Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Summary

Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Abstract

Hautverletzungen setzen eine komplexe regenerative Kaskade in Gang, an der verschiedene Zelltypen beteiligt sind. Unter diesen spielen periphere Gliazellen eine entscheidende Rolle bei der Sicherstellung des Erfolgs des Reparaturprozesses. Unser Verständnis dieser Prozesse ist jedoch aufgrund der Einschränkungen der aktuellen Technologien unvollständig. Daher wurde die iterative Bleaching-extends-multiplexity (IBEX)-Methode eingesetzt, um Veränderungen der zellulären Zusammensetzung der Haut mit Antikörpern zu charakterisieren, die gegen Proteine gerichtet sind, die von Schlüsselzelltypen und -strukturen exprimiert werden, die an der Geweberegeneration beteiligt sind. Wichtig ist, dass Antikörper, die gegen Zellproliferationsmarker gerichtet sind, oft die Anzahl der sich teilenden Zellen in der Haut unterschätzen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde die Click-iT EdU-Chemie mit der IBEX-Methode kombiniert, die eine detaillierte Charakterisierung proliferierender Zelltypen ermöglicht. Unter Verwendung eines vollautomatischen konfokalen Spinning-Disk-Mikroskops wurde ein Hochdurchsatz-Workflow für die iterative Bildgebung von Proben entwickelt, die in 24-Well-Platten geschnitten wurden. Neben der Erweiterung der IBEX-Methode zur Bewertung von Zellzuständen in situ mit Click-iT EdU wurde auch eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eingeführt, die Bildkorrektur, Stitching und Registrierung durchführt und von Forschern ohne umfangreiche Programmierkenntnisse verwendet werden kann. Darüber hinaus wird eine detaillierte Dokumentation zur Verarbeitung und Visualisierung von hochgemultiplexten Bilddaten (unter Verwendung herkömmlicher Bildanalysesoftware, einschließlich Fiji und QuPath) bereitgestellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Vielseitigkeit des IBEX-Protokolls unterstreicht und seine Anpassung an eine etablierte konventionelle Bildgebungsplattform demonstriert. Insbesondere ermöglicht die Kombination von IBEX mit Click-iT EdU-Markierung den Nachweis und die Kategorisierung von sich aktiv teilenden Zelltypen in intakten Geweben und während hochdynamischer Prozesse mit räumlicher Auflösung.

Introduction

Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers und die Urbarriere, um den Körper vor der äußeren Umgebung zu schützen¹. Folglich ist es einer Vielzahl von externen Herausforderungen ausgesetzt, die seine Barrierefunktion beeinträchtigen. Daher hat die Haut komplexe Mechanismen entwickelt, um die Integrität und Funktionalität des Gewebes nach einer Schädigung wiederherzustellen. Die Wundheilung der Haut findet in drei sich überschneidenden Stadien statt: Entzündung, Proliferation und Reifung/Umbau. An diesen drei Stadien sind mehrere verschiedene Zelltypen beteiligt, wie z. B. dermale Fibroblasten und Immunzellen, die zusammenwirken, um die ursprünglichen biologischen Eigenschaften des verletzten Hautgewebes wiederherzustellen ^1,2,3.

Die Haut ist ein dicht innertes Organ, und es ist bekannt, dass die Innervation der Nerven für einen erfolgreichen Reparaturprozess entscheidend ist ^4,5,6. Abgesehen von der axonalen Signalübertragung ^4,7,8 sind die peripheren Gliazellen, die normalerweise die Axone umhüllen, an der erfolgreichen Geweberegeneration beteiligt ^9,10,11. Die Rolle unterrepräsentierter Zelltypen, wie z. B. peripherer Gliazellen, bei dynamischen Prozessen wie der Regeneration von Hautgewebe ist jedoch nach wie vor wenig verstanden. Um die Funktion dieser Zellen besser bestimmen zu können, ist es wichtig, die zelluläre Mikroumgebung und die benachbarten Zelltypen zu analysieren, mit denen sie während des Regenerationsprozesses interagieren können. Da die Zellproliferation eine Schlüsselphase für die Geweberegeneration ist, ist es außerdem wichtig, die proliferierenden Zelltypen während des gesamten Reparaturprozesses genau zu erkennen und zu klassifizieren.

Multiplexe, optische High-Content-Bildgebungsverfahren wie IBEX¹² wurden entwickelt, um die zelluläre Zusammensetzung zu charakterisieren, Zell-Zell-Interaktionen zu visualisieren und zu quantifizieren und Mikroumgebungsmuster in komplexen Geweben mit räumlicher Auflösung zu analysieren. Während andere Multiplexing-Methoden spezielle Instrumente und proprietäre Reagenzien erfordern, besteht ein besonderer Vorteil von IBEX darin, dass es mit kommerziell erhältlichen Antikörpern, Reagenzien und Mikroskopen, die in einer Standardforschungsumgebung zugänglich sind, zu relativ geringen Kosten etabliert werden kann. Während Anti-Ki-67-Antikörper, die häufig in IBEX-Panels verwendet werden, proliferierende Zelltypen in vielen Geweben zuverlässig markieren^13,14, wurde festgestellt, dass die Anzahl der Ki-67-positiven (Ki-67+) Zellen im Vergleich zu anderen Methoden in fixierten gefrorenen Gewebeschnitten von akuten murinen Hautwunden unterschätzt wurde. Daher haben wir die Click-iT EdU-Chemie mit IBEX kombiniert und festgestellt, dass die Anzahl der EdU⁺-Zellen die Gesamtzahl der proliferierenden Zellen, die mit anderen Methoden gewonnen wurden, genauer darstellt.

