Methodenartikel

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

DOI:

10.3791/67780

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27. Dezember 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier zeigen wir, wie Epithelzellen, die mit Fibroblasten in dem nanofaserigen membranbasierten Zweischichtsystem kultiviert wurden, stabil an der Membran haften und auf ihr wachsen können.

Zusammenfassung

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Zu den technischen Hürden bei einer Kultur von Epithelzellen gehören Dedifferenzierung und Funktionsverlust. Biomimetische dreidimensionale (3D) Zellkulturmethoden können die Effizienz der Zellkultur verbessern. In dieser Studie wird ein fortschrittliches zweischichtiges Kultursystem vorgestellt, das Epithelzellen als gewebeähnliche Schichten mit der Kultur von Fibroblasten in einer 3D-Umgebung kultivieren soll. Polyvinylalkohol (PVA) und Poly(ε-Caprolacton) (PCL) nanofaserige Membranen (NMs) wurden durch Elektrospinnen hergestellt und als physiologisch relevante extrazelluläre Matrix für die Kultur von Epithelzellen bzw. Fibroblasten verwendet. In den oberen Insert-Wells wurden Lungenepithelzellen auf dem PVA NM kultiviert, und in den unteren Kammern wurden Fibroblasten auf dem PCL NM kultiviert. Diese Konfiguration eliminiert den direkten Zell-Zell-Kontakt und erleichtert die Untersuchung der parakrinen Signalgebung, die durch lösliche Faktoren vermittelt wird. Die konfokale Mikroskopie wurde eingesetzt, um die Verteilung, das Wachstumsmuster und die Expression von intrazellulären Proteinen, einschließlich Zona occludens, in Epithelzellen zu analysieren. Z-Stacking-Techniken ermöglichten detaillierte 3D-Rekonstruktionen und lieferten präzise Einblicke in die Integrität von Tight Junctions und die räumliche Organisation innerhalb der Epithelschicht. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden die morphologischen Eigenschaften von Zelltypen auf den nanofaserigen Membranen untersucht. Die REM-Bildgebung enthüllte komplizierte Zelloberflächenstrukturen und Wechselwirkungen mit den Nanofasern und bot eine umfassende Perspektive auf die zelluläre Architektur und die Zellinteraktion mit der Nanofaserstruktur. Der Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay ist eine einfache Methode zur Messung der Wachstumsraten von Epithelzellen und Fibroblasten im Laufe der Zeit. Es sorgt für die proliferativen Verhaltensweisen und potenziellen synergistischen Effekte der Kokultivierung dieser Zellen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wirksamkeit eines einfachen Insert-Co-Kultursystems für die gleichzeitige Kultivierung von Fibroblasten und Epithelzellen, das in verschiedenen physiologischen und pharmakologischen Kontexten von entscheidender Bedeutung ist, einschließlich der Regeneration von Epithelgewebe, der Tumormikroumgebung mit Endothel-, Immun- und anderen Stromazellen, des Toxizitätstests und des Arzneimittelaktivitätstests.

Einleitung

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Im Laufe der Jahrzehnte war die klassische zweidimensionale (2D) Monolayer-Kultur für das Verständnis von Infektionen, Pharmakologie und Toxikologie unerlässlich 1,2. Es ist jedoch wichtig, die Komplexität, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen Multikompositionen und die dreidimensionale (3D) Architektur der Gewebemikroumgebung zu berücksichtigen. Daher hat die 2D-Zellkultur Einschränkungen bei der Nachahmung gewebeähnlicher Strukturen 3,4. Zum Beispiel fehlt es an Zell-zu-Zell- und Zell-zu-extrazellulärer Matrix (ECM)-Signalwegen, die für die Zelldifferenzierung, -proliferation und -zellfunktionen in der vivo-Mikroumgebung unerlässlich sind. Aus diesen Gründen wurden die Systeme der 3D-Zellkulturen entwickelt5. Die Zellen in 3D-Kultur wachsen und interagieren dreidimensional mit der umgebenden extrazellulären Matrix. Darüber hinaus wurde ein 3D-Kokulturansatz entwickelt, der aus mehr als einem Zelltyp besteht, um die Lücke zwischen vereinfachten In-vitro-Modellen für Einzelzelltypen und den dynamischen zellulären Interaktionen, die in vivo auftreten, zu schließen 6. 3D-Kokultursysteme haben bei der Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation und der Zell-extrazellulären Matrix (ECM) Wechselwirkungen an Popularität gewonnen 7,8,9,10. Derzeitige 3D-Kokultursysteme haben mehrere Formen und können in direkte und indirekte Kokultur unterteilt werden 8,9. In der direkten Kokultur können verschiedene Zellfunktionen in kultivierten Zellen hauptsächlich durch direkten Kontakt und nicht durch parakrine Effekte beeinflusst werden. Im Vergleich dazu hat die indirekte Kokultur einen größeren Vorteil bei der Untersuchung der parakrinen Interaktion, indem Barrieren oder Schichten zur Trennung verschiedener Zelltypen verwendet werden.

Verschiedene Materialien und Verfahren werden verwendet, um biomimetische Gerüste herzustellen, die die ECM unter Verwendung biokompatibler und biologisch abbaubarer Substanzennachahmen 10. Die nanofaserige Gerüststruktur ahmt die Konfiguration der nativen EZM in biologischen Geweben nach und bietet eine 3D-Architektur für die Zellkultur11,12. Elektrogesponnene nanofaserige Membranen (NMs) wurden in der direkten und indirekten Kokultur verschiedener Zelltypen verwendet 13,14,15.

