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Methodenartikel

Design und Validierung eines volumetrischen Extrusions-Bioprinters für das Bioprinting von löslichem Basalmembranextrakt für die translationale Forschung

970 Ansichten

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DOI:

10.3791/67788

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28. März 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Biological Structure Mechanics (LaBS), Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Lösliche Basalmembranextrakte sind die am weitesten verbreiteten biologischen Matrices in der Krebsforschung, aber ihr komplexes rheologisches Verhalten erschwert ihr Bioprinting mit kommerziell erhältlichen Bioprinting-Systemen. In dieser Arbeit wird eine maßgeschneiderte Bioprinting-Strategie vorgestellt, um reine Matrixkonstrukte mit guter Formtreue sowohl in Einzel- als auch in mehreren Schichten herzustellen.

Zusammenfassung

In der translationalen Forschung sind 3D-In-vitro-Modelle unerlässlich, um das wissenschaftliche Verständnis und die therapeutische Entwicklung voranzutreiben. Zu diesem Zweck spielen lösliche Basalmembranextrakte (SBMes), die aus Sarkomzellen der Maus gewonnen werden, eine Schlüsselrolle bei der Replikation mechanischer und biochemischer Eigenschaften der In-vivo-Mikroumgebung . Sie sind besonders wertvoll in einer Vielzahl von Forschungsbereichen, vom Tissue Engineering bis hin zu Medikamententests. Insbesondere sind sie in der Krebsforschung von grundlegender Bedeutung, da traditionelle 2D-Zellkulturen, die in diesem Bereich weit verbreitet sind, irreführende Informationen liefern können, da sie die dreidimensionale (3D) Struktur und die Mikroumgebung des Tumors nicht erfassen.

In der Krebsforschung sind effektive 3D-In-vitro-Modelle entscheidend, um die Krebsentwicklung besser zu verstehen und Herausforderungen, wie z. B. Resistenzmechanismen, zu antizipieren. Organoide haben sich als vielversprechende 3D-In-vitro-Modelle herausgestellt, die eine genauere Darstellung der Tumorbiologie bieten. Sie wachsen in SBMes, da sie eine Umgebung schaffen, in der Zellen wachsen und sich selbst zu 3D-Strukturen organisieren können. SBMe stellt jedoch erhebliche Herausforderungen dar, darunter geringe mechanische Eigenschaften und komplexes rheologisches Verhalten, die seinen Einsatz in kommerziell erhältlichen pneumatischen Extrusions-Bioprinting-Systemen verhindern.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein kostengünstiges, volumetrisch kontrolliertes Bioprinting-System und ein spezifisches Protokoll für den Druck von Strukturen mit SBMe entwickelt. Dieses System basiert auf einem volumetrischen Extruder und überwindet die Grenzen traditioneller pneumatisch angetriebener Ansätze. Einmal zusammengebaut und mit einem spezifischen G-Code programmiert, kann das System sowohl reines als auch verdünntes SBMe biodrucken, um sowohl ein- als auch mehrschichtige Konstrukte zu erhalten. Dieser Ansatz bietet eine zuverlässigere und skalierbarere Methode zur Herstellung von 3D-Zellkulturmodellen und ebnet den Weg für eine effektivere Erforschung neuartiger Behandlungen und Medikamententests.

Einleitung

In der translationalen Forschung ist die Erstellung von 3D-In-vitro-Modellen, die die In-vivo-Umgebung genau nachbilden, unerlässlich, um das wissenschaftliche Verständnis und die therapeutische Entwicklung voranzutreiben1. Eine Schlüsselkomponente bei ihrer Herstellung ist die Verwendung von extrazellulären Matrix-Analoga (ECM), wie z. B. lösliche Basalmembranextrakte (SBMes), die die Komplexität des natürlichen Gewebes besser widerspiegeln. SBMes sind in einer Vielzahl von Forschungsbereichen besonders wertvoll, vom Tissue Engineering bis hin zu Wirkstofftests 2,3. Insbesondere sind sie in der Krebsforschung von grundlegender Bedeutung, da sie mechanische und biochemische Eigenschaften der Tumormikroumgebung replizieren und so die Entwicklung von Modellen ermöglichen, die das Tumorwachstum, die Metastasierung und das Ansprechen auf die Behandlung besser widerspiegeln.

