Methodenartikel

Extraktion des Elastizitätsmoduls nativer pulmonaler Basalmembranen von Mäusen aus der Rasterkraftmikroskopie abgeleiteten Kraftkarten

DOI:

10.3791/67784

⸱

31. Januar 2025

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll visualisiert, wie Kryoschnitte von murinem Lungengewebe vorbereitet, Rasterkraftmikroskopie-Kraftkartenexperimente durchgeführt und die Daten analysiert werden, um den Elastizitätsmodul der nativen pulmonalen Basalmembran der Maus zu bestimmen.

Zusammenfassung

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Die Rasterkraftmikroskopie (Rasterkraftmikroskopie) ermöglicht die Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften einer Probe mit einer räumlichen Auflösung von mehreren Dutzend Nanometern. Da Säugetierzellen die Mechanismen ihrer unmittelbaren Mikroumgebung wahrnehmen und darauf reagieren, ist die Charakterisierung biomechanischer Eigenschaften von Geweben mit hoher räumlicher Auflösung entscheidend für das Verständnis verschiedener Entwicklungs-, homöostatischer und pathologischer Prozesse. Die Basalmembran (BM), eine etwa 100 - 400 nm dünne Substruktur der extrazellulären Matrix (ECM), spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression und Metastasenbildung. Obwohl die Bestimmung des Elastizitätsmoduls einer so dünnen EZM-Substruktur eine Herausforderung darstellt, liefern biomechanische Daten des BM grundlegende neue Erkenntnisse darüber, wie der BM das Zellverhalten beeinflusst, und bieten darüber hinaus wertvolles diagnostisches Potenzial. In dieser Arbeit stellen wir ein visualisiertes Protokoll zur Beurteilung der BM-Mechanik in murinem Lungengewebe vor, das eines der wichtigsten Organe ist, das anfällig für Metastasen ist. Wir beschreiben einen effizienten Arbeitsablauf zur Bestimmung des Young-Moduls des BM, der sich zwischen den Endothel- und Epithelzellschichten im Lungengewebe befindet. Die Schritt-für-Schritt-Anleitung umfasst das Einfrieren von murinem Lungengewebe, Kryosektionen und die Aufzeichnung von AFM-Kraftkarten in Gewebeschnitten. Darüber hinaus bieten wir ein halbautomatisches Datenanalyseverfahren mit der CANTER Processing Toolbox an, einer eigens entwickelten, benutzerfreundlichen AFM-Datenanalysesoftware. Dieses Tool ermöglicht das automatische Laden von aufgezeichneten Kraftkarten, die Umwandlung von Kraft-Piezo-Dehnungskurven in Kraft-Piezo-Dehnungskurven, die Berechnung von Young-Modulen und die Erstellung von Young-Modul-Maps. Schließlich wird gezeigt, wie die aus dem Lungen-BM abgeleiteten Elastizitätsmodulwerte mit Hilfe eines räumlichen Filterwerkzeugs bestimmt und isoliert werden können.

Einleitung

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AFM-Kraftkarten haben sich als eine weit verbreitete Technik zur Bestimmung der nanomechanischen Eigenschaften einer Vielzahl biologischer Proben mit einer räumlichen Auflösung im Nanometerbereich und einer Piconewton-Kraftempfindlichkeit von 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 herausgestellt . Bahnbrechende Forschungen zur Anwendung von AFM-Messungen auf biologische Proben unter physiologischen Bedingungen wurden von P. Hansma und Kollegen 13,14,15,16,17,18,19,20 durchgeführt. Anschließend wurden AFM-Kraftmessungen eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften einzelner Moleküle21, lebender Zellen und ihres Zytoskeletts 9,10,22,23,24,25,26, Gewebe und Gewebeabschnitte 6,8,11,27,28 zu beurteilen. 29,30,31 sowie biologische Hydrogele 3,4,32. In unserer Forschung haben wir AFM verwendet, um die mechanischen Eigenschaften biologischer und chemischer Bindungen zu untersuchen 18,33,34,35,36,37 und um die nanomechanischen Eigenschaften einzelner Zellen zu messen 38,39,40. Darüber hinaus zeigten Messungen des Wachstumsfugenknorpels8, dass die Kollagenarchitektur und der Elastizitätsmodul der extrazellulären Matrix (ECM) die Chondrozytenteilung und damit die Wachstumsrichtung der murinen Wachstumsfuge während der Embryonalentwicklung steuern. Darüber hinaus untersuchten wir die Veränderungen im Zusammenhang mit Knorpeldegeneration und Osteoarthritis im Gelenkknorpel 2,41,42,43,44,45,46,47.

In den letzten Jahren wurden in zahlreichen AFM-Untersuchungen die mechanischen Eigenschaften sowohl von gesundem als auch von pathologischem Lungengewebe untersucht 48,49,50,51,52. Diese Untersuchungen untersuchten jedoch in erster Linie die gesamte Gewebemechanik und konzentrierten sich nicht auf bestimmte Gewebekomponenten wie die BM. Die BM stellt eine dünne Schicht (100 nm - 400 nm beim Menschen) einer spezialisierten EZM-Struktur dar, die die meisten Organe und Gewebestrukturen von Säugetieren wie Neuronen, Muskeln, Adipozytengewebe und Blutgefäße auskleidet. Wir fanden heraus, dass die mechanischen Eigenschaften des murinen pulmonalen BM eine zentrale Rolle bei der Metastasenbildung spielen, so dass ein weicheres BM mit einer höheren Überlebenswahrscheinlichkeit bei Brust- und Nierenkrebspatientinnen korreliert53. Darüber hinaus zeigte diese Untersuchung, dass das sezernierte extrazelluläre Matrixprotein Netrin-4 den Young-Modul des BM durch eine stöchiometrische 1:1-Interaktion mit Laminin γ1 verringert, einer Schlüsselkomponente, die in fast allen Lamininnetzwerken in BMs40 vorhanden ist.

Hier präsentieren wir die Visualisierung unseres entwickelten Protokolls zur Bestimmung des Elastizitätsmoduls (EBM) des 100 - 200 nm dünnen murinen pulmonalen BM. Der Elastizitätsmodul des BM ist ein Maß für seine Steifigkeit und ist definiert als das Verhältnis der Spannung (Kraft pro Flächeneinheit) zu der resultierenden axialen Dehnung (Verschiebung) während einer linearen elastischen Verformung54, in diesem Fall einer kleinen Kompression des BM durch die eindrückende AFM-Spitze. In einem AFM-Experiment können die Kraft und die Verschiebung (Eindringtiefe) aus der Auslenkung des AFM und der Auslegerposition ermittelt werden, und der Elastizitätsmodul (die Spannungs-Dehnungs-Beziehung) kann aus der resultierenden Kraft-Dehnungs-Kurve extrahiert werden, indem ein geeignetes elastisches Modell verwendet wird, das die Geometrie der Eindringspitze berücksichtigt (in diesem Fall ein modifiziertes Hertz-Modell55). Die wichtigsten Schritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Methodik für die Vorbereitung und Einbettung von murinen Lungengewebeproben in eine OCT-Verbindung (siehe Schritt 1), wodurch das anschließende Kryosektionsverfahren (Schritt 2) erleichtert wird, das die Bestimmung der BM-Steifigkeit unter Verwendung von AFM-Kraftkarten ermöglicht. Die hier vorgestellte Kryosektionstechnik, bei der einseitiges und doppelseitiges Klebeband verwendet wird, ermöglicht das Schneiden von Lungengewebe ohne die Notwendigkeit einer Fixierung und ohne Auftauen des Schnitts. Das detaillierte AFM-Verfahren zur Erhebung geeigneter Daten zur Beurteilung der BM-Steifigkeit ist im dritten Abschnitt des Protokolls beschrieben. Im nächsten Abschnitt des Protokolls erläutern wir, wie die generierten Kraftvolumina mit Hilfe einer eigenentwickelten MATLAB-basierten Software, der CANTER Processing Toolbox56, automatisiert analysiert werden können (Schritt 4.1). In diesem Schritt wird der Elastizitätsmodul aus jeder aufgezeichneten Kraft-Eindring-Kurve extrahiert, indem ein modifiziertes Hertz-Modell angepasst wird, das für die Eindringkörpergeometrie korrigiert wird, in diesem Fall eine vierseitige Pyramide55. Schließlich beschreiben wir in den Schritten 4.2 und 4.3, wie das Spatial Filtering Tool und das R2 Filtering Tool der entwickelten Toolbox angewendet werden, um die für die Basalmembran (BM) spezifischen Young-Moduluswerte aus dem umfassenden Satz von Young-Moduluswerten zu extrahieren, die in der Kraftkarte erhalten wurden, die alle Gewebekompartimente der Alveolarwand enthält.