Epithelzellen bilden eine physikalische Barriere der wichtigsten Organe, während Fibroblasten vorherrschende Stromazellen sind, die den EZM-Umbau vermitteln und das benachbarte Epithel regulieren 6,16,17. Epithelzellen und Fibroblasten interagieren mit Laminin in der Basalmembran bzw. Fibronektin in der interstitiellen Matrix über Integrinrezeptoren auf der Zelloberfläche18. Werden Epithelzellen auf den Poly(vinylalkohol) (PVA) NMs mit Durchmessern von 150 - 250 nm und Mikroporen kultiviert, bilden sie anstelle von Zellaggregaten und Sphäroiden Mehrschichten, und ihre Wachstumsmuster ähneln denen der Zellen im Epithelgewebe19. Im Vergleich dazu bieten die Poly(caprolacton) (PCL) NMs mit Durchmessern von 400-1.500 nm und 10-50 μm Mikroporen eine ähnliche räumliche Dimensionalität wie die interstitielle Matrix für das Wachstum von kultivierten Fibroblasten13,14. Aufgrund ihrer Biokompatibilität sind PVA- und PCL-Membranen häufig verwendete Polymere im Tissue Engineering 20,21.

In dieser Studie wird ein fortschrittliches zweischichtiges Kultursystem vorgestellt, das poröse elektrogesponnene NMs verwendet, um Epithelzellen als gewebeähnliche Schichten und Fibroblasten innerhalb einer 3D-Struktur zu kultivieren. Das Protokoll kann in fünf Schlüsselphasen unterteilt werden: Nanofaserherstellung, Faserpostvernetzung und Qualitätsbewertung, Vorbereitung der membrangebundenen Kulturvertiefung, Zellaussaat und 3D-Kokultur sowie Assays von 3D-kultivierten Zellen.

Protokoll

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1. Herstellung von wasserstabilen PVA-Nanofasern

  1. Wiegen Sie 0,02 g Poly(acrylsäure) (PAA) und 1 g PVA ab und geben Sie sie dann in eine saubere Glasflasche mit einem Magnetstab. Geben Sie 7,8 mL destilliertes Wasser in die Flasche, stellen Sie die Flasche auf einen Tellerrührer und stellen Sie die Temperatur auf 84 °C, die Drehzahl auf 500 U/min und die Zeit auf 12 h ein.
  2. Lassen Sie die Flasche auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie 0,2 ml Glutaraldehyd (GA) hinzufügen. Stellen Sie die Flasche auf den Tellerrührer und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 500 U/min, die Zeit auf 30 Minuten und die Temperatur auf Raumtemperatur ein.
  3. Verwenden Sie eine 5-ml-Spritze zum Elektrospinnen, trennen Sie die Kolben von den Fässern und reinigen Sie kleine Plastikreste in den Fässern und an der Spitze der Kolben.
  4. Verwenden Sie Nadeln, um den Flüssigkeitsfluss zu blockieren, und gießen Sie dann PVA-Lösung in jedes Fass (Volumen: jeweils 2,5-3 ml). Montieren Sie die Kolben und entfernen Sie dann die Nadeln.
    HINWEIS: Möglicherweise befindet sich eine Blase in der Lösung, also warten Sie, bis die Blase verschwindet. Dies dauert ca. 10-30 min.
  5. Montieren Sie eine neue 27 G Metallnadel und setzen Sie sie dann in die Elektrospinnmaschine ein.
  6. Wickeln Sie den Sammler gut mit Folie ein.
  7. Lassen Sie die Injektorblende in die ursprüngliche Position zurückkehren. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Maschine: (jede Pumpe) Injektionsvolumen: 2 mL, Injektionsrate: 6 μL/min, Walzendrehzahl: 100 U/min, Abstand von Spitze zu Auffangbehälter: 14 cm. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfluss für jede Pumpe.
  8. Die Maschine mit einem elektrischen Potential von ca. 12 kV betreiben.
  9. Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit zu Beginn des Prozesses 40 - 50 % und am Ende des Prozesses 25 - 30 % beträgt. Verwenden Sie einen Luftbefeuchter, wenn die Luftfeuchtigkeit abnimmt, und stellen Sie am Tag vor dem Elektroschleudern Geschirr mit destilliertem Wasser in die Maschine, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen.
    HINWEIS: Dies ist ein kritischer Faktor für die erfolgreiche Herstellung von PVA-Nanofasern.
  10. Überprüfen Sie den Durchfluss regelmäßig. Wenn die Nadel blockiert ist, stoppen Sie die Maschine vorübergehend. Verwenden Sie ein Labortuch, um den Tropfen zu entfernen, und warten Sie, bis der neue Tropfen erscheint. Wenn nicht, wechseln Sie die Nadel und lassen Sie die Maschine weiter laufen.
  11. Der Prozess der Herstellung von PVA-Nanofasern dauert ~6 Stunden. Nachdem der Elektrospinnvorgang abgeschlossen ist, lösen Sie die Folie mit der Fasermatte vom Kollektor und lagern Sie die Nanofasermatte in Trockenmittel unter Vakuum.

