Entnahme von natürlich freigesetzten Exosomen aus Tumorgewebe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige Methode zur Extraktion von Exosomen aus Tumorgeweben, indem sie auf natürliche Weise freigesetzt und wiederholt entnommen werden, um eine experimentelle Grundlage für die Untersuchung der Funktion von Exosomen bei der Tumorentwicklung zu schaffen.

Zusammenfassung

Als Vesikel, die von Zellen sezerniert werden, umschließen und übertragen Exosomen verschiedene Nukleinsäuren, Proteine und Lipide und nehmen an der Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen teil. Exosomen in der Tumormikroumgebung spielen eine wichtige Rolle für die biologischen Eigenschaften von Tumorzellen und können die Zustände anderer Zellen stark beeinflussen. Um die spezifischen Funktionen von Exosomen bei der Entwicklung von Tumoren weiter zu untersuchen, ist es daher zweifellos notwendig, Exosomen aus Tumorgeweben zu extrahieren und zu isolieren. Die direkte Extraktion von Exosomen aus Tumorgewebe reduziert den Bedarf an In-vitro-Zellkulturen , und Exosomen aus Tumorgewebe können denen im natürlichen Zustand ähnlicher sein. Daher ist die Aufrechterhaltung des natürlichen Zustands von Exosomen im Tumorgewebe der Schlüssel zum Extraktionsprozess. Der enzymatische Verdau wird oft mit einer Ultrazentrifugation kombiniert, um Exosomen aus Tumorgeweben zu extrahieren. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Verfügung, um Exosomen aus Tumorgewebe zu extrahieren. Wir verwendeten ein serumfreies Medium, um kleine Tumorgewebestücke auf einem Rütteltisch zu inkubieren, sammelten und extrahierten wiederholt Exosomen, die auf natürliche Weise aus dem Tumorgewebe freigesetzt wurden, und identifizierten die extrahierte Exosomenstruktur, -konzentration und -eigenschaften, was eine neue Methode für Forscher darstellte, die die Funktion von Exosomen bei der Tumorentwicklung untersuchen.

Einleitung

Exosomen sind ein Subtyp der extrazellulären Vesikel, die von Zellen sezerniert werden und typischerweise eine Größe von 30 nm bis 200 nm haben ^1,2. Sie beteiligen sich an der interzellulären Kommunikation und liefern verschiedene Signalmoleküle, darunter Nukleinsäuren (z. B. Desoxyribonukleinsäure (DNA), Boten-RNA (mRNA), Mikro-Ribonukleinsäure (miRNA), lange nicht-kodierende RNA (lncRNA), zirkuläre RNA (circRNA)), Proteine und Lipide 1,3,4,5, an Empfängerzellen, um deren physiologische Funktionen zu beeinflussen ^6,7. Ursprünglich in Retikulozyten von Schafen 8^{identifiziert, wurden} Exosomen seitdem in verschiedenen Körperflüssigkeiten identifiziert, darunter Blut, Speichel, Urin, Liquor, Aszites, Fruchtwasser und Muttermilch ^{9,10,11,12,13,14,15,16}. Darüber hinaus können Exosomen von vielen Zelltypen sezerniert werden, darunter Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen, Fettzellen und Tumorzellen¹⁷. Mit ihrer weiten Verbreitung spielen Exosomen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen pathologischen Prozessen, insbesondere Krebs, und bei verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der Embryonalentwicklung, der Gewebereparatur und -regeneration sowie der Immunregulation 18,19,20.

In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Exosomen das Auftreten von Tumoren, die Invasion, die Metastasierung, die Chemotherapieresistenz und die Immunität gegen oder pro Tumor fördern 20,21,22. Krebsexosomen können die Genexpression in Rezeptoren oder benachbarten Krebszellen aktivieren, um ihre biologischen Phänotypen zu verändern, und Krebszellen können mit Stromazellen in der Tumormikroumgebung interagieren, um die Proliferation, Invasion und Angiogenese von Krebszellen zu fördern 23,24,25. Exosomen, die von Tumorzellen freigesetzt werden, können ihnen helfen, toxische Medikamente auszuscheiden, und aus Stromazellen gewonnene Exosomen können die Bildung von Krebszellen fördern²⁰. Von Krebs abgeleitete Exosomen sind an verschiedenen Stadien der Metastasierung von Krebszellen beteiligt, einschließlich der Invasion benachbarter Gewebe, des Transfers durch das Kreislaufsystem und der Ausbreitung in entfernte Organe²⁰. Schließlich erfüllen Exosomen bei Krebs sowohl Immunaktivierungs- als auch Immunsuppressionsfunktionen, abhängig von den Liganden, Proteinen und miRNAs, die sie tragen²⁰. Aufgrund der wichtigen Funktionen von Exosomen aus Tumorgewebe zeigen sie einen potenziellen Anwendungswert bei der Früherkennung, der genauen Behandlung und der prognostischen Überwachung von Tumoren^21,22.

