Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Summary

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Abstract

Dreidimensionale (3D) Zellkulturen bieten eine genauere Darstellung der in vivo Mikroumgebung als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kulturen, da sie verbesserte Interaktionen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix fördern. Ziel dieser Studie war es, eine effiziente, kostengünstige und reproduzierbare Methodik zur Erzeugung von 3D-Zellstrukturen (Sphäroide/Organoide) unter Verwendung eines innovativen stempelbasierten Systems zur Herstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen zu entwickeln. Ein neuartiger Stempel wurde verwendet, um 663 Mikrowells pro Well einer 6-Well-Platte herzustellen, was eine ideale Umgebung für die Zellaggregation bietet. Primäre Pankreas-Inselzellen des Schweins wurden in diese Mikrovertiefungen ausgesät, wo sie sich zu Sphäroiden/Organoiden zusammenballten. Die Kulturen wurden bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubiert, und das Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht. Die Sphäroidbildung wurde periodisch überwacht und Proben zur Charakterisierung entnommen. Die Methode erzeugte erfolgreich einheitliche und qualitativ hochwertige Sphäroide, wodurch die experimentelle Variabilität reduziert, Manipulationen minimiert und Zellinteraktionen verbessert wurden. Die Verwendung von Mikromusterformen auf Agarosebasis bot eine vereinfachte, kontrollierte Umgebung für 3D-Kulturen und bot eine standardisierte und kostengünstige Lösung. Diese Methodik unterstützt Anwendungen für Wirkstofftests und Tissue Engineering und bietet eine praktische und skalierbare Plattform für 3D-Zellkulturmodelle, die einfach in verschiedenen Laborumgebungen implementiert werden können.

Introduction

In den letzten 50 Jahren haben zahlreiche zellbiologische Untersuchungen gezeigt, dass zweidimensionale (2D) Kulturen die in vivo Bedingungen, die in Tiermodellen beobachtet wurden, nicht genau replizieren^{können 1}. Strukturell erlauben 2D-Zellkulturen es den Zellen nicht, sich dreidimensional zu organisieren und die in In-vivo-Systemen beobachtete Situation zu replizieren. Darüber hinaus sind zelluläre Signalwege in 2D-Kulturen im Vergleich zu dreidimensionalen (3D) Kulturen verändert, was wahrscheinlich erklären könnte, warum bestimmte Arten des Wirkstoffscreenings mit 2D-Kulturen so unterschiedlich sind². Ein bedeutender Fortschritt in der Zellkulturtechnik entstand mit der Einführung von 3D-Kultursystemen. 3D-Systeme variieren in ihrer Komplexität je nach zellulärer Zusammensetzung und Zytoarchitektur erheblich. Im Allgemeinen werden zwei Arten von Strukturen erzeugt, nämlich: Sphäroide und Organoide. Sphäroide werden als einfache Ansammlungen von Zellen beschrieben, die aus normalem oder Tumorgewebe, Embryoidkörpern und Zelllinien gewonnen werden. Die Bildung von 3D-Strukturen wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, darunter Zell-Zell-Interaktionen und Signalwege, die durch Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) vermittelt werden, die strukturelle Unterstützung und biochemische Signale bieten. Diese Elemente regulieren Wechselwirkungen, die zur Organisation und Funktion des Gewebes beitragen³. Das Sphäroidkultursystem wurde erstmals in den frühen 1970er Jahren beschrieben, wobei V79-Lungenzelllinien des chinesischen Hamsters als Modell für knotige Karzinome verwendet wurden, die unter nicht adhärenten Bedingungen wachsen und perfekte Kugeln bilden⁴. Organoide werden als Cluster organspezifischer Zelltypen beschrieben, die von Stamm- oder Vorläuferzellen abgeleitet sind und sich durch Prozesse wie Zellsortierung und Abstammungsspezifikation räumlich begrenzt selbst organisieren, was die in vivo-Entwicklung widerspiegelt⁵.

Für die Kultivierung von Zellen unter 3D-Bedingungen stehen mehrere verfügbare Methoden und Materialien zur Verfügung. Die wichtigsten Methoden, die derzeit zur Erzeugung von 3D-Kulturen verwendet werden, sind: 1) hängende Tropfen; 2) rotierende Zellkultur und Kunststoffe mit geringer Anhaftung; 3) Pyramidenplatten mit konischen Vertiefungen; 4) makroporöse Gerüste; 5) magnetische Kügelchen; und 6) gerüstfreie Hydrogele.

