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Methodenartikel

Ein modifiziertes QuEChERS-HPLC-Verfahren zum Nachweis von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Zebrafischembryonen, die Feinstaub ausgesetzt waren

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DOI:

10.3791/67757

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13. Juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben eine modifizierte QuEChERS-HPLC-Methode entwickelt, um die internen Spiegel von 16 PAK in Zebrafischembryonen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Exposition der Mutter gegenüber Feinstaub (PM2,5) mit einem aerodynamischen Durchmesser von 2,5 μm oder weniger wurde mit Spontanaborten und verschiedenen angeborenen Krankheiten beim Menschen in Verbindung gebracht. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch unklar. Zebrafischembryonen werden häufig verwendet, um die Entwicklungstoxizität von PM2,5 zu untersuchen, aber die Messung der internen Konzentrationen von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK), den primären toxischen Bestandteilen von PM2,5, stellt eine Herausforderung dar. In dieser Studie haben wir eine schnelle, einfache, billige, effektive, robuste und sichere Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (QuEChERS-HPLC)-Methode entwickelt, um die internen Werte der 16 PAK zu bewerten, die in der Prioritäten-Schadstoffliste der US-Umweltschutzbehörde (EPA) aufgeführt sind. Zebrafischembryonen wurden 2-72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit extrahierbarer organischer Substanz (EOM) aus PM2,5 behandelt. Für die Probenvorbereitung wurde die QuEChERS-Methode eingesetzt, für die qualitative und quantitative Analyse von PAK die HPLC-FLD/DAD (HPLC mit Fluoreszenzdetektor und Diodenarray-Detektor). Wir konnten erfolgreich sechs PAK (Phenanthren, Anthracen, Fluoren, Acenaphthen, Fluoranthen und Pyren) in Zebrafischembryonen nachweisen, die PM2,5 ausgesetzt waren. Diese Methode ist entscheidend für die Untersuchung der Mechanismen der PM2,5-induzierten Entwicklungstoxizität.

Einleitung

Feinstaub (PM2,5) mit einem aerodynamischen Durchmesser kleiner/gleich 2,5 μm. ist ein führender umweltbedingter Risikofaktor. Aufgrund seiner geringen Größe ist PM2,5 in der Lage, in das Kreislaufsystem einzudringen und die mütterlich-fetale Barriere zu durchdringen. Epidemiologische Studien haben die Exposition von Müttern gegenüber PM2,5 mit Spontanaborten und verschiedenen angeborenen Krankheiten in Verbindunggebracht 1,2,3,4. Die zugrundeliegenden Mechanismen der embryonalen Toxizität von PM2,5 sind jedoch nicht gut verstanden. PAK, der primäre toxische Bestandteil von PM2,5, sind aufgrund ihrer mutagenen und krebserregenden Eigenschaften für den Menschen hochgiftig 5,6. Von den Hunderten von PAK wurden 16 von der US-Umweltschutzbehörde EPA als Schadstoffe mit hoher Priorität eingestuft.

Der Zebrafisch, Danio rerio, ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen, seiner schnellen Entwicklung, seiner hohen Fortpflanzungsrate und seiner einfachen Pflege ein leistungsfähiger Wirbeltier-Modellorganismus. Die Transparenz von Zebrafischembryonen ermöglicht die direkte Beobachtung des gesamten Körpers unter dem Mikroskop und ermöglicht so detaillierte Studien. Gelöste PAK können durch Diffusion in Zebrafischembryonen gelangen7. In vielen Studien wurden Zebrafischembryonen verwendet, um die toxischen Wirkungen und Mechanismen von extrahierbarer organischer Substanz (EOM) aus PM2,5 8,9,10,11 zu untersuchen. Die meisten dieser Studien haben jedoch nur die 16 prioritären PAK in der EOM charakterisiert, ohne die internen PAK-Spiegel in Zebrafischembryonen zu ermitteln12. Diese Herausforderung kann auf die geringe Größe der Zebrafischembryonen und die Komplexität der embryonalen Matrix zurückzuführen sein.

Die QuEChERS-Methode (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) ist eine innovative Probenvorbereitungstechnik, die für die Analyse von Pestizidrückständen, Tierarzneimitteln und anderen Kontaminanten in Lebensmittel- und Umweltproben verwendetwird 13,14. In Verbindung mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde diese Methode zum Nachweis von Pestiziden im Zebrafischeingesetzt 15. PAK, die zwei oder mehr Benzolringe enthalten, haben starke Fluoreszenzeigenschaften und eignen sich daher besonders gut für die Detektion mit Fluoreszenzdetektoren. In dieser Studie haben wir eine modifizierte QuEChERS-HPLC-Methode entwickelt, um die Konzentrationen von 16 PAK in Zebrafischembryonen zu bestimmen, die EOM ausgesetzt waren.

