Methodenartikel

Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern mittels HeLa-Zellen und Immunzytochemie mit Lichtmikroskopie

DOI:

10.3791/67575

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31. Oktober 2025

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1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir bieten eine Schritt-für-Schritt-Methode der Immunzytochemie (ICC) zum Nachweis von Anti-MDA5 an. Dieser Ansatz umfasst Zellfixierung, Permeabilisierung, Antikörperinkubation und bildgebende Verfahren, die den genauen Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern ermöglichen und die Diagnose einer schnell fortschreitenden interstitiellen Lungenerkrankung bei Myositis-Patienten unterstützen.

Zusammenfassung

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Anti-MDA5-Autoantikörper sind wichtige Biomarker für Dermatomyositis (DM), amyopathische Dermatomyositis (CADM) und Polymyositis (PM), insbesondere bei der Identifizierung von Patienten mit einem Risiko für eine schnell fortschreitende interstitielle Lungenerkrankung (RP-ILD). Die frühzeitige Erkennung dieser Autoantikörper ist für die Verbesserung der Patientenergebnisse unerlässlich, da eine verzögerte Diagnose oft zu schlechten Prognosen führt. Derzeit ist der Radioimmunoassay der Goldstandard für den Nachweis von Anti-MDA5, aber sein Einsatz ist durch hohe Kosten, langwierige Verfahren und den Bedarf an spezialisiertem Fachwissen eingeschränkt. Darüber hinaus weist der Blot-Test, ein weit verbreitetes klinisches Instrument, eine hohe Falsch-Positiv-Rate für MDA5-Autoantikörper auf, was die diagnostische Genauigkeit beeinträchtigen kann. Um diese Einschränkungen zu beheben, schlagen wir eine nicht-radioaktive, hochempfindliche und standardisierte Bestätigungstestmethode mit Hilfe der Immunzytochemie (ICC) vor. Dieses Protokoll umfasst die Behandlung von HeLa-Zellen mit einem MDA5-Konstrukt, die Permeabilisierung der Zellen mit Triton X-100, um die Bindung von primären Anti-MDA5-Autoantikörpern zu erleichtern, und den Nachweis gebundener Antikörper unter Verwendung von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Meerrettichperoxidase) mit DAB-Chromogen für die Mikroskopie-Bildgebung. ICC bietet einen praktischen, kostengünstigen und hochempfindlichen Ansatz zur Visualisierung von Anti-MDA5-Autoantikörpern in zellulären Strukturen. Durch die Integration von ICC als ergänzendes Bestätigungsverfahren zielt diese Studie darauf ab, die Zuverlässigkeit des Anti-MDA5-Nachweises zu erhöhen und dadurch die diagnostischen und prognostischen Strategien für RP-ILD bei DM-, CADM- und PM-Patienten zu verbessern.

Einleitung

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Idiopathische inflammatorische Myopathien (IIM), allgemein als Myositis bezeichnet, sind eine heterogene Gruppe von Autoimmunerkrankungen, die durch chronische Muskelentzündungen, variable klinische Manifestationen und unterschiedliche therapeutische Ergebnisse gekennzeichnet sind. Häufige Symptome sind Muskelschwäche, verminderte Ausdauer und Myalgie1. Zu den primären Subtypen der IIM gehören Polymyositis (PM) und Dermatomyositis (DM), während sich die klinisch amyopathische Dermatomyositis (CADM) durch charakteristische Hautausschläge auszeichnet, die denen bei DM ähneln, jedoch mit minimaler oder keiner Musk....

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Protokoll

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1. Zellkultur und Transfektion

  1. Bewahren Sie HeLa-Zellen mit Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 auf.
  2. Durchgang der Zellen alle 2-3 Tage oder wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % bis 100 % erreichen.
  3. 7 × 104 HeLa-Zellen in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte (1,9 cm2/Well) 24 h vor der Transfektion säen, damit die Zellen eine Konfluenz von etwa 90 % erreichen.
  4. 500 ng Plasmid (pENTER-MDA5) und 1,5 μl Transfektionsreagenz werden in jeweils....

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Ergebnisse

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Das Personal, das die Tests durchführte, wurde für die Identitäten der Proben, einschließlich der spezifischen Patienten, von denen sie gewonnen wurden, verblindet, um mögliche Verzerrungen im Bewertungsprozess zu minimieren. Die gesunden Kontrollproben wurden zwar keiner Verblindung unterzogen, lieferten aber durchweg klare und eindeutige Ergebnisse.

Abbildung 1A zeigt die erfolgreiche Expression v.......

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Diskussion

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Unsere ICC-basierte Technik zur Identifizierung von Anti-MDA5-Autoantikörpern bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden wie der Line-Blot-Analyse und dem Radioimmunoassay. Zuvor berichteten Nombel et al. über Sensitivitäts- und Spezifitätswerte von 96 % bzw. 100 %, indem sie die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) an MDA5-transfizierten Zellen mit ELISA in einer Kohorte von 23 Anti-MDA5-positiven Dermatomyositis-Patienten und 22 Anti-MDA5-negativen Kontrollen verglichen

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Teile dieses Manuskripts wurden mit Hilfe von GPT-4 von OpenAI erstellt. Die Autoren haben den Inhalt überprüft und überarbeitet, um Genauigkeit und Originalität zu gewährleisten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des taiwanesischen National Science and Technology Council unterstützt, die Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 und NSTC 113-2320-B-039-032) gewährt wurden. Diese Studie wurde auch teilweise durch Zuschüsse der China Medical University and Hospital unterstützt, die Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 und C1110812016-12) gewährt wurden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-Platten (1,9 cm²/brunnen)Corning354541
Antibiotikum-AntimykotikumGibco15240062
BecherPYREX1000-600
Konische Röhren (15 mL)Corning430052
Konische Röhren (50 mL)Corning430290
Deionisiertes destilliertes WasserUnser deionisiertes destilliertes Wasser wird intern mit einem Milli-Q-System produziert (Spalte 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Spalte 2: Prepak, SN: F1CB11442)
Charakterisiertes fetales RinderserumCytivaSH30396.03
Graduierte Zylinder (50 mL)VITLAB64804
Hämatoxylin Gill IILeica3801522
Hyclone Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium mit hohem GlukosespiegelCytivaSH30243.02
Lipofectamin 2000 TransfektionsreagenzInvitrogen11668019Transfektionsreagenz
MDA-5 (D74E4) Rabbit mAbZell-Signaltechnik5321
Mikrozentrifugenröhren (1,5 mL Eppendorf-Röhren)AXYGEN142503
Opti-MEM I reduzierte SerummediumGibco31985070
Orbitalshaker (optional)FIRSTEKS300R
ParaformaldehydSigma-Aldrich4 % in 1x PBS
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
PipettencontrollerThermowissenschaftlich130165
Pipetten GILSON
Pipetten und Pipettenspitzen (10 & Mikro; L)QSP104-Q
Pipetten und Pipettenspitzen (200 & Mikro; L)QSPT090-Q
Pipetten und Pipettenspitzen (1000 & micro; L)QSP111-Q
Serologische Pipetten (5 mL)SPL91005
Serologische Pipetten (10 ml)SPL91010
Serologische Pipetten (25 ml)SPL91025
SignalStain-DAB-Substrat-KitZellsignalisierung80590,3 % in PBS

Referenzen

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  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
  2. Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R.

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Schlagwörter

Immunzytochemischer Assayinterstitielle LungenerkrankungDermatomyositis BiomarkerTriton X 100 PermeabilisierungMeerrettichperoxidase NachweisDAB Chromogen F rbungSekund rantik rper Markierung

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