Hängende Tropfen sind die Methode, mit der gerüstfreie 3D-Kulturen erhalten werden. Dieses Verfahren weist gewisse Einschränkungen auf, darunter die Notwendigkeit einer umfangreichen Handhabung, eine geringe Produktionseffizienz, eine sphärische Geometrie und die Exposition gegenüber hohen Scherkräften. Darüber hinaus können bestimmte Verfahren, wie z. B. der Ersatz des Mediums oder die Zugabe von Verbindungen, eine Herausforderung darstellen und zu Materialverlusten führen. Darüber hinaus deuten Literaturberichte darauf hin, dass einige Zelllinien bei Verwendung dieses Ansatzes keine dicht gepackten Sphäroide produzieren⁶.

Rotierende Zellkulturen und Kunststoffe mit geringer Bindung werden verwendet, um zu verhindern, dass sich Zellen an das Substrat anheften, wodurch sie sich zusammenlagern und Sphäroide bilden. Dieser Prozess erfordert spezielle Kolben und/oder Rühren/Drehen. Obwohl dies einer der einfachsten Ansätze für die großtechnische Produktion von Sphäroiden oder Organoiden ist, ist er nicht ohne Nachteile, wie z. B. die Notwendigkeit einer speziellen Ausrüstung, eine geringe Langlebigkeit der Kultur, Größenunterschiede bei Sphäroiden, mechanische Schädigung der Zellen und eine geringe Effizienz⁶.

Pyramidenplatten mit konischen Vertiefungen sind kommerziell erhältliche Platten, die sich auf die Kosten auswirken, zusätzlich zu der Tatsache, dass einige Manipulationen die Bildung von Sphäroiden/Organoiden behindern können⁷.

Makroporöse Gerüste werden auch für die 3D-Kultivierung eingesetzt. Ein großes Hindernis liegt jedoch darin, ein effektives Cell Seeding und eine gleichmäßige Verteilung zu erreichen. Dieses Problem tritt auf, weil die Porengrößen entweder zu klein für die Zellpenetration oder zu groß sein können, um die Zellen sicher zu halten. Um dieses Problem anzugehen, wurden mehrere Strategien untersucht⁸, die sich direkt auf die Komplexität und die Kosten dieser Technik auswirken.

Die Methode der magnetischen Beads erzeugt eine kleine Anzahl von Sphäroiden/Organoiden, ist mit hohen Kosten verbunden und kann Nanopartikelrückstände in den Zellen hinterlassen⁹.

Unter den Systemen zur Kultivierung von Sphäroiden stehen nicht-adhäsive Agarose-Hydrogele zur Verfügung, die ein gerüstfreies Hydrogel darstellen. Dieser Ansatz bietet bemerkenswerte Vorteile, wie z. B. eine präzise Kontrolle über die Größe der 3D-Strukturen und die Möglichkeit, eine beträchtliche Anzahl dieser Strukturen pro Platte zu erzeugen. Bei diesem Verfahren werden Zellen in ein Hydrogel mit vorgeformten Vertiefungen eingebracht, in dem sie absinken und sich selbst zu 3D-Sphäroiden¹⁰ zusammensetzen.

In dieser Studie stellen wir ein Gerät und eine Methodik zur einfachen, effizienten, reproduzierbaren und kostengünstigen Erzeugung von Agarose-Mikrovertiefungen unter Verwendung einer Mikromusterform vor.

Die Verwendung dieses Stempels als Form zur Erzeugung von Mikrovertiefungen in Agarose mit Hilfe der Schwerkraft zielt darauf ab, die Zellinteraktion innerhalb der Mikrotiter- und Zellorganisation zu verbessern, indem 3D-Strukturen (Sphäroide/Organoide) in vitro auf einfache, effiziente, reproduzierbare und kostengünstige Weise erzeugt werden, wodurch Forschungszeit und Laborressourcen gespart werden.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution CEUA-FMUSP: 1699/2021, genehmigt am 8. September 2021 - "Isolierung und Verkapselung von porcinen Pankreasinseln" und ist Teil des thematischen Projekts unserer Zell- und Molekulartherapie NUCEL Group (www.usp.br/nucel), FAPESP Grant Nr. 2016/05311-2, mit dem Titel: "Regenerative Medizin mit dem Ziel der Therapie chronisch-degenerativer Erkrankungen (Krebs und Diabetes)".