2. Behandlung einer nanofaserigen PVA-Membran mit Salzsäure (HCl)-Dampf und Beurteilung der Faserqualität

HINWEIS: Die Wasserstabilität von PVA-NMs ist nach der Nachvernetzungsreaktion durch HCl-Dampf gut erhalten. Dieser Prozess ist für die geeignete Dicke, Porengröße und Rauheit der NMs optimiert. PVA ist ein sehr hydrophiles Polymer, und elektrogesponnene PVA-Nanofasern sind instabil bei Wasserkontakt und feuchten Bedingungen. PVA-NMs sollten unmittelbar nach der Herstellung des PVA-Polymers mit HCl-Dampf behandelt werden.

  1. Schneiden Sie eine Nanofasermatte in Stücke in der gewünschten Größe für die Trans-Well-Einlage.
  2. Bereiten Sie eine kleine Schale mit 1,5 ml reinem HCl vor. Legen Sie die HCl-haltige Schale und die Nanofaserstücke in eine Vakuumkammer und schließen Sie den Deckel.
    HINWEIS: HCl-Dampf wird als Postvernetzungsmittel verwendet, um die Nanofaser wasserstabil zu machen.
  3. Öffnen Sie das an die Vakuumpumpe angeschlossene Ventil, warten Sie 10 s, bis der HCl-Rauch aufsteigt, und schließen Sie dann das Ventil. Behandeln Sie die Membranen 2 Minuten lang mit HCl-Rauch.
  4. Nach der Behandlung mit HCl-Dampf geben Sie einige Tropfen destilliertes Wasser (DW) auf die Membranen, legen Sie sie auf einen Objektträger und entfernen Sie die Membran von der Folie. Nach einer 20-minütigen Lufttrocknung haften die Membranen auf natürliche Weise an der Schiene.
  5. Beschichten Sie die Membranen auf Carbonband mit einer dünnen Goldschicht unter Verwendung eines Autosputter-Coaters. Erhalten Sie Rasterelektronenmikroskop-Bilder (REM).
  6. Nach der Vernetzung von PVA-NMs mit HCl waschen Sie sie 3x mit 1x PBS und überprüfen Sie den pH-Wert nach dem Einweichen in Nährmedien, um das Fehlen von HCl-Resten zu bestätigen.

3. Herstellung von PCL-Nanofasern und Bewertung der Nanofaserqualität

  1. Wiegen Sie 1,5 g PCL ab und geben Sie es in eine saubere Glasflasche. Geben Sie 8,5 ml Chloroform in die Flasche, stellen Sie die Flasche auf einen Tellerrührer und lösen Sie PCL 12 h lang bei Raumtemperatur in Chloroform auf.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.9, mit Ausnahme der Schritte 1.7 und 1.8, stellen Sie die Injektionsrate auf 8 μL/min und die Spannung auf 17,5 kV ein.
    HINWEIS: Die PCL-Herstellung dauert ~3,5 Stunden.
  3. Schneiden Sie ein kleines Stück der Membran ab und beschichten Sie die Stücke mit dem Auto-Sputter-Verfahren für 5 Minuten. Erhalten Sie REM-Bilder.

4. Montage von zwei Membranschichten in einem Trans-Well

HINWEIS: In diesem Protokoll verwenden wir eine 24-Well-Platte und die entsprechende Einsatzvertiefung. Das PVA NM wird an der Einlegevertiefung befestigt, während das PCL NM an der unteren Vertiefung befestigt wird.

  1. Schneiden Sie eine Nanofasermatte in runde Stücke mit einem Durchmesser von 10 mm bzw. 13 mm für PVA- und PCL-NMs.
  2. Verwenden Sie Polydimethylsiloxan (PDMS) Sylgard 184 als Haftmittel, um die Membranen an der Einlage und der Kammervertiefung zu befestigen. Mischen Sie vor der Verwendung Sylgard 184 Base (Teil A) und Härter (Teil B) in einem Plastikbecher im Massenverhältnis 10:1. Verwenden Sie einen sauberen Objektträger und mischen Sie die PDMS-Lösung 2-3 Minuten lang kräftig, bis die gesamte Mischung mit Blasen gefüllt ist. Lassen Sie die Blase 10 Minuten lang entstehen, bevor Sie sie verwenden; In der Zwischenzeit die Folie auf 100 °C erwärmen lassen.
  3. Verteilen Sie das PDMS auf einem Objektträger und tauchen Sie die untere Kante der Wendeschneidplatte gut in das PDMS ein. Halten Sie die Einlage gut kopfüber auf den Objektträgerwärmer, damit das PDMS aushärten kann (~10-15 min). Überprüfen Sie vorsichtig mit einer 200-μl-Spitze, um sicherzustellen, dass das PDMS nicht klebrig ist.
  4. Behandeln Sie die PVA-NM-Stücke wie in den Schritten 2.2 bis 2.4 beschrieben.
  5. Drücken Sie die Einlage gut vorsichtig auf das PVA NM-Stück, so dass die Unterseite der Einlage zur Nanofaserseite des Membranstücks zeigt. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser in die Mitte der Vertiefung und verwenden Sie eine Pinzette, um die Folie zu entfernen. Legen Sie die Einsatzmulde in eine neue 24-Well-Platte und lassen Sie die Membran trocknen.
  6. Wenn Sie das PCL NM-Stück an der unteren Vertiefung befestigen, achten Sie darauf, die 200-μL-Spitze in die PDMS-Mischung zu tauchen und sie genau an den vier Ecken und in der Mitte zu punktieren.
  7. Legen Sie die Platte auf den Schienenwärmer und lassen Sie das PDMS 5-7 min aushärten, um die Qualität der Montage zu gewährleisten.
  8. Legen Sie das PCL NM-Stück in die PDMS-enthaltende Vertiefung, wobei die Nanofaserseite der Membran mit dem PDMS verbunden ist. Drücken Sie mit einer kleinen, sauberen Bürste die Folienseite des Membranstücks leicht an, um eine vollständige Befestigung zu erzielen. Geben Sie 0,2 ml 70%iges Ethanol in die Vertiefung, um die Folie leicht zu entfernen.
  9. Sterilisieren Sie den Einsatz und die untere Vertiefung im Trans-Well-Setup unter UV-Licht über Nacht.
    HINWEIS: Das gemischte PDMS kann zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert werden. ACHTUNG: Die mit der PCL-Nanofasermembran befestigte Platte kann trocken gelagert werden, muss aber vor der Verwendung mit 70 % Ethanol befeuchtet werden.
  10. Waschen Sie am nächsten Tag die Einlage und den Boden gut, indem Sie 200 μl bzw. 500 μl 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 3 x 10 min hinzufügen. Die Einlage und die untere Vertiefung sind gebrauchsfertig.