Darüber hinaus wurde durch den Einsatz eines vollautomatischen konfokalen Spinning-Disk-Mikroskops ein Hochdurchsatz-Workflow für die iterative Bildgebung von Gewebeschnitten in einer 24-Well-Platte etabliert. Die resultierenden Bilder werden dann verarbeitet, indem mehrere Open-Source-Python-Tools zu einer neuartigen Bildverarbeitungspipeline kombiniert werden, die die Bilder für ungleichmäßige Beleuchtung korrigiert, das Stitching der einzelnen Kacheln und schließlich die Bildregistrierung durchführt. Im Einzelnen wurde die BaSiCPy-Bibliothek¹⁵ für die Beleuchtungskorrektur, die m2stitch-Bibliothek für das Stitching der Bilder und die Phasenkreuzkorrelation für die Zyklusregistrierung verwendet. Die registrierten Bilder werden als OME-TIFFs gespeichert und können dann in herkömmliche Bildanalysesoftware wie Fiji¹⁷ und QuPath¹⁸ geladen werden, wo die Bilder dann weiterverarbeitet werden und Zelltypkategorisierungen und andere Messungen, wie Intensitäts- und Entfernungsberechnungen, durchgeführt werden können. Zusammengenommen ermöglichte uns das vorliegende Protokoll eine detaillierte, hocheffiziente Charakterisierung der wichtigsten Zelltypen der regenerierenden Haut, mit besonderem Fokus auf die zelluläre Mikroumgebung, die die periphere Gliazellpopulation umgibt.

Protocol

Alle Tierzuchten, Haltungen und Versuche wurden nach den Richtlinien des Veterinäramtes des Kantons Zürich, Schweiz, durchgeführt.

1. Hautwunden in voller Dicke (Tag 0)

1. Induzieren Sie 8-10 Wochen alte Mäuse mit 5 % Isofluran in 70 % O₂ und halten Sie sie mit 2,5 % Isofluran aufrecht.
2. Rasieren Sie die Rückenhaut und reinigen Sie sie gründlich.
3. Desinfizieren Sie vor der Operation mit antibakterieller Seife und 70%iger EtOH-Lösung.
4. Wenden Sie eine präoperative Analgesie mit einer subkutanen Injektion von Buprenorphin (30 μg∙mg∙kg⁻¹⁾ an.
5. Erzeugen Sie vier kreisförmige Exzisionswunden in voller Dicke von 5 mm auf der unteren Rückenhaut jedes Tieres, zwei auf jeder Seite, 1 cm von der Mittellinie des Tieres entfernt und etwa 2 cm voneinander entfernt¹⁹.
6. Führen Sie eine postoperative Analgesie mit einer 3-tägigen Behandlung mit Buprenorphin über Trinkwasser (9 μg/ml mit 2% Saccharose) durch.
7. Lassen Sie die Wunden heilen, ohne sich anzulegen.
8. Entnehmen Sie die Wunden zu definierten Zeitpunkten für die histologische Untersuchung und die durchflusszytometrische Analyse.
9. Für das IBEX-Protokoll präparieren und fixieren Sie das Hautgewebe mit 4%iger Paraformaldehyd (PFA)-Lösung bei 4 °C über Nacht. Verwenden Sie eine im Handel erhältliche Biopsiekapsel, um ein Kräuseln der Proben während der Fixierung zu verhindern. Kryoschützen Sie die 4 % PFA-fixierten Gewebe in 30 % Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C. Übertragen Sie das Gewebe für 2 h bei RT in eine 1:1-Mischung aus 30 % Saccharose mit O.C.T. und betten Sie es schließlich in O.C.T. ein, bevor Sie es in Isopentan einfrieren.

2. Probenvorbereitung (Tag 1)

1. Die 24-Well-Platte 15 Minuten lang mit 200 μl Chrom-Alaungelatine auf einem Wippenschüttler bestreichen. Anschließend die Gelatine vollständig entfernen und die beschichteten Vertiefungen 60 min im 40 °C heißen Ofen trocknen. Beschichten Sie doppelt so viele Vertiefungen, die als Backup benötigt werden. Fügen Sie 2 ml PBS pro Vertiefung hinzu.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Beschichtung vollständig trocken ist, bevor Sie das Tuch platzieren. Wells können auch einen Tag vorher beschichtet und über Nacht bei RT getrocknet werden. Lagern Sie die beschichteten Vertiefungen nach dem Überziehen nicht im Kühlschrank oder Gefrierschrank und verwenden Sie die beschichtete 24-Well-Platte innerhalb von 1-2 Tagen, um beste Ergebnisse zu erzielen.
2. Schneiden Sie das in O.C.T. eingebettete Gewebe am Kryostaten auf eine Dicke von 15-30 μm und überführen Sie es schnell in eine beschichtete Vertiefung mit 2 mL PBS.
   HINWEIS: Das Gewebe kann mit einem Metallspatel oder einer Pinzette übertragen werden.
3. Entfernen Sie das PBS vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette und achten Sie darauf, den Gewebeschnitt zentriert in der Vertiefung zu halten. Um dies effektiv zu tun, saugen Sie das PBS langsam von den Rändern der Vertiefung ab und passen Sie die Pipettenposition nach Bedarf an, um eine Verschiebung des Gewebes zu verhindern.
   HINWEIS: Die genaue Platzierung des Gewebes ist für den Erfolg des Protokolls unerlässlich. Sobald das Gewebe an der beschichteten Oberfläche haftet, kann es nicht mehr neu positioniert werden.
4. Trocknen Sie die Gewebeschnitte 1 h im 37 °C heißen Ofen.

