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Methodenartikel

Hochdurchsatz-Dissoziation und orthotope Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen

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DOI:

10.3791/67607

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20. Dezember 2024

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1Division of Exercise Physiology, Department of Health Professions, West Virginia University School of Medicine, 2Cancer Institute, West Virginia University School of Medicine, 33Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente, nicht-chirurgische Methode zur orthotopen Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen bei Mäusen. Die Technik beinhaltet eine enzymatische Tumordissoziation, gefolgt von einer direkten Injektion in die Brustfettpolster, was eine Hochdurchsatzimplantation ermöglicht. Die umfassende Validierung gewährleistet die Modelltreue und ermöglicht strenge Studien über verschiedene Brustkrebs-Subtypen hinweg.

Zusammenfassung

Patienten-abgeleitete Xenotransplantate (PDXs) stellen eine klinisch relevante Methode zur Rekapitulation von tumorbetroffenen Zelltypen und der Tumormikroumgebung dar, die für die Weiterentwicklung des Wissens über Brustkrebs (BC) unerlässlich ist. Darüber hinaus ermöglichen PDX-Modelle die Untersuchung systemischer BC-Effekte, was mit in vitro-Modellen nicht möglich ist. Traditionelle Methoden zur Implantation von BC-Xenotransplantaten beinhalten in der Regel Anästhesie und sterile chirurgische Eingriffe, die zeitaufwändig und invasiv sind und die Skalierbarkeit von PDX-Modellen in der BC-Forschung einschränken. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und skalierbare Methode zur orthotopen Implantation von BC PDXs in Mäusen. Für die PDX-Transplantation wurde der immundefiziente Mausstamm NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) verwendet. Humane BC-Proben, die von IRB-zugelassenen Patienten gewonnen wurden, wurden mechanisch und enzymatisch dissoziiert und dann in einer Lösung aus Basalmembranextrakt (BME) und RPMI 1640 resuspendiert. Die Tiere wurden durch Scrubfing fixiert, und es wurde Enthaarungscreme aufgetragen, um die Haare von den Fettpolstern an der vierten Leistenbrustwarze zu entfernen, gefolgt von einer Injektion. Etwa 2 Millionen Zellen in einer 100 μL Suspension wurden mit einer 26 G Nadel bilateral orthotopisch in die Brustfettpolster injiziert. Bemerkenswert war, dass kein Anästhetikum erforderlich war und die Gesamtzeit des Eingriffs von der Zellvorbereitung bis zur Injektion weniger als 5 Minuten betrug. Nach einer mehrmonatigen Wachstumsphase wurden die Tumore herausgeschnitten und für die Authentifizierung aufbereitet. Die Validierung umfasste die Bewertung des Rezeptorstatus mittels Immunhistochemie mit spezifischen Antikörpern für traditionelle BC-Rezeptoren (d. h. ER, PR, HER2). Die Tumormorphologie wurde durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) bestätigt, die von einem Pathologen interpretiert wurde. Die genetische Ähnlichkeit mit der Patientenprobe wurde durch Bulk-RNA-Sequenzierung und Short Tandem Repeat (STR)-Analyse verifiziert. Dieser Ansatz für die PDX-Transplantation und -Validierung unterstützt die rigorose Entwicklung von Modellen und die Hochdurchsatz-Tumorimplantation und ermöglicht so leistungsfähige Studien über verschiedene BC-Subtypen hinweg.

Einleitung

Brustkrebs (BC) wird jedes Jahr bei über 2 Millionen Frauen weltweit diagnostiziert1. Um das grundlegende biologische Verständnis von BC zu verbessern und neuartige Therapeutika erfolgreich in zugelassene Behandlungen zu überführen, sind präklinische Tiermodelle notwendig, die die definierenden Merkmale von Patiententumoren beibehalten. Es wurde gezeigt, dass patienteneigene Xenotransplantate (PDXs) die Tumorheterogenität mit hoher Genauigkeit rekapitulieren, wenn sie orthotopisch implantiert werden, einschließlich Histopathologie, Rezeptorexpression und genetischer Aberrationen 2,3,4. Wichtig ist, dass sie auch Stromazellen zurückhalten, die zur Mikroumgebung des Tumors beitragen, wie z. B. Gefäßsysteme, Immunzellen und krebsassoziierte Fibroblasten. Sie werden jedoch nach und nach durch murine Wirtsstromazellen mit Passageersetzt 5. PDXs ermöglichen auch die Untersuchung von systemischen Komplikationen infolge des Tumorwachstums, wie z.B. Fatigue 6,7, was derzeit mit in vitro-Modellen nicht möglich ist.