Protokoll

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Alle Verfahren für den Umgang mit Tierproben wurden vom Tierversuchsrat des dänischen Ministeriums für Umwelt und Ernährung (Zulassungsnummer 2017-15-0201-01265) gemäß dem dänischen Tierschutzgesetz genehmigt. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, verwendeten wir eine männliche C57BL/6-Maus im Alter von 13 Wochen.

ACHTUNG: Im folgenden Protokoll ist in mehreren Schritten der Umgang mit Gewebeproben erforderlich. Tragen Sie beim Umgang mit biologischen Proben immer geeignete Handschuhe und einen Laborkittel.

1. Vorbereitung der Probe

  1. Legen Sie eine frisch entnommene Mauslunge in eine Einweg-Basisform von 15 x 15 x 5 mm. Injizieren Sie unter Verwendung einer 10-ml-Spritze mit einer 0,9-mm-Nadel vorsichtig ein Verhältnis von 1:1 (Volumen zu Volumen) aus dem Medium mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) in die Probe, während Sie gleichzeitig die Nadel zurückziehen. Führen Sie die Injektion bei Raumtemperatur durch, während Sie die Probe mit einer kleinen chirurgischen Pinzette sicher halten. Die Injektion gilt als abgeschlossen, wenn die Probe anschwillt und eine auffällige Menge an Nässen beobachtet wird.
  2. Füllen Sie reines OCT in die Form, bis die Probe vollständig eingetaucht ist. Um ein vollständiges Einfrieren der gesamten Lunge zu gewährleisten, lagern Sie die Probe mindestens 4 h lang bei einer Temperatur von -80 °C.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe mindestens 2 Jahre bei -80 °C gelagert werden. Basierend auf den Herstellerangaben für das OCT beträgt die Lagerzeit von eingebettetem Gewebe über 10 Jahre. Es wird allgemein empfohlen, Proben, die länger als 4 Monate gelagert werden müssen, in eine transparente Folie einzuwickeln, um zu verhindern, dass Feuchtigkeit in die Probe eindringt.

2. Kryosektion einer eingebetteten Lungenprobe

  1. Regulieren Sie die Temperatur der Kryotomkammer auf -17 °C, da dies die optimale Schnitttemperatur für Lungengewebeproben ist. Stellen Sie die Temperatur der Schneidtischeinheit auf -22 °C ein, falls diese Funktion verfügbar ist. Dies dient dazu, sicherzustellen, dass die optimale Schnitttemperatur auf der Probenoberfläche während des gesamten Schnittprozesses aufrechterhalten wird.
  2. Bereiten Sie 40 Objektträger mit doppelseitigem Klebeband vor, das vorsichtig in der Mitte des Objektträgers platziert wird, bevor Sie ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen über das Klebeband rollen, um eine feste und blasenfreie Haftung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Länge des doppelseitigen Klebebandes in etwa der Breite des OCT-Blocks mit der Probe entspricht. Objektträger mit mattiertem Rand ermöglichen die Beschriftung mit einem Bleistift mit Probeninformationen und der Schnittnummer.
  3. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in eine Objektträgerbox ein. Stellen Sie anschließend die Box mit den Objektträgern in die Kryotomkammer, um sie zu kühlen.
    HINWEIS: Das Abkühlen der Objektträger verhindert das Auftreten eines Frost-Tau-Zyklus beim Aufnehmen der Schnitte, der die mechanischen Eigenschaften der Probe beeinträchtigen würde.
  4. Bereiten Sie mehrere einseitige Klebebänder vor, die jeweils ungefähr die gleiche Größe wie der gefrorene Probenblock haben.
  5. Füllen Sie die inneren beiden Ringe des Probenhalters mit OCT-Medium. Positionieren Sie die Probe innerhalb des OCT-Mediums auf dem Probenhalter und stellen Sie sicher, dass er so waagerecht wie möglich ist. Stellen Sie anschließend den Probenhalter für ca. 10 min in die Kryotomkammer, bis das OCT-Medium vollständig erstarrt ist und die Probe fest mit dem Halter verbunden ist.
  6. Setzen Sie den Halter mit der Probe auf die Schneidtischeinheit des Kryotoms. Stellen Sie alle wesentlichen Komponenten des Kryotoms, wie z. B. die Neigung des Schneidtisches und die Position der Klinge, gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts ein, um eine Schnittebene zu erstellen, die parallel zur Oberfläche des OCT-Blocks ausgerichtet ist.
  7. Nehmen Sie das anfängliche Trimmen der Probe vor, indem Sie die Schnittdicke auf 50 μm einstellen, und beginnen Sie mit dem Schneiden, bis die gewünschte Stelle innerhalb der Probe erreicht ist (in der Regel etwa 500 μm innerhalb der Lungenprobe von ihrer Oberfläche) für die Entnahme von Gewebeobjektträgern. Stellen Sie die Schnittstärke des Kryotoms auf 15 μm ein, was der gewünschten Dicke der Gewebeschnitte entspricht.
    VORSICHT: Bei der Verwendung eines Schneidinstruments, wie z. B. eines Kryotoms, ist Vorsicht geboten. Um die persönliche Sicherheit zu gewährleisten, halten Sie sich an die Sicherheitsrichtlinien des Herstellers und halten Sie die Finger von der Klinge fern.
  8. Befestigen Sie ein Stück einseitiges Klebeband an der Probe, indem Sie mit dem Daumen festen Druck ausüben. Stellen Sie vorher sicher, dass der Daumen gekühlt wurde, indem Sie ihn einige Sekunden lang gegen die Kammerwand des Kryotoms halten.
    HINWEIS: Das Klebeband sollte fest auf die Probe aufgebracht werden, da eine mangelnde Haftung dazu führen kann, dass sich das Klebeband während des Schnitts vom Gewebe löst.
  9. Erstellen Sie einen 15 μm großen Gewebeschnitt mit dem Kryotom. Verwenden Sie eine Bürste, um den Schnitt zu lenken und zu verhindern, dass sich das Klebeband während des Schneidvorgangs von der Probe löst. Für eine glatte Oberfläche des Gewebeschnitts ist es unerlässlich, dass das Schnitttempo langsam und gleichmäßig bleibt.
  10. Der im vorherigen Schritt erstellte Abschnitt liegt nun flach auf dem Klingenblock auf, wobei das Band nach oben zeigt. Verwenden Sie einen der gekühlten Objektträger mit dem doppelseitigen Klebeband aus der Objektträgerbox und drücken Sie es fest auf den Schnitt, um ihn aufzunehmen. Legen Sie dann den Objektträger, der nun den Schnitt trägt, wieder in die Objektträgerbox.
    HINWEIS: Achten Sie beim Umgang mit dem Objektträger und dem Schnitt darauf, dass sie sich immer in der Kryotomkammer befinden, um zu verhindern, dass der Schnitt während des Schneidvorgangs auftaut.
  11. Wiederholen Sie die vorherigen drei Schritte, bis die erforderliche Anzahl von Abschnitten, d. h. 40, gesammelt wurde.
  12. Wenn Sie fertig sind, setzen Sie den Deckel auf die Objektträgerbox und geben Sie ihn auf Trockeneis in einen -20 °C heißen Gefrierschrank. Reinigen Sie abschließend das Kryotom, indem Sie alle verwendeten Gegenstände desinfizieren und das UV-Licht in der Kryotomkammer einschalten.
    HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden. Lagern Sie die Proben bei einer Temperatur von -20 °C, bis die AFM-Messungen durchgeführt werden. Die empfohlene Lagerzeit für die Schnitte und das OCT-Medium sollte 6 Wochen nicht überschreiten. Nach Ablauf dieses Zeitraums können die Schnitte und das OCT-Medium aufgrund ihrer beträchtlichen Oberfläche und ihrer Neigung zur Feuchtigkeitsaufnahme Veränderungen aufweisen, die einem Gefrierbrand ähneln.

