Platte auf einem Orbitalschüttler durchgeführt werden.
2. Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig. Verwenden Sie geeignete Handhabungsrichtlinien.
3. Aspirieren Sie das Fixierreagenz und verwenden Sie PBS, um die Zellen 2x zu waschen.

3. Permeabilisierung der Zellen

1. Geben Sie Triton X-100 Reagenz (0,3% PBS) hinzu und lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen.
2. Nach 10 Minuten das Reinigungsmittel entsorgen.
3. Fügen Sie PBS hinzu, um die Zellen einmal zu waschen.

4. Zell-Blockierung

1. Führen Sie eine Blockierung mit 10 % fötalem Rinderserum in PBS (1x) durch und inkubieren Sie die Zellen 1 h lang bei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie das Blockierungsreagenz und fügen Sie dann PBS hinzu, um die Zellen einmal zu waschen.

5. Hybridisierung des Antikörpers des Patienten

1. Geben Sie das verdünnte Patientenplasma in die Zellen. Achten Sie darauf, die Patientenprobe (1:5.000 Verdünnung in PBS) vor der Anwendung in PBS zu verdünnen.
   HINWEIS: Passen Sie die Verdünnung an, um das Signal zu verstärken oder den Hintergrund nach Bedarf zu reduzieren. Um unverfälschte Ergebnisse zu gewährleisten, wussten die Mitarbeiter, die die Tests durchführten, nicht, welche Proben zu den Patienten gehörten und welche von gesunden Personen stammten.
2. Die Probe wird bei 4 °C für 12-16 h (über Nacht) inkubiert.
3. Nach der Inkubationszeit die Patientenprobe entnehmen und die Zellen 3x mit PBS waschen.

6. Hybridisierung von Sekundärantikörpern

1. Behandeln Sie die Zellen mit verdünntem Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG (1:250 Verdünnung in PBS) und lassen Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur stehen.
2. Eine Stunde später entsorgen Sie die Sekundärantikörper.
3. Spülen Sie mit PBS 3x.

7. Zellfärbung

1. Färben Sie die Zellen nach dem Waschen der Zellen mit 300 μl DAB-Arbeitslösung/-Vertiefung.
   HINWEIS: Diese Lösung wurde durch Mischen von DAB-Chromogenkonzentrat und DAB-Verdünnungsmittel gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.
2. Nachdem Sie die Zellen 5 Minuten lang gefärbt haben, entfernen Sie den Farbstoff, spülen Sie ihn mit entionisiertem destilliertem Wasser ab und schütteln Sie ihn 5 Minuten lang.

8. Gegenfärbung von Zellen

1. Den Zellkern mit verdünntem Hämatoxylin gegenfärben.
   HINWEIS: Wir verwenden Hämatoxylin Gill II in einer 10-fachen Verdünnung und warten 5 Minuten auf den Färbeprozess.
2. Nach 5 min das Hämatoxylin entsorgen, anschließend 2 x 5 min mit entionisiertem destilliertem Wasser waschen.

9. Beobachtung

1. Beobachten Sie das Färbeergebnis mit einem optischen Mikroskop.
   HINWEIS: Ein richtig positives Ergebnis zeigt eine starke braune Färbung in HeLa-Zellen, die MDA5 exprimieren; dies bestätigt die Anti-MDA5-Autoantikörper in der Probe des Patienten. Ein negatives Ergebnis zeigt HeLa-Zellen ohne braune Färbung, was auf keine Anti-MDA5-Autoantikörper hinweist. Ein falsch-positives Ergebnis zeigt eine ausgedehnte Braunfärbung in allen Zellen, unabhängig von der MDA5-Expression. Diese unspezifische Färbung, die bei anderen Autoimmunerkrankungen auftritt, muss von einer echten positiven Färbung unterschieden werden, um Fehldiagnosen zu vermeiden.

Das Personal, das die Tests durchführte, wurde für die Identitäten der Proben, einschließlich der spezifischen Patienten, von denen sie gewonnen wurden, verblindet, um mögliche Verzerrungen im Bewertungsprozess zu minimieren. Die gesunden Kontrollproben wurden zwar keiner Verblindung unterzogen, lieferten aber durchweg klare und eindeutige Ergebnisse.

Abbildung 1A zeigt die erfolgreiche Expression von MDA5 in HeLa-Zellen, die mit dem pENTER-MDA5-Konstrukt transfiziert wurden. Um die Wirksamkeit der Transfektion zu validieren, wurde die ICC mit einem kommerziellen Anti-MDA5-Antikörper durchgeführt. In etwa 50% der transfizierten Zellen wurde eine starke braune zytoplasmatische Färbung beobachtet, was auf eine robuste MDA5-Proteinexpression hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten nicht-transfizierte Zellen, die unter identischen Bedingungen verarbeitet wurden, keine zytoplasmatische Färbung, was die Spezifität des Antikörpers und das Fehlen einer endogenen MDA5-Expression bestätigt.

Gemäß dem ICC-Protokoll zeigten repräsentative Proben von anti-MDA5-positiven Patienten, die durch radioaktiv markierte Immunpräzipitation bestätigt wurden, eine klare braune zytoplasmatische Färbung in MDA5-exprimierenden HeLa-Zellen, während nicht transfizierte Zellen ungefärbt blieben (Abbildung 1B). Dieses Färbemuster weist auf das Vorhandensein von Anti-MDA5-Autoantikörpern im Patientenplasma hin und stimmt mit dem etablierten Goldstandard-Nachweis mit 35S-Methionin-markierten K562-Zellextrakten überein.

