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Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden zur Untersuchung der Genfunktion

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DOI:

10.3791/67598

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29. November 2024

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1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir die akute genetische Manipulation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden durch Elektroporation vor. Diese kortikalen Organoidmodelle eignen sich besonders gut für die Injektion, da ventrikelähnliche Strukturen nach dem Schneiden leicht identifiziert werden können, was die funktionelle Untersuchung der kortikalen Entwicklung des Menschen, neurologischer Entwicklungsstörungen und der kortikalen Evolution ermöglicht.

Zusammenfassung

Menschliche kortikale Organoide sind zu wichtigen Werkzeugen für die Erforschung der menschlichen Gehirnentwicklung, der neurologischen Entwicklungsstörungen und der Evolution des menschlichen Gehirns geworden. Studien, die die Genfunktion durch Überexpression oder Knockout analysieren, haben in Tiermodellen maßgeblich dazu beigetragen, mechanistische Einblicke in die Regulation der Neokortex-Entwicklung zu liefern. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für den CRISPR/Cas9-vermittelten akuten Gen-Knockout durch Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden vor. Das Schneiden von kortikalen Organoiden hilft bei der Identifizierung ventrikelähnlicher Strukturen für die Injektion und anschließende Elektroporation, was es zu einem besonders geeigneten Modell für die akute genetische Manipulation während der kortikalen Entwicklung des Menschen macht. Wir beschreiben das Design von Guide-RNAs und die Validierung der Targeting-Effizienz in vitro und in kortikalen Organoiden. Die Elektroporation von kortikalen Organoiden wird in mittleren neurogenen Stadien durchgeführt, was das Targeting der meisten wichtigen Zellklassen im sich entwickelnden Neokortex ermöglicht, einschließlich apikaler radialer Gliazellen, basaler Vorläuferzellen und Neuronen. Zusammengenommen stellt die Elektroporation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden eine leistungsfähige Technik dar, um die Genfunktion, die Genregulation und die Zellmorphologie während der kortikalen Entwicklung zu untersuchen.

Einleitung

Der Neokortex bezieht sich auf die äußere Hülle der Gehirnhälften und ist eine Struktur, die nur bei Säugetieren vorkommt. Der Neokortex stellt den Sitz der höheren kognitiven Funktionendar 1,2,3,4,5. Während der Entwicklung entstehen aus neuralen Stamm- und Vorläuferzellen Neuronen, ein Prozess, der als Neurogenese bezeichnet wird. Funktionelle Studien, die die Entwicklung des menschlichen Neokortex untersuchen, bilden die Grundlage für die Aufklärung der Mechanismen, die der Regulation menschlicher neuraler Stammzellen, neuronaler Pathologien und der Evolution des menschlichen Gehirns zugrunde liegen 2,6,7.

In der Vergangenheit stützten sich Studien zur Entwicklung des menschlichen Gehirns auf deskriptive histologische Ansätze unter Verwendung von postmortalem Gewebe, wobei neuere frei schwebende Gewebekultursysteme funktionelle Untersuchungen mit menschlichem fötalem Gewebe ermöglichten 8,9. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass menschliches fötales Hirngewebe die Fähigkeit besitzt, sich selbst zu langfristig expandierenden Organoiden zu organisieren10. Die Forschung an fötalem Gewebe hat wichtige Einblicke in die menschliche Entwicklung geliefert11,12, doch die eingeschränkte Verfügbarkeit von Gewebe und ethische Erwägungen schränken ihre breite Anwendung für mechanistische Studien der menschlichen Gehirnentwicklung ein. In den letzten zehn Jahren wurden Protokolle entwickelt, die die Erzeugung dreidimensionaler neuronaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) ermöglichen, einschließlich humaner induzierter PSC (hiPSC)13,14.

Zerebrale Organoide weisen wichtige Merkmale des sich entwickelnden Gehirns auf, wie z. B. die Bildung ventrikelähnlicher Strukturen, die apikobasale Polarität, die kortikale Zytoarchitektur, die interkinetische Kernmigration während der radialen Gliateilung und die neuronale Migration. Wichtig ist, dass diese neuen menschlichen Organoidmodelle Merkmale des sich entwickelnden menschlichen Gehirns rekapitulieren, die bei der Maus nicht gut modelliert sind, einschließlich evolutionär relevanter wichtiger neuronaler Vorläufertypen, insbesondere der basalen radialen Gliazellen (oder der äußeren radialen Glia)7,14,15. Mehrere Einschränkungen der frühen zerebralen Organoid-Protokolle - wie z. B. Probleme mit der Heterogenität von Organoiden, eine begrenzte Nährstoffversorgung des inneren Kerns und eine unterschiedliche regionale Identität - wurden in den jüngsten Protokollfortschritten behoben, und weitere Verbesserungen sind in den kommenden Jahren zu erwarten 15,16,17,18,19. Menschliche zerebrale und kortikale Organoide sind schnell zu Schlüsselmodellen geworden, um die kortikale Entwicklung des Menschen20, neurologische Störungen 21,22,23,24 und die Evolution des Gehirns 25,26,27,28,29 zu untersuchen und groß angelegte Screening-Ansätze durchzuführen 30,31,32.

Für die akute genetische Manipulation wurden in Tiermodellen der Neokortex-Entwicklung hauptsächlich zwei Methoden verwendet: die Virusverabreichung durch Infektion von Zielzellen33 und die In-utero- oder In-vitro-Elektroporation 34,35. Die Injektion von DNA - und in jüngerer Zeit von CRISPR/Cas9-Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexen36 - in die Seitenventrikel, gefolgt von einer Elektroporation, bietet den Vorteil, dass bestimmte Regionen des Gehirns basierend auf der Ausrichtung der Elektroporationselektroden gezielt angesprochen werden können. Bei der Elektroporation handelt es sich um kurze elektrische Impulse, die die Durchlässigkeit der Zellmembran vorübergehend erhöhen und das Einbringen von DNA und anderen geladenen Molekülen in die Zellen ermöglichen. Die In-utero-Elektroporation wurde erstmals an der Mausdurchgeführt 37, wo sie schnell zu einer weit verbreiteten Methode für die Entwicklungsneurobiologie wurde. Die Methode wurde später auch auf andere Spezies angewendet, wie z.B. die Ratte38,39 und das Frettchen 40,41,42, eine gyrenzephale Spezies, die zur Untersuchung der Neokortexexpansion und der kortikalen Faltung verwendet wird 3,43,44,45.

Die Elektroporation ist auch zu einer wichtigen Methode in der Organoidforschung des menschlichen Gehirns geworden46. In zerebralen Organoiden wurde die Elektroporation zur Visualisierung der Zellmorphologie und der neuronalen Axone14,47, zur Abgabe von Gen-Knockdown-Reagenzien(22,48,49) und zur Untersuchung der Genfunktion durch Überexpression(50) eingesetzt. Die Methode ist nicht auf Humanmodelle beschränkt, sondern wurde auch zur genetischen Modifikation von zerebralen Organoiden von Primaten eingesetzt50,51. Darüber hinaus wurde die Elektroporation von kortikalen Organoiden, die in einem Spin Ω Spinning-Bioreaktor erzeugt werden, beschrieben52.

In diesem Protokoll skizzieren wir die Elektroporation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden15 für Studien der Genfunktion in der kortikalen Entwicklung. Hirnregionen-spezifische Organoide erhöhen die Reproduzierbarkeit und Konsistenz, was für den Erfolg quantitativer Analysen, zum Beispiel bei der Modellierung von Krankheiten, entscheidend ist. In dem in Schnitte geschnittenen humanen kortikalen Organoid-Protokoll15 werden während der iPSC-Differenzierung potente Musterungsreize angewendet, um eine homogene Population von dorsalen Vorläuferzellen des Vorderhirns zu erhalten, gefolgt von der Anwendung von Nährmedien, die das Gewebewachstum mit weniger instruktiven Signalen fördern53,54. Es wurde gezeigt, dass das Schneiden von kortikalen Organoiden den Zelltod reduziert, der aus einer verminderten Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff im Organoidkern resultiert15. Darüber hinaus unterstützt das Slicing die Entwicklung ventrikelähnlicher Strukturen, die reichlich basale radiale Gliazellen enthalten, wobei eine anhaltende Neurogenese zur Bildung einer erweiterten kortikalen plattenartigen Region führt15. Durch das wiederholte Schneiden in diesem Protokoll eignen sich diese kortikalen Organoide auch besonders gut für die Elektroporation, da die Ventrikellumen leicht identifiziert und durch Injektion gezielt werden können. Die Elektroporation von geschnittenen kortikalen Organoiden wurde zur Untersuchung genregulatorischer Regionen und der kortikalen Evolution eingesetzt 26,55.