3. AFM-Kraftkarten eines Lungenschnitts

HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden der JPK NanoWizard 4XP (AFM) und der motorisierte Tisch von Bruker in Kombination mit dem DMi8 (inverses optisches Mikroskop) von Leica verwendet, um die Kraft-Weg-Kurven der Lungenschnitte aufzuzeichnen.

  1. Einrichten des AFM
    1. Schalten Sie alle benötigten Geräte des AFM-Setups ein (z.B. Computer, AFM-Controller, Schwingungsisolationstab, optisches Mikroskop, etc.).
    2. Starten Sie die AFM-Steuerungssoftware. Wählen Sie in der Übersicht Experiment auswählen den Modus QI Advanced Imaging aus. Geben Sie außerdem den Speicherort an, an dem die Experimentdaten und Kalibrierungsdateien gespeichert werden sollen.
      HINWEIS: Wenn Sie nicht über die QI Advanced Imaging-Erweiterung verfügen, verwenden Sie den Force Mapping-Modus im Kontaktmodus als alternative Option.
    3. Wählen Sie einen Ausleger mit einer geeigneten Federkonstante für die jeweilige Art der zu beobachtenden Probe. Für die weichen Lungengewebeproben wird der MLCT Cantilever F von Bruker mit pyramidenförmiger Spitze und einer nominalen Federkonstante von 0,6 N/m empfohlen. Wenn ein Chip mehrere Ausleger enthält (z. B. die MLCT), entfernen Sie alle längeren Ausleger vom Chip mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass nur der Ausleger, der für die Messung verwendet wird, mit der Probe in Kontakt kommt.
      HINWEIS: Andere Ausleger, die mit der Probe in Berührung kommen, als der für die Messung verwendete, können während des Experiments zu unerwünschten Bewegungen der Probe oder sogar zu einer Ablösung der Probe vom darunter liegenden Band führen.
      ACHTUNG: Vermeiden Sie es, im aktuellen oder nachfolgenden Schritt mit der Pinzette mit dem zur Messung verwendeten Ausleger in Berührung zu kommen.
    4. Nehmen Sie den Einbau des Chips auf den Auslegerhalter vor. Setzen Sie den Halter in den AFM-Kopf ein. Positionieren Sie den AFM-Kopf auf dem Probentisch, der sich auf dem inversen optischen Mikroskop befindet. Richten Sie den optischen Hebelweg wie in der Bedienungsanleitung beschrieben aus. Die korrekte Ausrichtung des optischen Hebelgangs wird erreicht, wenn der Laserstrahl zunächst am vorderen Ende des Messauslegers platziert wird und anschließend der reflektierte Laserstrahl auf die Mitte der segmentierten Fotodiode trifft.
  2. Cantilever-Kalibrierung mit der Methode des thermischen Rauschens57
    HINWEIS: Die Kalibrierung des Auslegers umfasst die Bestimmung der Empfindlichkeit des invertierten optischen Hebels (InvOLS) und der Federkonstante. Die individuelle Kalibrierung jedes verwendeten Auslegers ist notwendig, da die für Ausleger übliche Nennfederkonstante in der Regel nur eine grobe Näherung darstellt. In Experimenten, bei denen die mechanischen Eigenschaften einer Probe aus aufgezeichneten Kraftkurven bestimmt werden, wie z. B. der in diesem Protokoll beschriebene, ist es unerlässlich, das InvOLS direkt durch eine kontaktbasierte Methode auf einem starren Substrat zu bestimmen. Alternative Methoden zur Bestimmung des InvOLS, wie z.B. die Ableitung aus der Geometrie des Auslegers, können nur eine grobe Annäherung liefern und sind für die hier beschriebene Art von Anwendung nicht geeignet. Werden alternativ Ausleger verwendet, bei denen der Lieferant die exakte Federkonstante angibt, kann die InvOLS durch ein von Schiller et al. beschriebenes Verfahren bestimmt werden.58.
    1. Platzieren Sie einen Objektträger auf dem Probentisch des AFM. Der Objektträger dient als starres Substrat für die berührungslose Bestimmung des InvOLS.
    2. Nachdem Sie den AFM-Kopf auf den Probentisch gesetzt haben, senken Sie den Kopf mit Hilfe der Schrittmotoren ab, bis der verbleibende Spalt zwischen dem Auslegerhalter und dem Objektträger nur noch ca. 1 - 2 mm beträgt. Tragen Sie PBS mit einer 1-ml-Spritze mit einer langen Nadel (0,9 mm x 70 mm) seitlich auf den Cantilever-Halter auf, so dass es nach unten fließen und einen Flüssigkeitsmeniskus im Spalt zwischen dem Halter und dem Objektträger bildet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die gleiche Flüssigkeit, wie z. B. Puffer oder Medium, die für die Kraftvolumenmessungen der Probe verwendet wird, auch für den Kalibrierungsprozess verwendet wird.
    3. Um eine kontaktbasierte Kalibrierung in der Software durchzuführen, navigieren Sie zur Seite "Daten erfassen " und wählen Sie die Option "Erweiterte Ansicht " aus. Greifen Sie auf den Kalibrierungsmanager zu, indem Sie die Schaltfläche "Burger-Menü" in der oberen rechten Ecke verwenden. Wählen Sie in dieser Schnittstelle Kontaktbasiert als Methode aus, und wählen Sie im Dropdown-Menü den Cantilever-Namen MLCT F als Cantilever-Namen aus. Stellen Sie zusätzlich in den entsprechenden Eingabefeldern den Sollwert auf 1 V und die Anzahl der Scans auf 10 ein.
    4. Geben Sie auf der Seite "Daten erfassen " im linken Bedienfeld einen Sollwert von 1 V für das automatische Annäherungsverfahren ein. Klicken Sie auf die blaue Schaltfläche mit dem nach unten zeigenden Pfeil in der oberen linken Ecke der Benutzeroberfläche, um den automatischen Ansatz zu starten. Wenn der Ansatz abgeschlossen ist und der Cantilever mit dem Objektträger in Kontakt kommt, klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrieren im Fenster des Kalibrierungs-Managers .
      HINWEIS: Die InvOLS- und die Cantilever-Federkonstante werden dann beide automatisch durch Aufzeichnung von 10 Kraftkurven sowie der thermischen Leistungsspektraldichte (PSD) bestimmt, die zur Bestimmung der Federkonstante mit der thermischen Rauschmethode57 verwendet wird. Nachdem der automatische Kalibrierungsvorgang abgeschlossen ist, überprüfen Sie visuell, ob die angepasste Kurve den Normalmodus (erste Spitze) der aufgezeichneten PSD des Cantilevers korrekt beschreibt und dass die ermittelte Federkonstante die gleiche Größenordnung hat wie die vom Hersteller des Cantilevers angegebene nominale Federkonstante. Ist dies nicht der Fall, muss der Anpassungsbereich manuell angepasst werden, um sicherzustellen, dass die Anpassung mit dem ersten Peak des thermischen Leistungsspektrums konvergiert und diesen darstellt.
    5. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, schließen Sie das Fenster des Kalibrierungs-Managers . Nach dem Schließen des Calibration Managers wird eine Kalibrierdatei (*.tnd ascii-Datei) im vorgewählten Verzeichnis (siehe Schritt 3.1.2) erzeugt, die die ermittelten Kalibrierergebnisse enthält, die später für die Datenanalyse benötigt werden. Dokumentieren Sie die Kalibrierwerte für die spätere Bezugnahme während des Datenanalyseprozesses, z. B. im Labornotizbuch.