Die Patientenmerkmale sind in der ergänzendenTabelle S1 zusammengefasst, in der die klinischen Diagnosen, der Status des Anti-MDA5-Antikörpers und die Einteilung in drei Gruppen aufgeführt sind: Anti-MDA5-positiv, falsch-positiv und gesunde Kontrolle. Zusätzlich zum Antikörperstatus fasst die ergänzende Tabelle S1 nun auch die Demografie der Patienten zusammen, einschließlich Alter, Geschlecht und zugrunde liegender Diagnose für jede Kohorte. Die Antikörperreaktivität wurde semi-quantitativ als schwach (1+), mäßig (2+) oder stark (3+) eingestuft, basierend auf der Bandenintensität, was einen Anstieg der Antikörperspiegel widerspiegelt. Dies bietet einen klinischen Kontext für die Interpretation der ICC-Ergebnisse, während der primäre methodische Schwerpunkt der vorliegenden Studie beibehalten wird. Die Studienkohorte umfasste 10 Patienten mit bestätigten Anti-MDA5-Autoantikörpern (positive Gruppe), fünf Patienten mit Autoimmunerkrankungen, die durch kommerzielle Blot-Tests falsch-positive Ergebnisse lieferten (falsch-positive Gruppe) und 10 gesunde Personen (gesunde Kontrollgruppe). Jede Probe wurde zusammen mit Positiv- und Negativkontrollen getestet und unabhängig voneinander mittels radioaktiv markierter Immunpräzipitation verifiziert. Für Proben mit eindeutigen und schlüssigen Färbeergebnissen wurde ein einziger ICC-Lauf als ausreichend erachtet. In Fällen, in denen die Färbung mehrdeutig oder grenzwertig war, wurden weitere Tests durchgeführt, einschließlich serieller Verdünnungen und replizierter ICC-Assays, um eine genaue Interpretation zu gewährleisten. Dieser Ansatz gewährleistete sowohl methodische Strenge als auch Ressourceneffizienz bei der Validierung der Leistung der ICC-basierten Nachweismethode.

Falsch-positive Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. In diesen Proben wurde Plasma von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen als idiopathischen entzündlichen Myopathien (IIM) verwendet. Im Gegensatz zu Abbildung 1 wurde die braune zytoplasmatische Färbung in allen Zellen umfassend beobachtet, unabhängig vom MDA5-Expressionsstatus. Dieses Färbemuster deutet auf eine unspezifische Bindung hin und unterstreicht das Potenzial für falsch positive Ergebnisse in Proben von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen. Negative Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt, in der Plasma von gesunden Personen getestet wurde. Weder in transfizierten noch in nicht transfizierten HeLa-Zellen wurde eine braune zytoplasmatische Färbung beobachtet, was auf das Fehlen von Anti-MDA5-Autoantikörpern in diesen Proben hinweist.

Abbildung 1: Validierung der MDA5-Expression und Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern mittels ICC. (A) HeLa-Zellen, die mit einem MDA5-exprimierenden Plasmid transfiziert wurden, wurden mit einem kommerziellen Anti-MDA5-Antikörper gefärbt. Es wurde eine starke braune zytoplasmatische Färbung beobachtet, die auf eine robuste MDA5-Proteinexpression hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten nicht-transfizierte Zellen, die unter identischen Bedingungen verarbeitet wurden, keine Färbung, was sowohl die Antikörperspezifität als auch das Fehlen einer endogenen MDA5-Expression bestätigt. (B) Mit MDA5 transfizierte HeLa-Zellen wurden mit Plasma von Patienten inkubiert, die durch radioaktiv markierte Immunpräzipitation als anti-MDA5-positiv bestätigt wurden. Es wurde eine deutliche zytoplasmatische Braunfärbung beobachtet, die das Vorhandensein von Anti-MDA5-Autoantikörpern in der Patientenprobe zeigt. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzung: ICC = Immunzytochemie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Nachweis falsch-positiver Signale mittels Plasma von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen als IIM. Eine weit verbreitete braune zytoplasmatische Färbung wurde sowohl in transfizierten als auch in nicht transfizierten Zellen beobachtet, was auf eine unspezifische Antikörperbindung hindeutet. Diese Ergebnisse verdeutlichen das Potenzial für einen falsch-positiven Nachweis in Line-Blot-Assays bei der Verwendung von Plasma von Patienten mit Autoimmunerkrankungen, die nicht mit anti-MDA5-positiven IIM-Patienten verwandt sind. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzung: IIM = idiopathische entzündliche Myopathien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Negative Färbeergebnisse mit Plasma von gesunden Kontrollpersonen. HeLa-Zellen, die mit MDA5 transfiziert und mit Plasma von gesunden Personen inkubiert wurden, zeigten wenig bis gar keine braune zytoplasmatische Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle S1: Patientenmerkmale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Teile dieses Manuskripts wurden mit Hilfe von GPT-4 von OpenAI erstellt. Die Autoren haben den Inhalt überprüft und überarbeitet, um Genauigkeit und Originalität zu gewährleisten.