5. Zellaussaat und Assemblierung von zwei Schichten für das Kokulturmodell

HINWEIS: MLE-12-Zellen wurden in 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin-Antibiotikum kultiviert. NIH3T3-Zellen wurden in 1x DMEM hoher Glukose mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin-Antibiotikum kultiviert.

  1. Bewahren Sie die Zellen in einer 150-mm-Kulturschale auf. Wenn sie zu 70-80 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS und trypsinisieren Sie sie mit 2 ml vorgewärmter 0,05%iger Trypsin/EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C.
  2. Klopfen Sie vorsichtig auf die Schale, um die Zellen vom Boden zu lösen, und fügen Sie dann 8 ml vollständiges Kulturmedium zu jedem Zelltyp hinzu, um das Trypsin-Enzym zu neutralisieren. Die Zellsuspension wird in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, 5 Minuten lang bei 400 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Färben Sie die Zellen mit dem Cell-Tracker, um die Verteilung der ausgesäten Zellen auf NM zu beobachten (siehe Abschnitt 6 für weitere Details).
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL vollständigem DMEM/F12-Medium. Bestimmen Sie die Zellzahl und stellen Sie sie auf 6 × 106 MLE-12 Zellen/ml und 8 × 105 NIH3T3 Zellen/ml ein.
    HINWEIS: Vollständiges DMEM/F12-Medium wird für die Kokultur mit MLE-12- und NIH3T3-Zellen verwendet.
  4. Füllen Sie die untere Vertiefung mit 500 μl vollständigem DMEM/F12-Medium (die Vertiefung ohne PCL). Übertragen Sie den an der PVA-Nanofasermembran befestigten Einsatz in den Trans-Well und fügen Sie 50 μl MLE-12-Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2.
  5. Füllen Sie gleichzeitig die an der PCL-Nanofasermembran befestigte Bodenvertiefung mit 500 μl NIH3T3-Zellsuspension und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2.
  6. Nach 2 Stunden montieren Sie den MLE-12-Zell-haltigen Einsatz und die NIH3T3-Zell-enthaltende Bodenvertiefung in der Trans-Well-Anordnung. Dies ist das Kokulturmodell mit MLE-12-Zellen als obere Schicht und NIH3T3-Zellen als untere Schicht. Kokulturieren Sie die Zellen in den zweischichtigen Membranen für die gewünschte Zeit.

6. Assay für die Zellverteilung

  1. Bereiten Sie 5 μM Cell-Tracker Rot-Grün-Lösung in einem Gesamtvolumen von 2 mL vollständigem DMEM/F12-Medium vor.
  2. Nach der Trypsinisierung mischen Sie MLE-12-Zellen mit der zuvor vorbereiteten roten Cell-Tracker-Lösung und NIH3T3 mit der grünen Cell-Tracker-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 , um eine optimale Zellmarkierung zu gewährleisten. Geben Sie 8 mL vollständiges DMEM/F12-Medium zu den Proben und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 × g .
    HINWEIS: Cell Tracker kann die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen nicht beeinflussen. Daher können Cell-Tracker-gefärbte Zellen bis zur Konfluenz kultiviert werden. Die Fluoreszenzintensität in den gefärbten Zellen kann 4-5 Tage nach der Kultivierung abnehmen.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 bis 5.6.
  4. Übertragen Sie während der Beobachtung unter einem konfokalen Mikroskop die Einsatzvertiefung von der 24-Well-Platte auf eine 12-Well-Platte.
    HINWEIS: Dadurch wird der Abstand zwischen der Objektivlinse und den Zellen minimiert und die Beobachtung der Zellmorphologie ermöglicht.