      ACHTUNG: Verzichten Sie ab diesem Schritt darauf, die Laserposition am Ausleger zu verändern, den Spiegel im AFM-Kopf zu verstellen oder den Auslegerhalter neu zu platzieren. Das Ändern dieser Elemente wirkt sich auf das InvOLS aus und macht die Kalibrierungswerte ungültig. Um die thermische Drift zu kompensieren, passen Sie die Position der segmentierten Fotodiode des AFM-Kopfes an.
  3. Analyse einer Alveolarwand an einem Lungenschnitt
    1. Nehmen Sie den Objektträger zur Auswertung aus dem Gefrierschrank. Lassen Sie die Probe etwa 1 Minute lang bei Raumtemperatur auftauen, bis das gesamte OCT-Medium klar geworden ist. Geben Sie anschließend einige Tröpfchen PBS in den Lungengewebeabschnitt, um ihn zu rehydrieren.
    2. Legen Sie den Objektträger mit dem Lungengewebeschnitt auf den Probentisch. Setzen Sie den AFM-Kopf wieder auf den Probentisch und senken Sie den Kopf ab, bis sich der Ausleger etwa 1 mm über der Probe befindet. Geben Sie mit einer 1 ml-Spritze in Kombination mit einer 0,9 mm x 70 mm Nadel etwas zusätzliches PBS an die Seite des Cantileverhalters, bis sich ein flüssiger Meniskus zwischen dem Gewebeabschnitt und dem Cantileverhalter bildet.
    3. Navigieren Sie zum Einstellungsmanager , indem Sie auf die Schaltfläche Mit dem Schraubenschlüsselsymbol in der oberen rechten Ecke der Benutzeroberfläche klicken. Passen Sie im Einstellungsmanager die folgenden allgemeinen Einstellungen an. Stellen Sie im Abschnitt Anflugeinstellungen die Zielhöhe auf 4 μm ein. Fahren Sie dann im Abschnitt "Einstellungen für den aktuellen Modus " mit den erweiterten Feedback-Einstellungen fort und setzen Sie den Multiplikator auf 1. Wählen Sie abschließend im Unterabschnitt "Force-Einstellungen ", der sich ebenfalls im Abschnitt "Aktuelle Modus-Einstellungen " befindet, die Option "Zurückgezogener Piezo " aus dem Dropdown-Menü "Modus am Ende ".
    4. Verwenden Sie das inverse optische Mikroskop, um eine intakte Alveolarwand zu identifizieren und zu ihr zu navigieren. Eine intakte Wand zeichnet sich im Hellfeldbild durch dunkle und glatte Ränder aus. (siehe Abbildung 2A-B).
      HINWEIS: Das Importieren des Hellfeldbildes in die AFM-Steuerungssoftware, sofern verfügbar, kann dabei hilfreich sein, den Ausleger zu einer bestimmten Alveolarwand zu navigieren und eine Kraft- oder QI-Karte darüber genau zu erfassen. In der JPK SPM-Software wird diese Funktion als Direct Overlay bezeichnet.
    5. Stellen Sie die Parameter für die Kraft-Eindring-Kurven im linken Bedienfeld basierend auf dem verwendeten AFM, dem verwendeten Ausleger und der beobachteten Probe ein. Für den NanoWizard 4XP und den MLCT Cantilever F von Bruker empfehlen wir folgende Parameter: Sollwert = 5 nN; z-Länge = 8 μm; Z-Geschwindigkeit = 300 μm/s.
      HINWEIS: Die empfohlene z-Länge von 8 μm ist ziemlich groß. Dies wird auf die Eigenschaften des Lungengewebes zurückgeführt. Da Lungengewebe in der Regel recht weich ist, kann die Eindringtiefe an bestimmten Stellen bis zu 4 μm erreichen, selbst bei einem relativ bescheidenen Sollwert von 5 nN. Um zu gewährleisten, dass die Basislinie, bei der die Spitze nicht mit der Probe in Berührung kommt, mindestens etwa die Hälfte der Kraft-Eindruck-Kurve ausmacht, wird empfohlen, die Gesamtlänge der Kurve auf 8 μm einzustellen. Dadurch wird die spätere Kurvenanalyse deutlich vereinfacht. Für andere Bio-AFM sollten diese Parameter ebenfalls anwendbar sein, obwohl die Nomenklatur für bestimmte Parameter, wie z. B. den Sollwert, der die maximale Eindringkraft bestimmt, von Hersteller zu Hersteller variieren kann. Wenn das AFM-System nicht in der Lage ist, die hier angegebene hohe Vertikalgeschwindigkeit zu erreichen, ist es notwendig, die z-Geschwindigkeit gemäß der Empfehlung Ihres AFM-Herstellers zu verringern.
      ACHTUNG: Um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, ist es unerlässlich, über alle Experimente hinweg identische z-Annäherungsgeschwindigkeiten zu verwenden.
    6. Legen Sie die Position und Größe der anfänglichen Übersichtskraftkarte fest, und stellen Sie sicher, dass sie die gesamte Alveolarwand umfasst, die sich von einer Luftseite zur anderen erstreckt. Für murine Lungengewebeproben ist in der Regel eine Größe zwischen 20 μm x 20 μm und 30 μm x 30 μm ausreichend. Unabhängig von der spezifischen Größe der Karte legen Sie die Anzahl der Pixel (die der Anzahl der aufgezeichneten Kraftkurven entspricht) auf 50 x 50 fest. Dies führt zur Generierung von 2.500 Kraft-Eindringkurven für jedes Kennfeld, was die notwendige Auflösung zur Identifizierung des BM im Neigungskanal des Kraftkennfelds liefert. (siehe Abbildung 2C-D).
    7. Untersuchen Sie nach der Aufnahme der Übersichtskarte den Höhen- und Neigungskanal der Kraftkarte. Wenn der Höhenkanal anzeigt, dass die Alveolarwand intakt ist (siehe Abbildung 2D) und wenn es möglich ist, den BM im Hangkanal als klar definierte helle Linie (siehe Abbildung 2C,E) zwischen zwei Schichten des Epithels und des Endothels zu unterscheiden, nehmen Sie eine fokussiertere Kraftkarte mit einer Größe von 3 μm x 3 μm oder 4 μm x 4 μm auf dem BM auf. Halten Sie die Pixel bei 50 x 50 Kurven.
      HINWEIS: Dieses Verfahren führt zu einer höheren Kartenauflösung und ermöglicht die Aufzeichnung einer größeren Anzahl von Young-Modul-Werten, insbesondere für den BM (siehe Abbildung 2E-F). Darüber hinaus ermöglicht dies eine genauere Unterscheidung zwischen dem BM und dem umgebenden Gewebe, was die Präzision des anschließenden räumlichen Filterprozesses erhöht. Wenn die Kanäle der Übersichtskarte eine kollabierte oder gerissene Wand zeigen, Artefakte, die darauf zurückzuführen sind, dass der Cantilever, der die Probe nicht nur mit der Spitze berührt, oder kein identifizierbarer BM im Schrägkanal, navigieren Sie zu einer anderen Wand auf dem Gewebeschnitt, bis eine Wand mit einer artefaktfreien Beurteilung des BM identifiziert werden kann.
      Die vorangegangenen Schritte (3.3.6 und 3.3.7) werden an weiteren Schnitten derselben Lungenprobe wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von Alveolarwänden bestimmt wurde. Für jede Lungenprobe werden mindestens vier Wände empfohlen, um robuste Ergebnisse zu erzielen59.
    8. Sobald die Messung abgeschlossen ist, reinigen Sie alle Geräte und Materialien, die mit der Probe und PBS in Kontakt gekommen sind. Wenn die Probe nicht mehr benötigt wird, entsorgen Sie sie in einem autoklavierbaren Abfallbehälter aus Glas. Speichern Sie alle aufgezeichneten Daten und fahren Sie die AFM-Steuerungssoftware und den Computer herunter. Schalten Sie schließlich alle elektrischen Geräte aus, die verwendet wurden.
      HINWEIS: An dieser Stelle kann das Protokoll pausiert werden. Die experimentellen Daten werden gespeichert und können zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden.