3. Gewebeblockierung, EdU-Click-iT-Reaktion und Antikörper-Immunmarkierung, IBEX-Zyklus 1 (Tag 1)

1. Rehydrieren Sie 5 Minuten lang mit 1 ml PBS.
2. Permeabilisieren Sie das Gewebe mit 500 μl 0,5% Triton in PBS für 30 min bei RT.
3. Waschen Sie das Tuch 2x kurz mit PBS.
4. Führen Sie die Click-iT-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers 30 Minuten lang bei RT durch.
   HINWEIS: Bewahren Sie die Proben vor Licht geschützt auf.
5. Waschen Sie das Tuch 2x kurz mit PBS.
6. Blockieren Sie das Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur (RT) mit einem Blockierungspuffer.
   HINWEIS: Hier wurde für dieses Experiment 10% Eselserum in PBS verwendet, dies kann jedoch nach Bedarf angepasst werden. Jeder Blockierungspuffer, der mit Standard-Immunmarkierungsprotokollen kompatibel ist, ist geeignet.
7. Primäre Antikörper (verdünnt in Blocking-Puffer; siehe Materialtabelle) für den 1. Zyklus über Nacht bei 4 °C auftragen.
   HINWEIS: Die Blockierung und Immunmarkierung kann auch für ~1 h mit einer nicht erhitzenden Mikrowelle durchgeführt werden, wie in Radtke et ^al.12 beschrieben. Bei Hautwunden wird jedoch das beste Signal-Rausch-Verhältnis erzielt, wenn Primärantikörper über Nacht inkubiert werden. Immunmarkierte Gewebeschnitte können vor der Bildgebung mehrere Tage in PBS gelagert werden. Eine Bildgebung wird am nächsten Tag empfohlen, um eine optimale Signalqualität zu gewährleisten.

4. Immunmarkierung von Sekundärantikörpern und nukleäre Gegenfärbung (Tag 2)

1. Waschen Sie die Vertiefungen mit 3 x 1 mL PBS.
2. Inkubieren Sie den Gewebeschnitt mit der Anti-Kaninchen-Sekundärantikörperfärbung (1:300) in Blockierungslösung, zusammen mit der nuklearen Gegenfärbung Hoechst 1:1.000, für 1 h bei RT im Dunkeln.
3. 3 x 5 min mit 1 mL PBS bei RT waschen.
4. Lassen Sie ~500 μl PBS in jeder Vertiefung und bringen Sie die Platte zum Mikroskop.
   HINWEIS: Dies kann ein Pausenpunkt sein: Die Proben sind mehrere Tage lang bei 4 °C stabil, aber das Signal-Rausch-Verhältnis ist am besten, wenn es innerhalb von 24 Stunden nach der Immunmarkierung abgebildet wird.