Trotz erheblicher Fortschritte in den letzten Jahrzehnten versagen viele Therapien weiterhin, was zu häufigem Versagen der Behandlung im klinischen Umfeld führt. Dieses Versagen wird häufig auf Arzneimittelresistenzmechanismen zurückgeführt, die durch ein hohes Maß an Zellheterogenität verursacht werden 4,5. Effektive In-vitro-Modelle, die in der Lage sind, die Komplexität menschlicher Tumore genau zu rekapitulieren, sind entscheidend, um die Krebsentwicklung besser zu verstehen und dieses Phänomen zu antizipieren.

Traditionelle 2D-Zellkulturen waren grundlegend in der Krebsforschung, können aber zu irreführenden Informationen über die Wirksamkeit von Medikamenten und das Tumorverhalten führen, da sie die 3D-Struktur und Mikroumgebung tatsächlicher Tumore nicht erfassen 6,7,8. Im Gegensatz dazu haben sich 3D-In-vitro-Modelle als vielversprechende Alternativen herausgestellt, die eine genauere Darstellung der Mikroumgebung und des biologischen Verhaltens von Tumoren bieten, indem sie die 3D-Komplexität nachahmen 9,10.

In der Krebsforschung werden Organoide häufig als 3D-Modelle zur Untersuchung von Krankheiten und der Wirksamkeit von Medikamenten verwendet, da sie genauere und relevantere Modelle von menschlichen Geweben und Organen liefern. Die Verwendung von SBMe, das aus Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen gewonnen wird, war entscheidend für die Weiterentwicklung der Krebsforschung11,12. Es bietet ein gelartiges Substrat, in dem Zellen wachsen, sich vermehren und sich selbst zu organoiden Strukturen organisieren können, um eine ordnungsgemäße Entwicklung und ein ordnungsgemäßes Wachstum zu gewährleisten13,14.

SBMe stellt jedoch aufgrund seiner einzigartigen und komplexen Eigenschaften eine Reihe von Herausforderungen dar. Als nicht-newtonsches Fluid weist SBMe scherverdünnende Eigenschaften auf, was bedeutet, dass seine Viskosität mit zunehmender Scherspannung abnimmt, was seine Handhabung und Anwendung bei variablen Kräften inkonsistent macht. Darüber hinaus trägt sein thixotropes Verhalten zur Komplexität bei, da es seine Viskosität im Laufe der Zeit wiederherstellen kann, wenn die Scherspannung entfernt wird15,16. Diese Eigenschaften, zusammen mit der geringen mechanischen Festigkeit (mit Werten des Speichermoduls zwischen 10 Pa und 5.000 Pa je nach Proteinkonzentration) und dem wärmesensitiven Verhalten, verschlimmern diese Herausforderungen und erfordern eine sorgfältige Kontrolle während der Herstellung und Verwendung sowie den Biodruck in reiner Form.

Standardmäßige pneumatisch betriebene Bioprinting-Systeme sind nicht in der Lage, die SBMe-Abgabe richtig zu steuern, da die Anwendung von Druck ein unkontrollierbares Verhalten nach dem Auswurf aus der Spritze verursacht. Er wird von einem Phänomen beeinflusst, das dem für polymere Schmelzen beschriebenen "Spurt"-Effekt ähnelt, bei dem die Durchflussrate abrupt über einen bestimmten kritischen Druckwert 17,18,19 ansteigt. Wie in unserer vorherigen Arbeit16 berichtet, ermöglicht die volumetrische Dosierstrategie die Entkopplung der SBMe-Extrusion von dem im Dispenser erzeugten Druck, der von den rheologischen Eigenschaften der Matrix, den Arbeitsbedingungen und der Düsengeometrie abhängt. In den letzten Jahren wurden auf dem Markt mehrere Versuche unternommen, das gleiche Prinzip auszunutzen, wobei der Matribot von Corning den Weg weist. Es ermöglicht die Handhabung und Abscheidung von SBMe und anderen temperaturempfindlichen Biotinten dank kontrollierter Temperaturbedingungen. Es kann jedoch teuer sein, was die Zugänglichkeit für kleinere Labore einschränkt.