Während des Elektroporationsverfahrens wird die Injektionsmischung in das Lumen ventrikelähnlicher Strukturen abgegeben. Bei Anlegen eines gepulsten elektrischen Feldes wird das Gemisch von apikalen radialen Gliazellen aufgenommen, die den Ventrikel auskleiden. Wenn sich apikale radiale Gliazellen teilen und verbindlichere Zelltypenentstehen 4, werden die elektroporierten Wirkstoffe an basale Vorläuferzellen und Neuronen weitergegeben. Elektroporierte Nachkommen sind nach 3 Tagen in der ventrikulären Zone (VZ) und der subventrikulären Zone (SVZ) verteilt und erstrecken sich 7 Tage nach der Elektroporation während der mittleren neurogenenStadien über den größten Teil der kortikalen Wand, einschließlich der kortikalen Platte (CP)-ähnlichen Region.

Hier beschreiben wir die CRISPR/Cas9-vermittelte Genstörung56 durch Elektroporation in geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden26. Darüber hinaus kann die Elektroporationsmethode auch zur Genüberexpression, zur Visualisierung der Zellmorphologie und zellulärer Prozesse durch Expression fluoreszierender Proteine, zur Bereitstellung von Plasmidbibliotheken für Massive Parallel Reporter Assays (MPRA), zur Bereitstellung von Epigenom-Editing-Werkzeugen und zur Markierung von Zellen für die Live-Bildgebung eingesetzt werden.

Protokoll

Alle Experimente mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die in der Helsinki-Erklärung von 1964 festgelegt und von der Ethikprüfungskommission des Universitätsklinikums Dresden genehmigt wurden (IRB00001473; IORG0001076; ethische Zulassungsnummer SR-EK-456092021).

1. Design von Guide-RNAs für den akuten CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Knockout

  1. Entwerfen Sie ein Paar von Guide-RNAs (gRNAs), die auf dasselbe Exon abzielen, mit einem Abstand von idealerweise 7-11 bp (Vermeidung von Vielfachen von 3 bp) zwischen den protospacerbenachbarten Motiven (PAMs), um die Wahrscheinlichkeit eines Proteinaufschlusses mithilfe von Software oder Online-Tools zu erhöhen.
    HINWEIS: Im Idealfall sollten Exons, die funktionale Domänen kodieren, als Ziel verwendet werden. Alternativ können auch die ersten Exons des Transkripts gewählt werden (Abbildung 1A). Wählen Sie die Leit-RNAs basierend auf dem Aktivitäts-Score (nahe 1)57 und dem Spezifitäts-Score (nahe 100 %)58 aus.

2. Kultivierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen

  1. Zur Erzeugung humaner kortikaler Organoide und zur Validierung der gRNA-Funktion wird die hiPSC-Linie CRTDi004-A59 verwendet, die von einem gesunden Spender stammt.
  2. Die iPSCs werden wie zuvor beschrieben60 auf mit Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platten in Stammzellmedium unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO2) kultiviert. Induzierte PSCs sollten bei 80% Konfluenz unter Verwendung eines Enzyms zur Einzelzelldissoziation mit Supplementierung des ROCK-Signalweg-Inhibitors (1:1.000) während der ersten 24 Stunden passageiert werden.
    HINWEIS: Andere iPS-Linien können für die Organoidgenerierung und gRNA-Validierung verwendet werden.

3. Extraktion genomischer DNA aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

  1. Verwenden Sie 2 Wells mit 80 % bis 90 % konfluentem hiPSC einer 6-Well-Platte für die genomische DNA-Extraktion. Dissoziieren Sie die Zellen mit einem Enzym von der Platte, um eine einzellige Suspension herzustellen. Die Zellen werden in 1 ml Stammzellmedium (Gesamtvolumen) aufgenommen, dann 10 Minuten lang bei 600 x g geschleudert und der Überstand entfernt.
  2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 μl Lysepuffer (50 mM TrisHCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,5 % SDS, 5 mM EDTA in H2O) und 12,5 μl Proteinase K (10 mg/ml Stamm). 2 h bei 55 °C und 250 U/min inkubieren.
  3. 100 μl 5 mM NaCl untermischen. 10 min bei 18.000 x g bei 4 °C schleudern und den Überstand in neue 1,5 mL Reaktionsröhrchen überführen.
  4. 250 μl Isopropanol zugeben, die Röhrchen mehrmals umdrehen und 15 min bei 18.000 x g bei 4 °C schleudern.
  5. Den Überstand entfernen, mit 500 μl 70 % EtOH (molekularbiologische Qualität) waschen, die Röhrchen umdrehen und 10 min bei 18.000 x g bei 4 °C schleudern.
  6. Zum Schluss entfernen Sie den Überstand vollständig, indem Sie ihn vorsichtig abpipettieren und die geöffneten Reaktionsgefäße auf Küchenpapier drücken.
  7. Lassen Sie das Pellet 10 min bei RT an der Luft trocknen, dann lösen Sie das Pellet 30 min lang bei 37 °C in 100 μl nukleasefreiem Wasser auf.
  8. Messen Sie die Konzentration der DNA mit einem Spektrometer. Isolierte genomische DNA ist bei -20 °C mehrere Monate lang stabil.

4. Verifizierung der Template-Erkennung mittels gRNA (in vitro)

HINWEIS: Als ersten Ansatz zur Validierung einer erfolgreichen Template-Erkennung durch gRNAs wird eine in vitro Cas9-Reaktion durchgeführt, bei der doppelsträngige DNA in zwei Fragmente gespalten wird, die durch Agarose-Gelelektrophorese 40,61,62 unterschieden werden können.

  1. Um das Template zu generieren, führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit einem High-Fidelity-PCR-Mastermix und 10-μM-Primern an genomischer DNA durch, die aus hiPSC isoliert wurde (Abschnitt 3), unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 30 s, 40 Zyklen [98 °C, 10 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 min] und endgültige Elongation bei 72 °C für 5 min.
    1. Passen Sie die Glühtemperatur entsprechend den PCR-Primern an. Stellen Sie sicher, dass das Amplikon eine Größe von 800 bp bis 1,5 kb mit asymmetrischer Lokalisation der gRNA-Bindungsstellen aufweist.
    2. Das PCR-Produkt wird durch Gelelektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgelöst, die entsprechende Bande aus dem Gel geschnitten und die DNA26 extrahiert.
    3. Messen Sie die DNA-Konzentration des extrahierten PCR-Produkts mit einem Spektrometer.
  2. Assemblieren Sie die funktionelle gRNA durch Kombination von 10 μM CRISPR-RNA (crRNA, benutzerdefinierte Sequenz, 100 μM Stamm) und 10 μM tracrRNA (100 μM Stamm) in nukleasefreiem Duplexpuffer (5 μL Gesamtvolumen). Inkubieren Sie die Mischung 5 Minuten lang bei 95 °C und lassen Sie sie dann auf Raumtemperatur (RT) abkühlen.
  3. Erstellen Sie den Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex, indem Sie 10 μM der gRNA aus Schritt 4.2 und 1 μM Cas9-Enzym (aus Streptococcus pyogenes, 62 μM Stamm) in PBS für 15 Minuten bei RT (25 μL Gesamtvolumen) kombinieren.
  4. Um die In-vitro-Verdauungsreaktion durchzuführen, mischen Sie 1 μM des RNP-Komplexes (aus Schritt 4.3) mit 0,1 μM DNA-Template (PCR-Produkt aus Schritt 4.1) und 1x Cas9-Nuklease-Reaktionspuffer (enthält 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 6,5; kann in Aliquoten bei -20 °C gelagert werden).
    1. Bis zu einem Endvolumen von 10 μL mit nukleasefreiem Wasser auffüllen.
    2. Die Reaktion wird 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
    3. Fügen Sie 2 mg/ml Proteinase K hinzu und inkubieren Sie weitere 10 Minuten bei 56 °C, um das DNA-Substrat aus dem Cas9-Enzym freizusetzen. Lagern Sie das aufgeschlossene Reaktionsgemisch bis zur endgültigen Analyse bei 4 °C oder -20 °C.
      HINWEIS: Die Verwendung eines molaren Verhältnisses von Cas9-RNP:DNA-Substrat von 10:1 wird empfohlen, um die beste Spalteffizienz zu erzielen. Verdünnen Sie das PCR-Produkt bei Bedarf in nukleasefreiem Wasser auf die erforderliche Konzentration. Als Negativkontrolle kann ein Reaktionsgemisch mitgenommen werden, dem entweder das gRNA- oder das Cas9-Enzym fehlt.
  5. Visualisieren Sie gespaltene Produkte durch Agarosegelelektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel.
    HINWEIS: Idealerweise sollten zwei unterschiedlich große Banden sichtbar sein und die Template-Bande sollte verschwunden sein oder für effiziente gRNAs stark reduziert sein (Abbildung 1B).