Für eine erfolgreiche BC-PDX-Transplantation ist jedoch ein immundefizienter Mausstamm erforderlich, wobei der am häufigsten verwendete Stamm NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) ist. NSG-Mäuse haben keine adaptive Immunität und weisen eine stark defekte angeborene Immunitätauf 8. Die BC PDX-Transplantation wurde bei anderen immundefizienten Stämmen wie SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl) mit ähnlichen Transplantationsraten erreicht4.

Traditionelle Methoden zur Implantation von BC-PDXs beinhalten die chirurgische Implantation eines Tumorfragments in das Brustfettpolster9, und dieser Ansatz führt zu einer erfolgreichen Transplantation mit günstigen Raten. Die Notwendigkeit steriler chirurgischer Eingriffe und des Einsatzes von Narkosemitteln macht es jedoch zeitaufwändig, wodurch die Anzahl der Mäuse, die in einem bestimmten Zeitfenster implantiert werden können, begrenzt wird. Angesichts des potenziellen prädiktiven Nutzens von PDXs für das Ansprechen auf Medikamente bei Tumoren und den Einsatz in der Präzisionsmedizin10 ist ein einfacher und reproduzierbarer Arbeitsablauf für die homogene Implantation von PDXs bei Mäusen von entscheidender Bedeutung. Dieser Artikel zeigt die Dissoziation von humanen Brusttumoren in eine Einzelzellsuspension und die anschließende orthotope Injektion in Brustfettpolster von immundefizienten Mäusen.

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Protokoll

Dieses Protokoll entspricht den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der West Virginia University (WVU). Weibliche NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse im Alter von 8 Wochen oder älter und mit einem Gewicht von etwa 25 g wurden für Tumorzellinjektionen verwendet. Brustkrebstumorgewebe wurde am West Virginia University Cancer Institute (Morgantown, WV) und vom NCI Cooperative Human Tissue Network im Rahmen des genehmigten Protokolls des WVU Institutional Review Board und des WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee beschafft. Von den Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Alle Verfahren wurden unter aseptischen Bedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II unter Befolgung geeigneter Protokolle für persönliche Schutzausrüstung (PSA) durchgeführt. Einzelheiten zu den Tieren, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Enzymatische Dissoziation von Tumorgewebe mit hohem Durchsatz