In unserer vorherigen Arbeit haben wir eine kostengünstige kundenspezifische Alternative vorgestellt - ein volumetrisch angetriebenes Bioprinting-System16. Diese Version basierte auf einem modifizierten 3D-Drucker der Einstiegsklasse mit einem benutzerdefinierten 3D-gedruckten Extruder. Trotz seiner Wirksamkeit im Bioprinting wies es einige Einschränkungen bei der Wiederholbarkeit des Drucks auf. Da er von einem Einsteiger-3D-Drucker abgeleitet war, hatte er einige Probleme mit den Z-Bewegungen und dem Auto-Homing. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, haben wir eine weiterentwickelte Version unseres kundenspezifischen, kostengünstigen volumetrischen Dosiersystems und ein spezifisches Protokoll für das Bioprinting von Strukturen mit SBMe entwickelt.

Hier stellen wir Protokolle für den Aufbau und die Nutzung dieses Systems zur Verfügung. Es besteht aus einem kundenspezifischen volumetrisch gesteuerten Extruder, der auf unserer vorherigen Studie16 basiert, einem Bioprinter-Gehäuse und einem Steuerungssystem. Produktion und Montage erfolgen für jedes Modul. Wenn das System mit einer speziellen gcode-Datei zusammengesetzt und programmiert wird, die der Protokollbeschreibung für die Matrixhandhabung folgt, ist es in der Lage, reine oder verdünnte Konstrukte mit dem SBMe mit guter Formtreue sowohl in Einzel- als auch in mehreren Schichten zu drucken.