5. Nachweis der gRNA-Funktion in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

HINWEIS: Es wird empfohlen, die Wirksamkeit von gRNAs zu testen, die auf dieselbe Zelllinie abzielen, aus der kortikale Organoide erzeugt werden26. Zu diesem Zweck werden RNP-Komplexe, die die relevanten gRNAs enthalten, mit einem GFP-Expressionsplasmid in hiPSCs co-transfiziert, die Zellen werden 3 Tage lang kultiviert und die genomische DNA wird anschließend für die Sequenzierungsanalyse isoliert. Für jeden gRNA-Test werden etwa 200.000 Zellen benötigt. Die Zellen sollten nicht mehr als 70 % bis 80 % konfluent sein und nach dem Auftauen mindestens zweimal durchgelassen worden sein. Es ist wichtig, eine Negativkontrolle (gLACZ)36,63 und eine Scheinbedingung (Nukleofektionslösung ohne RNP) mitzunehmen.

  1. Ändern Sie das Medium des hiPSC 2 h vor dem Experiment so, dass es den ROCK-Inhibitor (1:1.000) enthält, um die Lebensfähigkeit der Zellen in einer Zellkulturhaube zu erhöhen.
  2. Beschichten Sie die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einer Basalmembranmatrix.
  3. Starten Sie die Nukleofektoreinheit ("X-Einheit" für 16-Well-Streifen) und wählen Sie das Programm "ES-Zellen, H9" als vorprogrammiert (Puls CB150). Wählen Sie die entsprechende Anzahl von Vertiefungen des Streifens aus.
  4. Bereiten Sie die RNP-Komplexe vor, indem Sie 24 μM crRNA und 24 μM tracrRNA in einem Duplex-Puffer kombinieren.
    1. 5 min bei 95 °C inkubieren, dann auf RT abkühlen lassen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
    2. In der Zwischenzeit verdünnen Sie das Cas9-Enzym in PBS auf 8 μM.
    3. Kombinieren Sie 3 μl gRNA und 3 μl Cas9 und inkubieren Sie 15 Minuten bei RT, um das RNP zusammenzusetzen.
      HINWEIS: Ein molares Verhältnis von 3:1 gRNA:Cas9 sorgt für eine optimale Spaltungseffizienz. Um gRNAs als Paar zu testen, bereiten Sie jeden RNP separat vor und kombinieren Sie am Ende 1,5 μl jedes RNP.
  5. Während der 15-minütigen RNP-Inkubation wird das hiPSC unter einer Zellkulturhaube für die Nukleofektion vorbereitet.
    1. Ersetzen Sie die Basalmembranbeschichtung durch 1,5 ml Stammzellmedium, das mit ROCK-Inhibitor (1:1.000) und 1x Penicillin/Streptomycin pro Vertiefung ergänzt wird.
    2. Bereiten Sie die Nukleofektionslösung als Mastermix auf Eis gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    3. Nehmen Sie die hiPS-Zellen von der Platte, um eine Einzelzellsuspension herzustellen (wie in Abschnitt 2 beschrieben), und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Färbung in einer Neubauer-Zählkammer.
    4. Pelletieren Sie 200.000 lebende Zellen pro gRNA-Paar bei 600 x g für 5 Minuten.
  6. Geben Sie in der Zellkulturhaube auf Eis 3 μl RNP zu 20 μl Nukleofektionslösung plus 0,2 μg/μl pCAG-GFP-Plasmid.
  7. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in den 23 μl der endgültigen Nukleofektionmischung und überführen Sie sie in 1 Vertiefung eines 16-Well-Nukleofektionstreifens auf Eis.
  8. Sobald alle Bedingungen im Streifen sind, platzieren Sie ihn in der X-Einheit der Nukleofektormaschine außerhalb der Haube und drücken Sie die Starttaste , um die Nukleofektion zu starten.
  9. Transportieren Sie anschließend den Nukleofektionsstreifen zurück unter die Zellkulturhaube und übertragen Sie die nukleofectierten Zellen auf die vorbereitete 6-Well-Platte, indem Sie die Strip-Wells mit etwas Medium von der Platte ausspülen.
  10. Kultivieren Sie das hiPSC 3 Tage lang und wechseln Sie das Medium mit 1x Penicillin/Streptomycin täglich. Nach 24 h wird der ROCK-Inhibitor nicht mehr benötigt.
  11. Überprüfen Sie, ob das GFP-Signal unter einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop vorhanden ist (Abbildung 1C).
    1. An Tag 3 werden GFP-positive Zellen durch fluoreszierende aktivierte Zellsortierung (FACS) sortiert und gesammelt.
    2. Bereiten Sie den Sortierpuffer mit 2 % FBS in PBS vor und halten Sie ihn bei 4 °C.
    3. Eine Tischzentrifuge auf 4 °C abkühlen lassen. Bereiten Sie 1,5 mL Reaktionsröhrchen mit 50 μl Sortierpuffer mit ROCK-Inhibitor (1:1.000) für die Entnahme von Zellen nach FACS auf Eis und 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappen auf Eis vor.
    4. Stellen Sie einzellige Suspensionen der kernhaltigen Zellen her.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Stammzellmedium mit ROCK-Inhibitor (1:1.000) pro Probe und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 600 x g .
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Sortierpuffer mit ROCK-Inhibitor (1:1.000), dann fügen Sie 0,4 μl DAPI (2 ng/μl) hinzu, um lebende Zellen durch FACS zu identifizieren.
    7. Pipettieren Sie die Zelllösung durch die Kappe des Zellsiebs der gekühlten Röhrchen mit rundem Boden, um alle Zellklumpen zu entfernen.
      HINWEIS: DAPI kann die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Zeit beeinträchtigen, daher ist es am besten, jeder Probe vor dem Sortieren frische hinzuzufügen.
    8. 10.000 lebende GFP-positive lebende (DAPI-negative) Zellen werden in die zuvor vorbereiteten 1,5 mL Reaktionsröhrchen mit 50 μl Sortierpuffer mit ROCK-Inhibitor (auf Eis) sortiert.
  12. Extrahieren Sie nach FACS direkt genomische DNA aus sortierten Zellen.
    1. Schleudern Sie die gesammelten, sortierten Zellen im Sortierpuffer bei 600 x g für 10 min herunter.
    2. Entfernen Sie den Überstand und nehmen Sie das Zellpellet in 250 μl Lysepuffer plus 12,5 μl Proteinase K pro Probe auf.
    3. Fahren Sie fort wie in Abschnitt 3 beschrieben.
    4. Zum Schluss lösen Sie das DNA-Pellet in 50 μl nukleasefreiem Wasser auf.
  13. Führen Sie eine PCR durch, um ein Template für die Sanger-Sequenzierung zu generieren, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Verwenden Sie als Kontrolle die DNA aus der gLACZ-Bedingung und die Primer, die auf das interessierende Gen abzielen (dieselben Primer wie in Abschnitt 4 verwendet). Extrahieren Sie die entsprechenden Banden aus der Agarose-Gelelektrophorese, reinigen Sie sie über eine Säule und senden Sie sie zur Sanger-Sequenzierung.
  14. Richten Sie die Sanger-Sequenzierungsergebnisse mit einer paarweisen, globalen Ausrichtung aus.
    HINWEIS: Erfolgreiches Targeting kann durch überlagerte Signale oder unvollständige Sequenzen identifiziert werden, die aus zufälligen Insertionen/Deletionen um die gRNA-Bindungsstelle herum resultieren (Abbildung 1D).