  1. Tauen Sie die Enzyme H, R und A aus dem menschlichen Tumordissoziationskit in einem sterilen C-Röhrchen auf und kombinieren Sie sie. Fügen Sie 200 μl Enzym H, 100 μl Enzym R und 25 μl Enzym A hinzu. Bringen Sie das endgültige Volumen auf ~5 ml, indem Sie 4,7 ml steriles RPMI 1640 Medium in das C-Röhrchen geben.
    HINWEIS: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kann anstelle von RPMI 1640 verwendet werden.
  2. Tumorfragmente können geschnitten und eingefroren werden, wie in bestehenden Protokollen beschrieben9. Übertragen Sie aufgetaute Tumorfragmente und das dazugehörige Gefriermedium auf eine Hälfte einer sterilen 100-mm-Kulturschale. Übertragen Sie die Tumorfragmente mit einer sterilen Pinzette in ein steriles 5-ml-Mikroröhrchen.
    HINWEIS: Eine sterile Injektionsnadel kann als Alternative zur Pinzette verwendet werden. Anstelle eines 5-ml-Mikroröhrchens kann eine 35-mm-Schale verwendet werden.
  3. Waschen Sie die Tumorfragmente mit 1-3 mL steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 1x). Manipulieren Sie die Fragmente in der Lösung mit einer Pinzette, um eine gründliche Entfernung des restlichen Gefriermediums zu gewährleisten.
  4. Übertragen Sie die gewaschenen Fragmente mit einer Pinzette in ein 2-ml-Mikroröhrchen. Tragen Sie 1 ml Dreifach-Antibiotika-Lösung (TAB) auf die Tumorfragmente auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann bei Bedarf übersprungen werden. 10x TAB-Material kann durch Auflösen von 1 % Gentamicin, 1 % Clindamycin und 0,5 % Polymyxin-B-Sulfat in sterilem 1x PBS hergestellt werden. Verdünnen Sie es auf 1x TAB-Lösung in sterilem 1x PBS.
  5. Übertragen Sie die desinfizierten Fragmente mit einer sterilen Pinzette in ein neues 5-ml-Mikroröhrchen. Führen Sie eine zweite Wäsche mit 1-3 ml sterilem PBS durch. Übertragen Sie die gewaschenen Fragmente in die trockene Hälfte der 100-mm-Kulturschale aus Schritt 1.2.
  6. Mit zwei sterilen Skalpellklingen Nr. 10 wird das Tumorgewebe gründlich zerkleinert. Übertragen Sie die zerkleinerten Tumorfragmente auf eine Klinge und legen Sie sie in das C-Röhrchen mit der vorbereiteten Enzymlösung. Befestigen Sie den Tubendeckel fest, bis ein letztes Klicken zu spüren ist.
  7. Drehen Sie das C-Rohr mehrmals um, um eine gleichmäßige Verteilung der Tumorfragmente in der Enzymlösung zu gewährleisten.
  8. Setzen Sie das C-Rohr in den mechanischen Dissoziator ein. Drehen Sie das Rohr um und stellen Sie sicher, dass der gesamte Inhalt in das Medium eingetaucht ist. Das Rohr befindet sich in der Maschine in einer umgekehrten Position.
    1. Befestigen Sie das Rohr in einem Schlitz, wobei der eingekerbte Teil zum Bediener zeigt. Platzieren Sie gegebenenfalls die Heizung um das Rohr.
  9. Wählen Sie das 37C_h_TDK_3 Programm über die Touchscreen-Oberfläche aus. Dieses Programm arbeitet 60 Minuten lang bei 37 °C. Bei weicheren Tumoren können 37C_h_TDK_1 oder 2 verwendet werden.
    HINWEIS: Um die größtmögliche Wirksamkeit zu erzielen, wird empfohlen, die Mäuse während dieser Dissoziationsphase auf die Injektion vorzubereiten, indem Enthaarungscreme auf die Injektionsstellen aufgetragen wird.
  10. Überprüfen Sie nach Abschluss des Dissoziationsprogramms den Inhalt der Röhre. Es sollten keine sichtbaren Tumorfragmente zurückbleiben.
    HINWEIS: Wenn Fragmente vorhanden sind, kann eine zusätzliche Dissoziationszeit erforderlich sein. Führen Sie in solchen Fällen das Programm für weitere 20-30 Minuten aus.
  11. Sobald eine ausreichende Dissoziation erreicht ist, zentrifugieren Sie das C-Rohr bei 200 x g für 5-8 min bei 4 °C, um dissoziierte Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumaspiration oder einer Pipette.
  12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5-10 ml frischem RPMI-Medium. Übertragen Sie die Zellsuspension zur leichteren Handhabung in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension bei 200 x g für 5-8 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig ansaugen.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann weggelassen werden, wenn das Zellenpellet klein ist. In solchen Fällen werden die Zellen direkt in das gewünschte Medienvolumen resuspendiert und dann mit Basalmembranextrakt (Matrigel) kombiniert, um den Zellverlust zu minimieren.
  13. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Volumen von RPMI 1640, was der Hälfte des gewünschten Endinjektionsvolumens entspricht. RPMI 1640 und Matrigel werden in einem Verhältnis von 1:1 v/v kombiniert, mit einem endgültigen Injektionsvolumen von 100 μl pro Injektionsstelle.
    HINWEIS: Für die bilaterale Injektion in 4 Mäuse beträgt das erforderliche Gesamtvolumen 800 μl. Resuspendieren Sie daher die Zellen in mindestens 400 μl RPMI 1640. Um einen möglichen Volumenverlust zu berücksichtigen, ist es ratsam, das Endvolumen um weitere 20 % zu erhöhen, wobei das Verhältnis von 1:1 v/v beibehalten wird. Alternativ kann DMEM oder 1x PBS anstelle von RPMI 1640 verwendet werden.
  14. Zählen Sie die resuspendierten Zellen mit einem Hämozytometer oder einer automatisierten Methode. Nach Bedarf verdünnen, um die gewünschte Konzentration für die Injektion zu erreichen. Es wird ein Ausgangspunkt von ca. 1-2 Millionen Zellen pro Injektionsstelle vorgeschlagen.
  15. Kombinieren Sie in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden die gewünschte Menge an verdünnter Zellsuspension in RPMI mit einem gleichen Volumen Matrigel. Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren, um die Homogenität zu gewährleisten.
    HINWEIS: Nach dem vorherigen Schritt fügen Sie 400 μl verdünnte Zellsuspension zu 400 μl Matrigel hinzu. Berücksichtigen Sie die Anzahl der zu verwendenden Injektionsnadeln und berücksichtigen Sie die damit verbundenen Volumenverluste. Halten Sie Matrigel immer auf Eis. Tauen Sie es nicht auf, bis die Zellen wieder suspendiert sind, da es sich schnell verfestigt. Empfohlen zur Aufbewahrung kleiner Aliquots (z. B. 120 μl) für schnelles Auftauen und Kombination in einem 2-ml-Röhrchen.
  16. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis sie zur Injektion bereit ist.

