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Methodenartikel

In-vivo-Markierung stabiler Isotope zur massenspektrometrischen Identifizierung von väterlichen Metaboliten, die während der Befruchtung von Spermien auf die Eizelle übertragen werden

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DOI:

10.3791/67765

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17. Juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Verfahren zielt darauf ab, Metaboliten zu identifizieren, die während der Befruchtung von Spermien auf Eizellen übertragen werden, indem stabile Isotopenmarkierungen mit 2H,2O oder U13C Glukose verwendet werden, gefolgt von einer metabolomischen Analyse. Deuterium-markierte Bullen werden mit unmarkierten Müttern verpaart. Gesammelte Präimplantationsembryonen werden mittels Massenspektrometrie analysiert, um väterliche (deuterierte) von mütterlichen (nicht deuterierten) Metaboliten zu trennen.

Zusammenfassung

Der väterliche Beitrag zur Embryogenetik war bisher jahrzehntelang auf allelische Sequenzen beschränkt. Ein Jahrzehnt an Ergebnissen deutet stattdessen darauf hin, dass epigenetische Faktoren - DNA-Methylierung, Histonmodifikationen, chromosomale Organisation und regulatorische RNAs - eine entscheidende Rolle bei der väterlichen Vererbung spielen und die Embryonalentwicklung und die Genexpression von Zygoten beeinflussen. Zusammen mit Nukleinsäuren kann das Spermienmetabolom (Lipide, Kohlenhydrate, freie Aminosäuren) als epigenetisches Signal fungieren. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Metaboliten, die von Spermien auf Eizellen übertragen werden, durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Das Verfahren umfasst die Markierung stabiler Isotope von Spermien mit 2H, 2O oder U13C Glukose, um durch Metabolomik väterliche Metaboliten nachzuverfolgen, die während der Befruchtung auf die Eizelle übertragen wurden. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, die Rolle des väterlichen Spermienmetaboloms bei der Anfälligkeit der Nachkommen für Stoffwechselstörungen aufzudecken, und es kann angepasst werden, um Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie Umweltbedingungen wie Ernährung und Exposition gegenüber Schadstoffen die väterlichen Stoffwechselbotschaften verändern, was sich möglicherweise auf die Gesundheit der Nachkommen und die Veranlagung für Diabetes, Fettleibigkeit und Herz-Kreislauf-Erkrankungen auswirkt.

Einleitung

Väterliches Epigenom beeinflusst die Anfälligkeit der Nachkommen für Stoffwechselstörungen
Anders als bei der Fülle von prä- und postkonzeptionellen Rollen, die von Müttern während der Embryonalentwicklung ausgenutzt werden, wurde jahrzehntelang angenommen, dass der Beitrag der Samenzellen ausschließlich genetisch bedingt ist. Nach der genetischen Vererbungstheorie war der väterliche Beitrag zur phänotypischen Variabilität eines Individuums (einschließlich seiner Anfälligkeit für Krankheiten) ausschließlich auf die genetische Sequenz der väterlich vererbten Allelvarianten und auf ihre Wechselwirkungen mit den mütterlich vererbten Allelvarianten zurückzuführen1. Heutzutage ist klar, dass Allele nicht die einzigen genetischen Botschaften sind, die der Vater während der Befruchtung an seine Nachkommen weitergibt, sondern dass eine Vielzahl epigenetischer Signale zur väterlichen Vererbung beiträgt 2,3,4. Zu den bisher identifizierten epigenetischen Signalen gehören: (1) Methylgruppen, die kovalent an Cytosine des elterlichen Genoms angehängt wurden 5,6,7, (2) posttranslationale Modifikationen (Acetylierung, Methylierung) von Histonen, die mit Spermienchromosomen assoziiert sind und an die Eizellen abgegeben werden 8, (3) die 3D-Organisation väterlicher Chromosomen, die zu einer intrachromosomalen Interaktion (auch bekannt als topologisch Assoziationsdomänen, TAD) führt, die in der Zygote persistiert9,10 und (4) regulatorische RNA-Moleküle (miRNAs, tRNA-abgeleitete Fragmente und piwi-interagierende RNAs)11,12 sowie rRNAs13 und tRNAs14, die während der Befruchtung von Spermien in die Eizelle freigesetzt werden.