6. Erzeugung von in Scheiben geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden

HINWEIS: Humane kortikale Organoide (hCO) werden nach der Methode des geschnittenen neokortikalen Organoids (SNO) erzeugt, wie zuvor ausführlich beschrieben15,60.

  1. Nehmen Sie kleine hiPSC-Kolonien aus 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 mg/ml Kollagenase ab, indem Sie sie 30-40 Minuten lang bei 37 °C in einem Inkubator inkubieren. In der Zwischenzeit eine neue 6-Well-Platte mit der Basalmembranmatrix beschichten.
    1. Stoppen Sie das Enzym mit 1 ml Stammzellmedium und sammeln Sie die Kolonien mit einer breiten Spitze in 5 ml Stammzellmedium in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Alle Schritte, in denen "Pipettenspitzen mit breitem Durchgang" erwähnt werden, können auch mit Spitzen durchgeführt werden, die auf eine Öffnung von mindestens 2 mm Durchmesser zugeschnitten sind.
    2. Sobald sich die Kolonien am Boden abgesetzt haben, entfernen Sie das alte Medium und ersetzen Sie es durch frisches Stammzellmedium.
    3. Verteilen Sie die Kolonien mit einer Spitze mit breiter Bohrung gleichmäßig auf der beschichteten 6-Well-Platte mit 1,5 ml Stammzellmedium pro Well.
    4. Kultivieren Sie den hiPSC für 2-3 Tage unter Standardbedingungen.
  2. Sobald die hiPSC-Kolonien einen Durchmesser von etwa 1,5 mm erreicht haben, lösen Sie alle Kolonien wieder mit 1 mg/ml Kollagenase ab, indem Sie sie bis zu 1 h bei 37 °C inkubieren.
    1. Stoppen Sie das Enzym mit 6 mL Vorderhirnmedium 115 und sammeln Sie abgelöste Kolonien in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit breiten Spitzen.
    2. Sobald sich die Kolonien abgesetzt haben, entfernen Sie das alte Medium und waschen Sie es mit 5 ml Vorderhirnmedium 1.
    3. Übertragen Sie schließlich die Kolonien auf eine 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Attachment, die 3 ml Vorderhirnmedium 1 pro Well mit breiten Spitzen enthält, und lassen Sie sie embryoide Körper (EBs) bilden. Dieser Schritt zeigt Tag 0 des Protokolls für humane kortikale Organoide an. Befolgen Sie von hier an das Protokoll wie veröffentlicht15.
  3. An Tag 7 EBs in eine Basalmembranmatrix einbetten, mit etwa 20 EBs pro "Keks" und 1 Woche lang in Vorderhirnmedium kultivieren 2 15. An Tag 14 werden Organoide mechanisch aus der Matrix freigesetzt und die Kultivierung in 6-Well-Platten mit extrem niedrigem Attachment in Vorderhirnmedium 315 auf einem Orbitalschüttler bei 120 U/min fortgesetzt.
  4. Ab dem 35. Tag wird dem Medium 1 % v/v Basalmembranmatrix zugeführt.
  5. In Woche 6 betten Sie die Organoide in 3 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ein und schneiden Sie sie auf einem Vibratom in 500 μm dicke Scheiben (Abbildung 2A, B), das die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung in den Organoiden unterstützt. Wiederholen Sie bei Bedarf das Schneiden von Organoiden alle 4 Wochen.
  6. Ab dem 70. Tag werden Organoide im Vorderhirnmedium kultiviert 415.

7. Elektroporation von in Scheiben geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden

HINWEIS: Humane kortikale Organoide können injiziert und elektroporiert werden, sobald ventrikelähnliche Strukturen sichtbar sind, etwa ab Woche 2. Bei Organoiden im späteren Stadium (Woche 5 und älter) ist die Elektroporation am effizientesten und die Lebensfähigkeit der Zellen am besten, wenn der Eingriff 2 Tage nach dem Schneiden der Organoide durchgeführt wird 26,55. Nach dem Schneiden sind ventrikelähnliche Strukturen leicht zu identifizieren, was den Injektionsprozess erleichtert (Abbildung 2C, D). Darüber hinaus bleiben ventrikelähnliche Strukturen nach dem Schneiden für einige Zeit teilweise offen, so dass überschüssige Injektionslösung entweichen kann, was die Integrität des Adhärens-Verbindungsgürtels, der die Ventrikel auskleidet, schützt. Der Zeitplan für das Schneiden kann verschoben werden, um ihn an den experimentellen Zeitplan anzupassen. Das Schneiden sollte bei Langzeitkulturen alle 3-4 Wochen wiederholt werden.

  1. Ziehen Sie die Borosilikatglaskapillaren für Injektionen an einem Mikrokapillarabzieher mit folgenden Einstellungen: P 500, Hitze 600, Zug 30, Geschwindigkeit 40, Zeit 1. Bewahren Sie die Kapillaren in einer großen Petrischale mit Klebeband zur Fixierung auf.
  2. Am Tag der Elektroporation wird der CRISPRR/Cas9 RNP-Komplex wie in Schritt 5.4 beschrieben mit einer Endkonzentration von 24 μM RNP frisch hergestellt. Die Co-Elektroporation von 0,1 μg/μl pCAG-GFP-Plasmid (oder eines anderen fluoreszierenden Reporters) unterstützt die Identifizierung elektroporierter Zellen. Darüber hinaus fügen Sie der endgültigen Injektionsmischung 0,1 % Fast Green-Lösung in Wasser hinzu, was eine Bestätigung der erfolgreichen Abgabe der Mischung ermöglicht.
    HINWEIS: Machen Sie separate Mischungen für jedes interessierende Gen und dieg LACZ-Kontrolle .
  3. Die Tyrode-Lösung (eine Packung Tyrode-Salz, 1 g NaHCO3, 13 mL à 1 M HEPES pH 7,25 in 1 L dH2O) auf 37 °C vorwärmen. Lagern Sie die restliche Tyrode-Lösung mehrere Monate lang bei 4 °C.
  4. Wählen Sie hCO mit gut entwickelten ventrikelähnlichen Strukturen (Abbildung 2E) und verwerfen Sie alle Organoide, die keine ventrikelähnlichen Strukturen aufweisen (Abbildung 2F). Übertragen Sie bis zu 10 Organoide in eine 6 cm große Petrischale, die die Tyrode-Lösung enthält, und bewahren Sie die restlichen hCOs im Inkubator auf.
  5. Füllen Sie eine Mikrokapillare aus Glas mit Hilfe einer Microloader-Pipettenspitze mit 10 μL der Injektionslösung und öffnen Sie die Kapillare, indem Sie das dünne Ende mit einer Pinzette abdrücken. Prüfen Sie, ob die Kapillare offen ist, indem Sie etwas Injektionsmischung in die Tyrode-Lösung abgeben. Führen Sie die Injektionen mit einem Mikroinjektor in einer kontinuierlichen Einstellung mit kontrolliertem Anschnitt über einen Fußschalter durch.
  6. Führen Sie die Kapillare in die Mitte ventrikelähnlicher Strukturen ein (Abbildung 2C) und injizieren Sie 0,2-0,5 μl der Mischung, indem Sie den Fußschalter drücken.
    HINWEIS: Es können bis zu 5 Ventrikel pro hCO injiziert werden, wobei insgesamt 7-8 hCOs pro Replikat verarbeitet werden. Idealerweise sollten die Ventrikel anvisiert werden, die der Außenseite des hCO zugewandt sind, da diese in der Regel am besten entwickelt sind (Abbildung 2G, H).
  7. Drücke das Organoid mit einer feinen Pinzette dagegen, um die Bewegung einzuschränken. Greifen Sie nicht nach den Organoiden (Abbildung 2C).
  8. Nach der Injektion verwenden Sie eine Pipettenspitze mit breiter Bohrung, um 1-2 Organoide in eine Elektroporationskammer zu übertragen, die die Tyrode-Lösung enthält (Abbildung 2C, D).
  9. Richten Sie die injizierten Organoide so zu den Elektroden hin aus, dass apikale radiale Gliazellen in ventrikelähnlichen Regionen, die der Außenseite des Organoids zugewandt sind, anvisiert werden.
  10. Befestigen Sie die Kabel an der Elektroporationskammer, wobei die injizierte Seite des Organoids zum Pluspol (Anode; Abbildung 2D).
  11. Drücken Sie die Impulstaste des Elektroporatorgeräts, um mit fünf Impulsen von 38 V für jeweils 50 ms im Abstand von 1 s zu elektropopolieren.
    HINWEIS: Die Elektroporationseinstellungen können vom verfügbaren Elektroporator abhängen und müssen möglicherweise optimiert werden.
  12. Wiederholen Sie die Injektions- und Elektroporationsschritte, bis die gewünschte Anzahl von Organoiden verarbeitet ist.
  13. Sammeln Sie die elektroporierten Organoide in einem Medium bei RT, bis alle Proben für den gleichen Zustand verarbeitet wurden. Stellen Sie sicher, dass sie sich insgesamt nicht länger als 30 Minuten außerhalb des Inkubators befinden.
  14. Anschließend werden die elektroporierten hCOs wieder in das entsprechende Nährmedium umgefüllt und in den ersten 24 h ohne Schütteln kultiviert.
    HINWEIS: Nach 2-3 Tagen sollte das GFP-Signal in elektroporierten hCOs unter einem Fluoreszenzstereoskop sichtbar sein (Abbildung 2H). Der Zeitpunkt der Analyse nach der Elektroporation sollte in Abhängigkeit von der zu beantwortenden biologischen Fragestellung gewählt werden. Nach 3-7 Tagen befinden sich GFP-positive Zellen in den VZ, SVZ und CP15,60.

