Methodenartikel

Hochdurchsatz-Dissoziation und orthotope Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen

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DOI:

10.3791/67607

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20. Dezember 2024

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1Division of Exercise Physiology, Department of Health Professions, West Virginia University School of Medicine, 2Cancer Institute, West Virginia University School of Medicine, 33Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente, nicht-chirurgische Methode zur orthotopen Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen bei Mäusen. Die Technik beinhaltet eine enzymatische Tumordissoziation, gefolgt von einer direkten Injektion in die Brustfettpolster, was eine Hochdurchsatzimplantation ermöglicht. Die umfassende Validierung gewährleistet die Modelltreue und ermöglicht strenge Studien über verschiedene Brustkrebs-Subtypen hinweg.

Zusammenfassung

Patienten-abgeleitete Xenotransplantate (PDXs) stellen eine klinisch relevante Methode zur Rekapitulation von tumorbetroffenen Zelltypen und der Tumormikroumgebung dar, die für die Weiterentwicklung des Wissens über Brustkrebs (BC) unerlässlich ist. Darüber hinaus ermöglichen PDX-Modelle die Untersuchung systemischer BC-Effekte, was mit in vitro-Modellen nicht möglich ist. Traditionelle Methoden zur Implantation von BC-Xenotransplantaten beinhalten in der Regel Anästhesie und sterile chirurgische Eingriffe, die zeitaufwändig und invasiv sind und die Skalierbarkeit von PDX-Modellen in der BC-Forschung einschränken. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und skalierbare Methode zur orthotopen Implantation von BC PDXs in Mäusen. Für die PDX-Transplantation wurde der immundefiziente Mausstamm NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) verwendet. Humane BC-Proben, die von IRB-zugelassenen Patienten gewonnen wurden, wurden mechanisch und enzymatisch dissoziiert und dann in einer Lösung aus Basalmembranextrakt (BME) und RPMI 1640 resuspendiert. Die Tiere wurden durch Scrubfing fixiert, und es wurde Enthaarungscreme aufgetragen, um die Haare von den Fettpolstern an der vierten Leistenbrustwarze zu entfernen, gefolgt von einer Injektion. Etwa 2 Millionen Zellen in einer 100 μL Suspension wurden mit einer 26 G Nadel bilateral orthotopisch in die Brustfettpolster injiziert. Bemerkenswert war, dass kein Anästhetikum erforderlich war und die Gesamtzeit des Eingriffs von der Zellvorbereitung bis zur Injektion weniger als 5 Minuten betrug. Nach einer mehrmonatigen Wachstumsphase wurden die Tumore herausgeschnitten und für die Authentifizierung aufbereitet. Die Validierung umfasste die Bewertung des Rezeptorstatus mittels Immunhistochemie mit spezifischen Antikörpern für traditionelle BC-Rezeptoren (d. h. ER, PR, HER2). Die Tumormorphologie wurde durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) bestätigt, die von einem Pathologen interpretiert wurde. Die genetische Ähnlichkeit mit der Patientenprobe wurde durch Bulk-RNA-Sequenzierung und Short Tandem Repeat (STR)-Analyse verifiziert. Dieser Ansatz für die PDX-Transplantation und -Validierung unterstützt die rigorose Entwicklung von Modellen und die Hochdurchsatz-Tumorimplantation und ermöglicht so leistungsfähige Studien über verschiedene BC-Subtypen hinweg.

Einleitung

Brustkrebs (BC) wird jedes Jahr bei über 2 Millionen Frauen weltweit diagnostiziert1. Um das grundlegende biologische Verständnis von BC zu verbessern und neuartige Therapeutika erfolgreich in zugelassene Behandlungen zu überführen, sind präklinische Tiermodelle notwendig, die die definierenden Merkmale von Patiententumoren beibehalten. Es wurde gezeigt, dass patienteneigene Xenotransplantate (PDXs) die Tumorheterogenität mit hoher Genauigkeit rekapitulieren, wenn sie orthotopisch implantiert werden, einschließlich Histopathologie, Rezeptorexpression und genetischer Aberrationen 2,3,4. Wichtig ist, dass sie auch Stromazellen zurückhalten, die zur Mikroumgebung des Tumors beitragen, wie z. B. Gefäßsysteme, Immunzellen und krebsassoziierte Fibroblasten. Sie werden jedoch nach und nach durch murine Wirtsstromazellen mit Passageersetzt 5. PDXs ermöglichen auch die Untersuchung von systemischen Komplikationen infolge des Tumorwachstums, wie z.B. Fatigue 6,7, was derzeit mit in vitro-Modellen nicht möglich ist.

Für eine erfolgreiche BC-PDX-Transplantation ist jedoch ein immundefizienter Mausstamm erforderlich, wobei der am häufigsten verwendete Stamm NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) ist. NSG-Mäuse haben keine adaptive Immunität und weisen eine stark defekte angeborene Immunitätauf 8. Die BC PDX-Transplantation wurde bei anderen immundefizienten Stämmen wie SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl) mit ähnlichen Transplantationsraten erreicht4.