Angesichts der Bedeutung von Exosomen aus Tumorgewebe haben viele Forscher versucht, sie zu extrahieren, um ihre Eigenschaften und Funktionen weiter zu untersuchen. Die direkte Extraktion von Exosomen aus Tumorgewebe reduziert nicht nur den Bedarf an In-vitro-Zellkulturen, sondern ähnelt auch dem natürlichen Zustand von Exosomen. Daher ist die Aufrechterhaltung des natürlichen Zustands von Exosomen im Tumorgewebe der Schlüssel zum Extraktionsprozess. Die physikalischen Eigenschaften von Exosomen sind die Grundlage gängiger Extraktionsmethoden, und selten werden die Veränderungen der Exosomenkomponenten berücksichtigt, die durch Stimulation während des Extraktionsprozesses verursacht werden. Tatsächlich wird die Qualität von Exosomen stark von verschiedenen Exosomen-Extraktionsverfahren beeinflusst^26,27. Derzeit wird Tumorgewebe durch Enzyme verdaut und vor der Trennung Methoden wie Dichtegradientenzentrifugation, Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, Größenausschlusschromatographie (SEC), Polymerfällung, Immunaffinitätschromatographie und mikrofluidische Methoden unterzogen 2,21,28,29 . Hier stellen wir eine Methode zur Extraktion von Exosomen aus Tumorgewebe vor. Wir verwendeten ein serumfreies Medium, um kleine Tumorgewebeblöcke in einem Shaker zu kultivieren, sammelten und extrahierten dann Exosomen, die auf natürliche Weise vom Tumorgewebe freigesetzt werden, und identifizierten die Konzentration und Eigenschaften der extrahierten Exosomen, wodurch wir Basismaterialien und experimentelle Beweise für die Untersuchung der Funktion von Exosomen bei der Tumorentwicklung lieferten.

Protokoll

Alle Experimente mit Tumorgewebe-Exosomen wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Diese Studie wurde nach den Richtlinien der Ethikkommission des West China Hospital der Sichuan University (20220301101) genehmigt und durchgeführt. Vier Wochen nach der Inokulation mit SGC-7901-Zellen wurde eine Nacktmaus (BALB/c, männlich, 8 Wochen alt, 26 g) mittels Zervixluxation euthanasiert.

1. Entnahme von Tumorgewebe

1. 5 Min. in 75% Alkohol einweichen.
2. Begeben Sie sich auf einen sterilen Operationstisch und verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um die Außenhaut des Eileitertumors zu öffnen.
3. Ziehen Sie das ektopische Tumorgewebe ab, schneiden und wiegen Sie es, um zwei Stücke mit gleichem Gewicht zu erhalten.
   HINWEIS: Ein Stück Tumorgewebe wird für die Exosomenextraktion im Rahmen dieses Protokolls verwendet, und ein anderes Stück Tumorgewebe gleichen Gewichts wird für die Exosomenextraktion durch Enzymverdau³⁰ verwendet.

2. Präkonditionierung von Tumorgewebe

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte auf Eis und in einer sterilen Umgebung durch.

1. Pipettieren Sie 10 ml vorgekühlte Phosphatpuffersalzlösung (PBS) (0,01 m), um das Tumorgewebe zu waschen und Oberflächenblut und Fett zu entfernen.
2. Schneiden Sie das Tumorgewebe (~400 mm³) mit einer Augenschere in 1-2 mm große Stücke in 20 mL PBS mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer 10 cm sterilen Petrischale. Übertragen Sie die obige Mischung in ein konisches 50-ml-Röhrchen.