Das väterliche Epigenom ist ein wichtiger Informationsträger für die Nachkommen. Väterliche Informationen beeinflussen die Zygote, den Embryo während seiner Entwicklung und nach der Geburt die Neigung der Nachkommen zu Stoffwechselstörungen und Krankheiten. Diese nicht-Mendelsche Vererbung (je nachdem, ob sie eine oder mehrere aufeinanderfolgende Generationen betrifft) wird von vielen Autoren als einer der verdeckten Faktoren angesehen, die für die drastische Zunahme von dysmetabolischen Erkrankungen in den entwickelten westlichen Ländern verantwortlich sind15. Tatsächlich ist nach den Theorien PoHaD (Paternal Origin of Health and Disease) und DoHaD (Developmental Origin of Health and Disease) der epigenetische Beitrag der Eltern einer der Faktoren, die Nachkommen dazu prädisponieren, im Erwachsenenalter an Diabetes, Fettleibigkeit und Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu erkranken16,17. Interessanterweise ist das elterliche Epigenom außergewöhnlich anfällig für Umweltreize und kann sowohl durch metabolische Bedingungen (wie Drogenkonsum, Ernährungsgewohnheiten und metabolische Fitness)18 als auch durch rein umweltbedingte Parameter (wie die Exposition gegenüber Schadstoffen, soziale Beziehungen und mentalen und beziehungsbezogenen Stress) beeinflusst werden5,11. Jeder der oben genannten Reize kann so die Epigenome der Keimzellen (Spermien und Eizellen) verändern und zukünftige Generationen beeinflussen.

Der Verzehr von fettreicher Ernährung (HFD) stellt einen der am besten untersuchten Umweltreize dar, der das väterliche Epigenom verändern und zu schädlichen Botschaften an die Nachkommen führenkann 19. Dieser Stimulus wirkt sich auf den Phänotyp der Nachkommen (bis zur dritten Generation) aus, die oft eine größere Neigung zur Entwicklung von Stoffwechselstörungen aufweisen, unabhängig von ihrer Kalorienaufnahme. Nachkommen des Vaters, die HFD konsumieren, zeigen sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten Wachstumsverzögerung, Glukoseintoleranz und Insulinresistenz20,21. Beim Menschen wurde die epigenetische Vererbung hauptsächlich in Generationen untersucht, die während und unmittelbar nach Hungersnöten oder Überfütterungen geboren wurden22. In der Överkalix-Kohorte korrelierte die Nahrungsverfügbarkeit der Großeltern väterlicherseits während ihrer langsamen Wachstumsphase mit dem Gesamtmortalitätsrisiko, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, dem BMI, dem Taillenumfang und der Fettmasse ihrer Enkelkinder23. In jüngster Zeit wurden Hinweise auf eine väterliche intergenerationelle Weitergabe in anderen Kohorten bestätigt24.

Väterliche Metaboliten, die an der intergenerationellen Vererbung beteiligt sind
Trotz klinischer und epidemiologischer Evidenz sind die molekularen Details der väterlichen intergenerationellen Vererbung nach wie vor unklar. Zunächst steht die Identifizierung aller molekularen Transducer epigenetischer Information noch aus. Wissenschaftliche Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die nukleäre Komponente der Spermien allein die Komplexität der Vererbung zwischen den Generationen nicht erklären kann. Variationen in der DNA-Methylierung wurden in der Tat in den Spermien von Mäusen und Ratten gemessen, die mit HFD gefüttert wurden, aber bei einem so geringen Prozentsatz der Spermienpopulation, dass dies die hohe Penetranz des dysmetabolischen Phänotyps, die bei den Nachkommen beobachtet wurde, nicht erklären kann25. Auf der anderen Seite hat der Pool von Signal-RNAs, die von Spermien auf Eizellen übertragen werden, eine sehr kurze Halbwertszeit und obwohl er in der Lage ist, die zygotische Genexpression zu beeinflussen, scheint es unwahrscheinlich, dass er nach der Befruchtung in der Zygote in Tag-2- und Tag-3-Embryonen, in Morulae und in Blastozysten in wirksamen Konzentrationen gehalten wird. Es scheint also offensichtlich, dass neue molekulare Determinanten am intergenerationellen Vererbungsmechanismus beteiligt sein müssen.