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Protokoll

1. Probenbehandlung

  1. PM2.5 Kollektion
    1. Sammeln Sie PM2,5 auf 47 mm Quarzmembranfiltern.
      HINWEIS: PM2,5 wurde in der Stadt Suzhou, China, gesammelt.
  2. EOM-Extraktion
    1. Den Filter in Stücke schneiden und mit 150 ml Acetonitril in einen konischen Glaskolben geben.
    2. Der Kolben wird 1 h lang bei 35 °C mit Ultraschall beschallt und der Extrakt in vier 50-ml-Röhrchen überführt.
    3. Zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei 7.000 × g , geben Sie dann den Überstand in einen Rotationsverdampfer und konzentrieren Sie ihn auf ca. 5 mL.
    4. Unter Stickstofffluss in einem 35 °C warmen Wasserbad bis zur Trockenheit verdampfen und den Rückstand in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen.
  3. Behandlung von Zebrafischembryonen
    1. Halten Sie den Zebrafisch in einem Umlaufwassersystem bei einem 14-stündigen Licht- und 10-stündigen Dunkelzyklus bei 28 °C16.
    2. Entnehmen Sie befruchtete Eizellen (200 Embryonen pro Gruppe) und geben Sie sie in Petrischalen aus Glas (Kalknatronglas, 80 x 15 mm) mit 30 ml Wasser aus dem Umlaufwassersystem.
    3. Geben Sie 30 μl EOM (10 mg/ml) 2 h nach der Befruchtung (hpf) in eine Glas-Petrischale mit 200 Embryonen. Nicht behandelte Gruppen dienen als leere Steuerelemente.
      HINWEIS: Die endgültige Konzentration von EOM beträgt 10 mg/L, basierend auf der Rate der Herzfehlbildungen (Ergänzende Abbildung S1).
    4. Stellen Sie die Gerichte in einen 28 °C heißen Inkubator.

2. Vorbereitung der QuEChERS-Probe

  1. Nehmen Sie die Schalen mit Embryonen bei 72 hpf aus dem Inkubator. Waschen Sie die Embryonen 3x mit reinem Wasser.
  2. Übertragen Sie die Embryonen in 1,5-ml-Röhrchen (nach verschiedenen Gruppen) und entfernen Sie überschüssiges Wasser.
  3. Legen Sie die Röhrchen für 30 min in einen -80 °C Gefrierschrank, um die embyros17 zu lyophilisieren und zu lyophilisieren. Zermahlen Sie dann die Embryonen mit einem Glasstab.
  4. Geben Sie 25 μl 16 PAH gemischte Standardlösung (2,0 μg/ml) in die DMSO-Kontrollgruppe, um die Spike-Wiederfindung zu testen.
  5. 1 mL n-Hexan zugeben und 30 s lang vortexen, dann 30 Minuten lang bei 35 °C mit Ultraschall beschallen.
  6. Bei 7.000 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand in ein frisches Röhrchen überführen.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6.
  8. Die gesammelten Überstände werden unter Stickstofffluss in einem 35 °C warmen Wasserbad bis zur Trockenheit verdampft.
  9. 1 ml Acetonitril zugeben und 30 s lang vortexen.
  10. Fügen Sie 10 mg primäres sekundäres Amin (PSA), 45 mg Magnesiumsulfat und 15 mg C18-Packung hinzu und wirbeln Sie dann 30 s lang.
  11. Bei 7.000 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen.
  12. Schritt 2.9 wiederholen und bei 7.000 × g 5 min zentrifugieren. Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen.
  13. Verdampfen Sie den Überstand auf 0,5 mL unter Stickstoff.
  14. Filtern Sie durch eine 0,22 μm mikroporöse Membran.