Traditionelle Methoden zur Implantation von BC-PDXs beinhalten die chirurgische Implantation eines Tumorfragments in das Brustfettpolster9, und dieser Ansatz führt zu einer erfolgreichen Transplantation mit günstigen Raten. Die Notwendigkeit steriler chirurgischer Eingriffe und des Einsatzes von Narkosemitteln macht es jedoch zeitaufwändig, wodurch die Anzahl der Mäuse, die in einem bestimmten Zeitfenster implantiert werden können, begrenzt wird. Angesichts des potenziellen prädiktiven Nutzens von PDXs für das Ansprechen auf Medikamente bei Tumoren und den Einsatz in der Präzisionsmedizin10 ist ein einfacher und reproduzierbarer Arbeitsablauf für die homogene Implantation von PDXs bei Mäusen von entscheidender Bedeutung. Dieser Artikel zeigt die Dissoziation von humanen Brusttumoren in eine Einzelzellsuspension und die anschließende orthotope Injektion in Brustfettpolster von immundefizienten Mäusen.

Protokoll

Dieses Protokoll entspricht den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der West Virginia University (WVU). Weibliche NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse im Alter von 8 Wochen oder älter und mit einem Gewicht von etwa 25 g wurden für Tumorzellinjektionen verwendet. Brustkrebstumorgewebe wurde am West Virginia University Cancer Institute (Morgantown, WV) und vom NCI Cooperative Human Tissue Network im Rahmen des genehmigten Protokolls des WVU Institutional Review Board und des WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee beschafft. Von den Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Alle Verfahren wurden unter aseptischen Bedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II unter Befolgung geeigneter Protokolle für persönliche Schutzausrüstung (PSA) durchgeführt. Einzelheiten zu den Tieren, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Enzymatische Dissoziation von Tumorgewebe mit hohem Durchsatz