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Protokoll

1. 3D Druck und Montage von volumetrischen Biodruckern

  1. Bereiten Sie die Komponenten des Bioprinters vor und drucken Sie sie in 3D.
    1. Laden Sie die *. STL-Designdateien aus der Zusatzdatei 1.
    2. Last*. STL-Datei in der proprietären Slicing-Software, um die Ausrichtung der Teile auf der Druckplatte und alle für den 3D-Drucker erforderlichen Optionen zu definieren. Drucken Sie die Teile mit Polymilchsäure (PLA) mit Optionen mittlerer Qualität (0,4 mm Düsengröße, 1,75 mm Filamentdurchmesser, 220 °C Extrudertemperatur, 50 °C Druckbettplattentemperatur, 0,2 mm Schichthöhe, 300 mm/s Druckgeschwindigkeit).
      HINWEIS: Die Optionen für mittlere Qualität können je nach dem Drucker, der zum Drucken der Teile verwendet wird, unterschiedlich sein.
    3. Löse die gedruckten Teile vom 3D-Druckerbett. Entfernen Sie die gedruckten Stützstrukturen, falls vorhanden, und polieren Sie die Oberflächen, falls erforderlich.
  2. Montieren Sie den Extruder (Abbildung 1).
    1. Setzen Sie zwei Linearkugellager (LM4UU) in die vertikalen Löcher des Schiebeblocks ein. Setzen Sie ebenfalls eine Gewindemutter T8 in das hintere Mittelloch ein und befestigen Sie diese mit vier Schrauben (M3x10).
    2. Befestigen Sie eine starre Wellenkupplung am Schrittmotor und befestigen Sie diese dann mit vier Schrauben (M3x6) am Motorgehäuse des Extruders.
      HINWEIS: Richten Sie den Schrittmotor entsprechend der Nut im Extrudermotorgehäuse aus, um die richtige Positionierung der Buchse für Kabel zu ermöglichen.
    3. Befestigen Sie den in Schritt 1.2.2 montierten Schrittmotor mit der zuvor eingeschobenen starren Wellenkupplung an einer Leitspindel T8 (150 mm). Stellen Sie sicher, dass jeder Block mit den Stellschrauben richtig befestigt ist.
    4. Befestigen Sie ein Pendelflanschlager (8 mm Innendurchmesser) mit zwei Schrauben (M4x8) an der Unterseite des Extruderbodens.
    5. Setzen Sie zwei Kugellager (4 x 9 x 4 mm) in die dafür vorgesehenen Löcher oben auf dem Extruderboden und die anderen beiden in die Löcher im unteren Bereich ein.
    6. Führen Sie das zusammengebaute Teil (Schritt 1.2.1) durch den Hohlraum im oberen Teil der Struktur in den Extruderboden ein. Verbinden Sie die vier Kugellager (Schritt 1.2.5) mit zwei 4-mm-Stangen, eine für jede Seite. Lassen Sie die Stangen durch die beiden Linearkugellager im montierten Teil in Schritt 1.2.1 laufen.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, die Stangen zuerst auf die oberen beiden Kugellager zu setzen und dann in den Extruderboden zu stecken, bis sie das untere Kugellager erreichen und alles in den definierten Schlitzen gesichert ist.
    7. Führen Sie das in Schritt 1.2.3 aufgebaute Teil in das mittlere Loch des Extruderbodens ein. Drehen Sie die Leitspindel, um die Gewindemutter zu passieren und das selbstausrichtende Flanschlager zu erreichen. Verwenden Sie die Stellschrauben im Bauteil, um die Leitspindel zu verriegeln, und zwei Schrauben (M3x8), um das Extrudermotorgehäuse oben auf dem Extrudersockel zu befestigen.
    8. Verwenden Sie zwei weitere Schrauben (M3x40) und M3-Muttern, um den Flanschhalter des Spritzenzylinders am unteren Teil des Extruderbodens zu befestigen, um den Flansch des Spritzenzylinders zu verriegeln (Einführrichtung von oben nach unten). Verwenden Sie zwei weitere Schrauben (M3x30) und M3-Muttern, um den Spritzenkolbenhalter an den oberen Löchern des Schieberblocks zu befestigen (Einsteckrichtung von unten nach oben), um den Kolbenflansch zu verriegeln.