2. Orthotope Injektion von hautnahen Brustfettpolstern mit dissoziiertem PDX

  1. Bestimmen Sie die Masse jeder Maus mit einer kalibrierten Waage. Tragen Sie eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die Zielinjektionsstelle(n) auf. Massieren Sie die Creme mit einem sterilen Wattestäbchen abwechselnd im und gegen den Uhrzeigersinn ein, um eine schnelle Fellentfernung zu ermöglichen.
    1. Entfernen Sie überschüssiges Fell und Enthaarungscreme mit einem sterilen, mit Kochsalzlösung getränkten Mullschwamm. Sorgen Sie für eine vollständige Haarentfernung im Injektionsbereich.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 60 s Exposition der Enthaarungscreme, um Hautreizungen zu vermeiden. Mäuse können vor dem Auftragen der Enthaarungscreme rasiert werden, um die Einwirkzeit weiter zu minimieren. Dieser Schritt kann während der Tumordissoziation durchgeführt werden, um die Zeiteffizienz zu optimieren und die Dauer der Lagerung der Zellsuspension auf Eis zu minimieren.
  2. Führen Sie eine gründliche Sichtprüfung jeder Maus durch, um die Eignung für die Injektion zu beurteilen. Untersuchen Sie auf Anzeichen von Schmerzen, Stress, Krankheit oder anderen Kontraindikationen.
  3. Aspirieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Spritze ohne aufgesetzte Nadel vorsichtig auf und ab, um die Homogenität zu gewährleisten. Setzen Sie eine 26-G-Nadel auf die 1-ml-Spritze und entnehmen Sie das gewünschte Injektionsvolumen. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Spritze durch leichtes Klopfen oder Schnippen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, 600 μl pro Spritze nicht zu überschreiten, um die einhändige Injektion zu erleichtern.
  4. Legen Sie die vorbereitete Spritze waagerecht auf den Eisbehälter, wobei die Nadel vom Bediener weg ausgerichtet ist. Positionieren Sie den Eisbehälter und die Nadel auf der gleichen Seite wie die dominante Hand oder die bevorzugte Injektionshand des Bedieners. Nehmen Sie die Maus aus dem Gehäuse und desinfizieren Sie den Injektionsbereich mit einem Alkoholreinigungspad.
  5. Halten Sie die Maus sicher fest, indem Sie die Rückenhaut im Nacken und Rücken fest greifen. Sorgen Sie für eine ausreichende Ruhigstellung, um die Brustfettpolster deutlich freizulegen. Das Brustfettpolster der Leistengegend erstreckt sich von der Brustwarze bis zur Oberseite der Hüfte. Es ist als weiches, rosafarbenes Gewebe im beschriebenen Bereich unter der Haut zu beobachten.
    HINWEIS: Ein Bedienerassistent kann eine flache Pinzette verwenden, um die Haut, die das Fettpolster enthält, zu kneifen und anzuheben. Diese Technik trägt dazu bei, dass der Bediener, der die Injektion durchführt, erfolgreich auf das Fettpolster abzielt.
  6. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage. Führen Sie die Nadel (abgeschrägt nach oben) in einem 45-Grad-Winkel ein, wobei Sie etwa 0,5-1 cm kaudal zum Fettpolster zur Hüfte zeigen, und stellen Sie die Nadellänge ein.
    1. Schiebe die Nadel in das Fettpolster ein. Injizieren Sie kontrolliert das gewünschte Volumen der Zellsuspension. Eine effiziente Injektionsgeschwindigkeit trägt dazu bei, die Unruhe der Tiere durch längere Fixierung zu minimieren.
      HINWEIS: Um das Leiden der Tiere so gering wie möglich zu halten, sollte die maximale Dauer der kontinuierlichen manuellen Fixierung 30 s nicht überschreiten. Wenn die Fixierungsdauer 30 s überschreitet, sollte das Tier in den Käfig entlassen werden, damit es sich vor einem zweiten Versuch erholen kann.
  7. Drehen Sie die Nadel nach der Injektion um 180 Grad (Abschrägung nach unten). Halten Sie die Nadelposition kurz bei, bevor Sie sie langsam entnehmen, um den Zellverlust von der Injektionsstelle zu minimieren. Wenn Blutungen auftreten, tragen Sie bei Bedarf Standardgaze oder hämostatische Gaze auf.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 für das kontralaterale Fettpolster, wenn bilaterale Injektionen erforderlich sind. Bei mehreren Tieren wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 2.2-2.7.