  1. Tauen Sie die Enzyme H, R und A aus dem menschlichen Tumordissoziationskit in einem sterilen C-Röhrchen auf und kombinieren Sie sie. Fügen Sie 200 μl Enzym H, 100 μl Enzym R und 25 μl Enzym A hinzu. Bringen Sie das endgültige Volumen auf ~5 ml, indem Sie 4,7 ml steriles RPMI 1640 Medium in das C-Röhrchen geben.
    HINWEIS: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kann anstelle von RPMI 1640 verwendet werden.
  2. Tumorfragmente können geschnitten und eingefroren werden, wie in bestehenden Protokollen beschrieben9. Übertragen Sie aufgetaute Tumorfragmente und das dazugehörige Gefriermedium auf eine Hälfte einer sterilen 100-mm-Kulturschale. Übertragen Sie die Tumorfragmente mit einer sterilen Pinzette in ein steriles 5-ml-Mikroröhrchen.
    HINWEIS: Eine sterile Injektionsnadel kann als Alternative zur Pinzette verwendet werden. Anstelle eines 5-ml-Mikroröhrchens kann eine 35-mm-Schale verwendet werden.
  3. Waschen Sie die Tumorfragmente mit 1-3 mL steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 1x). Manipulieren Sie die Fragmente in der Lösung mit einer Pinzette, um eine gründliche Entfernung des restlichen Gefriermediums zu gewährleisten.
  4. Übertragen Sie die gewaschenen Fragmente mit einer Pinzette in ein 2-ml-Mikroröhrchen. Tragen Sie 1 ml Dreifach-Antibiotika-Lösung (TAB) auf die Tumorfragmente auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann bei Bedarf übersprungen werden. 10x TAB-Material kann durch Auflösen von 1 % Gentamicin, 1 % Clindamycin und 0,5 % Polymyxin-B-Sulfat in sterilem 1x PBS hergestellt werden. Verdünnen Sie es auf 1x TAB-Lösung in sterilem 1x PBS.
  5. Übertragen Sie die desinfizierten Fragmente mit einer sterilen Pinzette in ein neues 5-ml-Mikroröhrchen. Führen Sie eine zweite Wäsche mit 1-3 ml sterilem PBS durch. Übertragen Sie die gewaschenen Fragmente in die trockene Hälfte der 100-mm-Kulturschale aus Schritt 1.2.
  6. Mit zwei sterilen Skalpellklingen Nr. 10 wird das Tumorgewebe gründlich zerkleinert. Übertragen Sie die zerkleinerten Tumorfragmente auf eine Klinge und legen Sie sie in das C-Röhrchen mit der vorbereiteten Enzymlösung. Befestigen Sie den Tubendeckel fest, bis ein letztes Klicken zu spüren ist.
  7. Drehen Sie das C-Rohr mehrmals um, um eine gleichmäßige Verteilung der Tumorfragmente in der Enzymlösung zu gewährleisten.
  8. Setzen Sie das C-Rohr in den mechanischen Dissoziator ein. Drehen Sie das Rohr um und stellen Sie sicher, dass der gesamte Inhalt in das Medium eingetaucht ist. Das Rohr befindet sich in der Maschine in einer umgekehrten Position.
    1. Befestigen Sie das Rohr in einem Schlitz, wobei der eingekerbte Teil zum Bediener zeigt. Platzieren Sie gegebenenfalls die Heizung um das Rohr.
  9. Wählen Sie das 37C_h_TDK_3 Programm über die Touchscreen-Oberfläche aus. Dieses Programm arbeitet 60 Minuten lang bei 37 °C. Bei weicheren Tumoren können 37C_h_TDK_1 oder 2 verwendet werden.
    HINWEIS: Um die größtmögliche Wirksamkeit zu erzielen, wird empfohlen, die Mäuse während dieser Dissoziationsphase auf die Injektion vorzubereiten, indem Enthaarungscreme auf die Injektionsstellen aufgetragen wird.
  10. Überprüfen Sie nach Abschluss des Dissoziationsprogramms den Inhalt der Röhre. Es sollten keine sichtbaren Tumorfragmente zurückbleiben.
    HINWEIS: Wenn Fragmente vorhanden sind, kann eine zusätzliche Dissoziationszeit erforderlich sein. Führen Sie in solchen Fällen das Programm für weitere 20-30 Minuten aus.
  11. Sobald eine ausreichende Dissoziation erreicht ist, zentrifugieren Sie das C-Rohr bei 200 x g für 5-8 min bei 4 °C, um dissoziierte Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumaspiration oder einer Pipette.
  12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5-10 ml frischem RPMI-Medium. Übertragen Sie die Zellsuspension zur leichteren Handhabung in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension bei 200 x g für 5-8 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig ansaugen.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann weggelassen werden, wenn das Zellenpellet klein ist. In solchen Fällen werden die Zellen direkt in das gewünschte Medienvolumen resuspendiert und dann mit Basalmembranextrakt (Matrigel) kombiniert, um den Zellverlust zu minimieren.
  13. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Volumen von RPMI 1640, was der Hälfte des gewünschten Endinjektionsvolumens entspricht. RPMI 1640 und Matrigel werden in einem Verhältnis von 1:1 v/v kombiniert, mit einem endgültigen Injektionsvolumen von 100 μl pro Injektionsstelle.
    HINWEIS: Für die bilaterale Injektion in 4 Mäuse beträgt das erforderliche Gesamtvolumen 800 μl. Resuspendieren Sie daher die Zellen in mindestens 400 μl RPMI 1640. Um einen möglichen Volumenverlust zu berücksichtigen, ist es ratsam, das Endvolumen um weitere 20 % zu erhöhen, wobei das Verhältnis von 1:1 v/v beibehalten wird. Alternativ kann DMEM oder 1x PBS anstelle von RPMI 1640 verwendet werden.
  14. Zählen Sie die resuspendierten Zellen mit einem Hämozytometer oder einer automatisierten Methode. Nach Bedarf verdünnen, um die gewünschte Konzentration für die Injektion zu erreichen. Es wird ein Ausgangspunkt von ca. 1-2 Millionen Zellen pro Injektionsstelle vorgeschlagen.
  15. Kombinieren Sie in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden die gewünschte Menge an verdünnter Zellsuspension in RPMI mit einem gleichen Volumen Matrigel. Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren, um die Homogenität zu gewährleisten.
    HINWEIS: Nach dem vorherigen Schritt fügen Sie 400 μl verdünnte Zellsuspension zu 400 μl Matrigel hinzu. Berücksichtigen Sie die Anzahl der zu verwendenden Injektionsnadeln und berücksichtigen Sie die damit verbundenen Volumenverluste. Halten Sie Matrigel immer auf Eis. Tauen Sie es nicht auf, bis die Zellen wieder suspendiert sind, da es sich schnell verfestigt. Empfohlen zur Aufbewahrung kleiner Aliquots (z. B. 120 μl) für schnelles Auftauen und Kombination in einem 2-ml-Röhrchen.
  16. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis sie zur Injektion bereit ist.