Neben Nukleinsäuren trägt das Sperma auch metabolomische Komponenten zur Zygote bei, wie Lipide, Kohlenhydrate und Aminosäuren 26,27,28,29. Diese Metaboliten, insbesondere solche, die mit modulatorischen Aktivitäten ausgestattet sind, könnten die zygotische Genexpression und die Embryonalentwicklung beeinflussen und somit als epigenetische Signale fungieren30. Ähnlich wie bei Nukleinsäuren können die Konzentration und die relative Häufigkeit dieser Metaboliten in Spermien durch Umweltbedingungen beeinflusst werden, die der Vater erlebt hat, und stellen somit Informationsträger für die Nachkommen dar 28,30,31,32,33,34. In der Tat hat sich gezeigt, dass das Spermienmetabolom reifer Spermien vom Gesundheitszustand des Vaters abhängt und von Umweltfaktoren wie Ernährung, körperlicher Bewegung, giftigen Substanzen und endokrinen Disruptoren beeinflusst wird.

Das Verständnis der Rolle der Spermienmetaboliten in der Embryonalentwicklung wird durch mehrere technische Einschränkungen erschwert: (1) der Größenunterschied zwischen dem Spermium und der Eizelle, der zu einem minimalen metabolischen Massenbeitrag der Spermien für die Zygote führt, und (2) die verschiedenen metabolomischen Schwankungen, die das Sperma während seiner Produktionsstadien (Spermatogenese), Nebenhodenreifung durchläuft, Ejakulation und Verschmelzung mit der Eizelle.

Fluktuation des Spermienmetaboloms während der Spermienreifung
Bei Säugetieren werden Spermien im Hoden durch Spermatogenese produziert, ein spermatogonialer Stammzell-abhängiger Prozess, bei dem sich engagierte Spermatogonien zu primären Spermatozyten entwickeln, die in die Meiose eintreten und runde haploide Spermatiden produzieren. Die Morphogenese dieser Zellen zu Spermien erfolgt durch die Spermiogenese, einen massiven morphofunktionellen Umbau der Spermatiden von runden Zellen zu länglichen/kondensierten/hochspezialisierten Zellen, der der letzten Phase der Spermatogenese entspricht. Die daraus resultierenden Spermien sind jedoch unbeweglich und noch nicht befruchtungsfähig35. Nach der Spermionierung, wenn Spermien aus dem Rete Hoden in den Nebenhoden freigesetzt werden, interagieren die Spermien mit epithelialen Nebenhodenzellen und binden sich an Proteine und exosomale Vesikel, die von diesen Zellen sezerniert werden (Nebenhoden, reich an Sphingomyelin und Arachidonsäure). Die Passage durch den Nebenhoden ermöglicht es den Spermien, ihre volle Reife zu erreichen, und selbst wenn sie in einem voraktivierten Zustand gehalten werden, erwerben sie die Kompetenz für die Motilität36. Während des Nebenhodentransits wird die Spermienmembran negativer geladen und mit Sphingomyelin angereichert. Auch die Spermienmembran wird flüssiger durch eine fortschreitende Senkung des Cholesterinspiegels und einen gleichzeitigen Anstieg der mehrfach ungesättigten Fettsäuren (hauptsächlich Arachidonsäure, Docosapentaensäure und Docosahexaensäure). Nach der Ejakulation fördern Samenflüssigkeitsproteine und Albumin im weiblichen Genitaltrakt die Spermienkapazität, indem sie die Hyperpolarisation und den Kalziumeinstrom fördern, um die Beweglichkeit der Spermien zu aktivieren. Die Plasmamembran kapazitiver Spermien weist eine weiter erhöhte Fließfähigkeit, ein niedriges Cholesterin-Phospholipid-Verhältnis und einen reduzierten Gehalt an Sialinsäure, GM1-Gangliosid und Triglyceridenauf 31,37.