7. Konfokale Beobachtungen von 3D-kokultivierten Zellen

HINWEIS: Die Bindung von Epithelzellen an ein PVA-NM ist im Vergleich zu der von Fibroblasten an einem PCL-NM schwach. Entsorgen Sie alte Medien manuell durch Pipettenaspiration und geben Sie neue Medien oder Lösungen vorsichtig an die Wand der Vertiefungen. Versuchen Sie während des Färbevorgangs, die Membranen nicht trocknen zu lassen.

HINWEIS: Die Zelladhäsion kann verbessert werden, indem Laminin beschichtet oder Peptide von Integrin-bindenden Motiven in PVA-Nanofaserneingebaut werden 19.

  1. Übertragen Sie den Einsatz auf eine neue 24-Well-Platte. Entsorgen Sie das alte Medium und fügen Sie 150 μl einer 4%igen Paraformaldehyd (PFA)-Lösung hinzu. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Entfernen Sie die 4%ige PFA-Lösung und waschen Sie die anhaftenden Zellen mit 150 μL 1x PBS.
  3. Zur Blockierung und Permeabilisierung 150 μl 5 % normales Ziegenserum und 0,2 % Triton X-100 in 1x PBS verdünnt zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Bereiten Sie die Alexa Fluor 594-konjugierten Anti-Zona occludens Ab (1:400) und Phalloidin-iFlour 488 (1:1.000) vor, indem Sie sie in einem Antikörperverdünnungsreagenz verdünnen. Entfernen Sie die Blockierungslösung, fügen Sie 150 μl der Fluorophorlösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Antikörperlösungen mit äußerster Präzision vor, da dies die Qualität der Ergebnisse direkt beeinflusst. Vermeiden Sie Lichteinwirkung.
  5. Die Antikörperlösung verwerfen und die Zellen 10 min lang mit 150 μl 1x PBS waschen.
  6. 150 μl Hoechst 33342 verdünnt in 1x PBS (1:1.000) zugeben und 10 min inkubieren; Vermeiden Sie Lichteinwirkung.
  7. Entfernen Sie die Hoechst 33342 Lösung und waschen Sie die anhaftenden Zellen mit 150 μL 1x PBS für 10 min.
  8. Bereiten Sie einen sauberen Objektträger vor und fügen Sie eine genaue Menge wässrigen Einbettgels hinzu. Verwenden Sie eine Pinzette mit spitzen Spitzen, um die Membranen vorsichtig von der umgebenden Kante zu lösen. Legen Sie die Membranen auf das Eindeckgel und stellen Sie sicher, dass die Seite mit den Zellen nach oben zeigt. Fügen Sie eine genaue Menge Montagegel hinzu und decken Sie es mit einer Abdeckfolie ab. Versiegeln Sie die Dias mit Nagellack, um eine präzise und vollständige Abdichtung zu gewährleisten.
  9. Beobachten Sie Zellen unter einem konfokalen Mikroskop mit den folgenden Bildgebungseinstellungen: Steuerung der Laserleistung: 405 Intensität 10; Steuerung der Laserleistung: 488 Intensität 10; Steuerung der Laserleistung: 561 Intensität 10; Empfindlichkeit des Detektors: 420LP (600er Wert); Empfindlichkeit des Detektors: 525/50 (700er Wert); Empfindlichkeit des Detektors: 561LP (750er Wert).

8. Assay der Zelladhäsion an Nanofasern

  1. Entsorgen Sie die alten Medien und waschen Sie die Zellen mit 150 μL 1x PBS.
  2. Fixieren Sie die Zellen mit 150 μL 3% GA verdünnt in 1x PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
  3. Waschen Sie die Zellen mit 150 μL 1x PBS in 10 min.
  4. Fixieren Sie die Zellen sekundär, indem Sie 150 μl 1% Osmiumtetroxid (OsO4) verdünnt in 1x PBS für 1 h hinzufügen.
    ACHTUNG: OsO4 und sein Dampf sind schädlich. Es muss in einem Abzug verwendet werden.
  5. Verwerfen Sie die Lösung und waschen Sie die Zellen mit 300 μl 1x PBS für 2 x 10 min.
  6. Dehydrieren Sie die Zellen mit abgestuftem Ethanol von 50 %, 70 %, 90 % und 95 % auf 100 % für 10 Minuten in jedem Schritt. Führen Sie den letzten Dehydratisierungsschritt durch, indem Sie 10 Minuten lang frisches 100%iges Ethanol hinzufügen.
  7. Trocknen Sie die Zellen und Membranen vollständig an der Luft. Verwenden Sie eine Pinzette mit den spitzen Spitzen, um die Membranen zu lösen, und platzieren Sie die Membranen mit einem beidseitigen Klopfen auf dem Probenhalter. Führen Sie 5 Minuten lang ein Ionensputtern durch, bevor Sie die Zellen unter REM bei 2.000-facher Vergrößerung betrachten.

9. Zellwachstums-Assay

HINWEIS: In diesem Protokoll wird der CCK-8-Assay verwendet, um die Zellwachstumsrate gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren.

  1. Bereiten Sie die CCK-8-Mischung vor, indem Sie 9 Teile vorgewärmtes DMEM/F12 (nach Volumen) mit 1 Teil des CCK-8-Reagenzes mischen. Nachdem Sie das alte Kulturmedium entfernt haben, geben Sie 150 μl des CCK-8-Gemischs in die zellenthaltende Vertiefung.
  2. Übertragen Sie den Einsatz auf die neue 24-Well-Platte, um ihn von der unteren Vertiefung mit den Zellen zu trennen. Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2.
  3. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein 1,5-ml-Röhrchen. Bei 1.800 × g 3 min zentrifugieren.
  4. Geben Sie 100 μl des Überstands aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in die 96-Well-Platte. Lesen Sie die optische Dichte (OD) bei 450 nm.