3. Follow-up-Verfahren

  1. Entsorgen Sie alle scharfen Gegenstände in dafür vorgesehenen Behältern für scharfe Gegenstände. Entsorgen Sie den restlichen Inhalt in den dafür vorgesehenen Abfallbehältern.
  2. Wenn während der Injektion Blutungen auftreten, überwachen Sie die Mäuse danach mindestens 1 Stunde lang, um eine Blutstillung sicherzustellen.
  3. Überwachen Sie wöchentlich die Körpermasse. Beurteilen Sie das Tumorvolumen, sobald das Wachstum tastbar wird.

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Ergebnisse

Diese Studie skizziert einen effizienten und nicht-chirurgischen Ansatz für die orthotope Implantation von patientinnenstammenden Brustkrebs-Xenotransplantaten bei Mäusen. Brusttumorgewebe wurde mit humanspezifischen Enzymen und mechanischer Bewegung dissoziiert, in einem 1:1 v/v-Verhältnis von Matrigel: RPMI 1640 resuspendiert und orthotopisch in die leistenförmigen Brustfettpolster von NSG-Mäusen injiziert (Abbildung 1 und Abbil...

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Diskussion

In diesem Artikel wird eine effiziente Hochdurchsatzmethode zur orthotopischen Implantation von BC-PDXs in die leistenden Brustfettpolster von immundefizienten Mäusen vorgestellt. Dieser optimierte Arbeitsablauf ermöglicht es dem einzelnen Forscher, PDXs pro Tag in Dutzende von Mäusen zu implantieren und so groß angelegte und angemessen leistungsfähige Studien zu unterstützen. Die Fähigkeit, mehrere einzigartige PDXs gleichzeitig zu dissoziieren und zu implantieren, ermöglicht auch präzi...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenzulegen haben.

Danksagungen

Wir möchten uns bei den großzügigen Beiträgen der Patienten bedanken, die Tumorproben für die Entwicklung von PDXs zur Verfügung gestellt haben. Emidio Pistilli dankt Hannah Wilson, MD/PhD, für ihre bedeutenden früheren Beiträge. Diese Forschung wurde von den folgenden Organisationen unterstützt: National Institutes of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) unter der Preisnummer R01AR079445 (Pistilli); die WVU Genomics Core Facility (U54GM104942); die WVU Animal Model and Imaging Facility (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); National Institutes of General Medical Sciences unter der Fördernummer P20GM121322 (Lockman). Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL TuberkulinspritzeBD305945steril
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4Gibco10010023steril
2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem BodenEppendorf0030123620sterile
26 G Nadel, ½ in.BD305111steriles
5,0 mL MikroröhrchenEppendorf0030119401steriles
8+ Wochen altes NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) MäuseThe Jackson Laboratory#005557
Alkohol-VorbereitungspadsFisher Scientific22-363-750steril
Basalmembran-Extrakt (Matrigel)Cultrex3632-005-02
Applikatoren mit Wattespitze, 6 Zoll.Fisher Scientific22-029-553sterile
Pinzette mit mittleren, nicht gezackten Spitzen, 152 mmElektronenmikroskopie Sciences50-365-845sterile
EnthaarungscremeNair
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissoziator mit HeizernMiltenyi Biotec130-096-427
Nr. 10 SkalpellklingenFisher Scientific12-000-162sterile
Vlies-Mullschwämme, 4x4 ZollFisher Scientific22-028-558steril
RPMI 1640 1x + L-GlutaminGibco11875093steriles
Tumordissoziationsset, humanMiltenyi Biotec130-095-929
gebogene

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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