Bevor das Sperma auf die Eizelle trifft, durchläuft es die Akrosomreaktion, eine Verschmelzung des Akrosoms (eine von Golgi abgeleitete membranöse Organelle, die den vorderen Teil des Spermienkerns bedeckt und während der Spermiogenese gebildet wird) mit der Plasmamembran der Spermien, die die Reorganisation der Plasmamembran der Spermien und die Fähigkeit zum Durchdringen der Zona pellucida (ZP), einer Matrix von Glykoproteinen, die die Eizelle umgibt,erleichtert 35. 38. Urheberrecht Als letzter Schritt führt die Hemifusion zwischen Spermium und Eizellmembran, die durch die Spermienproteine IZUMO1, SPACA6 und TMEM9539 gefördert wird, zum Einbau von Spermienlipiden in die Eizellmembranen und zum Transfer des Nuklein- und Stoffwechselinhalts in die Eizelle.

Begründung des Verfahrens
Ziel dieses Verfahrens ist es, Metaboliten zu identifizieren, die von den Spermien transportiert und bei der Befruchtung in die Eizelle übertragen werden (Abbildung 1). Um zwischen Spermien und Eizellen abgeleiteten Metaboliten in der Zygote zu unterscheiden, werden die Spermien mit Deuterium (2H, einem Wasserstoffisotop) oder 13C (einem Kohlenstoffisotop) markiert, wobei in vivo die metabolische Markierung mit Deuteriumoxid, 2H2O40 oder einheitlich markiertem U13C Glucose41 verwendet wird. Isotopenmarkierte männliche Mäuse werden dann mit unmarkierten Weibchen verpaart, um schließlich Zygoten, Morulae und Blastozysten zu sammeln. Embryonen im Frühstadium werden verarbeitet, um (1) polare, (2) unpolare Metaboliten und (3) Sterole zu extrahieren. Die Metabolome werden dann mit massenspektrometrischen Techniken analysiert. Isotopenmarkierte (väterliche) Metaboliten werden identifiziert und von unmarkierten (mütterlichen) Metaboliten unterschieden, wobei ihre väterliche Herkunft eindeutig nachgewiesen wird.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Neapel Federico II, Italien, genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Auswahl und Gruppierung der Männchen des Typs C57BL/6J

  1. Wählen Sie C57BL/6J Rüden von ca. 12 Wochen aus.
  2. Teilen Sie die Männchen in zwei Gruppen ein und nennen Sie sie MARKIERT (unter stabiler Isotopenmarkierung) oder UNMARKIERT (wird als Kontrolle und zur Messung der Wirksamkeit der Isotopenmarkierung in Samenzellen und Morulae verwendet).
  3. Um die Nebenhoden von unmarkierten Samenzellen zu entleeren, lassen Sie die Männchen sich mit gepaarten Weibchen paaren.

2. Markierung stabiler Isotopen von C57BL/6J-Männchen

  1. Wenn Sie 2H2O für die In-vivo-Markierung verwenden, bereiten Sie 10 % v/v 2H2O angereichertes Wasser für die Verwendung als Trinkwasser vor, indem Sie 100 mL 2H2O mit 900 mL Leitungswasser mischen. Wenn Sie U13C-Glucose für die In-vivo-Markierung verwenden, bereiten Sie 5%-15% U13C-Glucose Wasser für die Verwendung als Trinkwasser vor, indem Sie 50-150 g U13C-Glucose in 1 l Leitungswasser auflösen;
    ACHTUNG: Ein längerer Verzehr von 2H2O ist für Mäuse giftig. Legen Sie für jeden spezifischen Mausstamm die maximale Menge von 2H2O fest, die dem Trinkwasser zugesetzt werden soll, um eine maximale Markierungseffizienz und minimale Nebenwirkungen zu erzielen. Längerer Verzehr von Glukose verursacht bei Mäusen Hyperglykämie und Diabetes. Legen Sie die maximale Menge an U13C-Glucose fest, die dem Trinkwasser hinzugefügt werden soll, um eine maximale Markierungseffizienz und minimale Nebenwirkungen zu erzielen.
  2. Ersetzen Sie die Wasserflaschen durch solche, die isotopenmarkiertes Trinkwasser enthalten, und lassen Sie die Mäuse es 2,5-5 Wochen lang trinken (was mindestens die Hälfte der Spermatogenese abdeckt), wobei Sie die Flüssigkeit zweimal pro Woche erneuern.
  3. Lassen Sie die markierten Männchen am Ende des Behandlungszeitraums sich mit superovulierten Weibchen paaren.