3. Freisetzung von Exosomen

1. Das Röhrchen aus Schritt 1.2 bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
2. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 20 ml Minimum Essential Medium α Medium (α-MEM). Bei 37 °C bei 100 U/min 1 h in einem Schüttler mit konstanter Temperatur inkubieren.
3. Bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 10 mL α-MEM-Medium. Bei 37 °C bei 100 U/min für 6 h in einem Schüttler mit konstanter Temperatur inkubieren.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei allen Schritten. Eine kurze Inkubation und eine Wäsche mit α-MEM-Medium reichen aus, um intrazelluläre Bestandteile zu entfernen, die durch das Schneiden austreten, einschließlich intrazellulärer Vesikel und Organellen.
5. Bei 200 × g 5 min, 4 °C zentrifugieren und den Überstand in einem neuen Röhrchen auffangen.
6. Resuspendieren Sie das Tumorgewebe mit 10 mL α-MEM-Medium.
7. Wiederholen Sie die Inkubation ab Schritt 2.4 und anschließend Schritt 2.5.
8. Die in den Schritten 2.5 und 2.7 gesammelten Mittelüberstände mischen.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei allen Schritten. Zwei 6-stündige Inkubationen induzierten die natürliche Freisetzung von Exosomen aus den Tumorgewebestücken.

4. Ultrazentrifugation

1. Filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,45 μm mikroporösen Filter.
2. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 12.000 × g für 30 min bei 4 °C, um die großen Vesikel zu entfernen.
3. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen umgefüllt und 90 Minuten lang bei 4 °C bei 120.000 × g zentrifugiert, um Exosomen zu sammeln.
4. Den Exosomenniederschlag mit PBS (0,01 M) waschen und erneut bei 140.000 × g für 60 min bei 4 °C zentrifugieren.
5. Die gefällten Exosomen sind in PBS (0,01 M) zur sofortigen Verwendung oder Lagerung bei -80 °C zu suspendieren.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei allen Schritten. Führen Sie jeden Schritt mit der kleinstmöglichen Zentrifugalkraft und der kürzesten Zentrifugalzeit durch.

5. Darstellung der Ergebnisse der Exosomenidentifizierung

1. Identifizieren Sie die Morphologie von Exosomen aus Tumorgewebe mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)^30.
2. Bestimmen Sie die Größe und Konzentration von Exosomen aus Tumorgewebe mittels Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)³⁰.
3. Identifizieren Sie die exosomalen Proteinmarker CD9 und CD63 mittels Western Blot (WB)³⁰.
   HINWEIS: Neuere Richtlinien für die Exosomenforschung, einschließlich der Verwendung von CD63 und CD9 als Kriterien für Exosomenmarker³¹.

Ergebnisse

Die TEM zeigte, dass die Exosomen, die mit dieser Methode aus Tumorgewebe gewonnen wurden, typische becherartige Strukturen aufwiesen (Abbildung 1A), und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Form der Exosomen, die mit dieser Methode extrahiert wurden, und der Form der Exosomen, die mit dieser Methode extrahiert wurden (Abbildung 1B). Die NTA-Ergebnisse zeigten, dass der durchschnittliche Exosomendurchmesser 172,8 nm betrug, was im Bereich von 30-...

Diskussion

Bei dieser Methode wurden Exosomen aus Tumorgewebe aus dem ektopischen Magenkrebsgewebe von Nacktmäusen extrahiert, und die Schlüsselschritte waren die Freisetzung, Exsudation, Trennung und Reinigung der Exosomen. Verschiedene Exosomentrennungsmethoden wurden entsprechend den physikalischen Eigenschaften und der Zusammensetzung der Exosomen^entworfen und verifiziert 2,21,28,29, jede mit Vor- und Nachteilen, aber der Zweck besteht darin, die Auswirkungen verschieden...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
α-MEM	HyClone	SH30265.01B
Anti-CD63 Antikörper	Bioss	bsm-43117M
Anti-CD9 Antikörper	Bioss	bs-2489R
Zentrifugenröhrchen	Thermo	339650
Konstanttemperaturschüttler	Thermo	MAXQ4450
Sterile Einwegpipette-10 mL	JET
EDTA	Biosharp	BS107
Elektrische Pipette	Thermo	9501
Horizontale Zentrifuge mit kontrollierter Temperatur	Thermo	Sorvall ST1R plus
Nanopartikel-Tracking-Analysator	Malvin	NanoSight Pro
Ophthalmische Schere	Jinzhong	Y3D010
PBS	HyClone	SH30256.01B
Phosphotungstinsäure	Sigma	455970-10G
Chirurgische Schere	Jinzhong	J21010
Sekundärantikörper	Bioss	Bs-0295G	Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L/FITC
Transmissionselektronenmikroskop	Nikon	Plan Apo WF
Ultrazentrifugalröhre	Beckman	355618

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