    9. Setzen Sie zwei Schrauben (M4x80) in zwei Federn ein und lassen Sie sie durch die Löcher im unteren Teil des Extruderbodens und des Spritzenblocks gleiten. Schrauben Sie die Muttern so fest, dass der Platz für die Spritze frei bleibt, um ein Verrutschen des Spritzenblocks zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Schrauben müssen von hinten nach vorne gehen.
  3. Montieren Sie die X-Achse (Abbildung 2).
    1. Setzen Sie vier Linearkugellager (LM8UU x 24 mm) in das X_Left_Block ein und X_Right_Block Teile in die oberen und unteren Löcher, jeweils zwei. Befestigen Sie auch zwei Gurtblöcke mit Schrauben (M2x10) an den Blöcken X rechts und X, so dass Platz für den Gurt bleibt.
    2. Setzen Sie zwei Kugellager (5 x 16 x 5 mm) in die mittleren Löcher X_Right_Block ein, eines auf jeder Seite. Setzen Sie eine Riemenscheibe (Bohrung 5 mm) in den inneren Hohlraum X_Right_Block und verbinden Sie die beiden Kugellager mit einer 5-mm-Stange (35 mm Länge), so dass sie durch die Riemenscheibe geführt wird.
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Montage eine längere Stange, um eine bessere Handhabung zu ermöglichen. Nachdem Sie die Stücke an Ort und Stelle positioniert haben, schneiden Sie den Stab in der gewünschten Länge ab.
    3. Befestigen Sie einen Endschalter mit zwei Schrauben (M3x8) am X_motor_housing. Setzen Sie den NEMA 17-Motor in das Motorgehäuse ein und befestigen Sie die X_block_1 Abdeckung mit vier Schrauben (M3x8) am Motorgehäuse und am Motor.
    4. Befestigen Sie eine Riemenscheibe (Bohrung 5 mm) am Motor und arretieren Sie diese mit Stellschrauben und schrauben Sie dann das montierte Teil in Schritt 1.3.3 mit vier Schrauben (M5x8) zu X_block_1 zusammen. Befestigen Sie auch einen Endschalter an der Unterseite des X_Left_Block mit zwei Schrauben (M3x8).
      HINWEIS: Der Außendurchmesser der Riemenscheiben in den Schritten 1.3.2 und 1.3.4 muss gleich sein.
    5. Setzen Sie zwei Linearkugellager (LM8UU x 45 mm) in die Löcher oben und unten am X_slider ein.
    6. Verbinden Sie die montierten Teile in den Schritten 1.3.2 und 1.3.4 mit zwei 8 mm Stangen (200 mm Länge) und lassen Sie sie in Schritt 1.3.5 durch das montierte Teil laufen.
      HINWEIS: Schneiden Sie die Stangen vor dem Zusammenbau in die gewünschte Länge ab.
    7. Ein Gurtende mit dem Gurtblock und zwei Schrauben (M2x8) am X_slider_belt_connection verriegeln. Den Riemen im montierten Teil 1.3.4 um die Riemenscheibe führen, dann im montierten Teil 1.3.2 um die Riemenscheibe führen und das andere Riemenende mit dem zweiten Riemenblock und zwei weiteren Schrauben (M2x8) an der X_slider_belt Verbindung befestigen. Stellen Sie sicher, dass der Riemen richtig angezogen ist, um die richtige Bewegung zu erhalten.
      HINWEIS: Während dieses Schritts muss die X_slider in Richtung eines Endes der X-Achsenstruktur verschoben werden, um Interferenzen zu vermeiden.
    8. Schrauben Sie den X_slider_belt_connection mit einer Schraube (M6x20) an den X_slider.
    9. Verbinden Sie den Extruder mit dem X_slider und befestigen Sie ihn mit vier Schrauben (M5x10).
  4. Montieren Sie die Y-Achse (Abbildung 3).