1. Herstellung der Stempelvorrichtung

HINWEIS: Dieser Stempel wird von der NUCEL-Gruppe (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/) nach Maß gefertigt. Das Stempelgerät wurde unter Verwendung der referenzierten Software entwickelt, die weithin für ihre Präzision und fortschrittlichen dreidimensionalen Modellierungsfähigkeiten anerkannt ist.

1. Stellen Sie sicher, dass die entworfenen Prototypen über 663 Mikropins verfügen, die so angeordnet sind, dass eine entsprechende Anzahl dreidimensionaler Kulturen, wie z. B. Sphäroide oder Organoide, erzeugt werden kann. Um die Stabilität des Stempels auf den Oberflächen des T6-Tabletts zu gewährleisten, positionieren Sie fünf Stützpunkte strategisch entlang des Umfangs des Geräts.
2. Achten Sie darauf, dass die Mikropins ein konisches Design mit einstellbaren Abmessungen von 1 bis 3 mm Länge haben. Der Basisdurchmesser des Konus variiert zwischen 0,7 und 1,5 mm, während der Kegelwinkel zwischen 5° und 10° liegt.
3. Achten Sie darauf, dass die "Stopp"-Struktur des Geräts, die die Tiefe der Mikrostifte definiert, eine einstellbare Länge von 10 bis 19 mm und einen Durchmesser von 20 bis 40 mm hat, wobei die Mikrostifte gleichmäßig über die Oberfläche verteilt sind.
4. Darüber hinaus sollte das Gerät mit einem ergonomischen Griff ausgestattet sein, der für die Einhandbedienung geeignet ist, um die Praktikabilität und Präzision während des Gebrauchs zu verbessern.
   HINWEIS: Um die Großserienproduktion des Geräts zu erleichtern, wird die digitale Datei im .stl-Format bereitgestellt, die für den 3D-Druckprozess unerlässlich ist.
5. Schneiden Sie es einfach mit einer geeigneten Software in Scheiben und drucken Sie es mit einem kompatiblen 3D-Drucker. Verwenden Sie folgende Druckmaße: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, um ein ideales Gleichgewicht zwischen Funktionalität und struktureller Qualität zu gewährleisten.
6. Verwenden Sie für die Herstellung des Geräts einen lichthärtenden 3D-Drucker, der mit dem UV-härtenden Polymerharz kompatibel ist, das eine hohe Auflösung und eine gleichmäßige Oberflächenbeschaffenheit aufweisen muss, wesentliche Eigenschaften für eine optimale Leistung des Geräts.
7. Schneiden Sie das digitale Modell für den Druck mit einer Software auf, die mit dem ausgewählten 3D-Drucker kompatibel ist.

2. Vorbereitung von Agarose-Mikrovertiefungen

1. Bereiten Sie die Agaroselösung vor.
   1. Wiegen Sie das reine Agarosepulver und lösen Sie es in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf, um eine Endkonzentration von 1-2% (w/v) zu erreichen.
   2. Erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle oder im Wasserbad, bis sie sich vollständig aufgelöst hat, um sicherzustellen, dass sie homogen und transparent ist.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Überhitzung oder übermäßiges Erhitzen, da dies die Agarose beschädigen kann. Bereiten Sie keine großen Mengen der Stammlösung vor.
   3. Lassen Sie die Lösung auf ~40 °C abkühlen, die ideale Temperatur zum Pipettieren.
2. Bereiten Sie den individuell angefertigten Stempel vor.
   1. Waschen Sie den Stempel mit einem Schwamm mit weichen Borsten und destilliertem Wasser, um Rückstände zu entfernen.
   2. Setzen Sie den gereinigten Stempel 5-10 Minuten lang UV-Licht aus, um die Sterilität zu gewährleisten.
3. Bilden Sie die Mikrovertiefungen.
   1. Gießen/pipettieren Sie ~3 mL der 40 °C heißen Agaroselösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, wobei eine gleichmäßige Tiefe von 2-3 mm sichergestellt wird.
   2. Positionieren Sie den speziell angefertigten Stempel in der Mitte der Vertiefung, solange die Agarose noch warm ist.
      HINWEIS: Der Stempel verfügt über seitliche Stützen, die eine Ausrichtung und Stabilität gewährleisten, so dass keine manuelle Unterstützung erforderlich ist. Jeder Stempel erzeugt ~663 Mikrowells (~2 mm Höhe) pro Well. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen auf den Mikropins befinden. Wenn sich Blasen bilden, bewegen Sie den Stempel vorsichtig, um sie zu entfernen.
   3. Lassen Sie die Agarose 5-10 min bei Raumtemperatur erstarren, ohne die Platte zu bewegen.
      HINWEIS: Stören Sie die Agarose während der Erstarrung nicht, um Schwankungen in der Mikrotiterstruktur zu vermeiden.
   4. Entfernen Sie den Stempel mit sanften Hin- und Herbewegungen, um das Vakuum zu lösen, ohne die Mikrowells zu beschädigen.
      HINWEIS: Diese Bewegung erleichtert den Lufteintritt und ermöglicht ein reibungsloses Entfernen des Stempels, ohne das Gel zu verformen. Die Mikrovertiefungen müssen intakt bleiben.
   5. Waschen Sie die Mikrovertiefungen 3x mit PBS-Lösung, um Rückstände zu entfernen.
   6. Setzen Sie die Platte 10 Minuten lang UV-Licht aus, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
   7. Geben Sie 3 ml Nährmedium hinzu und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem CO_{2 -} Inkubator bei 37 °C.
      HINWEIS: Bei dieser Inkubation wird vor der Aussaat der Zellen überprüft, ob keine Kontamination vorliegt.