5. Mikroskopaufbau und Bildgebung des ersten IBEX-Zyklus (Tag 2)

1. Melden Sie sich am Mikroskop an, laden Sie die Software und melden Sie sich mit dem Benutzerprofil an.
2. Geben Sie die Akquise-Einrichtung ein (öffnen Sie über Screening | Acquisition Setup) für die Protokollkonfiguration und Bildaufnahme.
3. Verwenden Sie die Auswurftaste , um die Platte in das Mikroskop zu laden.
4. Reinigen Sie den Boden der 24-Well-Platte mit 70 % Ethanol, bevor Sie die Platte in das Mikroskop legen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Platte laden , um die Platte in das Mikroskop zu laden.
5. Wählen Sie unter Objektiv und Kamera den gewünschten Vergrößerungs- und Aufnahmemodus aus. Wählen Sie als Erfassungsmodus den konfokalen 51 μm Spaltmodus .
   HINWEIS: Hier wurde für das Experiment ein 20-faches Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,95 und eine rotierende Scheibe mit 50 μm Lochblenden im Abstand von 250 μm verwendet.
6. Wählen Sie auf der Registerkarte Platte das verwendete Plattenmodell aus.
7. Gehen Sie zur Registerkarte Teller/Zu besuchende Orte. Klicken Sie unter den Site-Optionen auf Feste Anzahl von Sites. Wählen Sie die Anzahl der Spalten und Zeilen so aus, dass ungefähr die gesamte Vertiefung abgedeckt ist. Klicken Sie auf 10 % überlappende Websites.
   HINWEIS: Diese Schaltfläche muss aktiviert werden, um das Zusammenfügen der einzelnen Kacheln sicherzustellen.
8. Wählen Sie nur die erste gefüllte Vertiefung für die Erfassung aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Vertiefung auf der Bohrlochkarte klicken. Ausgewählte Wells sind grün und nicht ausgewählte Wells grau.
9. Verschieben Sie den Tisch an eine Position, an der sich das Gewebe befinden sollte, indem Sie mit der linken Maustaste auf die erste gefüllte Vertiefung in der Plattenkarte und auf eine Stelle in der Nähe der Mitte in der Sitemap klicken. Suchen Sie nach einer dunkleren Farbe des Bohrlochs und der Stelle, die die aktuelle Position anzeigt.
10. Gehen Sie zur Registerkarte Akquisition . Wählen Sie die Optionen Laserbasierte Fokussierung aktivieren und Z-Serie erfassen.
11. Gehen Sie zur Registerkarte Erfassung/Autofokus . Wählen Sie für Well-to-Well-Autofokus die Option Fokus auf Platte und Well-Boden aus, und wählen Sie für Site-Autofokus die Option Alle Sites aus.
12. Gehen Sie zur Registerkarte Wellenlängen und wählen Sie die Anzahl der Farbstoffe aus, die im aktuellen Zyklus abgebildet werden sollen. Suchen Sie nach der entsprechenden Anzahl neuer Registerkarten, die unter der Registerkarte Wellenlängen geöffnet werden.
13. Wechseln Sie zur ersten Registerkarte Wellenlänge. Wählen Sie unter Beleuchtung die Filtereinstellungen aus , die für das gewünschte Fluorophor am besten geeignet sind (z. B. wählen Sie DAPI , wenn Hoechst verwendet wurde).
14. Wählen Sie Laser mit Z-Versatz für die Z-Positionierung und klicken Sie auf die Schaltfläche Versatz berechnen , um die richtige Bildhöhe einzustellen. Eine Reihe von Bildern wird an verschiedenen Z-Positionen aufgenommen. Wählen Sie diejenige aus, bei der die Probe am besten scharf ist.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tischposition auf eine Stelle mit Gewebe eingestellt ist. Wenn an dieser Stelle kein Gewebe sichtbar ist, wählen Sie eine andere Stelle und versuchen Sie es erneut (siehe Schritt 4.9).
15. Drücken Sie die Fokus-Taste und warten Sie, bis ein scharfes Bild des Gewebes angezeigt wird.
16. Wählen Sie für Beleuchtungsstärke die Option 50 % aus. Geben Sie 2000 als maximale Zielintensität ein und drücken Sie Auto Exposure , um die Belichtungszeit automatisch anzupassen.
    HINWEIS: Um die Aufnahme zu beschleunigen, kann die Laserleistung erhöht werden, was die Belichtungszeit verkürzen sollte. Dies kann jedoch zu mehr Photo-Bleaching führen, was zu Bildartefakten führt, bei denen sich die einzelnen Kacheln überlappen.
17. Wählen Sie für "Z-Serie" die Option "Z-Serie" und "2D-Projektionsbild" aus, und wählen Sie für "Schattierungskorrektur " die Option "Nur FL-Schattierung" aus.
18. Wiederholen Sie die Schritte 5.13 bis 5.17 für die anderen Wellenlängen, wählen Sie jedoch anstelle von Laser mit Z-Versatz die Option Z-Versatz von W1 und dann 0 aus.
19. Wechseln Sie zur Registerkarte Z-Serie . Geben Sie die gewünschte Schrittweite ein (für das 20-fach-Objektiv verwenden Sie eine Schrittweite von 0,5 μm).
    HINWEIS: Die Erfassungsgeschwindigkeit kann durch die Verwendung einer Schrittweite erhöht werden, die dem 2- bis 3-fachen des empfohlenen Werts entspricht.
20. Klicken Sie auf die Schaltfläche Fokus und warten Sie, bis ein Pfeil mit der Bezeichnung Aktuelle Position angezeigt wird.
21. Klicken Sie auf Live starten und warten Sie, bis ein neues Fenster mit Live-Bildern erscheint. Ziehen Sie den Pfeil für die aktuelle Position , bis der untere Rand des Gewebes erreicht ist, und klicken Sie auf die Schaltfläche B festlegen . Ziehen Sie den Pfeil für die aktuelle Position , bis der obere Rand des Gewebes erreicht ist, und klicken Sie auf die Schaltfläche T festlegen . Klicken Sie auf F2: Stopp.
    HINWEIS: Die Wellenlänge, die für die Live-Bildgebung verwendet wird, kann unter Aktive Wellenlänge ausgewählt werden.
22. Wählen Sie die zu erwerbenden Websites aus. Stellen Sie zunächst sicher, dass sich die Bühne in der ersten Vertiefung befindet, indem Sie mit der linken Maustaste darauf klicken und erneut auf Live starten klicken. Gehen Sie zu verschiedenen Positionen innerhalb des Brunnens, indem Sie mit der linken Maustaste auf verschiedene Stellen in der Sitemap klicken. Suchen Sie den Rand des Gewebes und markieren Sie alle Stellen, die Gewebe für die Aufnahme enthalten, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken. Ausgewählte Sites werden grün und nicht ausgewählte Sites grau angezeigt.
    HINWEIS: Führen Sie dies vorerst nur für das erste Well aus und stellen Sie sicher, dass nur das erste Well für die Erfassung ausgewählt ist.
23. Wechseln Sie zur Registerkarte Ausführen . Nennen Sie den Plattennamen "Cycle{i}_Well{w}_{description}"; Ersetzen Sie {i}, {w} und {description} durch die entsprechenden Werte/Beschreibung.
24. Klicken Sie auf Protokoll speichern und speichern Sie es, wieder mit "Cycle{i}_Well{w}" im Namen.
25. Richten Sie die Akquisitionsregionen für alle anderen Bohrlöcher ein. Wiederholen Sie dazu die Schritte 5.22-5.24.
    HINWEIS: Für jede zu erfassende Vertiefung muss eine einzelne Protokolldatei gespeichert werden. Stellen Sie sicher, dass das richtige Bohrloch aktiviert ist, bevor Sie den neuen ROI zeichnen. Das Ergebnis sollte ein gespeichertes Protokoll pro zu erfassendem Well sein. Dies ist notwendig, da die Gewebe von gut zu gut unterschiedliche Formen haben. Falls der ROI und der Z-Stack in den Wells identisch sind, können die Wiederholungsschritte 5.22-5.24 und die Schritte 5.26-5.29 ebenfalls übersprungen werden. In diesem Fall wählen Sie einfach alle Wells aus, die abgebildet werden sollen (siehe Schritt 5.22), gehen Sie auf den Reiter Run und drücken Sie Acquire Plate.
26. Klicken Sie auf Steuerung | Zeitschrift | Starten Sie die Aufnahme und dann sofort Steuerung | Zeitschrift | Stoppen Sie die Aufnahme. Speichern Sie das erstellte Journal und öffnen Sie es wieder über Steuerung | Zeitschrift | Tagebuch bearbeiten.
27. Suchen Sie im linken Bereich nach Plate Acquisition - Load Protocol From File und auf Plate Acquisition , um diese Schritte zum Journal hinzuzufügen, und doppelklicken Sie darauf. Suchen Sie im rechten Bereich nach ihnen. Doppelklicken Sie auf die hinzugefügte Plate Acquisition - Load Protocol From File und wählen Sie das Protokoll aus, das für die erste Vertiefung gespeichert wurde (siehe Schritt 5.24).
28. Wiederholen Sie Schritt 5.27 für jeden zu erfassenden Well und laden Sie dabei immer das jeweilige Protokoll.
29. Klicken Sie auf Speichern und schließlich auf Journal ausführen , um die Erfassung zu starten (benötigt ca. 3 Stunden, um 180 Kacheln mit einem Z-Stack von 15 μm zu erfassen).