    1. Befestigen Sie die Befestigungshalterung mit vier Schrauben (M3x10) und vier Muttern an der oberen Rückseite des Bioprinters.
      HINWEIS: Die Position der Befestigungshalterung kann angepasst werden, um die richtige Spannung des Riemens zu erreichen und das Einsetzen des Schrittmotors zu ermöglichen.
    2. Setzen Sie den Schrittmotor in den Befestigungswinkel ein und verschrauben Sie ihn mit vier Schrauben (M3x8). Als nächstes setzen Sie eine Riemenscheibe (Bohrung 5 mm) auf die Kurbelwelle und fixieren diese mit Stellschrauben.
      HINWEIS: Die Riemenscheibe kann an der Kurbelwelle befestigt werden, bevor der Motor in die Befestigungshalterung eingesetzt wird, um Interferenzen zwischen den Komponenten zu vermeiden.
    3. Platzieren Sie zwei Schaltrollen (8 mm Innendurchmesser) an der vorderen 8 mm Stange und verriegeln Sie sie an den beiden Stangen (2,5 cm vom Ende entfernt). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die hintere Stange und fügen Sie eine weitere Riemenscheibe hinzu, die 5 cm vom rechten Ende entfernt ist.
    4. Befestigen Sie 12 selbstausrichtende Flanschlager (8 mm Durchmesser) an den inneren oberen Teilen des Biodruckers.
    5. Verbinden Sie die beiden vorderen Biodruckerteile und die beiden oberen hinteren Biodruckerteile (Richtung links/rechts) mit den in Schritt 1.4.3 montierten Stangen und verriegeln Sie sie mit den Pendelflanschlagern (8 mm Durchmesser). Befestigen Sie die beiden zusammengebauten Teile an allen Verbindungsstellen mit Schrauben (M3x8).
      HINWEIS: Wenn Sie die hintere Stange positionieren, platzieren Sie einen geschlossenen Riemen, der die Riemenscheibe am Schrittmotor mit der inneren Riemenscheibe an der Stange verbindet.
      HINWEIS: Befestigen Sie den Schrittmotor, indem Sie die Muttern festziehen, um sicherzustellen, dass sich der Motor nicht bewegt und der Riemen richtig gespannt wird.
    6. Verbinden Sie die beiden montierten Teile in Schritt 1.4.5 mit vier 8-mm-Stangen. Lassen Sie die Stangen durch die im Bauteil 1.3 vorhandenen Linearkugellager gleiten und verriegeln Sie sie mit den Pendelflanschlagern (8 mm Durchmesser). Befestigen Sie die beiden zusammengebauten Teile an allen Verbindungsstellen mit Schrauben (M3x8).
    7. Befestigen Sie ein offenes Bandende mit dem Gurtblock am oberen Teil des X_block_1 und wiederholen Sie diesen Vorgang zum X_block_2. Führen Sie den Riemen links um die hinteren Riemenscheiben, dann um die vordere Riemenscheibe und befestigen Sie das andere Riemenende wieder mit einem weiteren Riemenblock an der X_block_1. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das zweite Band.
      HINWEIS: Die Gurte müssen richtig angezogen werden, um die richtige Bewegung zu erhalten, und sie müssen die gleiche Länge haben, um ein Verbiegen oder Interferenzen bei Y-Bewegungen zu vermeiden.
  5. Montieren Sie die Z-Achse (Abbildung 4).
    1. Schrauben Sie die unteren Gehäuseteile des Bioprinters (M4x8) zusammen.
    2. Befestigen Sie ein Pendelflanschlager (8 mm Durchmesser) am Boden der Unterseite des montierten Teils in Schritt 1.5.2.
    3. Befestigen Sie zwei Flansch-Linearkugellager (LMH8UU) mit Schrauben (M3x8) an den äußeren Löchern im Z_slider und eine Gewindemutter in der mittleren Bohrung.
    4. Befestigen Sie einen Endschalter mit zwei Schrauben (M3x8) an der Z_plane linken Seite.