4. Datenanalyse

  1. Analyse von Kraft-Eindring-Kurven
    HINWEIS: Ein ausführliches Handbuch der Anwendung Force Curve Analysis finden Sie hier: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis.
    1. Starten Sie die CANTER Processing Toolbox56 in MATLAB und öffnen Sie die Anwendung Force Curve Analysis .
      HINWEIS: Die Toolbox kann aus dem GitHub-Repository heruntergeladen werden, indem Sie diesem Link folgen: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. Die README.md Datei, die eine umfassende Anleitung zur Installation der Software und zur Initiierung mit MATLAB enthält, ist im GitHub-Repository verfügbar. Weitere Informationen zu den einzelnen in der Toolbox enthaltenen Anwendungen finden Sie im entsprechenden Wiki unter https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki.
    2. Laden Sie das hochauflösende Kraftkennfeld (3 μm x 3 μm oder 4 μm x 4 μm), indem Sie auf die Schaltfläche Datei auswählen klicken, zu dem Speicherort navigieren, an dem das Kraftmodul gespeichert ist, darauf doppelklicken und dann auf der Benutzeroberfläche der Anwendung auf die Schaltfläche Daten laden klicken.
    3. Es erscheint ein Popup-Fenster, in dem die Kalibrierwerte (InvOLS und Federkonstante) angefordert werden, die (siehe Schritt 3.2) für den Cantilever, mit dem die im vorherigen Protokollschritt ausgewählte Kraftkarte aufgezeichnet wurde, ermittelt wurden. Geben Sie die Kalibrierwerte in die entsprechenden Eingabefelder ein. Wenn sie in Schritt 3.2.4 nicht dokumentiert wurden, beziehen Sie sich auf die automatisch generierte Kalibrierdatei, die auch die Kalibrierwerte enthält. Behalten Sie die Standardoption ja für die Frage bei, ob der Tip-Sample-Abstand berechnet werden soll. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Senden , um fortzufahren.
    4. Es erscheint ein zweites Popup-Fenster, in dem Sie die Eindringkörpergeometrie und das Poisson-Verhältnis für die eingerückte Probe auswählen können. Wählen Sie für die verwendeten MLCT-Ausleger als Spitzengeometrie Vierseitige Pyramide und geben Sie 17,5° für den halben Winkel zur Kante ein (beides sind die Standardwerte). Verwenden Sie das standardmäßige Poisson-Verhältnis von 0,5, das ein inkompressibles Material darstellt. Um mit dem Ladevorgang der QI-Karte fortzufahren, klicken Sie auf die Schaltfläche Senden .
      HINWEIS: Während des Belastungsvorgangs werden die aufgezeichneten Durchbiegungs-Weg-Kurven (Rohdaten des AFM) auf der Grundlage der bereitgestellten Kalibrierwerte in Kraft-Eindring-Kurven umgewandelt. Für ein umfassendes Verständnis der einzelnen Transformationsschritte und der zugehörigen Gleichungen verweisen wir auf die ergänzenden Informationen von Hartmann et al.59.
    5. Nach Abschluss des Ladevorgangs wird der anfängliche Kraftverlauf des Kraftkennfelds auf dem Bildschirm angezeigt. Stellen Sie sicher, dass der Grundlinienkorrekturmodus Versatz + Neigung ausgewählt ist. Dieser Modus erkennt automatisch die Grundlinie der Kraft-Induktions-Kurve und korrigiert die Neigung und den vertikalen Versatz auf Null. Wählen Sie zusätzlich als Algorithmus für den Kontaktpunktfinder über Hertz-Modell aus und verwenden Sie für diese Option einen Wert von 20% im dafür vorgesehenen Eingabefeld. Dieser Algorithmus eignet sich besonders gut für die Detektion des Kontaktpunkts in Kraft-Eindruck-Kurven, die an Weichteilproben aufgezeichnet wurden. Zuletzt stellen Sie die Passungstiefe im entsprechenden Eingabefeld auf 1,5 μm ein.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Steifigkeit des Objektträgers den resultierenden Elastizitätsmodul nicht beeinflusst, wird empfohlen, die maximale Passungstiefe auf einen Wert einzustellen, der nicht mehr als 10 % der Gewebeschnittdicke60 beträgt. Für weitere Details zu den Korrekturalgorithmen siehe die ergänzenden Informationen von Hartmann et al.59.
      ACHTUNG: Verwenden Sie in allen Experimenten die gleiche Passtiefe, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse vergleichbar sind.
    6. Um die Anpassung des modifizierten Hertz-Modells auf alle Kraft-Eindring-Kurven der QI-Karte anzuwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Beibehalten und auf alle anwenden . Es öffnet sich ein Dialogfenster, in dem Sie gefragt werden, ob die einzelnen Kraftkennlinien während der Analyse angezeigt werden sollen. Durch die Nichtanzeige der Kurven wird die Verarbeitungsgeschwindigkeit leicht beschleunigt.
    7. Nach Abschluss der letzten Kraftverlaufsanalyse erscheint ein Fenster, in dem Sie gefragt werden, ob die Passungsergebnisse gespeichert werden sollen. Um die Ergebnisse in beiden zu speichern. tsv (tabulatorgetrennte Werte) und .xlsx (Excel) Dateiformate, klicken Sie auf Ja und geben Sie einen Namen für die Ergebnisdateien ein. Darüber hinaus wird eine Textdatei mit der Dateiendung *.meta_data gespeichert, die alle Details zur Analyse der Kurven enthält, wie z. B. die verwendeten Kalibrierwerte, das gewählte Passungsmodell, den ausgewählten Kontaktpunkterkennungsalgorithmus, den Passungsbereich und andere relevante Informationen.
    8. Schließen Sie die Anwendung Kraftkurvenanalyse , indem Sie auf das Kreuzsymbol in der oberen rechten Ecke des Hauptfensters klicken.
  2. Räumliche Filterung von QI-Kartenergebnissen
    HINWEIS: Der Schritt der räumlichen Filterung stellt sicher, dass nur die Young-Modulwerte der QI-Karten, die aus dem BM stammen, für die weitere Analyse berücksichtigt werden. Eine ausführliche Anleitung für das Result Filtering Tool finden Sie hier: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool.
    1. Wählen Sie das Tool zur Ergebnisfilterung aus der Liste der Anwendungen im Anwendungsauswahlfenster der CANTER Processing Toolbox aus und starten Sie die Anwendung, indem Sie auf die Schaltfläche Anwendung starten klicken.
    2. Um die Anpassungsergebnisse zu laden, klicken Sie in der oberen Menüleiste der Benutzeroberfläche des Ergebnisfilterwerkzeugs auf Öffnen. Suchen Sie im folgenden Popup-Fenster die erste Schaltfläche Set auf der Registerkarte JPK Maps und wählen Sie die .tsv-Datei aus, die die Ergebnisse der Kraftkurvenanalyse enthält (siehe Schritt 4.1.6). Klicken Sie auf die zweite Schaltfläche Festlegen und suchen Sie die QI-Map-Datei, die der bereits ausgewählten .tsv-Datei entspricht. Klicken Sie anschließend auf Senden, um die Kartendaten und die Ergebnisse der Kraftkurvenanalyse zu laden.
    3. Wählen Sie die Option Emodul aus dem oberen Dropdown-Menü Angezeigter Kanal , um die erhaltenen Ergebnisse des Elastizitätsmoduls als Kartenbild anzuzeigen. Wählen Sie außerdem die Option Emodul (falls noch nicht ausgewählt) aus dem Dropdown-Menü Datenkanal aus, das sich unter dem Histogrammdiagramm befindet, um die Verteilung der geladenen Young-Moduluswerte der QI-Karte zu visualisieren.
    4. Klicken Sie auf die Pfeilschaltfläche Manipulationsfluss , die sich in der Mitte der Benutzeroberfläche befindet, und stellen Sie sicher, dass sie auf die rechte Seite zeigt. Stellen Sie die Umschaltschaltfläche für den Bildfilter im Filterpanel über den Histogrammachsen auf Ein . Wählen Sie die Option Freihand aus dem Dropdown-Menü Geometrie filtern und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen .
    5. Zeichnen Sie im oberen Kanalbild die Filtermaske, indem Sie den BM kreisen, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Das BM ist in der Elastizitätsmodulkarte als helle Struktur (hohe Elastizitätsmodulwerte) im Vergleich zum benachbarten Weichgewebe erkennbar (siehe Abbildung 3A). Wenn Sie mit dem Zeichnen der Maske fertig sind, lassen Sie die linke Maustaste los und doppelklicken Sie auf die Maske, die auf die Karte angewendet werden soll. Das Histogrammdiagramm auf der rechten Seite zeigt jetzt nur noch die Elastizitätsmodulwerte für die Kartenregionen, die grün hervorgehoben sind (die Standardfarbe; siehe Abbildung 3C-D).
    6. Um eine neue .tsv-Ergebnisdatei zu erstellen, die nur die maskierten Young-Moduluswerte enthält, klicken Sie in der oberen Menüleiste der Benutzeroberfläche auf Speichern > Histogramm speichern > Daten speichern. Alternativ können Sie mit der rechten Maustaste auf einen leeren Bereich der Histogramm-Plot-Achsen klicken und im Kontextmenü Daten speichern auswählen.
    7. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Alle auswählen , in dem Sie gefragt werden, welche Ergebnisse in die TSV-Datei geschrieben werden sollen. Bestätigen Sie anschließend die Auswahl mit einem Klick auf die Schaltfläche OK . Geben Sie anschließend im Speicherdialog einen Namen für die .tsv-Datei ein, wählen Sie den gewünschten Speicherort aus und klicken Sie schließlich auf OK , um die gefilterten Ergebnisse zu speichern.
    8. Schließen Sie das Ergebnisfilter-Tool , indem Sie auf das Kreuz-Symbol in der oberen rechten Ecke der Anwendung klicken.
  3. R2 Filterung der Ergebnisse
    HINWEIS: Dieser Protokollschritt stellt sicher, dass nur die Ergebnisse des Elastizitätsmoduls berücksichtigt werden, bei denen das modifizierte Hertz-Modell eine gute Übereinstimmung mit der Kraft-Eindring-Kurve zeigte, an die es angepasst wurde. Eine ausführliche Anleitung für das R² Filtering Tool finden Sie hier: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool.
    1. Starten Sie das R² Filtering Tool , indem Sie es in der Liste der Anwendungen des Anwendungsauswahlfensters der CANTER Processing Toolbox auswählen und auf Anwendung starten klicken.
    2. Navigieren Sie zur oberen Menüleiste der Benutzeroberfläche und klicken Sie auf .tsv-Datei öffnen. Suchen Sie im folgenden Dialogfeld zum Laden der Datei die .tsv-Datei mit den Elastizitätsmodulergebnissen des BM, die im vorherigen Schritt 4.2.5 gespeichert wurden, und wählen Sie sie durch Doppelklicken aus.
    3. Es wird ein Dialogfeld mit einer Liste der Datenspalten angezeigt, die in der TSV-Datei enthalten sind. Wählen Sie Emodul als Spalte aus, die die Elastizitätsmoduldaten enthält. Wählen Sie anschließend in einem separaten Listbox-Dialog, in dem die R²-Daten angefordert werden, rsquare_fit. Ist der Ladevorgang abgeschlossen, werden die geladenen Elastizitätsmoduldaten in Form eines Histogramms oben links auf dem Bildschirm angezeigt, während die R²-Datenverteilung in der Grafik oben rechts dargestellt wird.
    4. Geben Sie 0,96 in das Eingabefeld ein, das sich in der Mitte der grafischen Benutzeroberfläche befindet. Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten filtern , um den R²-Filter mit dem eingegebenen Wert anzuwenden. Bei dieser Aktion werden nur die Ergebnisse beibehalten, die einen R²-Wert von 0,96 oder höher aufweisen. Die gefilterten Verteilungen der Ergebnisse des Elastizitätsmoduls und der entsprechenden R²-Werte werden in der unteren Hälfte der Benutzeroberfläche angezeigt.
    5. Wählen Sie in der oberen Menüleiste die Option Gefilterte Daten speichern aus, um eine neue TSV-Datei zu erstellen, die nur die Ergebnisse enthält, die das definierte R²-Filterkriterium von > 0,96 erfüllen. Die gespeicherten Daten können nun als Histogramm dargestellt werden, z. B. mit dem Histogram Plotting Tool, das die Elastizitätsmodulverteilung für die sondierte Lungen-BM visualisiert (siehe Abbildung 4A).