6. Fluorophor-Bleiche (Tag 2)

1. Bereiten Sie ca. 30 Minuten vor Ende des Journals das Bleichreagenz vor. 10 mg Lithiumborhydrid werden in 10 mL ddH₂O gelöst und durch einen 0,22 μm Filter geleitet. 10 Minuten einwirken lassen und darauf warten, dass sich Blasen bilden. Um ein effizientes Bleichen zu gewährleisten, verwenden Sie das Bleichreagenz innerhalb von 4 h nach der Vorbereitung.
   ACHTUNG: Arbeiten Sie beim Umgang mit Lithiumborhydrid unter einer chemischen Haube, da es mit Luft reagieren und brennbares Wasserstoffgas erzeugen kann.
2. Bleichen Sie die Fluorophore 15 Minuten lang mit 1 ml 1 mg/ml Lithiumborhydrid, während Sie der üblichen Umgebungsbeleuchtung ausgesetzt sind. Achten Sie während des Bleichvorgangs auf kleine Bläschen auf dem Gewebe.
   HINWEIS: Wenn Sie unter einer chemischen Haube arbeiten, stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung während des Bleichvorgangs nicht automatisch ausgeschaltet wird.
3. Wiederholen Sie das Bleichen mit weiteren 1 ml 1 mg/ml Lithiumborhydrid (hergestellt aus der gleichen Lösung) für 15 Minuten.
4. Waschen Sie die Mulde 3 x 5 Minuten lang mit 1 mL PBS.
   HINWEIS: Verkürzen Sie die Waschzeiten nicht, da eine unvollständige Entfernung des Bleichreagenzes die nächste Antikörperplatte beschädigen kann.

