Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Aiman Ayesha; Borja Ocon; Yuhan Bi; Eugene C. Butcher

doi:10.3791/67754

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Methodenartikel

Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

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DOI:

10.3791/67754

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28. März 2025

Aiman Ayesha¹^,²^,³ , Borja Ocon¹^,²^,³ , Yuhan Bi¹^,²^,³ , Eugene C. Butcher¹^,²^,³

¹Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, ²Palo Alto Veterans Institute for Research, ³Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen verbesserte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und kompetitives Homing vor, um die Rezeptor-vermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Diese Methode bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Transports von Immunzellen und hat potenzielle Anwendungen in der zukünftigen Grundlagen- und Therapieforschung.

Zusammenfassung

Das Verständnis, wie die Expression des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) die Zellpositionierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen beeinflusst, ist für die Aufklärung der Mechanismen des Immunzelltransports unerlässlich. Wir präsentieren einen kompetitiven Homing-Assay, der entwickelt wurde, um die GPCR-vermittelte T-Zell-Lokalisierung in Organen zu untersuchen, die ihre verwandten Chemoattraktant-Liganden exprimieren, und der sowohl für Kurzzeit- als auch für Langzeitstudien geeignet ist. Der Ansatz beinhaltet ein verbessertes Protokoll für die Transduktion von T-Zellen durch rekombinante murine Stammzellviren (MSCV), um das interessierende GPCR oder ein Kontrollkonstrukt zu exprimieren, gefolgt von kompetitivem Homing in Empfängermäusen. Die Zellverteilung in verschiedenen Organen wird mittels Durchflusszytometrie und/oder konfokaler Mikroskopie analysiert. In Kurzzeitexperimenten (10-12 h) zeigte die konfokale Mikroskopie deutliche Zelllokalisationsmuster, u.a. in den Lungenbläschen, den Bronchien submukosa, den venösen Stellen und dem Interstitium in der Lunge sowie im Epithel, das die Luftröhre, den Magen und das Uterushorn auskleidet. In Langzeitstudien (1-7 Wochen) lieferte die Durchflusszytometrie Einblicke in die bevorzugte Zellakkumulation und zeigte so dynamische Veränderungen und eine mögliche Reifung oder Neupositionierung innerhalb des Gewebes im Laufe der Zeit. Dieser kompetitive Homing-Assay ist ein robustes Werkzeug zur Untersuchung der GPCR-vermittelten Zellpositionierung und bietet wertvolle Einblicke in die gewebespezifische Verteilung und potenzielle Anwendungen in der Immunologie und therapeutischen Forschung.

Einleitung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind von grundlegender Bedeutung für die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich Signaltransduktion, Neurotransmission, Hormonregulation und Immunzellmigration¹. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der räumlich-zeitlichen Kontrolle der Migration und Lokalisation von Lymphozyten². Während der Priming-Phase der Immunantwort veranlassen die lokale Mikroumgebung und zelluläre Wechselwirkungen die T-Lymphozyten, eine einzigartige Gruppe von Adhäsionsmolekülen und Chemokinrezeptoren zu exprimieren, die als Homing-Rezeptor....