2. Orthotope Injektion von hautnahen Brustfettpolstern mit dissoziiertem PDX

  1. Bestimmen Sie die Masse jeder Maus mit einer kalibrierten Waage. Tragen Sie eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die Zielinjektionsstelle(n) auf. Massieren Sie die Creme mit einem sterilen Wattestäbchen abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn ein, um eine schnelle Fellentfernung zu ermöglichen.
    1. Entfernen Sie überschüssiges Fell und Enthaarungscreme mit einem sterilen, mit Kochsalzlösung getränkten Mullschwamm. Sorgen Sie für eine vollständige Haarentfernung im Injektionsbereich.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 60 s Exposition der Enthaarungscreme, um Hautreizungen zu vermeiden. Mäuse können vor dem Auftragen der Enthaarungscreme rasiert werden, um die Einwirkzeit weiter zu minimieren. Dieser Schritt kann während der Tumordissoziation durchgeführt werden, um die Zeiteffizienz zu optimieren und die Dauer der Lagerung der Zellsuspension auf Eis zu minimieren.
  2. Führen Sie eine gründliche Sichtprüfung jeder Maus durch, um die Eignung für die Injektion zu beurteilen. Untersuchen Sie auf Anzeichen von Schmerzen, Stress, Krankheit oder anderen Kontraindikationen.
  3. Aspirieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Spritze ohne aufgesetzte Nadel vorsichtig auf und ab, um die Homogenität zu gewährleisten. Setzen Sie eine 26-G-Nadel auf die 1-ml-Spritze und entnehmen Sie das gewünschte Injektionsvolumen. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Spritze durch leichtes Klopfen oder Schnippen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, 600 μl pro Spritze nicht zu überschreiten, um die einhändige Injektion zu erleichtern.
  4. Legen Sie die vorbereitete Spritze waagerecht auf den Eisbehälter, wobei die Nadel vom Bediener weg ausgerichtet ist. Positionieren Sie den Eisbehälter und die Nadel auf der gleichen Seite wie die dominante Hand oder die bevorzugte Injektionshand des Bedieners. Nehmen Sie die Maus aus dem Gehäuse und desinfizieren Sie den Injektionsbereich mit einem Alkoholreinigungspad.
  5. Halten Sie die Maus sicher fest, indem Sie die Rückenhaut im Nacken und Rücken fest greifen. Sorgen Sie für eine ausreichende Ruhigstellung, um die Brustfettpolster deutlich freizulegen. Das Brustfettpolster der Leistengegend erstreckt sich von der Brustwarze bis zur Oberseite der Hüfte. Es ist als weiches, rosafarbenes Gewebe im beschriebenen Bereich unter der Haut zu beobachten.
    HINWEIS: Ein Bedienerassistent kann eine flache Pinzette verwenden, um die Haut, die das Fettpolster enthält, zu kneifen und anzuheben. Diese Technik trägt dazu bei, dass der Bediener, der die Injektion durchführt, erfolgreich auf das Fettpolster abzielt.
  6. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage. Führen Sie die Nadel (abgeschrägt nach oben) in einem 45-Grad-Winkel ein, wobei Sie etwa 0,5-1 cm kaudal zum Fettpolster zur Hüfte zeigen, und stellen Sie die Nadellänge ein.
    1. Schiebe die Nadel in das Fettpolster ein. Injizieren Sie kontrolliert das gewünschte Volumen der Zellsuspension. Eine effiziente Injektionsgeschwindigkeit trägt dazu bei, die Unruhe der Tiere durch längere Fixierung zu minimieren.
      HINWEIS: Um das Leiden der Tiere so gering wie möglich zu halten, sollte die maximale Dauer der kontinuierlichen manuellen Fixierung 30 s nicht überschreiten. Wenn die Fixierungsdauer 30 s überschreitet, sollte das Tier in den Käfig entlassen werden, damit es sich vor einem zweiten Versuch erholen kann.
  7. Drehen Sie die Nadel nach der Injektion um 180 Grad (Abschrägung nach unten). Halten Sie die Nadelposition kurz bei, bevor Sie sie langsam entnehmen, um den Zellverlust von der Injektionsstelle zu minimieren. Wenn Blutungen auftreten, tragen Sie bei Bedarf Standardgaze oder hämostatische Gaze auf.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 für das kontralaterale Fettpolster, wenn bilaterale Injektionen erforderlich sind. Bei mehreren Tieren wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 2.2-2.7.

3. Follow-up-Verfahren

  1. Entsorgen Sie alle scharfen Gegenstände in dafür vorgesehenen Behältern für scharfe Gegenstände. Entsorgen Sie den restlichen Inhalt in den dafür vorgesehenen Abfallbehältern.
  2. Wenn während der Injektion Blutungen auftreten, überwachen Sie die Mäuse danach mindestens 1 Stunde lang, um eine Blutstillung sicherzustellen.
  3. Überwachen Sie wöchentlich die Körpermasse. Beurteilen Sie das Tumorvolumen, sobald das Wachstum tastbar wird.

