Ein modifiziertes QuEChERS-HPLC-Verfahren zum Nachweis von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Zebrafischembryonen, die Feinstaub ausgesetzt waren

Summary

Wir haben eine modifizierte QuEChERS-HPLC-Methode entwickelt, um die internen Spiegel von 16 PAK in Zebrafischembryonen zu bestimmen.

Abstract

Die Exposition der Mutter gegenüber Feinstaub (PM_2,5) mit einem aerodynamischen Durchmesser von 2,5 μm oder weniger wurde mit Spontanaborten und verschiedenen angeborenen Krankheiten beim Menschen in Verbindung gebracht. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch unklar. Zebrafischembryonen werden häufig verwendet, um die Entwicklungstoxizität von PM_2,5 zu untersuchen, aber die Messung der internen Konzentrationen von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK), den primären toxischen Bestandteilen von PM_2,5, stellt eine Herausforderung dar. In dieser Studie haben wir eine schnelle, einfache, billige, effektive, robuste und sichere Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (QuEChERS-HPLC)-Methode entwickelt, um die internen Werte der 16 PAK zu bewerten, die in der Prioritäten-Schadstoffliste der US-Umweltschutzbehörde (EPA) aufgeführt sind. Zebrafischembryonen wurden 2-72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit extrahierbarer organischer Substanz (EOM) aus PM_2,5 behandelt. Für die Probenvorbereitung wurde die QuEChERS-Methode eingesetzt, für die qualitative und quantitative Analyse von PAK die HPLC-FLD/DAD (HPLC mit Fluoreszenzdetektor und Diodenarray-Detektor). Wir konnten erfolgreich sechs PAK (Phenanthren, Anthracen, Fluoren, Acenaphthen, Fluoranthen und Pyren) in Zebrafischembryonen nachweisen, die PM_2,5 ausgesetzt waren. Diese Methode ist entscheidend für die Untersuchung der Mechanismen der PM_{2,5-induzierten} Entwicklungstoxizität.

Introduction

Feinstaub (PM_2,5) mit einem aerodynamischen Durchmesser kleiner/gleich 2,5 μm. ist ein führender umweltbedingter Risikofaktor. Aufgrund seiner geringen Größe ist PM_2,5 in der Lage, in das Kreislaufsystem einzudringen und die mütterlich-fetale Barriere zu durchdringen. Epidemiologische Studien haben die Exposition von Müttern gegenüber PM_2,5 mit Spontanaborten und verschiedenen angeborenen Krankheiten in Verbindung^gebracht 1,2,3,4. Die zugrundeliegenden Mechanismen der embryon....

Protocol

1. Probenbehandlung

1. PM_2.5 Kollektion
   1. Sammeln Sie PM_2,5 auf 47 mm Quarzmembranfiltern.
      HINWEIS: PM_2,5 wurde in der Stadt Suzhou, China, gesammelt.
2. EOM-Extraktion
   1. Den Filter in Stücke schneiden und mit 150 ml Acetonitril in einen konischen Glaskolben geben.
   2. Der Kolben wird 1 h lang bei 35 °C mit Ultraschall beschallt und der Extrakt in vier 50-ml-Röhrchen überführt.
   3. Zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei 7.000 × g , geben Sie dann den Überstand in einen Rotationsverdampfer und konzentrieren Sie ihn ....

Results

Das gesamte Verfahren für die EOM-Exposition, die Probenvorbereitung und den PAK-Nachweis ist in Abbildung 1 dargestellt. Für HPLC-FLU/DAD wurde ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 mit einem Nachweisbereich von 0,3 bis 5,0 ng/ml als akzeptabel angesehen. Die Nachweisgrenzen der Methode reichten von 3,0 × ^10-4 bis 5,0 × ^10-3 ng/Organismus. Alle Kalibrierkurven wiesen eine hohe Linearität auf (r² > 0,999). Die Präzisionswerte, die mit Extrakten aus Matrixpr.......

Discussion

Zebrafischembryonen sind ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Studien zur Entwicklungstoxizität, aber ihre geringe Größe erschwert den Nachweis von halbflüchtigen organischen Verbindungen (SVOCs) wie PAK. Bei der Probenvorbereitung ist es entscheidend, eine Kontamination von Zebrafischembryonen zu verhindern. Die ordnungsgemäße Reinigung der Proben ist ein wichtiger Schritt, um die Verschleppung von Verbindungen aus dem Expositionsmedium in den Probenextrakt zu vermeiden. Unvollstän.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 PAK gemischte Standardlösungen	o2si Smart Solutions (South Carolina, USA)	110124-06	16 PAKs gemischte Standardlösungen  umfasst Naphthalin (Nap), Acenaphthylen (Acy), Ass-Naphthen (Ace), Fluoren (Flo), Phenanthren (Phe), Anthracen (Ameise), Fluoranthen (Grippe), Pyren (Pyr), Benzo [a] Anthracen (BaA), Chrysen (Chrysen), Benzo [b] Fluoranthen (BbF), Benzo [k] Fluoranthen (BkF), Benzo [a] Pyren (BaP), Indeno [1,2,3-cd] Pyren (IcdP), Dibenz [a, h]Anthracen (DahA), Benzo [g,h,i] Perylen (BghiP).
1260 Infinity II LC System	Agilent Technologies (Santa Clara, USA)		FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
Acetonitril	Scharlab (Barcelona,Spanien)	AC03661000	Lösungsmittel
CNWBOND HC-C18 SPE	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)	Die C18-Packung SBEQ-CA0801	ist eine Umkehrphasenpackung mit einem guten Gleichgewicht zwischen hydrophil und hydrophob, die polare und unpolare organische Verbindungen gut adsorbieren und trennen kann.
Kieselgur	Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)	12214013	Zur Trennung, Reinigung und Entfernung organischer Verunreinigungen‌
Dispersive SPE 15 ml, EN	Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)	5982-5056	Probenaufreinigungsfilter
	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Shanghai, CHINA)	SCAA-104	Nadelfilter für organische Phase (Nylon), 0,22 Mikro; m
Hexan	Scharlab (Barcelona,Spanien)	HE02481000	Lösungsmittel
Millipore	Merck (New Jersey, USA)		Vorbereitung von Reinstwasser
Organomierung - N-EVAP Stickstoffverdampfer	Organomierung (Massachusetts,USA)		Verdampfung von Lösungsmitteln
Sorvall ST4 Plus	Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA)		Zentrifugation
Vortex- Genie 2 (G560E)	Scientific Industries (New York,USA)		Vortex
ZORBAX Eclipse PAH Agilent	Technologies, Inc (Santa Clara, USA)	959990-918	Diese Säule wird häufig in HPLC-Systemen verwendet, um eine präzise und zuverlässige Analyse von PAK zu erreichen.