7. IBEX-Zyklen (Tag 2)

1. Geben Sie Primärantikörper für den nächsten Immunmarkierungszyklus (Schritt 3.7) und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Wiederholen Sie die Schritte 4.4-5.4.
   HINWEIS: Die Schritte 4.2-4.3 werden nicht wiederholt, da ein ungekoppelter Kaninchen-Antikörper nur im ersten IBEX-Zyklus verwendet wird. Ungekoppelte Antikörper, die in weniger verbreiteten Spezies wie Huhn oder Meerschweinchen gezüchtet wurden, können jedoch auch in späteren Zyklen verwendet werden, da ihr Sekundärantikörper nicht mit den gekoppelten Primärantikörpern kreuzreagiert. Genaue Angaben zu den in den einzelnen Zyklen verwendeten Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle.
2. Laden Sie am Mikroskop die Protokolleinstellungen aus dem vorherigen IBEX-Zyklus für die entsprechende Vertiefung, indem Sie auf Protokoll laden klicken, das auf dem lokalen PC als Cycle{i}_Well{w} gespeichert ist (Schritt 5.24). Die Protokolleinstellungen enthalten den ROI (ausgewählte Kacheln für die Erfassung), die Vergrößerung, die Autofokus-Einstellungen und alle zusätzlichen Aufnahmeeinstellungen, die aus dem vorherigen IBEX-Zyklus (Schritte 5.5-5.25) gespeichert wurden.
3. Wählen Sie die Wellenlängen-Registerkarten aus und passen Sie die Belichtung und Beleuchtungsstärke für das neue Antikörper-Panel an (Schritte 5.12-5.18). Achten Sie darauf, dass Sie einen Marker (normalerweise DAPI oder Hoechst) über alle Zyklen hinweg abbilden, um die Zyklen danach auszurichten.
   HINWEIS: Wie in Radtke et ^al.18 berichtet, sind häufig verwendete fluoreszierende Proteine wie GFP und tdTomato nicht empfindlich gegenüber Lithiumborhydrid-Bleichung. Bei der Arbeit mit Gewebe, das endogene fluoreszierende Proteine wie tdTomato enthält, kann die entsprechende Wellenlänge nach Zyklus 1 bei der Erfassung weggelassen werden, wenn sie für die Bildregistrierung nicht benötigt wird – dies beschleunigt die Bildgebung. Wellenlängen können auf der Registerkarte Gesamtwellenlänge entfernt werden, indem die Anzahl der Erfassungskanäle reduziert wird. Darüber hinaus wurde kein konsistenter Anstieg der Gewebeautofluoreszenz über die Bildgebungszyklen beobachtet; Dies dürfte jedoch je nach Gewebetyp^{variieren 18}.
4. Prüfen Sie, ob die z-Stack-Einstellungen noch sinnvoll sind und passen Sie sie entsprechend an (Schritte 5.19-5.21).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schrittweite des Z-Stapels für alle Zyklen gleich ist.
5. Aktualisieren Sie den Plattennamen auf der Registerkarte Ausführen und speichern Sie das Protokoll erneut.
6. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.5 für alle zu erfassenden Wells.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Belichtungseinstellung für alle Wellenlängen zu notieren, die in der ersten Vertiefung verwendet werden, und die gleiche Einstellung in allen nachfolgenden Vertiefungen zu verwenden.
7. Bearbeiten Sie das Journal, wählen Sie die neuen Protokolldateien aus und speichern Sie das Journal für diesen Zyklus.
8. Führen Sie das Journal aus.
9. Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.4, um die Fluorophore zu bleichen.
10. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.9, bis die gewünschte Menge an Immunmarkierung erreicht ist.

8. Bildverarbeitung (Tag 2)

1. Nachdem Sie die Bildaufnahme der IBEX-Zyklen abgeschlossen haben, exportieren Sie die Bilddaten:
   1. Wählen Sie Screening | Dienstprogramme für Plattendaten | Bilder exportieren.
   2. Klicken Sie auf Platte(n) auswählen und wählen Sie alle erfassten Platten für jeden Zyklus und jedes Feld aus.
   3. Wählen Sie Alle Z-Ebenen, wählen Sie ein Ausgabeverzeichnis aus und drücken Sie OK , um die Daten zu exportieren.
      HINWEIS: Die Daten werden als einzelne TIFF-Dateien für jede Kachel und Ebene exportiert. Um alle Fliesen und Kreisläufe zu vereinen, wurden die folgenden Verarbeitungsschritte durchgeführt.
2. Ordnen Sie die exportierten Daten in Ordnern nach folgendem Schema an: Stellen Sie sicher, dass jeder Zyklus ein Ordner ist, der wiederum einen Ordner für jeden Vertiefung enthält. Benennen Sie wie folgt: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", wobei {i} und {well} der entsprechende Zyklus und well sind und * ein beliebiges Zeichen ist. Beispiel: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   HINWEIS: Für die nachfolgenden Verarbeitungsschritte ist eine korrekte Benennung und Ordnerstruktur erforderlich.
3. Installieren Sie die notwendigen Python-Pakete: Verwenden Sie Miniforge für die Verwaltung der Python-Umgebung. Unter https://github.com/conda-forge/miniforge finden Sie Installationsanweisungen.
   HINWEIS: Der Code für die Verarbeitungsschritte wird in Form von Jupyter Notebooks bereitgestellt. Sie sind unter https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove oder als ergänzende Datei (Ergänzungsakte 1, Ergänzende Akte 2, Ergänzende Akte 3, Ergänzende Akte 4 und Ergänzende Akte 5) zu finden.
4. Wenn Sie den Code von Github herunterladen, laden Sie alle Dateien herunter, indem Sie auf Code | Laden Sie ZIP herunter und folgen Sie den Installationsanweisungen in der README.md Datei.
5. Starten Sie Jupyter-Lab (Ergänzungsdatei 2):
   1. Aktivieren Sie die installierte Conda-Umgebung, indem Sie conda activate zmb-ibex-jove in einem Terminal eingeben.
   2. Wechseln Sie im Terminal in das heruntergeladene Verzeichnis, indem Sie z.B. cd C:\path\to\zmb-ibex-jove eingeben.
   3. Starten Sie Jupyter-Lab, indem Sie jupyter-lab in das Terminal eingeben. Es öffnet sich ein Browserfenster mit jupyter-lab.
6. Beleuchtungskorrektur berechnen:
   1. Navigieren Sie auf der linken Registerkarte zum Notebook " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" und öffnen Sie es mit einem Doppelklick. Dieses Notebook berechnet die Beleuchtungskorrekturbilder mit Hilfe der BaSiCPy-Bibliothek (Supplemental File 3).
   2. Ändern Sie die "base_dir" und "save_dir" in die richtigen Pfade, wo sich die Daten befinden und wo die Beleuchtungskorrekturbilder gespeichert werden sollen.
   3. Um den Code im Notebook auszuführen, markieren Sie jede Zelle, und drücken Sie UMSCHALT+EINGABETASTE , um ihn auszuführen. Führen Sie das Notebook von oben nach unten aus.
7. Führen Sie das Stitching für jeden einzelnen Zyklus durch (Zusatzdatei 4):
   1. Navigieren Sie auf der linken Registerkarte zum nächsten Notebook, und öffnen Sie es: "02_stitching_MD.ipynb". In diesem Notizbuch werden für jeden Zyklus die einzelnen Kacheln geladen, die Beleuchtung korrigiert und zusammengefügt, was zu einer Bilddatei pro Vertiefung und Zyklus führt. Verwenden Sie die m2stitch-Bibliothek (https://github.com/yfukai/m2stitch) zum Stitchen.
   2. Ändern Sie die Eingaben in der ersten Zelle in die richtigen Dateipfade. Führen Sie das Notebook erneut von oben nach unten aus.
8. Führen Sie die Bildregistrierung zwischen den Zyklen durch (Zusatzdatei 5):
   1. Navigieren Sie auf der linken Registerkarte zum nächsten Notebook, und öffnen Sie es: "03_registration_pcc.ipynb". In diesem Notebook werden die einzelnen Zyklen nur mit Hilfe von translationalen Transformationen zueinander ausgerichtet, die mit dem Phasenkreuzkorrelationsalgorithmus aus der frei zugänglichen scikit-image library (https://scikit-image.org/) berechnet werden.
   2. Ändern Sie die Eingaben in der ersten Zelle in die richtigen Dateipfade. Wählen Sie einen Referenzzyklus und einen Referenzkanal (in der Regel DAPI). Führen Sie das Notebook erneut von oben nach unten aus.
      HINWEIS: Es muss nur eines der Kapitel "Option 1: Alle Kanäle zusammen laden und speichern" und "Option 2: Kanäle als einzelne Dateien laden und speichern" ausgeführt werden. Im ersten Kapitel wird eine große Datei erstellt, die alle Kanäle aller Zyklen enthält. Im zweiten Kapitel wird für jeden Kanal eine eigene Datei erstellt. Die zweite Option benötigt weniger Arbeitsspeicher für die Verarbeitung.