3. Superovulation von C57BL/6J-Frauen

  1. Ausgewählte Hündinnen im Alter von ca. 4 Wochen mit einem Gewicht zwischen 12,5 und 14 g im präpubertären Alter.
  2. Induzieren Sie die Follikelreifung durch intraperitoneale Injektion von 5 I.E./50 μl/Maus PMSG (Serum für trächtige Stuten).
  3. Nach 47 Stunden wird intraperitoneal das luteinisierende Hormon HCG (Humanes Choriongonadotropin, 5 IE/50 μl/Maus) injiziert, um den Abschluss der Follikelreifung zu fördern und den Eisprung und die Bildung des Gelbkörpers einzuleiten.
  4. Lassen Sie die Weibchen nach der HCG-Injektion sich mit MARKIERTEN und UNMARKIERTEN Mäusen paaren, gemäß Schritt 1 in Abbildung 1.
  5. Nach der Paarung wird die Vaginalplug-Steuerung42 durchgeführt. Trennen Sie die positiven Weibchen und sperren Sie sie ein.

4. Entnahme des Embryos vor der Implantation durch Spülung

  1. Opfern Sie vaginale Plug-positive Weibchen nach institutionell anerkannten Protokollen (2,5 Tage nach dem Coitum zur Entnahme von Morulae).
  2. Stellen Sie die Tiere in Rückenlage auf den Tisch. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol und führen Sie eine breite Laparotomie durch.
  3. Entfernen Sie die Gebärmutter auf einer Seite, indem Sie den Gebärmutterhals einklemmen und am kaudalen Ende des Gebärmutterhalses schneiden; auf der anderen Seite, durch Durchtrennen am Ende des Gebärmutterhorns (infundibulärer Teil).
  4. Legen Sie die Gebärmutter in die Petrischale mit PBS, um sie zu spülen, und übertragen Sie sie dann in eine andere saubere Petrischale, um das Vorhandensein von Rückständen zu vermeiden.
  5. Um die Gebärmutter zu spülen, füllen Sie eine 2,5-ml-Spritze mit dem Nährmedium und befestigen Sie sie an einer 33-G-Hamilton-Nadel mit stumpfer Spitze.
  6. Führen Sie die Nadel in das wie oben vorbereitete Infundibulum des Eileiters ein und waschen Sie die gesamte Gebärmutter.
  7. Sammeln Sie die Morulae in einem Tropfen Kulturmedium, um sie von Schleimhautresten und Blut zu waschen.
  8. Übertragen Sie die gesammelten Proben in neue Entnahmeröhrchen und gruppieren Sie sie in MARKIERTE MORULAE und UNMARKIERTE MORULAE, je nachdem, ob sie aus Verpaarungsereignissen mit MARKIERTEN oder UNMARKIERTEN Bullen stammen. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein.
  9. Opfern Sie eine Gruppe von unverpaarten superovulierten Weibchen (nach institutionell anerkannten Protokollen), um unbefruchtete Eizellen zu sammeln. Übertragen Sie die entnommenen Proben in neue Entnahmeröhrchen und markieren Sie sie als UNMARKIERTE OOZYTEN. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein.

5. Spermienentnahme aus der Nebenhoden-Cauda

  1. Opfern Sie LABELED oder UNLABELED Bullen.
  2. Legen Sie die Tiere in Rückenlage auf den Tisch, befeuchten Sie den Bauch mit 70 % Ethanol und führen Sie eine breite Laparotomie durch.
  3. Entfernen Sie die Nebenhoden und tauchen Sie sie sofort in 3 ml PBS (pH 7,6) und schneiden Sie sie locker ab, um die Spermien aus den Gängen abzulassen.
  4. Filtere die Spermienproben durch das Käsetuch.
  5. Zentrifugieren Sie die Samenzellen bei 800 x g für 10 min (bei Raumtemperatur).
  6. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL kaltem, entionisiertem Wasser. Nur Samenzellen widerstehen der hypotonen Lösung, während Nicht-Spermien platzen.
  7. Zentrifugieren Sie die Spermien bei 800 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
  8. Beschriften Sie die Röhrchen und gruppieren Sie sie in MARKIERTES SPERMA und UNMARKIERTES SPERMA, je nachdem, ob sie von MARKIERTEN oder UNMARKIERTEN Bullen entnommen wurden.
  9. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie die Proben bei -80 °C.