    5. Befestigen Sie den Schrittmotor an einer starren Wellenkupplung. Befestigen Sie einen Schrittmotor mit vier Schrauben (M3x20) am Z_block und eine Gewindestange an der starren Wellenkupplung. Stellen Sie sicher, dass jeder Block mit den Stellschrauben richtig befestigt ist.
    6. Verbinden Sie das in Schritt 1.5.5 montierte Teil mit zwei 8-mm-Stäben mit der Bioprinter-Basis. Lassen Sie sie in Schritt 1.5.3 durch das zusammengebaute Teil laufen.
    7. Befestigen Sie den Z_block mit zwei Schrauben (M5x8) an der Rückwand.
    8. Verbinden Sie Z_plane mit vier Schrauben (M3x25) mit Z_slider. Führen Sie sie von oben nach unten in die Z_plane Löcher ein, führen Sie die Feder zwischen Z_plane und Z_slider und befestigen Sie sie mit Muttern. Passen Sie die Federspannung an, um die Ebene zu nivellieren.
    9. Befestigen Sie vier verstellbare Füße unter der Biodruckerstruktur in der jeweiligen Kavität. Nivellieren Sie den Biodrucker, indem Sie die Füße anpassen.
    10. Verbinden Sie das montierte Teil mit dem montierten Teil in Schritt 1.4.6 mit acht Schrauben (M4x12).
    11. Befestigen Sie zwei Scharniere an der Vorderseite der Struktur an den entsprechenden Stellen und einen Magneten am rechten Teil an der entsprechenden Stelle mit Schrauben (M2x8). Verschrauben Sie die Gesamtstruktur mit 2 mm transparenten Plexiglasplatten, um die Öffnungen zu verschließen.
      HINWEIS: Schrauben Sie die vordere Plexiglasscheibe an die Scharniere und setzen Sie eine weitere Schraube in Übereinstimmung mit dem Magneten ein, um eine Haustür zu erhalten.
  6. Zeigen Sie die Baugruppe an (Abbildung 5A).
    1. Lassen Sie die mit dem Display verbundenen Drähte durch das untere Loch führen und befestigen Sie das Display mit vier Schrauben (M3x3) am Displaygehäuse.
      HINWEIS: Dieser Durchgang muss ohne die Abdeckung des LCD-Knopfes erfolgen. Er könnte sich nach der Befestigung am Displaygehäuse auf dem vorinstallierten Drehknopf befinden.
    2. Verschließen Sie das Gehäuse mit dem Deckel mit vier Schrauben (M2x6).
    3. Setzen Sie die SD-Karte in den linken Steckplatz ein.
    4. Lassen Sie die Drähte durch das Loch an der Oberseite der Struktur führen. Schrauben Sie das zusammengebaute Teil mit zwei Schrauben (M3x8) an der Oberseite des Biodruckers fest.
      HINWEIS: Alle Drähte (Motoren, Endschalter und Anzeige) verlaufen nahe der Wand und treten aus dem unteren linken Loch aus. Sie werden mit Kabelklemmen befestigt, um Eingriffe in die mechanischen Teile zu vermeiden.
  7. Elektronik-Baugruppe (Abbildung 5B)
    1. Befestigen Sie die Buchse mit zwei Schrauben (M3x10) am äußeren Teil des Elektronikgehäuses.
    2. Befestigen Sie das Mainboard mit vier Schrauben (M3x10) am Innenteil des Elektronikgehäuses.
    3. Befestigen Sie den unteren Teil des Netzteils mit vier Schrauben (M3x8) am Innenteil des Elektronikgehäuses.
    4. Führen Sie die Drähte durch das kreisförmige Loch an der Abdeckung und verbinden Sie sie mit dem Motherboard. Verschließen Sie das Elektronikgehäuse mit seiner Abdeckung mit vier Schrauben (M3x10).
      HINWEIS: Es ist möglich, das Elektronikgehäuse an die Struktur des Biodruckers anzuschließen oder es bei kleinen Arbeitsräumen auf dem Schreibtisch zu lassen.
      Abbildung 6 zeigt alle elektronischen Kabelverbindungen. Sie können je nach verwendetem 3D-Drucker-Motherboard leicht unterschiedlich sein.