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nach der Identifizierung und Messung einer intakten Alveolarwand ist das primäre Ergebnis dieses Protokolls die gefilterten Elastizitätsmodulwerte des BM. Es ist wichtig zu beachten, dass es nicht in jedem Gewebeschnitt möglich ist, eine geeignete Alveolarwand für die AFM-Messung zu finden. In unseren experimentellen Beobachtungen wiesen ca. 75% der Kryoschnitte aus murinen Lungenproben eine quantifizierbare Alveolarwand auf. Um die räumliche Verteilung des Elastizitätsmoduls in einem pulmonalen BM genau zu bestimmen, empfehlen wir, Kraftkarten zu verwenden, die entweder 3 μm x 3 μm oder 4 μm x 4 μm umfassen. Dieser Ansatz gewährleistet eine ausreichende Auflösung für die Untersuchung von Lungen-BMs von Mäusen, die typischerweise eine Dicke von 100 nm bis 200 nm haben. Daher werden beim experimentellen Ansatz 50 x 50 Kraftkurven für jede Kraftkarte erfasst, was insgesamt 2.500 Kraftkurven ergibt. Innerhalb der Kraftkarte sind die Kraftkurven gleichmäßig verteilt. Dies impliziert, dass neben dem Young-Modul des BM auch die Gewebestrukturen, die den BM umgeben, auch in den kleinen Kraftkarten untersucht werden. Um den Elastizitätsmodul ausschließlich des pulmonalen BM genau und selektiv zu bestimmen, haben wir daher in diesem Protokoll einen zweistufigen Filterprozess implementiert.

Der erste Filterschritt der bedienerabhängigen räumlichen Filterung wählt die Ergebnisse der Kraftkurvenanpassung aus, die aus dem murinen Lungen-BM stammen und etwa 10 % bis 25 % der Gesamtergebniswerte ausmachen, die in der analysierten Kraftkarte enthalten sind. Nach dieser anfänglichen räumlichen Filterung werden ca. 250 bis 625 Anpassungsergebnisse für die weitere Analyse beibehalten. Der nächste Filterschritt stellt sicher, dass nur die BM-bezogenen Ergebnisse einbezogen werden, die aus Kraftkurven stammen, die durch das modifizierte Hertz-Modell angemessen beschrieben wurden. Daher wird das Bestimmtheitsmaß (R2) der modifizierten Hertz-Modellanpassung als Filterkriterium verwendet. Unsere empirischen Erfahrungen deuten darauf hin, dass die Beibehaltung von Ergebnissen mitR2-Werten über 0,96 für Fit-Ergebnisse geeignet ist, die durch die Einhaltung dieses Protokolls erzielt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass derR2-Wert maßgeblich von der Qualität (Glätte) und Länge der Basislinie des Kraftverlaufs, der Bestimmung des Kontaktpunktes und der Konvergenz des angepassten Modells beeinflusst wird. Nach Anwendung beider Filterverfahren verbleiben typischerweise etwa 100 bis 500 Elastizitätsmodulwerte für die BM einer einzelnen Alveolarwand.

Die Verteilung dieser verbleibenden Elastizitätsmodulwerte aus dem BM kann mit Hilfe eines Histogramms visualisiert werden (Abbildung 4A). Es ist wichtig zu beachten, dass die resultierenden Elastizitätsmodulwerte des pulmonalen BM einer logarithmischen Normalverteilung folgen, die häufig bei Zufallsvariablen beobachtet wird, die nur positive Werte61 erreichen können. Dies wird durch das QQ-Diagramm in Abbildung 4B visualisiert. Folglich kann eine Normalverteilung (Gaußsche Verteilung) an die Verteilung der logarithmisch transformierten Werte des Elastizitätsmoduls (E) angepasst werden. Hier wurde der natürliche Logarithmus (ln) verwendet, um die E-Werte zu transformieren. Die Spitzenposition der Verteilung (μ) und der Standardabweichung (σ) wurde aus dieser Anpassung extrahiert und anschließend erneut transformiert, um den repräsentativen Elastizitätsmodul zu erhalten, der als EBM bezeichnet wird, wobei die folgende Gleichung verwendet wurde:

figure-results-1

Beachten Sie, dass das Standardabweichungsintervall nach der Retransformation nicht mehr symmetrisch um den Spitzenwert ist. Die negativen (σ-) und positiven (σ+) Kanten des Standardabweichungsintervalls können mit den folgenden Ausdrücken berechnet werden:

figure-results-2

figure-results-3

Diese Gleichungen sind eine Folge der Tatsache, dass die Exponentialfunktion die Kehrfunktion des natürlichen Logarithmus62 ist.