6. Extraktion von Lipiden und polaren Metaboliten

  1. Die Probe aus den Schritten 1-5 wird bei 4° C auf Eis äquilibriert.
  2. Geben Sie 225 μl eiskaltes Methanol (MeOH) zu den Proben und inkubieren Sie sie 1 min lang bei -30 °C und legen Sie sie anschließend für 10 min in ein Schallbad.
    1. Optional: Bei der Einstellung der Versuchsbedingung werden 0,1-2 ppm C16-Ceramid-13, C3-15 N und L-Lysin-ε-15N-Hydrochlorid als interne Standards hinzugefügt, um die Effizienz der Extraktion für unpolare bzw. polare Metaboliten zu messen.
  3. 750 μl eiskalten Methyl-tert-butylether (MTBE) in einen Thermomixer geben für 1 h bei 4 °C (550 U/min).
  4. Nach dem Zentrifugieren werden 188 μl H2O zu den Proben gegeben. Trennen Sie die oberen Phasen (Lipide) von der unteren Phase (polare Metaboliten) und trocknen Sie sie.
    ACHTUNG: MeOH verursacht beim Verschlucken Erblindung und Schäden an Leber, Nieren und Herz. Eine übermäßige Exposition hat eine akkumulative Wirkung auf das zentrale Nervensystem. MTBE kann Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen. Arbeiten Sie unter einem Abzug.
  5. Trocknen Sie die Probe mit einem Vakuumkonzentrator. Getrocknete Proben bis zur Massen-/Spektrometrie-Analyse bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Getrocknete Proben können bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden und warten auf die Massen-/Spektrometrieanalyse. Für die Identifizierung von Metaboliten, die in Präimplantationsembryonen weniger vertreten sind, kann es erforderlich sein, Proben aus demselben Paarungspaar und Paarungsereignis zu poolen.

7. Extraktion von Sterolen

HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Kunststofftuben und -spitzen [sie werden durch das unpolare organische Lösungsmittel aufgelöst]; Verwenden Sie stattdessen Glasröhrchen und Pasteurpipetten aus Glas, um Flüssigkeiten abzugeben.

  1. Die Probe aus den Schritten 1-5 bei 4 °C auf Eis äquilibrieren. Die entnommenen Proben werden in 500 μl einer Lösung von Methanol/H 20 70 % v/v resuspendiert und die Suspension in ein Glasröhrchen überführt.
    1. Homogenisieren durch Vortexen für 30 s. Das Homogenat 16 h bei 4 °C ruhen lassen.
    2. Optional: Bei der Einstellung der Versuchsbedingungen werden 0,1-2 ppm des Pflanzensterins Sitostanol-5,6,22,23-d4 als interne Standards hinzugefügt, um die Effizienz der Extraktion von Sterolen zu messen.
      ACHTUNG: MeOH verursacht beim Verschlucken Erblindung und Schäden an Leber, Nieren und Herz. Eine übermäßige Exposition hat eine akkumulative Wirkung auf das zentrale Nervensystem.
  2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.220 x g für 15 min bei Raumtemperatur. Den Überstand in ein sauberes Glasröhrchen umfüllen und mit 500 μl PBS ergänzen.
  3. 7 mL eiskalten Diethylether zugeben und 1 Min. vortexen. Lassen Sie die Probe 1-2 Min. stehen und warten Sie auf die Phasentrennung. Frieren Sie das Rohr ein, indem Sie es in ein Trockeneis-/Acetonbad tauchen. Übertragen Sie die nicht gefrorene Diethyletherphase in ein neu markiertes Glasröhrchen.
    ACHTUNG: Diethylether ist eine hochentzündliche Flüssigkeit und Dampf und zersetzt sich in Luft und Licht zu explosiven Peroxiden. Arbeiten Sie nicht in engem Kontakt mit Flammen. Diethylether ist gefährlich, wenn er verschluckt wird, und schädlich für die Haut.
  4. Tauen Sie die Wasserphase bei 37 °C auf und wiederholen Sie Schritt 4.3. Kombinieren Sie die in den Schritten 4.3-4.4 gesammelten Diethyletherphasen in einem einzigen Glasröhrchen.
  5. Trocknen Sie die Probe mit einem Vakuumkonzentrator. Gelagerte Proben bis zur Massen-/Spektrometrie-Analyse bei -80° C.