Ergebnisse

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Dieses Protokoll beschreibt die kritischen Schritte für die Kokultivierung von MLE-12-Lungenepithelzellen und NIH3T3-Fibroblasten durch die Konstruktion eines auf Nanofasermembranen basierenden Zweischichtmodells (Abbildung 1). Dieses Modell eignet sich für die Bildgebung lebender Zellen, die Immunhistochemie und die quantitative Endpunktanalyse von kokultivierten Zellen. Andere Zelltypen können ebenfalls genutzt werden, indem die Zelldichte und die Wachstumsbedingungen optimiert werden.

REM zeigt die gleichmäßige Verteilung von hergestellten PVA-Nanofasern ohne jegliche Kügelchenbildung (Abbildung 2A). Der Durchmesser der PVA-Nanofasern reichte von 150 nm bis 230 nm (180 ± 25 nm, mittlere ± Standardabweichung (SD)). Die Nanofasern in elektrogesponnenen PCL-NMs waren zufällig orientiert und ähnelten strukturell Kollagen (Abbildung 2B). Die meisten Fasern in PCL-NMs hatten einen Durchmesser zwischen 300 nm und 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Somit hatte die nanofaserige PVA-Membran kleinere Porengrößen als die nanofaserige PCL-Membran.

Vor der Aussaat wurden MLE-12- und NIH3T3-Zellen mit Cell-Tracker rot bzw. grün gefärbt und während des gesamten Kokulturprozesses überwacht. Wie in Abbildung 3 gezeigt, konnte die räumliche Verteilung von MLE-12-Zellen in der Insertkammer und NIH3T3-Zellen in der unteren Kammer deutlich beobachtet werden. Die Focus-Stacking-Analyse zeigte, dass NIH3T3-Zellen in unterschiedlichen Tiefen (102 ± 20 μm) dispergiert und detektiert wurden, während MLE-12-Zellen Schichten mit einer Dicke von 80 ± 10 μm bildeten. NIH3T3-Zellen infiltrieren die PCL-Nanofasermembran und erstrecken sich entlang der Nanofaserachsen, während MLE-12-Zellen an der Oberfläche der PVA-Nanofasermembran haften und eine Aggregation aufweisen (Abbildung 4). Als nächstes untersuchten wir die Zytoskelettorganisation von NIH3T3-Zellen und MLE-12-Zellen durch Aktinfärbung. NIH3T3-Zellen, die auf einer nanofaserigen PCL-Membran kultiviert wurden, zeigen eine Projektilverteilung von Aktinfilamenten, die Zellen im Gewebe ähneln, und die Aktinfärbung in MLE-12-Zellen, die auf einer nanofaserigen PVA-Membran kultiviert wurden, zeigt runde Aggregate ohne zelluläre Ausbreitung (Abbildung 5).

Die Verteilung und das Wachstumsmuster von MLE-12-Zellen in Monokulturen und Kokulturen wurden verglichen. Cell-Tracker rot gefärbte Zellen in Monokultur auf den PVA-NMs bildeten Aggregate, aber die Zellen im Kokulturzustand behielten eine gleichmäßige Verteilung auf der Membran bei (Abbildung 6A). In einer 3D-Analyse von konfokalen Mikroskopiebildern zeigt das Wachstumsmuster von kokultivierten MLE-12-Zellen auf den PVA-NMs eine geschichtete Adhäsion von kultivierten Zellen an der Membran mit einer höheren konfluenten Zelldichte im Vergleich zu Zellen, die in Abwesenheit von Fibroblasten kultiviert wurden (Abbildung 6B). Darüber hinaus waren die Zell-zu-Zell-Adhäsion und die Expression von zonalem Occludin (ZO)-1 auf den Zelloberflächen (Pfeil angedeutet), nicht aber von Zellaggregaten, in der Kokultur deutlicher als in der Kultur ohne Fibroblasten (Abbildung 6C).