Nach der erneuten Transformation des Spitzenwerts μ = 9,31 und der aus dem Histogramm in Abbildung 4A ermittelten Standardabweichung σ = 0,18 beträgt der repräsentative Elastizitätsmodulwert EBM = 11,05 kPa mit einem Standardabweichungsintervall von [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Alternativ kann eine logarithmisch-normale Verteilung an das Histogramm der nicht transformierten Werte des Elastizitätsmoduls (E) angepasst werden, um die charakteristischen Parameter der Verteilung zu bestimmen.

Es wird empfohlen, mindestens vier Wände pro Maus zu analysieren, um ein robustes repräsentatives Ergebnis zu erhalten, wie wir in Hartmann et al.59 ausführlich gezeigt haben. Um den repräsentativen Elastizitätsmodul EBM für eine Maus zu bestimmen, wurden die logarithmisch transformierten Werte aller vier Wände in einem kombinierten Histogramm aufgetragen und μ und σ durch Anpassung einer Normalverteilung bestimmt. Anschließend werden μ und σ wie zuvor beschrieben erneut transformiert, um EBM und das Standardabweichungsintervall für die Probandmaus abzurufen.

figure-results-4
Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten Protokollschritte zur Bestimmung des Elastizitätsmoduls einer murinen pulmonalen Basalmembran. Der erste Schritt besteht darin, murine Lungen zu gewinnen, vorzubereiten und anschließend einzubetten. Daher wird die Lunge mit einer Kombination aus OCT-Medium und PBS injiziert und dann vollständig in die OCT-Verbindung eingetaucht. Anschließend werden 15 μm dicke Lungengewebeschnitte durch Kryosektion mit einem Kryotom gewonnen. In diesem Protokoll beschreiben wir den Prozess der Verwendung von einseitigen und zweiseitigen Klebebändern, um die Proben während des Schneidprozesses an Ort und Stelle zu sichern. Anschließend werden die Elastizitätsmodulwerte des BM durch AFM-Kraftmesskarten an den Gewebeschnitten bestimmt. Nach Abschluss der Kraftkurvenanalyse wird eine räumliche und R²-Filterung angewendet, um die Ergebnisse des Elastizitätsmoduls der interessierenden Struktur, insbesondere des BM (in der Kraftkarte grün dargestellt und in der logarithmisch transformierten Elastizitätsmodulverteilung quantifiziert) zu isolieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 2: Ein beispielhaftes Kraftkartierungs-AFM-Experiment, das an einem murinen Lungengewebeschnitt durchgeführt wurde. (A) Hellfeldmikroskopisches Übersichtsbild eines murinen Lungengewebeschnitts, das die Identifizierung geeigneter intakter Alveolarwände zwischen zwei Lungenbläschen ermöglicht. Auf der rechten Seite des Bildes ist der dreieckige MLCT-Ausleger F des AFM zu sehen. (B) Vergrößerte Ansicht einer ausgewählten Wand innerhalb des Gewebeschnitts. (C) Neigung und (D) Höhenkanal einer 15 x 15 μm großen Übersichtskarte mit 50 x 50 Kraftkurven der Alveolarwand. Im Hangkanal ist das BM als helle Linie (weißer Pfeil) zu erkennen, die auf eine Struktur mit erhöhter Steifigkeit innerhalb der Wand hinweist. Der Höhenkanal bestätigt die Unversehrtheit der Wand und zeigt keine Anzeichen eines Bruchs. Nach der Identifizierung des BM in der Übersicht 15 x 15 μm Karte wird eine kleinere 4 x 4 μm Karte (E: Steigungskanal, F: Höhenkanal) mit 50 x 50 Kraftverläufen aufgenommen. Maßstabsleisten: (A) 200 μm und (B-D) 25 μm. Die Bereiche der Farbskalen der gezeigten AFM-Bilder betragen (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (Übersichtsbild) und 2,42 - 8,37 nN/μm (kleineres Bild), (F) 0 - 3,38 μm (Übersichtsbild) und 0 - 1,99 μm (kleineres Bild), von dunkel bis hell. Für alle AFM-Bilder wurden lineare Farbskalen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 3: Visualisierung des räumlichen Filterverfahrens. (A) Die Young-Modulkarte, die sich aus der Kraftkurvenanalyse ergibt, wie sie im Ergebnisfilterwerkzeug angezeigt wird, um die räumliche Filterung der Ergebnisse zu ermöglichen. Der BM ist als heller Streifen (hohe Elastizitätsmodulwerte) zu erkennen, der von weicheren Gewebekompartimenten umgeben ist. (B) Histogramm der Elastizitätsmodulwerte, die der ungefilterten Karte entsprechen (A). Nach der Anwendung der räumlichen Filtermaske (grüner Bereich) (C) enthält das Histogramm ausschließlich die Elastizitätsmodulwerte aus dem grün hervorgehobenen Bereich, der als BM identifiziert wurde. Es ist zu beachten, dass die auf der linken Seite des Histogramms beobachtbaren weichen Restwerte auf schlecht konvergierende Passungen zurückzuführen sind, die im nachfolgenden R²-Filterschritt eliminiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-7
Abbildung 4: Elastizitätsmodulverteilung eines murinen Lungen-BM, der nach diesem Protokoll erhalten wurde. (A) Logarithmisches normalisiertes Histogramm der resultierenden BM-Elastizitätsmodulwerte (N = 325). Durch Anpassung an eine Normalverteilung (schwarze durchgezogene Linie) wird der Mittelwert μ = 9,31 mit einer Standardabweichung von σ = 0,18 ermittelt. Nach der Retransformation entspricht dies einem Elastizitätsmodul des BM von EBM = 11,05 kPa mit einem asymmetrischen Standardabweichungsintervall von [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ: Diagramm der Quantile der logarithmusisierten BM-Elastizitätsmodulwerte im Vergleich zu den Quantilen einer Standardnormalverteilung. Dieses Diagramm zeigt, dass mit Ausnahme einiger Werte am linken und rechten Rand der Verteilung die resultierenden Werte des Elastizitätsmoduls hauptsächlich logarithmisch-normalverteilt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die mechanischen Eigenschaften von BMs haben aufgrund ihres Einflusses auf verschiedene zelluläre Funktionen, wie z.B. Tumorknospung, zelluläre Differenzierung, Zellbewegung und die Zugänglichkeit von Chromatin 53,63,64,65,66,67,68 großes Interesse geweckt. Folglich besteht eine ungedeckte Lücke in der Fähigkeit, die BM-Mechanik auf konsistente und messbare Weise zu bewerten. Dieses Protokoll soll es AFM-Anwendern ermöglichen, den Elastizitätsmodul von Lungen-BMs aus gesunden oder pathologischen murinen Lungenproben zu bestimmen, die von Wildtyp- oder genetisch veränderten Mäusen stammen. Die benutzerfreundliche, auf der grafischen Benutzeroberfläche basierende MATLAB-Anwendung CANTER Processing Toolbox56 erleichtert die nachgelagerte Analyse von AFM-Daten. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für andere Forscher nützlich sein wird, die Studien durchführen, die zu Fortschritten in der klinischen Diagnose, dem Management oder neuen Behandlungsstrategien für Lungenerkrankungen führen könnten.

Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehört die Sicherstellung, dass die Gewebeschnitte während der Kryosektion der Lungenprobe zu keinem Zeitpunkt auftauen, um Veränderungen der mechanischen Eigenschaften aufgrund von Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Daher ist es wichtig, nur vorgekühlte Objektträger zu verwenden, um die Schnitte zu sammeln und sie nur innerhalb der Kammer des Kryotoms zu handhaben. Der wichtigste Schritt bei der Aufnahme von Kraftkarten an einer Alveolarwand ist die Verwendung des generierten Hangbildes, das einen qualitativen Überblick über die Steifigkeitsverteilung des sondierten Bereichs bietet, um einen geeigneten Messort des BM zu identifizieren. Die räumliche Filterung der erhaltenen Elastizitätsmodulwerte stellt einen kritischen Schritt im Protokoll dar und ist ein Schlüsselmerkmal der CANTER Processing Toolbox. Dieser Filterschritt ermöglicht es dem Forscher, das BM, das sich zwischen zwei weicheren Zellschichten befindet, durch seinen ausgeprägten steiferen Fußabdruck zu identifizieren und die entsprechenden Elastizitätsmodulwerte des BM für die weitere Analyse zu extrahieren.