3. Zellaussaat in Mikrovertiefungen

1. Bereiten Sie die Zellsuspension vor.
   1. Sammeln Sie die Zellen durch Trypsinisierung oder eine andere Dissoziationsmethode, um eine homogene Suspension zu erhalten.
   2. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Konzentration entsprechend der gewünschten Anzahl pro Mikrotiterplatte an.
      HINWEIS: Um 5.000 Zellen pro Mikrotiterplatte in 663 Mikrovertiefungen zu säen, bereiten Sie eine Suspension vor, die mindestens 3.315 × insgesamt 10⁶ Zellen enthält. Optimieren Sie die Zellkonzentration, um zentrale Nekrosen zu verhindern und eine ausreichende Nährstoff- und Sauerstoffdiffusion zu gewährleisten.
2. Säen Sie die Zellen aus.
   1. Pipettieren Sie ~3 mL der vorbereiteten Zellsuspension über die Mikrowells und sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung, indem Sie die Platte vorsichtig schwenken.
   2. Lassen Sie die Zellen durch die Schwerkraft absetzen (~10-15 min) oder führen Sie eine sanfte Zentrifugation bei 100 × g für 5 min durch.
      HINWEIS: Eine Zentrifugation kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in den Mikrovertiefungen konzentrieren.
   3. Die Platte wird in einen CO₂ -Inkubator bei 37 °C und befeuchteter Atmosphäre überführt.

4. Pflege von 3D-Zellkulturen

1. Tauschen Sie das Nährmedium aus.
   1. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, entfernen Sie 50 % des alten Mediums und fügen Sie frisches Medium hinzu.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Mikrovertiefungen während des gesamten Kulturzeitraums untergetaucht bleiben, um ein Austrocknen zu verhindern.
2. Überwachen Sie die Bildung von 3D-Kulturen.
   1. Fahren Sie mit der Kultivierung fort, bis die 3D-Strukturen vollständig ausgebildet und kompakt sind (z. B. 2-3 Tage für primäre Pankreas-Inselkulturen).
      HINWEIS: Bei Kulturen, die eine längere Formationszeit erfordern, alle 2-3 Tage einen teilweisen Mediumwechsel durchführen.

5. Sammlung und Charakterisierung von 3D-Strukturen

1. Sammle die Sphäroide/Organoide.
   1. Entfernen Sie das alte Medium und sammeln Sie die 3D-Strukturen durch kräftiges Pipettieren mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser oder abgeschnitten, um eine Kompression oder Disaggregation zu verhindern.
      HINWEIS: Durch kräftiges Pipettieren muss kontrolliert werden, um die Aggregate zu lösen, ohne sie zu verformen.
2. Bereiten Sie sich auf die Analyse vor.
   1. Verwenden Sie die gesammelten Sphäroide/Organoide sofort oder fixieren Sie sie für zukünftige Analysen.
      HINWEIS: Die Assoziation und Stabilität von Sphäroiden hängt vom Zelltyp, der Entstehungszeit und den Kulturbedingungen ab. Vorsicht ist wichtig, um Dissoziation zu vermeiden.