8. Fixierung und Kryosektion von elektroporierten humanen kortikalen Organoiden

  1. Fixieren Sie elektroporierte Organoide in 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT in einem 2 mL Reaktionsröhrchen.
    ACHTUNG: PFA ist giftig und krebserregend. Führen Sie alle Schritte mit PFA unter einem Abzug durch. Die Verwendung von Nitrilhandschuhen und einer Schutzbrille wird dringend empfohlen.
  2. Einmal 5 Minuten in PBS waschen und in steril filtrierter 30%iger Saccharose in PBS bei 4 °C lagern, bis das Gewebe vollständig mit Saccharose gesättigt ist.
  3. Betten Sie fixierte Organoide in ein Einbettungsmedium für gefrorene Gewebeproben plus 15 % Saccharose in PBS in Blöcken auf Trockeneis ein.
  4. 20-30 μm Schnitte werden an einem Kryostaten vorbereitet und das Gewebe auf Klebeobjektträgerngesammelt 26,64.
    HINWEIS: Das Protokoll kann entweder unterbrochen werden, sobald sich die fixierten Organoide in Saccharose befinden (stabil bei 4 °C für mehrere Monate) oder in ein Einbettungsmedium eingebettet (gefrorene Blöcke können in luftdichten Beuteln bei -20 °C für mehrere Monate bis Jahre gelagert werden).

9. Immunhistochemische Analyse von elektroporierten humanen kortikalen Organoiden

  1. Für die immunhistochemische Analyse26,64 ist die Antigengewinnung in Citratpuffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Polysorbat 20 in dH2O, pH 6,0) für 1 h bei 70 °C in einem Wasserbad durchzuführen.
  2. Einmal 5 min in PBS waschen, dann die Objektträger kurz trocknen und die Abschnitte mit einem Wachsstift umkreisen.
  3. Mit 0,1 M Glycin in PBS (pH 7,4) für 30 min bei RT abschrecken und anschließend zweimal mit PBS für jeweils 5 min waschen.
  4. Die Abschnitte mit Blockierungspuffer (10 % Pferdeserum, 0,1 % Octoxinol 9 in PBS) abdecken und 30 min bei RT inkubieren.
  5. Die Primärantikörper werden in Blockpuffer hergestellt und über Nacht bei 4 °C in Abschnitten inkubiert.
  6. Am nächsten Tag dreimal mit PBS für jeweils 5 min waschen, mit Sekundärantikörpern und DAPI in Blockpuffer für 1 h bei RT inkubieren und nochmals dreimal mit PBS für jeweils 5 min waschen.
  7. Montieren Sie die Objektträger in das Eindeckmedium und nehmen Sie das Bild an ein Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 3).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Antikörper gegen das in der Injektionsmischung verwendete Fluorophor zur Identifizierung der Zielzellen hinzuzufügen, da das native Signal nach der Fixierung häufig gelöscht wird. Antikörper und Farbstoffe, die für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden, wie in Abbildung 3 dargestellt, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

10. Nachweis des CRISPR/Cas9-vermittelten Knockouts auf Proteinebene

  1. Um den Knockout auf Proteinebene zu verifizieren, führen Sie eine Immunhistochemie für das Zielprotein auf den elektroporierten Organoiden durch (Abbildung 3I).
  2. Sowohl dieg LACZ-Kontrolle als auch die Zielorganoide mit denselben Einstellungen abbilden, um einen Vergleich der Fluoreszenzintensität zu ermöglichen (Abbildung 3I, J). Tun Sie dies auf zonenspezifische Weise, um die Wirkung auf die verschiedenen Zelltypen des sich entwickelnden Neokortex zu vergleichen. Zählen Sie Zellen in ImageJ/Fiji (Plugin Cell Counter) oder durch Segmentierung mit dem StarDist-Plugin 65.

Ergebnisse

Die CRISPR/Cas9-vermittelte Genablation erfordert das Design von gRNAs. Im Allgemeinen funktioniert es gut, eines der ersten Exons eines Gens von Interesse mit einem Paar von gRNAs im Abstand von 7-11 bp zu behandeln (Vermeidung von Vielfachen von 3 bp) (Abbildung 1A). Als erster Test kann die Effizienz der Template-Erkennung durch gRNAs in vitro unter Verwendung eines PCR-Templates 26,40,62 abgefragt werden. Effizientes Targeting und Cas9-vermitteltes Schneiden zeigen sich in der Reduktion der Matrizen-DNA und dem Auftreten von gespaltenen DNA-Produkten auf einem Agarosegel (Abbildung 1B). Weitere gRNA-Tests können in der iPSC-Linie durchgeführt werden, die für die Generierung von kortikalen Organoiden verwendet wird. Dies erfordert die Nukleofektion von iPSCs, die durch eine erfolgreiche Expression von Fluoreszenzreportern sichtbar gemacht werden kann (Abbildung 1C). Ein effizientes Targeting des interessierenden Locus kann durch Sanger-Sequenzierung verifiziert werden, was zu einem Chromatogramm führt, das abrupt endet oder sich um die Zielstelle legt (Abbildung 1D), was sich aus einem Spektrum von Indels aus der Doppelstrangbruchreparatur durch nicht-homologe Endverbindung66 ergibt. Guide-RNA-Effizienztests in vitro und in iPSC-Zellen helfen bei der Selektion effizienter gRNA-Paare für die Genablation in kortikalen Organoiden.

Vor der Elektroporation werden kortikale Organoide in Scheiben geschnitten, was die Identifizierung der Ventrikellumen für die Injektion des Elektroporationsgemisches unterstützt (Abbildung 2A-C). Die injizierten Organoide werden dann in die Elektroporationskammer überführt (Abbildung 2D). Für die Elektroporation sollten kortikale Organoide mit gut entwickelten ventrikelähnlichen Strukturen verwendet werden (Abbildung 2E), während kortikale Organoide ohne sichtbare Strukturen verworfen werden sollten (Abbildung 2F). Die Elektroporationsmischung enthält einen Farbstoff, der die Visualisierung von injizierten Ventrikeln während des Eingriffs ermöglicht (Abbildung 2G). Nach 1-3 Tagen in Kultur sind erfolgreich anvisierte Ventrikel durch natives GFP-Signal unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar (Abbildung 2H).