8. Derivatisierung von Proben

HINWEIS: Proben würden von der TMS-Derivatisierung für die Analyse spezifischer Metaboliten (Cholesterin, Fettsäuren, Aminosäuren) profitieren.

  1. Äquilibrieren Sie die Proben bei Raumtemperatur
    VORSICHT: Ein unvollständiges Gleichgewicht kann zu Kondensation von atmosphärischem Wasser an den Rohrwänden und Proben führen. Wasser konkurriert stark um die TMS-Derivatisierung.
  2. Solubilisieren Sie die Proben in 50 μl Pyridin und derivatisieren Sie sie durch Zugabe von 25 μl N,O-Bis(trimethylsilyl(TMS)trifluoracetamid (BSTFA). Inkubieren Sie die Proben 90 Minuten lang bei 60 °C. Schleudern Sie die Proben und fahren Sie sofort mit der GC-MS-Analyse fort.
    ACHTUNG: Pyridin ist brennbar, reizend und giftig. BSTFA ist brennbar, ätzend und reizend. Arbeiten Sie unter einem Abzug und tragen Sie Schutzhandschuhe.

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Ergebnisse

Um den Metabolitentransfer von den Spermien auf die Eizelle zu überwachen, werden Morulae, die von C57 BL/6J-Weibchen isoliert wurden, die mit Bullen aus MARKIERTEN und UNMARKIERTEN Gruppen gepaart wurden, gesammelt und mittels Massenspektrometrie-basierter Metabolomik analysiert. Die Metaboliten wurden wie in Schritt 6-7 beschrieben extrahiert und wie in Schritt 8 beschrieben mit TMS derivatisiert. Es wurde ein metabolomisches und lipidomisches Profiling von MARKIERTEN Morulae, UNMARKIERTEN Morulae, UNMARKIERTEN Eizelle...

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Diskussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Metaboliten, die während der Befruchtung von Spermien auf Eizellen übertragen werden, indem die Markierung stabiler Isotope männlicher Mäuse mit 2H,2O oder U13C Glukose gefolgt von einer metabolomischen Analyse verwendet wird. Isotopenmarkierte Metaboliten, die in Morulae vorkommen, sind väterlichen Ursprungs.

Obwohl Wasserstoff und Deuterium Isotope sind, sind sie i...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2H2O gefiltert, 99,8 Atom % 2HSigma Aldrich756822
AcetonSigma Aldrich179124
Agilent  SIL-8Agilent (Santa Clara, CA, USA)
C16-Ceramid-13C3-15NLGC-NormTRC-C342770-25MG
DichlormethanSigma Aldrich34856
DiethyletherSigma Aldrich673811
EthanolSigma Aldrich1,11,727
HCG (Humanes Choriongonadotropin,Sigma AldrichCG5-1VL
L-Lysin-ε-15N-HydrochloridSigma Aldrich608971
Männlich und weiblich  C57BL/6JOlaHsd-MäuseInotiv C57BL/6JOlaHsd
Methyl-tert-butylether (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-Bis(trimethylsilyl(TMS)
Trifluoracetamid (BSTFA)		Supelco15238
PBSApplichemNr. A0965-9010
PMSG (Trächtige Stute" s Serum)Lee Biosolutions493-10
PyridinSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Shimadzu
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
NatriumtrifluoracetatSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T Bruker Daltonics
TimsTOF Pro Q-TOF Bruker Daltonics
U13C Glukose Sigma Aldrich389374
Ultimative RS3000 UHPLC Thermo Fisher Scientific
VanGuard CSHTM Vorsäule (5,0 x 2,1 mm; 1,7 μm; m, 130 Å)Gewässer

Referenzen

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