Dieser fortschrittliche Analyseablauf zeigte, dass Netrin-4-Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Wurfmäusen einen wesentlich (etwa zweifach) höheren Elastizitätsmodul in ihrer pulmonalen Basalmembran aufwiesen53. Auf diese Weise erleichtert das vorliegende Protokoll die vergleichende Analyse verschiedener Erkrankungen oder Gruppen.

Neben dem Rasterkraftmikroskop gibt es zahlreiche Verfahren zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien, darunter optische oder magnetische Pinzetten 69,70,71 auf molekularer Ebene, Mikroindentationstechniken 72,73 auf mittlerer Ebene und geschlossene oder unbeschränkte Druckprüfungen74,75 auf makroskopischer Ebene. Insbesondere wurden Druckmyographie, Zugversuche76,77 und Rheologie78 eingesetzt, um die BM-Steifigkeit von Gefäßproben und rekonstituierten BM-Matrizen zu beurteilen. Techniken wie Druckmyographie und Zugversuche können jedoch nur die mechanischen Eigenschaften ganzer Gewebe oder ganzer Gewebestrukturen, wie z. B. ganzer Blutgefäße, zu denen verschiedene Zellschichten und Strukturelemente gehören, beurteilen. Infolgedessen werden bei der Verwendung dieser Methoden zur Bewertung der BM-Biomechanik die mechanischen Eigenschaften von Nicht-BM, wie z. B. zelluläre Komponenten, immer mit den BM-Ergebnissen überlagert, was es schwierig macht, die spezifischen Eigenschaften des BM selbst zu isolieren.

In diesem Protokoll wird das Feature of Interest (BM) durch räumliches Filtern der Force-Map-Ergebnisse extrahiert. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist die Anforderung, dass das interessierende Merkmal als eindeutiges Muster in den erhaltenen Young-Modul-Karten oder einem anderen verfügbaren Kartenkanal erkennbar und identifizierbar ist. So ist beispielsweise der BM im Alveolargewebe allein aufgrund seiner vernetzten Struktur identifizierbar, die im Vergleich zu den umgebenden Zellen einen deutlich höheren Elastizitätsmodul aufweist. Folglich manifestiert sich der BM als kontinuierlicher heller Streifen in den erhaltenen Young-Modul-Karten. Andere biologische Strukturen weisen jedoch mechanische Eigenschaften auf, die sich nicht ausreichend von denen des umgebenden Gewebes unterscheiden, um eine räumliche Filterung in den Kartenergebnissen zu ermöglichen. Obwohl das Protokoll mit anderen Methoden kombiniert werden kann, um Strukturen in den aufgezeichneten Kraftkarten zu identifizieren, wie z. B. Immunfluoreszenzfärbung, kann dieser Ansatz zu Ergebnissen führen, die schwer zu interpretieren sind. Diese Komplikation kann auftreten, weil Färbeverfahren die mechanischen Eigenschaften von Geweben verändern können. Daher sollte eine Aufbereitung oder Färbung des Gewebes vor der AFM-Messung nur durchgeführt werden, wenn keine alternative Methode zur Identifizierung des interessierenden Merkmals zur Verfügung steht. Darüber hinaus ist es wichtig, geeignete Kontrollexperimente durchzuführen, um die biomechanischen Eigenschaften von gefärbten und ungefärbten Proben zu vergleichen.

Das Protokoll führt eine Methode zur Identifizierung von Zielstrukturen auf der Grundlage des Elastizitätsmodulkontrasts ein. Folglich kann es auf Gewebe mit einem anatomischen BM angewendet werden, das dem der Lunge ähnelt, einschließlich der Schilddrüse, des Dickdarms und der Prostata. (siehe Extended Data Abbildung in Hartmann et al.59). Obwohl dieses Protokoll ursprünglich für die Analyse der BM-Mechanik entwickelt wurde, sind dieses Protokoll und die CANTER Processing Toolbox56 vielseitig genug, um jeden mechanisch unterschiedlichen und zusammenhängenden Bereich innerhalb von AFM-Kraftkarten zu untersuchen (siehe Anweisungen unter www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki). Diese breite Anwendbarkeit macht dieses Werkzeug im gesamten AFM-Bereich wertvoll und unterstützt die zunehmende Fokussierung auf die Mechanobiologie in der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H. und H.C.-S. Würdigung der Förderung durch das Bayerische Staatsministerium für Wissenschaft und Kunst durch den Bayerischen Forschungsschwerpunkt Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben (CANTER) und das Bayerische Akademische Forum (BayWISS)-Doktorandenkonsortium Gesundheitsforschung. Die Entwicklung der Datenanalysesoftware CANTER Processing Toolbox wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Teilprojekts 1 (CL 409/4-1/2) des Forschungskonsortiums Erforschung der Gelenkknorpel- und subchondralen Knochendegeneration und -regeneration bei Osteoarthritis - ExCarBon (FOR2407-1/2) gefördert. B.H. und H.C.-S. die Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen der Großgerätekampagne GGA-HAW (INST 99/38-1) anerkennen. Diese Arbeit wurde außerdem von der Dänischen Krebsgesellschaft (R204-A12454 (R.R.)) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (539446614 bis R.R.) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL SpritzeB Braun9166017VInjekt-F
10 mL SpritzeB Braun4606108VInjekt Luer Solo
15 mL Falcon TubeSarstedt62.554.002Röhrchen mit Schraubverschluss
Cantilever-Sonden - MLCTBruker AFM Probes3444AFM Cantilevers mit pyramidenförmiger Spitzenform
KryotomklingenLeica Biosystems14035843496Low-Profile Einwegklingen DB80LX
Kryotom-ProbenhalterLeica Biosystems14047740044Probenscheibe 30
CyotomeLeica BiosystemsCM1950Leica Cryostat
Direct Overlay ExtensionBrukerSoftwareerweiterung für die JPK SPM Software, die es ermöglicht, das optische Bild des inversen Mikroskops in den Data Viewer der SPM-Software zu importieren.
Einweg-BasisformScience ServicesSA62534-15Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm
Doppelseitiges Klebebandtesa Film56661-00002Fotofilm Klebeband
Cantilever-Halter mit fester FederBruker
Inverses Mikroskop - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK Motorisierter TischBruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM SoftwareBruker
K5 CMOS Mikroskop KameraLeica Microsystems
MATLABMathworksVersion R2024a oder höher
MATLAB - Curve Fitting Toolbox Mathworks
MATLAB - Toolbox für die BildverarbeitungMathworks
MATLAB - Toolbox für die Signalverarbeitung Mathworks
MATLAB - Toolbox für Statistik und maschinelles LernenMathworks
ObjektträgerCarl RothH869.1Einfache Objektträger für die Cantilever-Kalibrierung
Objektträger mit mattem RandCarl RothH870.1Objektträger mit mattiertem Rand für Kryosektionen
Nadel & Schrägstrich; 0,9 mm & mal; 25 mmB Braun4657500OCT Injektion  in die Lungenprobe
Nadel & Schrägstrich; 0,9 mm & mal; 70 mmB Braun4665791Lange Nadel zum Auftragen von PBS unter der AFM
OCT VerbindungSakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. Compound
Phosphat Buffered SalineBio& Verkauf derBS.L1825PBS-Lösung ohne Ca2+, Mg2+, 500 mL
QI Advanced Imaging ExtensionBrukerSoftware-Erweiterung für die JPK SPM Software, die für jedes aufgenommene Bildpixel die gesamte zugrunde liegende Kraftkurve bereitstellt.
SkalpellB Braun5518083Chirurgische Einweg-Skalpellschere
Kaut-BullingerM681700Präzisionsschere 13 cm 
Einseitiges Klebebandtesa Film57330-00000glasklares Klebeband, 33 m x 19 mm
DiaboxGWL Storing SystemsK50WDiabox für 50 Dias
Stereomikroskop - Stemi DR1663Zeiss
Pinzette - Vomm SS-SA-ESDEleshopELE002121

Referenzen

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