Für eine tiefergehende histologische Analyse kann die Immunhistochemie von Kryoschnitten durchgeführt werden. Im Idealfall sind mehrere zielgerichtete Ventrikel in einem elektroporierten kortikalen Organoid vorhanden (Abbildung 3A,B). Die optimalsten Elektroporationen zielen auf ventrikelähnliche Strukturen im äußeren Bereich des Organoids ab, der nach außen zeigt (Abbildung 3C), da dies typischerweise die am stärksten erweiterten Ventrikel sind. In einigen Fällen kann die Elektroporation zu einem übermäßigen Zelltod führen (Abbildung 3D,E), z. B. wenn die Plasmidkonzentrationen zu hoch sind oder die Elektroporationseinstellungen suboptimal sind. Elektroporationen, die dem Inneren des Organoids zugewandt sind (Abbildung 3F), beinhalten oft weniger ausgedehnte Bereiche der ventrikelartigen Strukturen als das Äußere. Unserer Erfahrung nach ist es hilfreich, die quantitative Analyse auf definierte Regionen des Organoids zu fokussieren, um die Variabilität zu reduzieren. Manchmal kann die Elektroporation zu einer Störung der apikalen Oberfläche führen (Abbildung 3G), z. B. wenn das Injektionsvolumen zu hoch ist, was zum Bruch der Ventrikel führt, oder wenn die elektrischen Impulse zu stark sind, was zu einer Delamination der Zellen führt. Wenn schließlich zwei benachbarte Ventrikel anvisiert werden (Abbildung 3H), kann es schwierig werden, die Grenzen der kortikalen Zonen und den Ursprung der Zielzellen zuzuordnen.

Die Immunhistochemie kann verwendet werden, um einen erfolgreichen CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout auf Proteinebene in interessierenden Zellen zu verifizieren (Abbildung 3I), hier am Beispiel des Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) Proteins PCGF467. Die Signalintensität kann in GFP-positiven Zellen unter Kontroll- und experimentellen Bedingungen analysiert werden (Abbildung 3J). Alternativ, wenn kein geeigneter Antikörper verfügbar ist, können Zielzellen mittels FACS aus kortikalen Organoiden60 isoliert und weiter durch Sanger oder Next Generation Sequencing36 analysiert werden. Darüber hinaus kann die Reduktion des Proteinspiegels auch mittels Western Blotting analysiert werden.

figure-results-1
Abbildung 1: Leit-RNA-Design und Validierung für akuten CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Knockout. (A) Schematische Darstellung der Designstrategie der Leit-RNA (gRNA) mit zwei gRNAs, die auf ein Exon eines interessierenden Gens abzielen. Schwarze Pfeile zeigen PCR-Primer für die Matrizenvorbereitung an, die für die gRNA-Validierung verwendet werden. (B) Validierung der gRNA-Effizienz in vitro. PCR-amplifizierte Templates wurden mit RNP-Komplexen verdaut. Nach erfolgreicher Teilung sind nach der Gelelektrophorese zwei unterschiedlich große Banden sichtbar (links), während die Matrize für gRNAs mit geringer Effizienz ungeschnitten bleibt (rechts). (C) Hellfeldbild (links), GFP-Fluoreszenz (Mitte) und zusammengeführte Bilder (rechts) von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) 3 Tage nach der Nukleofektion mit dem RNP-Komplex und einem GFP-Plasmid. Maßstabsbalken: 350 μm. (D) Validierung der gRNA-Effizienz in hiPSCs durch Sanger-Sequenzierung von amplifizierter DNA aus GFP-positiven Zellen. Nach erfolgreicher Spaltung der doppelsträngigen DNA zeigen Sequenzierungsspuren überlagerte Signale, beginnend mit der gRNA-Zielstelle (oben, KO1). Bei erfolglosem Targeting bleibt die DNA-Sequenzspur im Vergleich zur LACZ-Kontrolle unverändert (unten, KO2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden. (A) Schematische Darstellung, die den Arbeitsablauf für die Elektroporation von humanen kortikalen Organoiden (hCOs) zeigt. Zunächst werden hCOs in 500 μm dicke Scheiben geschnitten. Zwei Tage später wird der RNP-Mix, der ein GFP-Expressionsplasmid und Fast Green enthält, in Lumen ventrikelähnlicher Strukturen injiziert, vorzugsweise im äußeren Bereich von hCOs. Für die Elektroporation werden hCOs in die Elektroporationskammer gegeben. Nach mehrtägiger Kultivierung kann ein GFP-Signal in elektroporierten Bereichen nachgewiesen werden. (B) Bilder der Vibratom-Schnitte von hCOs. Die Organoide sind in 3% niedrigschmelzende Agarose in einem Medium in einem Block eingebettet (links). Der Block wird in 500 μm dicke Scheiben geschnitten (Mitte). Die in Scheiben geschnittenen Organoide werden mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung (rechts) zurück in die Kulturschale überführt. (C) Bilder, die die Injektion der Mischung mit RNP, pCAG-GFP und 0,1 % Fast Green in ventrikelähnliche Strukturen der Organoide zeigen. Die Organoide werden in die Tyrode-Lösung getaucht und die dünne Glaskapillare wird in das Lumen des Zentrums ventrikelähnlicher Strukturen eingeführt (links). Zur Stabilisierung der Organoide (links und Mitte) wird eine Pinzette verwendet. Die Ventrikel an der Außenseite der Organoide werden gezielt angesprochen (Mitte). Injizierte Organoide werden mit Pipettenspitzen mit breiter Öffnung (rechts) in die Elektroporationskammer oder später in die Kulturschale überführt. (D) Bilder der Elektroporationskammer, die aus einer Petrischale aus Glas und zwei Metallklingen besteht, die auf das Glas geklebt sind. Die Metallklingen dienen als Elektroden und enthalten Löcher, um die Kabel für den Anschluss an den Elektroporator zu befestigen. Die injizierte Seite des hCO, die durch einen grünen Schatten sichtbar ist, sollte zur Anode zeigen (Pluspol, rotes Kabel) (rechts). (E) Repräsentative Bilder von hCOs, die gut entwickelte ventrikelähnliche Strukturen zeigen. Der hellere Ring stellt den ventrikulären zonenartigen Bereich dar. Der dunklere Kreis in der Mitte der ventrikelartigen Struktur stellt das Lumen dar und sollte gezielt unterspritzt werden. (F) Repräsentative Bilder von hCOs ohne gut entwickelte ventrikelähnliche Strukturen, die wir empfehlen, nicht für weitere Experimente einzubeziehen. (G) Repräsentative Bilder von hCOs nach Injektion des Elektroporationsgemisches, in denen die Zielbereiche durch Fast Green sichtbar sind (orangefarbene Pfeile). (H) Repräsentatives Bild von hCO, das das native GFP-Signal 24 h nach der Elektroporation zeigt. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Immunhistochemische Analyse von elektroporierten geschnittenen humanen kortikalen Organoiden. (A) Schematische Darstellung eines elektroporierten humanen kortikalen Organoids (hCO) mit grün fluoreszierendem Signal. (B) DAPI-Färbung (grau) und Immunfluoreszenz für GFP (grün) eines kryosektionierten hCO mit mehreren elektroporierten Ventrikeln, 7 Tage nach der Elektroporation. (C-H) Beispielbilder verschiedener Elektroporationsergebnisse, gefärbt für GFP (grün) und Zellkerne (DAPI, grau). (C) Eine optimale Elektroporation mit intakten Kernen (siehe Einfügung 1, D), einer ungestörten ventrikelähnlichen Struktur und elektroporierten Zellen in dem zur Außenseite des Organoids zugewandten Bereich, der normalerweise am stärksten expandiert ist. (E) Beispiel für einen massiven Zelltod von hCO im elektroporierten Bereich (siehe auch Einfügung 2, D), gekennzeichnet durch kleine, DAPI-dichte und verzerrte Kerne. (F) Eine erfolgreiche Elektroporation, die auf das Innere des Organoids gerichtet ist und oft schwieriger zu interpretieren ist, da kortikale plattenartige Bereiche mit benachbarten Ventrikeln verschmelzen. (G) Gestörte ventrikelähnliche Strukturen in der Mitte des elektroporierten Bereichs (orangefarbener Pfeil). (H) Ein Beispiel für hCO, das mehrere kleinere Ventrikel enthält, die teilweise verschmolzen sind und daher schwer zu quantifizieren sind. (I) DAPI-Färbung (grau) und Immunfluoreszenz für GFP (grün) und PCGF4 (magenta) 7 Tage nach der Elektroporation eines RNP-Komplexes, der auf LACZ (gLACZ KO, links) oder PCGF4 (gPCGF4 KO, rechts) für CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout abzielt. Eingekreiste Zellen verdeutlichen die verminderte Intensität von PCGF4, was auf eine erfolgreiche Genablation hinweist. Ein einheitliches Signal ist in der LACZ-Steuerung (links) zu sehen. (J) Das Diagramm zeigt die quantifizierte PCGF4-Intensität nach Immunfluoreszenz in GFP-positiven Zellen für die Kontrolle (gLACZ KO) und die KO von PCGF4 (gPCGF4 KO) im Verhältnis zur medianen PCGF4-Expression in der gLACZ-Bedingung. Jeder Punkt stellt eine Zelle dar. Daten von 3-4 Organoiden aus zwei verschiedenen Chargen (grau und schwarz) derselben hiPSC-Linie. p < 0,0001, Mann-Whitney-Test. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen (B, C) oder Fluoreszenzmikroskop (E-I) Laserscanning-Mikroskop aufgenommen. Die Bilder zeigen Projektionen mit maximaler Intensität von 10-15 μm dicken Z-Stapeln. Weiße gestrichelte Linien zeigen die apikale Oberfläche, die dem Ventrikellumen zugewandt ist, und die Außenflächen von hCOs. Orangefarbene gestrichelte Linien zeigen die VZ/SVZ-Grenze in verschmolzenen Ventrikeln an. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Antikörper/FarbstoffVerdünnung
Anti-GFP für Hühnchen1:2,000
Maus Anti-PCGF41:300
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Huhn1:1,000
Alexa Fluor 555 Esel Anti-Kaninchen1:1,000
DAPI1 mg/ml Brühe; 1:1,000