Ergebnisse

Diese Studie skizziert einen effizienten und nicht-chirurgischen Ansatz für die orthotope Implantation von patientinnenstammenden Brustkrebs-Xenotransplantaten bei Mäusen. Brusttumorgewebe wurde mit humanspezifischen Enzymen und mechanischer Bewegung dissoziiert, in einem 1:1 v/v-Verhältnis von Matrigel: RPMI 1640 resuspendiert und orthotopisch in die leistenförmigen Brustfettpolster von NSG-Mäusen injiziert (Abbildung 1 und Abbildung 2). Um die Genauigkeit der PDX-Modelle zu gewährleisten, wurde die Übereinstimmung der ursprünglichen Tumorprobe des Patienten mit den passageierten Tumoren mit etablierten histopathologischen und genomischen Techniken validiert. Die Rezeptorexpression wurde mittels immunhistochemischer (IHC) Färbung von Standard-Brustkrebsrezeptoren, einschließlich des Östrogenrezeptors (ER), des Progesteronrezeptors (PR) und des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (HER2), profiliert (Abbildung 3). Die zelluläre Morphologie wurde anhand der Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung der geschnittenen Tumorschnitte und der pathologischen Interpretation der gefärbten Schnitte durch einen Pathologen beurteilt. Die Erhaltung der genetischen Landschaft und die Retention menschlicher Zellen wurde mittels Bulk-RNA-Sequenzierung und STR-Authentifizierung (Short Tandem Repeat) validiert (Abbildung 4 und Tabelle 1). Darüber hinaus wurde bei Erregertests keine Kontamination des Patienten oder der passageierten Tumorproben festgestellt, was bei der Verwendung von immundefizienten Mäusen ein wesentlicher Überprüfungsschritt ist.

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Abbildung 1: Überblick über das Protokoll. Darstellung des Arbeitsablaufs bei der Tumordissoziation und -injektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

NSG-Mäuse wurden für die Injektion vorbereitet, wobei eine Enthaarungscreme verwendet wurde, die abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn aufgetragen wurde, um das Fell aus dem Bereich des Brustfettpolsters der Leistenrinde gründlich zu entfernen (Abbildung 2A). Überschüssige Enthaarungscreme wurde mit steriler Gaze von der freiliegenden Bauchhaut abgewischt und der Bereich mit einem Alkoholtupfer desinfiziert (Abbildung 2B). Eine sterile Nadel, die mit dissoziierten Tumorzellen beladen war, wurde in einem Winkel von etwa 45 Grad 0,5 bis 1 mm kaudal zu den Brustfettpolstern der vierten Leistenbrustwarze positioniert (Abbildung 2C). Tumorzellen wurden kontrolliert in die Brustfettpolster der vierten Leistenbrustwarze injiziert (Abbildung 2D). Das Tumorwachstum wurde zunächst durch digitales Abtasten der Fettpolster nachgewiesen. Anschließend wurde die Progression des Tumorvolumens mittels Magnetresonanztomographie (MRT) quantitativ verfolgt (Abbildung 2E). Sowohl das Körpergewicht (Abbildung 2F) als auch das Tumorvolumen (Abbildung 2G) wurden wöchentlich gemessen, um Schwankungen des Gewichts und des Fortschreitens des Tumorvolumens zu überwachen. Die Tumore wurden visuell untersucht, um Wunden wie Geschwüre zu überwachen, die einen vorzeitigen Abbruch erforderlich machen würden. Die erfolgreiche bilaterale Transplantation des PDX in die leistenweisen Brustfettpolster ist in Abbildung 2H dargestellt, und die Fettpolster nach der Exzision der Tumoren sind in Abbildung 2I dargestellt.