Results

Die in dieser Studie verwendete Zellkultur wurde aus Pankreasinseln von Schweinen gewonnen. Das in dieser Studie verwendete Inselpräparat hatte eine Reinheit von 80 ± 5 % basierend auf der Dithizon-Färbung und eine Lebensfähigkeit von >80 % der Inselzellen basierend auf dem Nachweis von Fluoresceindiacetat in lebenden Zellen oder Propidiumiodid in toten Zellen (die Lebend/Tot-Fluoreszenzmethode). Es ist sicherzustellen, dass die Präparation der Pankreasinsel des Schweins zu mindestens 80 % rein (z. B. durch Dithizon-F...

Discussion

Obwohl es in der Literatur verschiedene 3D-Kulturprotokolle gibt, wurden in einer Studie von Wassmer et ^al.13 verschiedene Methoden zur Erzeugung von 3D-Strukturen unter Verwendung von Pankreasinseln getestet. Die Autoren beobachteten, dass einheimische Inselzellen und selbstaggregierte Sphäroide eine beträchtliche Heterogenität in Bezug auf Größe und Form aufwiesen und größer waren als solche, die mit anderen Methoden gewonnen wurden. Basierend auf ihren Erkenntn...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
31L Mikrowelle	Electrolux	78965840 6699 9	Gerät zum Erhitzen der Agaroselösung, um deren Auflösung zu erleichtern und eine größere Homogenität zu gewährleisten. Dadurch erreicht die Lösung den idealen flüssigen Zustand für die Bildung der Vertiefungen.
3DFila Grau undurchsichtiger lichtempfindlicher 3D-Harz			UV-härtender
Polymerharz 3D-Drucker - Creality Halot One	Creality	N/A	3D-Drucker zum Drucken des Stempelgeräts
Agarose	UNISCIENCE	UNI-R10111	Um das Gel zu bilden, lösen Sie 1 bis 2% in Kochsalzphosphatpuffer (PBS) oder einem geeigneten Medium auf.
Autodesk Fusion 360			3D-Modellierung
BB15 CO2 Inkubator	Thermo Fisher	51023121	Ausrüstung zur Inkubation von kultivierten Zellen in einer geeigneten und kontrollierten Umgebung.
Chitubox	Chitubox	N/A	Software zum Schneiden des Teils für den Druck
Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II	Grupo VECO	N/A	Gewährleistet eine sterile Umgebung für die Durchführung von Zellkulturen innerhalb festgelegter Parameter und Protokolle.
Kulturmedium	USBiologisch/Life Sciences	C5900-03A	Enthält Zusatzstoffe für die richtige Zellkultivierung.
Kulturplatten (P6)	SARSTEDT	1023221	Wird verwendet, um die Agarose zu formen und die Zellen zu kultivieren.
Erlenmeyerkolben (25 mL)	Laborglas	91 216 14	Ein Behälter zum Auflösen von 1– 2 % Agarose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder einem anderen geeigneten Medium, das typischerweise in einer Mikrowelle erhitzt wird.
Falcon 15 mL Polystyrol-Zentrifugenröhrchen	Corning	352099	Wird verwendet, um Zellen in Suspension zu halten und mögliche Verdünnungen durchzuführen.
Fötales Rinderserum (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Zusatzstoff für Kulturmedium.
PBS-Lösung (Kochsalzphosphat-Puffer)	Im Labor hergestellt	N/A	1x mit MiliQ Reinstwasser verdünnt. Wird zum Auflösen von Agarose 1 bis 2 % und zum Waschen bereits produzierter Vertiefungen verwendet.
Reagenzflasche mit blauem Verschluss - Schott	Laborglas	21801545	Wird zur Vorbereitung und Lagerung von Nährmedium verwendet.
Stempelgerät	NUCEL Group	N/A	Link- Dieser Link ermöglicht den Zugriff auf die .stl-Datei des Stempelgeräts. Schneiden Sie es einfach mit einer geeigneten Software in Scheiben und drucken Sie es mit einem kompatiblen 3D-Drucker. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=sharing
Behandelter Kulturkolben mit Filter 25 cm²	Corning	430639	Wird für die Kultivierung und Erhaltung von adhärenten Zellen verwendet.
Trypsin	Merck	07-07-9002	Zur Dissoziation von Zellen vor der Aussaat.
Ultraviolettes Licht (UV)	N/A	N/A	Wird zum Sterilisieren des Stempels und der Platten verwendet.