Die Proliferation von Zellen auf den Membranen wurde mit dem CCK-8-Assay gemessen. Die Proliferation von NIH3T3- und MLE-12-Zellen nahm mit der Zeit zu (Abbildung 7). Allerdings wurden auf den Membranen geringere Wachstumsraten der Zellen beobachtet als auf einer Kulturplatte (Daten nicht gezeigt). Kokultivierte NIH3T3- und MLE-12-Zellen auf NMs zeigen eine stabile Wachstumsrate im Vergleich zu den monokultivierten Zellen in einer Kulturplatte.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der NIH3T3-Fibroblasten- und MLE-12-Epithelzell-Co-Kulturmethode im Gerüst-basierten Zweischichtsystem. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Struktur von PVA- und PCL-Nanofasern. (A) PVA- und (B) PCL-Nanofasermembranen wurden durch Elektrospinnen hergestellt. Die Struktur und der Durchmesser der Nanofasern werden mittels REM der Membranoberflächen gemessen. Maßstabsleisten = 1 μm (A), 10 μm (B). Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: In einem Kokultursystem die räumliche Verteilung von NIH3T3-Zellen auf der nanofaserigen PCL-Membran und von MLE-12-Zellen auf der nanofaserigen PVA-Membran. NIH3T3-Zellen (4 × 105) wurden mit Cell-Tracker Green und MLE-12-Zellen (3 × 105) mit Cell-Tracker Red gefärbt. Die ausgesäten Zellen wurden 24 Stunden lang kultiviert und mit einem Z-Stacking-Bild eines konfokalen Mikroskops betrachtet. Die Zahlen werden in μm angegeben; Pfeile zeigen Abmessungen mit x (Breite), Y (Länge), Z (Tiefe) an. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Adhäsion und Morphologie von NIH3T3-Zellen auf PCL-Nanofasermembran und MLE-12-Zellen auf PVA-Nanofasermembran. Die Zellen wurden 24 Stunden lang auf den Membranen kultiviert und mit REM bei 2.000-facher Vergrößerung beobachtet. Maßstabsleisten = 15 μm. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Aktin-Stressfasern in NIH3T3-Zellen auf PCL-Nanofasermembran und MLE-12-Zellen auf PVA-Nanofasermembran. NIH3T3-Zellen (4 × 105) und MLE-12-Zellen (3 × 105 Zellen) wurden auf den nanofaserigen PCL- bzw. PVA-Membranen ausgesät. Nach 48-stündiger Kultur wurden die Zellen mit Phalloidin-iFlour 488 gefärbt und mit konfokaler Mikroskopie beobachtet. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol; PCL = Poly(ε-Caprolacton); FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Wachstumsmuster von kokultivierten MLE-12-Zellen auf einer nanofaserigen PVA-Membran. (A) Cell-Tracker-rot gefärbte MLE-12-Zellen (3 × 10,5 Zellen) wurden auf die PVA-Nanofasermembran ausgesät und allein (-NIH3T3-Zellen) und mit NIH3T3-Zellen in einem Zweischichtsystem (+NIH3T3-Zellen) für 48 h kultiviert. (B) Monokulturelle und kokultivierte MLE-12-Zellen für 48 Stunden wurden mit Hoechst 33342 (blau) und Phalloidin-iFlour 488 gefärbt und unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops beobachtet. Die 3D-Bilder werden mit der Oberflächenfunktion der Imaris Software angezeigt. (C) MLE-12-Zellen wurden 48 h lang kultiviert und mit Phalloidin-iFlour 488 und Anti-ZO-1-Antikörper (rot) fluoreszenzmarkiert. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzungen: PVA = Polyvinylalkohol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Wachstumsrate der Zellen in einem zweischichtigen Kokultursystem. NIH3T3-Zellen (4 × 105) und MLE-12-Zellen (3 × 105) werden für die angegebene Zeit kokultiviert. Das Zellwachstum im Insert und im Bottom Well wird mit dem CCK-8-Assay gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Der Übergang von 2D-Kultur- zu 3D-Kulturmodellen stellt einen bedeutenden Fortschritt bei der Entwicklung von In-vitro-Kokulturmodellen dar. Ein 3D-Kulturmodell muss die Mikroumgebung des Gewebes nachahmen, in der sich Zellen vermehren, aggregieren und differenzieren können22. Die Verwendung von gerüstbasierten 3D-Cokulturmodellen verbessert die Replikation der Gewebearchitektur. In dieser Studie bietet ein NM-basiertes Trans-Well-System eine indirekte 3D-Kokultur von zwei Zelltypen. Das PCL NM mit großen Poren in der unteren Kammer ermöglicht eine zelluläre Infiltration und ahmt die interstitielle Matrix nach. Dieses Gerüst unterstützt das Wachstum und die räumliche Organisation von Fibroblasten. Die Verwendung einer PVA-Nanofasermembran in der oberen Kammer ermöglicht die Bildung von MLE-12-Epithelzellen in der Schicht. Der Durchmesser und die Porengröße der nanofaserigen PVA-Membran machen sie zu einem idealen Substrat zur Unterstützung der Adhäsion und des Wachstums von Epithelzellen, die Epithelzellen auf der Basalmembran in Epithelgeweben nachahmen19.

Zelladhäsive Proteine wie Fibronektin und Laminin sind Schlüsselproteine in der EZM, die Zellen mit Kollagenfibrillen verbinden23. Epithelzellen interagieren mit Laminin über Integrinrezeptoren auf ihrer Oberfläche18. MLE-12-Zellen, die auf den PVA-NMs ausgesät wurden, hafteten an der Membran und wuchsen dreidimensional auf der Membran. Die Bindung der Epithelzellen an das poröse PVA-NM war jedoch gering, was zu einer Aggregation führte, da ihnen spezifische biologische Motive fehlen, die mit kultivierten Zellen interagieren. In unserem Kokultursystem gibt es keinen direkten Zell-Zell-Kontakt zwischen NIH3T3- und MLE-12-Zellen, und die Kommunikation erfolgt ausschließlich über parakrine Signalwege. Das Vorhandensein von kokultivierten NIH3T3-Zellen kann die Bindung von MLE-12-Zellen an die Membran während des gesamten Kulturzeitraums stabilisieren. Diese Stabilisierung kann auf die Sekretion löslicher Faktoren durch die Fibroblasten zurückgeführt werden, einschließlich Kollagen, Fibronektin, Laminin und verschiedener Wachstumsfaktoren24. Im Vergleich dazu verändern Fibroblasten in einem Tumormodell mit direkter Kokultur von Fibroblasten und Krebszellen in einem nanofibrösen PCL-Gerüst die Eigenschaften der EZM durch Matrix-Remodeling25.