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Abbildung 2: Präparation von Mäusen, PDX-Injektion und Überwachung der Tumorprogression. (A) Brustfettpolster wurden gründlich enthaart gemacht. (B) Darstellung der Injektionsstelle mit klarer Sichtbarkeit der Zielinjektionsbereiche. (C) Position der Spritze auf dem Fettpolster, typischerweise 0,5-1 mm kaudal zum Fettpolster, abhängig von der Nadellänge. Der weiße Pfeil zeigt den Zielbereich für die Nadel beim Einstechen an. (D) Darstellung einer dissoziierten Zellinjektion in das Brustfettpolster der linken vierten Leistenbrustwarze. Die Nadel sollte in einem Winkel von etwa 45 Grad gehalten werden, wie bei der Injektion gezeigt. (E) Repräsentatives MRT-Bild von bilateral transplantierten Tumoren an der Injektionsstelle. Tumore sind grün hervorgehoben. (F) Repräsentative Progression des Körpergewichts in Gramm nach Injektion von Tumorzellen (n = 5). Die dunkelblaue Linie stellt eine einfache lineare Regression dar, die signifikant ungleich Null ist (p < 0,0001); Mäuse nahmen im Durchschnitt 22 mg zu.Tag-1. Die dunkelblaue Schattierung ist ein Konfidenzintervall von 95 %, die hellblaue Schattierung ein Vorhersageintervall von 95 % und die orangefarbenen Linien sind Längsmessungen des Körpergewichts. (G) Repräsentative Progression einzelner Tumorvolumina in mm3 nach Injektion von Tumorzellen (n = 10). Die dunkelblaue Linie stellt die exponentielle Regression dar. Die Verdopplungszeit des Tumorvolumens betrug 19,08 Tage. Die dunkelblaue Schattierung ist ein 95 %-Konfidenzintervall, die hellblaue Schattierung ist ein 95 %-Vorhersageintervall und die orangefarbenen Linien stellen das longitudinale Tumorvolumen dar. (H) Erfolgreiche bilaterale Transplantation von PDX-Zellen in die leistenförmigen Brustfettpolster. Beachten Sie, dass die Vaskularisierung bei jedem Tumor zu sehen ist. Die weißen Pfeile kennzeichnen die Tumore. (I) Der Bereich des Brustfettpolsters der Leistengegend nach der Entfernung von Tumoren. (H,I) Die Einheiten auf dem Lineal sind in cm angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der repräsentative PDX (PEN_056) stammt von einer 31-jährigen kaukasischen Frau mit invasivem Mammakarzinom im Stadium 3A. Der Primärtumor, der aus der rechten Brust entnommen wurde, hatte einen Rezeptorstatus von ER und PR negativ, HER2 positiv (ER-PR-HER2+). Die IHC-Färbung für ER-, PR- und HER2-Rezeptoren zeigte eine Übereinstimmung zwischen der Patientin und PDX-Tumoren (Abbildung 3). Die PDX zeigt jedoch eine stärkere Expression von HER2, was auf ein selektives Wachstum von HER2+-Zellen zurückzuführen sein könnte. Die pathologische Auswertung von H&E-gefärbten Schnitten bestätigte ein schlecht differenziertes Karzinom mit konsistenter Morphologie und Zytologie sowohl in der Patienten- als auch in der PDX-Probe (Abbildung 3).

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Abbildung 3: IHC-Rezeptor- und H&E-Färbung. (Linke Spalte) IHC-Färbung von ER-, PR- und HER2-Rezeptoren und H&E-Färbung im Patiententumor. ER- und PR-Färbungen zeigen erwartungsgemäß keine offensichtliche positive Färbung. HER2-Flecken zeigen eine positive Wirkung auf HER2 (braun). (Rechte Spalte) IHC-Färbung von ER-, PR- und HER2-Rezeptoren und H&E-Färbung in der passageierten PDX-Probe. Die Rezeptorfärbung ähnelt stark der in der Patientenprobe, obwohl HER2 nach der Passage eine stärkere Expression zeigt. Maßstab: 50 μm; Vergrößerung: 20x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Genotypisierung der kurzen Tandemwiederholung (STR) bestätigte eine Ähnlichkeit von >80 % zwischen den 13 autosomalen Loci, die in den Konsensusrichtlinien der American Type Cell Culture Collection (ATCC) ASN-0002-2022 definiert wurden, plus 3 zusätzliche Loci (Tabelle 1). Die Massen-RNA-Sequenzierung (RNA-seq) der Tumorprobe des Patienten und PDX bestätigte ein gleichwertiges Alignment mit dem neuesten humanen Referenzgenom (T2T CHM13v2.0), wobei 82,3 % bzw. 79,1 % der Reads ausgerichtet waren. Darüber hinaus zeigten der Patiententumor und PDX eine starke positive Korrelation mit einem Pearson-r-Wert von 0,9559 (Abbildung 4A). Die Analyse der Gensatzanreicherung, bei der PDX mit dem Patiententumor verglichen wurde, zeigte, dass die Top 10 der signifikant angereicherten Signalwege aus genetischen ontologischen biologischen Prozessen überwiegend immunologische Gensätze waren, was darauf hindeutet, dass der Großteil der transkriptionellen Varianz zwischen PDX und Patiententumor auf das Fehlen von Immunzellen in der PDX-Probe zurückzuführen ist (Abbildung 4B).

Nr. D5S818D13S317Nr. D7S820VWATH01BINTPOXCSF1POD3S1358Nr. D21S11Nr. D18S51Penta_EPenta_DD8S1179FGA
Tumor des Patienten12
13		8
8		8
9		17
17		9
9.3		X
X		8
10		15
16		29
31.2		16
19		12
13		14
14		10
14		21
25
PDX-Tumor13
14		8
8		8
9		17
17		9
9.3		X
X		10
10		15
15		29
29		16
19		12
13		14
14		10
14		21
25

Tabelle 1: STR-Authentifizierung (Short Tandem Repeat).