Tabelle 1: Liste der Antikörper und Farbstoffe und ihrer Verdünnung, die für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden.

Diskussion

Menschliche zerebrale und kortikale Organoide sind zu Schlüsselmodellen für die Untersuchung der Entwicklung des menschlichen Neokortex geworden 7,16,17. Für die Modellierung menschlicher Erkrankungen sind isogene hiPS-Linien und Organoide zum Goldstandard geworden68. Da die Generierung neuartiger iPS-Linien jedoch zeit- und kostenintensiv ist, wurde die akute Manipulation von kortikalen Organoidmodellen für Untersuchungen der Genfunktion in großem Umfang angewendet.

Die Elektroporation von zerebralen und kortikalen Organoiden 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 ist einfach zu implementieren, und viele Labore, die traditionell Tiermodelle für funktionelle Studien verwendet haben, sind mit den erforderlichen Werkzeugen ausgestattet. Für die Injektion in vivo sind die lateralen Ventrikel typischerweise anvisiert 34,36,37,39,40,41,42. Diese werden in kortikalen Organoiden durch ventrikelähnliche Strukturen mit einem zentralen Lumen modelliert, das ebenfalls injiziert werden kann. Die Elektroporation kortikaler Organoide zielt hauptsächlich auf die Endfüße von Zellen ab, die die Ventrikel auskleiden, typischerweise apikale radiale Gliazellen69. Die Targeting-Effizienz variiert zwischen den Experimenten, aber typischerweise können nach 3-7 Tagen Elektroporation einige 100 bis 1.000 GFP-positive Zellen pro Organoid gewonnen werden. Die Dauer des Zellzyklus ist in humanen neuralen Vorläuferzellen etwa doppelt so lang wie in der Maus, wo apikale radiale Gliazellen eine Zellzykluslänge von 14 h und basale Vorläuferzellen von 23 h70 haben. Daher sind nach 3 Tagen hauptsächlich apikale radiale Gliazellen und intermediäre Vorläuferzellen GFP-positiv, während GFP-positive Zellen nach 7 Tagen über alle Zonen verteilt sind. Das GFP-Signal kann auch mehrere Monate nach der Elektroporation noch beobachtet werden, wobei GFP-positive Zellen hauptsächlich Neuronen darstellen, die über das Organoid verstreut sind, was es uns ermöglicht, die Morphologie einzelner Zellen zu analysieren. Das Targeting von neuralen Vorläuferzellen, die den Ventrikel auskleiden, ist in den Stadien möglich, in denen ventrikelähnliche Regionen unter dem Hellfeldmikroskop identifizierbar sind. Im aktuellen Protokoll15 ist dies von Woche 2 bis Woche 12 der kortikalen Organoidentwicklung möglich, danach schrumpfen die Ventrikel und sind nicht mehr sichtbar. Für einen erfahrenen Experimentator ist es machbar, 50-80 Organoide in einer Sitzung zu injizieren.

Während die Nachkommen apikaler radialer Gliazellen während der Zellteilung Genmanipulationsreagenzien erben, ist das direkte Targeting reifer Zellen wie Neuronen und Astrozyten mit dem Standard-Elektroporationsansatz nicht möglich. Stattdessen wurden virale Targeting-Methoden auf postmitotische Zellen im Nervensystem angewendet33,71. Insbesondere rekombinante Adeno-assoziierte Viren (AAVs) werden häufig für den Gentransfer im Nervensystem verwendet, da sie einfach herzustellen sind und terminale differenzierte Zellen mit hoher Effizienz transduzieren71. Darüber hinaus können AAVs auf bestimmte neuronale Subpopulationen ausgerichtet werden. Verschiedene virale Targeting-Ansätze, einschließlich der Verwendung von Adeno-, Sendai- und Lentiviren, wurden bereits bei zerebralen und kortikalen Organoidenangewendet 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

Eine Einschränkung in zerebralen Organoid-Protokollen ist die Entwicklung eines nekrotischen Kerns aufgrund der begrenzten Sauerstoff- und Nährstoffversorgung. Mehrere Strategien wurden implementiert, um die Zellviabilität im Organoidzentrum zu verbessern, darunter die Kultivierung von Organoiden in rotierenden Bioreaktoren14,54, die Co-Kultur von Endothelzellen oder biotechnologische Ansätze zur Modellvaskularisierung75,76, die Organoidtransplantation in Nagetiermodelle18,77 und das Schneiden von Organoiden15,47. Hier haben wir das geschnittene humane kortikale Organoid-Protokoll verwendet, von dem gezeigt wurde, dass es eine reduzierte Hypoxie im Organoidkern aufweist und die Expansion ventrikelähnlicher Strukturen und der kortikalen plattenartigen Regionunterstützt 15. Darüber hinaus ist das Schneiden von zerebralen Organoiden auch vorteilhaft für die Live-Bildgebung von basalen radialen Gliazellen, die sich in der subventrikulären Zone befinden, was die Erstellung von Zellschicksalsentscheidungskartenermöglicht 72. Ebenso wurde Live-Imaging verwendet, um geschnittene zerebrale Organoide zu untersuchen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert wurden, was das neuronale Überleben und das axonale Auswachsen unterstützt47. Wir fanden heraus, dass das Schneiden von menschlichen kortikalen Organoiden diese Organoidmodelle auch besonders anfällig für die Elektroporation macht, da ventrikelähnliche Strukturen nach dem Schneiden leicht identifiziert werden können. Die Elektroporation kortikaler Organoide ermöglicht die Einführung von DNA-Plasmiden, die klassischerweise für die Überexpression von Genen und in jüngerer Zeit für die Bereitstellung ganzer Plasmidbibliotheken verwendet werden55, sowie von CRISPR/Cas9-Geneditierungswerkzeugen zur Inaktivierung der Genfunktion26.