3. Bestimmung von PAK mittels HPLC

  1. Bereiten Sie eine Reihe von Arbeitslösungen (im Bereich von 1 bis 500 ng/ml) für den 16-PAK-Mischstandard mit Acetonitril vor und injizieren Sie sie in einen Flüssigkeitschromatographen unter Verwendung von Acetonitril/Wasser als mobiler Phase.
    1. Injizieren Sie 20 μl und wenden Sie das folgende Elutionsverfahren an: 0-18,5 min, 40 % Acetonitril auf 100 % Acetonitril; 18,5-28 min, 100% Acetonitril; 28-29,5 min, 100 % bis 40 % Acetonitril; Stoppzeit: 32 min; Temperatur der Säule: 25 °C; Durchflussrate: 1,8 mL/min. Es wird eine Standardkurve mit den Massenkonzentrationen der Standardarbeitslösungen auf der x-Achse und den entsprechenden Peakbereichen auf der y-Achse dargestellt, die einen Bereich von 5 ng/mL bis 500 ng/mL abdeckt.
      HINWEIS: Die Anregungs-/Emissionswellenlängen von PAK sind der ergänzenden Tabelle S1 zu entnehmen.
  2. Die gereinigte Probe (aus Schritt 2.14.) wird mit einem Fluoreszenzdetektor (FLD) und einem Diodenarray-Detektor (DAD) in den Flüssigkeitschromatographen injiziert.
  3. Identifizieren Sie das Vorhandensein von PAK durch Vergleich von Retentionszeiten und messen Sie die zugehörigen Peakbereiche.
    ANMERKUNG: Die Massenkonzentrationen der PAK wurden unter Verwendung der zuvor erstellten Standardkurve aus Schritt 3.1.1 bestimmt.
  4. Berechnen Sie die internen Konzentrationen der 16 PAK auf der Grundlage der gemessenen Massenkonzentrationen der Proben.

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Ergebnisse

Das gesamte Verfahren für die EOM-Exposition, die Probenvorbereitung und den PAK-Nachweis ist in Abbildung 1 dargestellt. Für HPLC-FLU/DAD wurde ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 mit einem Nachweisbereich von 0,3 bis 5,0 ng/ml als akzeptabel angesehen. Die Nachweisgrenzen der Methode reichten von 3,0 × 10-4 bis 5,0 × 10-3 ng/Organismus. Alle Kalibrierkurven wiesen eine hohe Linearität auf (r2 > 0,999). Die Präzisionswerte, die mit Extrakten aus Matrixpr...

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Diskussion

Zebrafischembryonen sind ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Studien zur Entwicklungstoxizität, aber ihre geringe Größe erschwert den Nachweis von halbflüchtigen organischen Verbindungen (SVOCs) wie PAK. Bei der Probenvorbereitung ist es entscheidend, eine Kontamination von Zebrafischembryonen zu verhindern. Die ordnungsgemäße Reinigung der Proben ist ein wichtiger Schritt, um die Verschleppung von Verbindungen aus dem Expositionsmedium in den Probenextrakt zu vermeiden. Unvollstän...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Fördernummer: 81972999) und dem Suzhou Science and Technology Development Plan (Basic Research on Medical Applications, SKY2023036 and SKY2023115).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16 PAK gemischte Standardlösungen o2si Smart Solutions (South Carolina, USA)110124-0616 PAKs gemischte Standardlösungen  umfasst Naphthalin (Nap), Acenaphthylen (Acy), Ass-Naphthen (Ace), Fluoren (Flo), Phenanthren (Phe), Anthracen (Ameise), Fluoranthen (Grippe), Pyren (Pyr), Benzo [a] Anthracen (BaA), Chrysen (Chrysen), Benzo [b] Fluoranthen (BbF), Benzo [k] Fluoranthen (BkF), Benzo [a] Pyren (BaP), Indeno [1,2,3-cd] Pyren (IcdP), Dibenz [a, h]Anthracen (DahA), Benzo [g,h,i] Perylen (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Santa Clara, USA)FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
AcetonitrilScharlab (Barcelona,Spanien)AC03661000Lösungsmittel
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)Die C18-Packung SBEQ-CA0801ist eine Umkehrphasenpackung mit einem guten Gleichgewicht zwischen hydrophil und hydrophob, die polare und unpolare organische Verbindungen gut adsorbieren und trennen kann.
KieselgurAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)12214013Zur Trennung, Reinigung und Entfernung organischer Verunreinigungen‌
Dispersive SPE 15 ml, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)5982-5056Probenaufreinigungsfilter
ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)SCAA-104Nadelfilter für organische Phase (Nylon), 0,22 Mikro; m
HexanScharlab (Barcelona,Spanien)HE02481000Lösungsmittel
MilliporeMerck (New Jersey, USA)Vorbereitung von Reinstwasser
Organomierung - N-EVAP StickstoffverdampferOrganomierung (Massachusetts,USA)Verdampfung von Lösungsmitteln
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, USA)Zentrifugation
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (New York,USA)Vortex
ZORBAX Eclipse PAH AgilentTechnologies, Inc (Santa Clara, USA)959990-918Diese Säule wird häufig in HPLC-Systemen verwendet, um eine präzise und zuverlässige Analyse von PAK zu erreichen.

Referenzen

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