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Abbildung 4: RNA-Sequenzierungskorrelation und Gensatzanreicherung. (A) Streudiagramm zur Visualisierung der log2 normalisierten Counts per Million (CPM) für alle Gene aus dem Patiententumor (x-Achse) und PDX (y-Achse). Es wurde eine starke positive Korrelation mit einem Pearson-r-Wert von 0,9559 gefunden. (B) Ridge-Plots für die Top 10 der angereicherten Gen-Ontologie-Gensätze für biologische Prozesse beim Vergleich von PDX vs. Patient Tumor. Kurven zeigen die Verteilung des Anreicherungswerts für jeden Gensatz; color stellt den FDR-q-Wert für jeden Gensatz dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In diesem Artikel wird eine effiziente Hochdurchsatzmethode zur orthotopischen Implantation von BC-PDXs in die leistenden Brustfettpolster von immundefizienten Mäusen vorgestellt. Dieser optimierte Arbeitsablauf ermöglicht es dem einzelnen Forscher, PDXs pro Tag in Dutzende von Mäusen zu implantieren und so groß angelegte und angemessen leistungsfähige Studien zu unterstützen. Die Fähigkeit, mehrere einzigartige PDXs gleichzeitig zu dissoziieren und zu implantieren, ermöglicht auch präzise onkologische Ansätze. Über die Zeiteffizienz hinaus entsteht durch die Dissoziation der Tumore eine homogene Suspension der Zelltypen, die gleichmäßig auf die Mäuse verteilt ist. Unserer Erfahrung nach trägt diese Homogenität zu konsistenten Transplantations- und Tumorwachstumsraten bei.

Obwohl dieses Protokoll im Allgemeinen effektiv ist, kann es in bestimmten Szenarien Änderungen erfordern. So erweist sich beispielsweise die standardmäßige Laufzeit von 1 h am mechanischen Dissoziator gelegentlich als unzureichend für eine vollständige Dissoziation des Tumorgewebes. Halten Sie das C-Rohr fest und schnippen Sie es mehrmals nach unten, um verstreutes Gewebe am Boden anzusammeln. Wenn sichtbare Gewebefragmente verbleiben, setzen Sie die Dissoziation fort und untersuchen Sie sie in Abständen von 15 Minuten erneut. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Gewebe, insbesondere fibröses oder fettiges Gewebe, der Dissoziation widerstehen können und eine manuelle Entfernung erfordern, um ein Verstopfen der Nadel während der Injektion zu verhindern.

Wir empfehlen, die kleinstmögliche Nadel (27 g oder 26 g) zu verwenden, um den Stress der Tiere zu minimieren und das Risiko eines Zellrückflusses von der Injektionsstelle zu verringern, der sich auf den Erfolg der Transplantation und die Tumorwachstumsraten auswirken könnte. Wenn jedoch undissoziiertes Gewebe oder Fettfragmente zurückbleiben, kann eine größere Nadel (16 G oder 18 G) erforderlich sein, wenn auch mit erhöhtem Risiko für Blutungen oder Zellverlust. Unabhängig von der gewählten Nadelstärke ist der Umgang mit den Tieren die wichtigste Komponente für eine effektive Durchführung der Injektionen. In diesem Protokoll wird keine Anästhesie verwendet, was zwar Zeit spart, dem Tier aber auch ein gewisses Maß an Mobilität ermöglicht, wenn Injektionen durchgeführt werden. Wenn beim Scrumpfing keine angemessene Fixierung erreicht wird, können abrupte Bewegungen der Gliedmaßen zu einer Punktion der Gefäße, der Schaffung einer Austrittswunde, die eine Zellretention verhindert, oder zu Bauchwandpunktionen führen. Vor der Injektion wertvoller Zellen wird dringend empfohlen, ausreichend zu üben.

Die beschriebene Dissoziationstechnik ist hochgradig übertragbar und kann bei der Implantation zahlreicher anderer Tumorarten sowohl für orthotope als auch für subkutane Modelle eingesetzt werden. Zumindest im Rahmen des BC sollte jedoch auf eine subkutane Implantation verzichtet werden. Die orthotope BC PDX-Injektion führt zu einer überlegenen Vaskularisierung des transplantierten Tumors durch den Wirt im Vergleich zur subkutanen Injektion, und die Implantation eines inguinalen Fettpolsters führt zu höheren Transplantationsraten als das thorakale Fettpolster11. Darüber hinaus haben orthotopisch implantierte PDXs im Vergleich zu subkutanen Injektionen eine kürzere Transplantationszeit und eine schnellere Wachstumsrate12. Es sollte auch beachtet werden, dass die Dissoziation zwar eine schnelle Injektion von Tumorzellen erleichtert, aber von Natur aus zum Verlust des Zell-zu-Zell-Kontexts führt; Daher ist dies möglicherweise nicht in allen Fällen ein geeigneter Ansatz. In Fällen, in denen eine authentische Zellinteraktion erforderlich ist (z.B. räumliche Transkriptomik der Tumore), kann die Injektion von zerkleinerten Tumorstücken oder die Implantation von Fragmenten bevorzugt werden.