9. Bildanalyse (Tag 2)

1. Herunterladen und öffnen Sie Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   HINWEIS: Bei den resultierenden Bildern handelt es sich um Mehrebenen- und Mehrkanalbilder, die als 3D-Bilder analysiert werden können. Hier wird ein Beispiel für einen Analyse-Workflow nur für 2D-Daten gezeigt, für die zunächst eine maximale Intensitätsprojektion berechnet wird.
2. Öffnen Sie die Datei in Fidschi, indem Sie die Datei in das Fidschi-Fenster ziehen.
3. Berechnen Sie die maximale Intensitätsprojektion, indem Sie Bild | Stapel | Z-Projekt..., wählen Sie "Maximale Intensität" und drücken Sie "OK". Speichern Sie das Bild erneut über Datei | Speichern unter | OME-TIFF".
4. Um die Zellen zu analysieren, verwenden Sie die Open-Source-Software QuPath; Laden Sie es von https://qupath.github.io/ herunter und installieren Sie es.
5. Öffnen Sie QuPath und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie einen leeren Ordner auf das Fenster ziehen.
6. Importieren Sie alle Dateien in das Projekt, indem Sie sie auf das QuPath-Fenster ziehen und mit den Standardeinstellungen auf Importieren klicken.
7. Doppelklicken Sie auf ein Bild im linken Bereich, um es zu öffnen. Geben Sie es als Fluoreszenz an, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
8. Öffnen Sie das Fenster Helligkeit/Kontrast , indem Sie Umschalt+C drücken.
   HINWEIS: Hier kann man auswählen, welche Kanäle angezeigt werden, und die Helligkeit und den Kontrast anpassen. Man kann auch die Kanalnamen und Farben ändern, indem man auf die Namen doppelklickt.
9. Wählen Sie die Option Extras | Polygon-Werkzeug und kommentieren Sie den Gewebebereich. Suchen Sie auf der Registerkarte Anmerkungen nach einer neuen Anmerkung. Legen Sie sie auf eine bestimmte Klasse fest, indem Sie die Anmerkung auswählen, eine Klasse (z. B. Andere) auswählen und auf Klasse festlegen klicken.
10. Zellen erkennen: Gehen Sie zu Analysieren | Zell-Detektion | Zell-Detektion.
    1. Wählen Sie einen nuklearen Kanal.
    2. Lassen Sie die meisten Einstellungen unverändert, aber passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie mit der Maus über einen Kern fahren und die in der unteren rechten Ecke angezeigte Intensität notieren. Bewegen Sie den Mauszeiger über einen Hintergrundbereich und notieren Sie sich die Intensität erneut. Wählen Sie als Schwellenwert einen Wert auf halbem Weg zwischen Hintergrund und Vordergrund aus.
    3. Klicken Sie auf Ausführen.
11. Überprüfen Sie Zellen und Messungen:
12. Indem Sie auf eine Zelle doppelklicken oder sie auf der Registerkarte Hierarchie auswählen, überprüfen Sie ihre Maße im unteren linken Bereich. Es sollten unterschiedliche Form- und Intensitätsmessungen für Zelle, Zellkern und Zytoplasma hinzugefügt werden.
13. Zellen klassifizieren:
    1. Um die erkannten Zellen nach der Intensität in einem Kanal zu klassifizieren, gehen Sie zu Klassifizieren | Klassifizierung von Objekten | Erstellen eines Klassifikators für einzelne Messwerte.
    2. Wählen Sie unter Kanalfilter den gewünschten Kanal und unter Messung eine entsprechende Messung aus (z. B. Zelle: Kanalmittelwert).
    3. Passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie den Mauszeiger erneut über eine positive und eine negative Zelle bewegen und einen Wert zwischen den beiden auswählen.
    4. Wählen Sie z. B. "Positiv" für "Über dem Schwellenwert " und "Negativ " für "Unter dem Schwellenwert" aus. Überprüfen Sie das Ergebnis, indem Sie die Livevorschau aktivieren.
    5. Klicken Sie auf Anwenden , um die Zellen zu klassifizieren.
14. Messen Sie die Entfernung zu annotierten Objekten (z. B. Nervenbündeln):
    1. Wählen Sie die Option Extras | Pinsel-Werkzeug .
    2. Zeichnen Sie über interessante Bereiche (z. B. Nervenbündel).
    3. Wechseln Sie zur Registerkarte Anmerkungen . Wählen Sie alle neuen Anmerkungen aus, wählen Sie eine entsprechende Klasse aus, und drücken Sie Klasse festlegen.
       HINWEIS: Sie können eine neue Klasse erstellen, indem Sie mit der rechten Maustaste in das Klassenfenster klicken und Hinzufügen/Entfernen | Klasse hinzufügen.
    4. Wechseln Sie zu Räumliche Analyse analysieren | Vorzeichenbehafteter Abstand zu Anmerkungen 2D , und drücken Sie Ja , wenn Sie dazu aufgefordert werden.
    5. Fügen Sie jeder Zelle eine neue Messung hinzu, die den Abstand zur nächstgelegenen Anmerkung einer bestimmten Klasse angibt.
15. Maße exportieren:
    1. Gehen Sie zu Messen | Zeigen Sie Erkennungsmessungen an und warten Sie, bis eine Liste aller Messungen aller Erkennungen angezeigt wird.
    2. Exportieren Sie die Tabelle als .txt über die Schaltfläche Speichern .
    3. Importieren Sie die Daten in eine Datenverarbeitungssoftware Ihrer Wahl, um sie weiter zu analysieren.