Epithelzellen ruhen auf einer Basalmembran, die als Wachstumsstütze und selektiv durchlässige Schicht fungiert. Mehrere technologische Strategien, einschließlich der Organoid-Technologie, werden derzeit entwickelt, um komplexe 3D-Modelle von Epithelgeweben zu erstellen26. Die Organoidstruktur erschwert jedoch die Verwendung herkömmlicher Assays27. Darüber hinaus wird die konventionelle Mikroskopie zur experimentellen Datenerfassung durch die Tatsache erschwert, dass Organoide kultiviert werden, während sie in eine 3D-Hydrogel-Matrix eingebettet sind27. In dieser Studie wurde die Insert-Kammer von der unteren Kammer getrennt, um eine präzise Beobachtung von Epithelzellen zu ermöglichen, die auf PVA NM kultiviert wurden. Darüber hinaus werden 3D-Organoide durch die Differenzierung von Stammzellen hergestellt. Daher dauert die Kultivierung von Stammzellen viel Zeit und ist im Vergleich zu einem Kokultursystem ein komplexer Vorgang, und die Heterogenität der Organoide wird berichtet28.

Im Vergleich zur Monokultur verbessert die Kokultur von Epithelzellen und Fibroblasten die Adhäsion am Gerüst und erhält ein stabiles Wachstum und eine stabile Funktion der kultivierten Epithelzellen. Darüber hinaus sind ergänzende Materialien, einschließlich Wachstumsfaktoren und Zytokine, im Kulturmedium aufgrund löslicher Faktoren, die von kokultivierten Fibroblasten sezerniert werden, nicht erforderlich. Trotz der Vorteile der Verwendung von nanofaserigen Gerüsten in der Zellkokultur durch strukturelle Unterstützung können sie im Vergleich zu biokompatiblen Hydrogelen keine EZM liefern, die Kultivierungszellen umgibt29. So kann diese Einschränkung durch die Verwendung von Zellen auf NM mit überschichteten Hydrogelen erreicht werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein einfaches Insert-Co-Kultursystem für die gleichzeitige Kultivierung von Fibroblasten und Epithelzellen in verschiedenen physiologischen und pharmakologischen Kontexten von entscheidender Bedeutung ist, einschließlich der Regeneration von Epithelgewebe, der Tumormikroumgebung, des Toxizitätstests und des Wirkstoffaktivitätstests. Ein nanofaseriges, membranbasiertes 3D-Kokultursystem wird instrumentiert und für Hochdurchsatz-Screening-Studien zur Wirkstoffabsorption und zum Transport konzipiert.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt der Republik Korea (HR16C0001) finanziert wurde. das vom Bildungsministerium finanzierte Zuschuss zur Verbesserung der Forschungskapazität in der Grundlagenforschung durch das Korea Basic Science Institute (National Research Facilities and Equipment Center) (2019R1A6C1010003); und Zuschüsse der National Research Foundation of Korea (NRF), die von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert werden (2022R1A4A5032702).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05% Trypsin/EDTAWelgeneLS015-01
100x Penicilin/StreptomycinGibco10378016
20x PBSLPS-LösungCBP007A
4% ParaformaldehydBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 konjugierter ZO-1 AntikörperInvitrogen339194
Antikörper Verdünnungsmittel OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 Assay KitDonginbioCCK-3000
Zellkulturschale (150x20)SPL20151
CellTracker Grün CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Rot CMTPXInvitrogenC34552
ChloroformSamchunC0584
Konisches RohrSPL50050
DeckglasCorningCLS2980245
DMEM hoher GlukosegehaltWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Exsikkatorsockel mit Planflansch, SchraubgewindeDWK Life Sciences7.022 260
DURAN Exsikkatordeckel & Exsikkator aus Glas AbsperrhahnDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Absperrhahn, mit PTFE-SpindelDWK Life Sciences 
ElektrospinnmaschineNanoNCESR200RD
Ethylalkohol, PureSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Konfokales Fluoreszenz-Laser-Scanner-Modul K1-fluoNanoskop-Systeme
Gel/MountBiomeda Corp.M01
GlutaraldehydlösungSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Metalldüse 27GNanoNC
NagellackNatur Republik
Normales ZiegenserumVector LaboratoriesS-1000
OsmiumtetroxidSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Kunststoff Syringe_Lure Schloss (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poly(acrylsäure)Sigma Aldrich323667
Poly(vinylalkohol)Sigma Aldrich341584
PolycaprolactonSigma Aldrich440744
rein HCLDuksan1129
RasterelektronenmikroskopieSECSNE-4500M
ObjektträgerglasMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
Synergy H1 Multimode ReaderBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

Referenzen

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Three Dimensional CocultureEpithelial CellsNanofibrous MembranesElectrospinning TechniquePolyvinyl Alcohol MembranePolycaprolactone MembraneFibroblast CocultureParacrine SignalingConfocal MicroscopyScanning Electron Microscopy

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