Während die Verwendung von immundefizienten Mäusen für PDX-Studien unerlässlich ist, führt sie zu gewissen Einschränkungen. Aus logistischer Sicht ist eine vollständig sterile Umgebung erforderlich, einschließlich Unterkunft, Nahrung und Wasser. Dies erfordert außerdem spezielle Haltungsbereiche für immundefiziente Tiere, um das Infektionsrisiko zu verringern, was die Unterbringungskosten erhöhen kann. Diese erhöhte Anfälligkeit für Infektionen ist der Grund, warum ein antibiotischer Inkubationsschritt für die Tumorfragmente vor der Dissoziation empfohlen wird. Einige Studien haben jedoch gezeigt, dass der Einsatz von Antibiotika in der Zellkultur zu Veränderungen der Genexpressionsprofile führt13. Vor diesem Hintergrund sollten Forscher den Einsatz von Antibiotika für jede Studie bewerten. Während das effektive Fehlen eines Immunsystems die Transplantation von PDXs ermöglicht, schließt es auch die Untersuchung der zahlreichen Auswirkungen des Immunsystems auf die BC-Progression aus14.

Diese Methode zeigt eine hohe Wiedergabetreue der Tumorproben des Patienten. Die histopathologische Authentifizierung bestätigte erwartungsgemäß die Konkordanz des passageierten PDX relativ zur Tumorprobe des Patienten. Die hohe Übereinstimmung der Reads mit dem menschlichen Genom deutet stark darauf hin, dass der PDX nach der Passage einen hohen Prozentsatz an menschlichen Zellen beibehält. Dies wird auch durch die >80%ige Ähnlichkeit in den STR-Profilen und die starke positive Korrelation in den RNA-seq-Daten zwischen dem Patiententumor und PDX unterstützt. Molekulare Anpassungen im peripheren Gewebe von PDX-Mäusen nach dem Wachstum von Brusttumoren stimmen auch mit molekularen Anpassungen bei menschlichen BC-Patientinnen überein. Bulk-RNA-seq- und Proteomanalysen der Skelettmuskulatur von BC PDX-Mäusen stimmen auffallend gut mit molekularen Veränderungen in Muskelbiopsien überein, die von Patienten mit BC 6,7 im Frühstadium erhalten wurden. Insgesamt liefert die Ähnlichkeit von STR-Profiling und RNA-seq, gepaart mit konsistenten Anpassungen in peripheren Geweben, überzeugende Daten für den Einsatz von BC PDX-Mäusen in präklinischen Studien.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenzulegen haben.

Danksagungen

Wir möchten uns bei den großzügigen Beiträgen der Patienten bedanken, die Tumorproben für die Entwicklung von PDXs zur Verfügung gestellt haben. Emidio Pistilli dankt Hannah Wilson, MD/PhD, für ihre bedeutenden früheren Beiträge. Diese Forschung wurde von den folgenden Organisationen unterstützt: National Institutes of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) unter der Preisnummer R01AR079445 (Pistilli); die WVU Genomics Core Facility (U54GM104942); die WVU Animal Model and Imaging Facility (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); National Institutes of General Medical Sciences unter der Fördernummer P20GM121322 (Lockman). Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL TuberkulinspritzeBD305945steril
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4Gibco10010023steril
2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem BodenEppendorf0030123620sterile
26 G Nadel, ½ in.BD305111steriles
5,0 mL MikroröhrchenEppendorf0030119401steriles
8+ Wochen altes NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) MäuseThe Jackson Laboratory#005557
Alkohol-VorbereitungspadsFisher Scientific22-363-750steril
Basalmembran-Extrakt (Matrigel)Cultrex3632-005-02
Applikatoren mit Wattespitze, 6 Zoll.Fisher Scientific22-029-553sterile
Pinzette mit mittleren, nicht gezackten Spitzen, 152 mmElektronenmikroskopie Sciences50-365-845sterile
EnthaarungscremeNair
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissoziator mit HeizernMiltenyi Biotec130-096-427
Nr. 10 SkalpellklingenFisher Scientific12-000-162sterile
Vlies-Mullschwämme, 4x4 ZollFisher Scientific22-028-558steril
RPMI 1640 1x + L-GlutaminGibco11875093steriles
Tumordissoziationsset, humanMiltenyi Biotec130-095-929
gebogene

Referenzen

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).
  2. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  5. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).
  6. Wilson, H. E., et al. Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue. Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).
  7. Wilson, H. E., et al. Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).
  8. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  9. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).
  10. Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power. Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).
  11. Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).
  12. Okano, M., et al. Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  13. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).
  14. Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. Immune system effects on breast cancer. Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Brustkrebs PDXTumordissoziationMilchdr senfettk rperHerstellung von Zellsuspensionenimmundefiziente M useRPMI 1640 MediumBeurteilung des RezeptorstatusH matoxylin Eosin F rbung
Hochdurchsatz-Dissoziation und orthotope Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen
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