Results

Diese Methode ermöglicht den adäquaten Nachweis proliferierender Zelltypen durch die Kombination von EdU Click-iT-Chemie mit IBEX in fixierten gefrorenen Maushautschnitten. Der Nachweis proliferierender Zelltypen wurde mit verschiedenen Methoden verglichen, insbesondere mit der Markierung proliferierender Zelltypen mit Ki-67-Antikörpern und dem Nachweis der Zellproliferation mit dem EdU Click-iT-Chemieansatz (Abbildung 1). Wir beobachteten, dass die Ki-67-Ant...

Discussion

Die Zellproliferation ist eine der vier Hauptphasen der Hautreparatur, und der Übergang zwischen der Entzündungsphase und der proliferativen Phase ist entscheidend für einen erfolgreichen Reparaturprozess²⁰. Eine gut regulierte Immunantwort ist unerlässlich, da anhaltende Entzündungen zu chronischen Wunden führen können, ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem ^1,21. Die Proliferation ist ein wichtiger ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antikörper und Reagenzien	QUELLE	BEZEICHNER	Kommentare
Antikörper
CD31 Alexa Fluor 647 (Zyklus 2)	BioLegend	Katze#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Zyklus 2)	BioLegend	Katze#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Zyklus 1)	BioLegend	Katze#151212	1:50
AB_2814055
Ki-67 Huhn (ck)	LSBio	Katze#LS-C772946	1:800
Ki-67 Rat (rt)	BioLegend	Katze#652402	1:100
AB_11204254
Neurofilament H& M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Zyklus 3)	BioLegend	Kat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (Staffel 1)	Zell-Signaltechnik	Kat#8238                                            AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Zyklus 3)	BioLegend	Katze#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 Esel-Anti-Kaninchen	Jackson ImmunoResearch	Kat#711-605-152
Reagenzien
Cellvis 24 Brunnen Glasbodenplatte	Cellvis	P24-1,5H-N
Chromalun-Gelatine	Neuankömmling-Versorgung	Katze#1033A
Click-iT EdU kit	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, Lithiumborhydrid, 95 %	Thermo Fisher Scientific	Katze#10438443
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura	Biosystems Schweiz	Kat#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Kat#10010-015
Superfrost Plus Adhäsionsmikroskop-Objektträger	Epredia	Katze#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Kat#T8787
Ausrüstung
Haarbürste	Faust AG	Katze#9172051 und 9172050
Mikrotom-Klingen	Biosystems Schweiz	Katze#207500011
Mikroskop	Molekulare Geräte, ImageXpress Konfokal HT.ai
Oven	Thermo Fisher Scientific	Katze#HBMCR4220
Rocker Shaker	Edmund Bü hler GmbH	Katze#32310015