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die Erforschung der Genfunktionrevolutioniert 56,57,58,63,66. In diesem Protokoll haben wir die Anwendung von gRNA/Cas9-Ribonukleoproteinkomplexen36 für die akute Geninaktivierung in menschlichen kortikalen Organoiden skizziert. Die erste Validierung der gRNA-Effizienz erfolgte in vitro, zunächst in einem Reagenzglas und dann in iPSCs. Wir stellen fest, dass diese einfachen ersten Tests die Auswahl vielversprechender gRNA-Paare unterstützen, insbesondere wenn keine funktionierenden Antikörper vorhanden sind. Da immer mehr Werkzeuge für den CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Knockout charakterisiert werden, könnten die ersten Validierungsschritte in Zukunft wegfallen. Während die Next Generation Sequencing von Ziel-DNA-Regionen, die aus iPSCs isoliert wurden, quantitativer ist und einen höheren Informationsgehalt aufweist, stellen wir fest, dass die Sanger-Sequenzierung beim Pre-Screening von gRNAs oft viel schnellere Ergebnisse liefern kann. Letztendlich ist die Validierung der effizienten CRISPR/Cas9-Editierung in kortikalen Organoiden und die Reduzierung der Proteinspiegel in den interessierenden Zellen der eindeutigste Beweis für eine erfolgreiche CRISPR/Cas9-vermittelte Genablation.

Die Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden ermöglicht die akute genetische Manipulation für Gain- und Loss-of-Function-Studien, die Visualisierung der Zellmorphologie und neuronaler Axone, die Bereitstellung von Plasmidbibliotheken für Screening-Ansätze und massive parallele Reporter-Assays, die Markierung von Zellen für die Live-Bildgebung und die Bereitstellung von Epigenom-Editing-Tools. Daher ist die Elektroporation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden eine leistungsfähige Methode, die mechanistische Einblicke in die Entwicklung der menschlichen Kortikalität, neurologische Entwicklungsstörungen und kortikale Evolution geben kann.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken den Einrichtungen des CRTD und der Dresden Concept Partner für die hervorragende Unterstützung, insbesondere K. Neumann und ihrem Team an der Stem Cell Engineering Facility, H. Hartmann und ihrem Team an der Light Microscopy Facility, A. Gompf und ihrem Team an der Durchflusszytometrie und Hartmut Wolf von der MPI-CBG-Werkstatt für den Bau der Elektroporationskammern. Wir danken Joshua Schmidt für sein Feedback zum Manuskript. Der MA bedankt sich für die Förderung durch das Zentrum für Regenerative Therapien der TU Dresden, die DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) und die Schram Foundation.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL PP Zentrifugenröhrchen, konischCorning430791
4D-Nucleofector CoreUnit Lonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit ZellsiebkappeCorningFalcon 352235
6-Well-Platte, Nunclon-behandeltThermo Fisher140675Für hiPSC Kultur
6-Well-Platte, extrem niedrige BindungCorning3471Für Organoidkulturen
A83-01STEMCELL Technologies72022Vorderhirnmedium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
LuftkompressorAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Sekundärer Antikörper, RRID: AB_2340375; Verdünnung 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572Sekundärer Antikörper, RRID: AB_162543; Verdünnung 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolIntegrierte DNA-TechnologienKundenspezifisches Design (bestellen als 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrierte DNA-Technologien10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Integrierte DNA-Technologien1081060100 & Mikro; g, aus Streptococcus pyogenes
Amphotericin B (Fungizone)Gibco15290018Vorderhirn Medium 2, 3 und 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anti-GFP-Primärantikörper (Huhn, polyklonal)Abcamab13970RRID: AB_300798; Verdünnung 1:2000
Anti-PCGF4-Primärantikörper (Maus, monoklonal)Millipore05-637 RRID: AB_309865; Verdünnung 1:300
ApoTome FluoreszenzmikroskopZeiss
AscorbinsäureSigma Aldrich1043003Vorderhirn Medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-Supplement (+ Vitamin A)Gibco17504044Vorderhirn medium 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Banane auf Micrograbber KabelsatzHarvard Apparatur BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (PCR-Gerät)Analytik Jena846-2-070-723
Kapillaren, Borosilikatglas mit Filament, AD 1,2 mm; Innendurchmesser 0,69 mm; 10 cm LängeWissenschaft ProdukteBF120-69-10Muss auf eine bestimmte Dicke gezogen werden
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Vorderhirn mittel 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Kollagenase Typ IVGibco17104019
CRTDi004-AStem Cell Engineering Facility at CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-AEinzelzell-angepasste hiPS-Linie von gesundem Spender
DAPIRoche102362760011 mg/ml-Stamm, 1:1000 verdünnt für
STEMCELL Technologies73884Vorderhirn medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Vorderhirn Medium 1, 2 und 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Vorderhirn Medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Pinzette, gerade, 11 cmFine Science Tools11295-51
ECM 830 Rechteck-ElektroporationssystemHarvard Apparatur BTX45-2052
EthanolSigma Aldrich32205-1L-M
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Fötales Rinderserum (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Flammender/Brauner MikropipettenabzieherSutter Instrument Co.P-97Zum Ziehen von Mikrokapillaren
Geneious Prime GraphPadSoftware LLC d.b.a GeneiousSoftware Version 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; unterstrichene Nukleotide = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Vorderhirn Medium 1, 2, 3 und 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycinSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1dieses Papier5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (entspricht den KO-Bildern in Abbildung 3I+J)
gPCGF4 KO2dieses Papier5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (entspricht dem KO Bilder in Abbildung 3I+J)
HEPESmade in house1 M stock
Horse Serum, hitzeinaktiviertesGibco26050088
Human GDNF Rekombinantes ProteinThermo Fisher450-10Vorderhirn medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Mensch/Maus/Ratte BDNF Rekombinantes ProteinThermo Fisher450-02Vorderhirn medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Salzsäure (HCl)Sigma Aldrich258148Zur Herstellung von TrisHCl
ImmEdge (wachs) PenVector LaboraoriesH-4000
Insulinlösung humanSigma Aldrich  I9278Vorderhirn mittel 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Knockout-SerumersatzGibco 10828-010Vorderhirn mittel 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Laser Scanning Konfokales 980 MikroskopZeiss
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, hochreinesThermoFisher 16520100zur Einbettung von hCOs während der Vibratom-Schnitte
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembranmatrix, LDEV-freiCorning354230Für Organoidkulturen
Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, LDEV-freiesCorning354277Für hiPSC-Kultur
MgCl2, 1 MThermo FisherAM9530G
Mikroinjektor PicoPump + FußschalterWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader Pipettenspitzen 0,5 bis 20 & Mikro; LEppendorf5242956003Zum Laden von Glaskapillaren
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Stammzellmedium
N-2 SupplementGibco17502048Vorderhirn Medium 2 und 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix New England BiolabsM0541S
Neubauer ZählkammerMarke718605
Neurobasales MediumGibco21103049Vorderhirn Medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
nicht-essentielle AminosäurenGibco 11140050Vorderhirnmedium 1, 2, 3 und 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Nukleasefreier Duplex-PufferIntegrierte DNA-Technologien1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583Einbettungsmedium für gefrorene Gewebeproben
P3 Primärzelle 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ParaformaldehydFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Peel-A-Way Embedding Mold TruncatedT12Polysciences Inc.18986-1Zur Einbettung von hCOs für Vibratome und Kryoschnitte
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140122Vorderhirn mittel 1, 2, 3 und 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 und für Stammzellmedium nach der Nukleofektion
Petrischale: 60 mm x 15 mm, ohne Entlüftung, sterilCorningBP50-02
Petrischale Platin-Elektrodenkammer, 5 mm SpaltHarvard-Gerät BTX45-0504
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)hergestellt im eigenen Haus
Proteinase KSigma AldrichP2308Aus Titrachium album; 10 mg/ml Vorrat
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
RHO/ROCK-Signalweg-Inhibitor (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Vorderhirnmedium 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Natriumcitrat-DihydratSigma AldrichW302600-1KG-K
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma AldrichL3771
Saccharose Sigma AldrichS7903
SuperFrost Plus AdhäsionsdiasFisher Scientific10149870
SZX10 mit einem KL 300 LEDOlympusSZX10Oder alternatives Stereoskop
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284a.k.a. Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503Zur Herstellung von TrisHCl
Trypan Blue Lösung, 0,4 %ThermoFisher15250061
TrypLE Express Enzym (1x)Thermo Fisher12604021Dissoziation zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen
Tween 20Sigma AldrichP1379a.k.a. Polysorbat 20
TyrodensalzSigma AldrichT2145-10x1l
Vibrierend Mikrotom (Vibratom)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 & micro; L Universal Fit FilterspitzenCorningTF-1005-WB-R-S
β-MercaptoethanolGibco 21985-023Vorderhirn mittel 1, 3 und 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IF-Dibutyryl-cAMP verwenden

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