2. Softwareeinstellung und Gcode-Generierungsprozess

  1. Vorbereitung der Einstellungen der Slicing-Software
    1. Öffnen Sie die Slicing-Software.
      HINWEIS: Die Anweisungen können je nach verwendeter Software oder Version unterschiedlich sein.
    2. Melden Sie sich bei der Plattform an.
    3. Gehen Sie zu den Einstellungsoptionen . Wählen Sie den Drucker aus, und fügen Sie dann einen nicht vernetzten Drucker hinzu. Wählen Sie einen benutzerdefinierten FFF-Drucker aus und geben Sie im Feld Druckername den Namen für den Drucker ein. Klicken Sie auf Hinzufügen.
      HINWEIS: Wenn es sich um die erste Softwareinstallation handelt, wird das Fenster Drucker hinzufügen nach der Anmeldung automatisch geöffnet.
    4. Ändern Sie im Fenster Maschineneinstellungen die Standardeinstellungen x, y, z auf 176, 120, 45 mm.
    5. Deaktivieren Sie die Option Beheiztes Bett, wenn sie nicht bereits deaktiviert ist.
    6. Fügen Sie in den Bereichen "Start-G-Code" und " End-G-Code" die Textzeilen ein, die in den Dateien mit den Titeln "JoVE_Starting_G-code.txt" und "JoVE_Ending_G-code.txt" in der Zusatzdatei 2 gemeldet sind.
      1. Den Wert 150 in der Zeile 'M92 E150' in der Start-G-Code-Datei entsprechend der anzuwendenden Durchflussmenge ändern. Schätzen Sie den richtigen Wert mit der folgenden Formel:
        figure-protocol-1
        Dabei ist Q die gewünschte Durchflussrate [μL/min].
        HINWEIS: Diese Formel wurde experimentell mit dem beschriebenen System erhalten. Anders kann es sein, wenn es Änderungen an den mechanischen oder elektrischen Komponenten gibt. Eine mögliche Alternative könnte darin bestehen, den Wert entsprechend dem verwendeten System zu fixieren und einen benutzerdefinierten MATLAB-Code zu erstellen, um die gewünschte gcode-Datei zu generieren.
    7. Ändern Sie den Wert für Kompatibler Materialdurchmesser im Bereich Extruder 1 auf 1,75 und schließen Sie dann.
    8. Gehen Sie zum Marktplatz, wählen Sie das Plugin für die Z-Offset-Einstellung aus und installieren Sie es. Starten Sie am Ende des Vorgangs die Software neu, um den Vorgang abzuschließen. Wählen Sie nach dem erneuten Öffnen Einstellungen | Drucker | Drucker verwalten in der Symbolleiste. Klicken Sie im Fenster "Einstellungen " auf "Einstellungen " und aktivieren Sie alle Optionen, indem Sie die Option "Alle markieren" auswählen und die Option "Schließen" auswählen.
    9. Konfigurieren Sie das Setup, indem Sie im Bühnenmenü, das das Konfigurationsfenster enthält, auf die Druckeinstellungen (dritte Schaltfläche) klicken. Geben Sie den Prozentsatz der Füllung im aktuellen Druckprofil im Konfigurationsfenster ein. Wählen Sie die Schaltfläche Benutzerdefiniert, um die aktuellen Druckeinstellungen und das Profil Fein im Dropdown-Menü zu ändern. Stellen Sie die Druckgeschwindigkeit auf 10 mm/s ein.
  2. GCode-Vorbereitung
    1. Laden Sie die *. STL-Designdatei mit dem Titel "JoVE_Square" aus der ergänzenden Datei 2 dieses Papiers.
    2. Last. STL-Datei in die Slicing-Software.
    3. Positionieren Sie das Werkstück auf der ebenen Fläche und bewegen Sie es zu den Koordinaten 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Erstellen Sie zwei Kopien, indem Sie auf das Symbol klicken. STL-Dateiname in der Objektliste und Auswahl der Option Ausgewählte multiplizieren. Verschieben Sie sie auf die folgenden Koordinaten: 16, 42,5, 0 mm und -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      HINWEIS: Es ist nicht möglich, die Druckreihenfolge automatisch zu definieren, es sei denn, sie wird direkt in der endgültigen Gcode-Datei manuell geändert. Für eine 6-Multiwell-Platte sind Koordinaten definiert.
    4. Gehen Sie im Bühnenmenü zu den Druckeinstellungen. Geben Sie im Abschnitt Wände den Wert 0 als Anzahl der Wandlinien ein. Geben Sie 0 als Wert für die Dicke von Obere/Untere im Abschnitt Oben/Unten ein. Geben Sie im Füllungsbedienfeld die folgenden Werte ein: Füllmuster: Raster, Abstand der Fülllinie: 5 mm, Richtungen der Fülllinien: [0].
      HINWEIS: Es ist möglich, die Verfahrgeschwindigkeit im Abschnitt Druckgeschwindigkeit zu reduzieren, um die Genauigkeit der X-Achse zu verbessern.
    5. Deaktivieren Sie das Zurückziehen im Abschnitt "Reisen" und drucken Sie die Kühlung im Abschnitt "Kühlung ".
    6. Wählen Sie im Abschnitt "Plattenhaftung erstellen " die Option "Keine " als "Plattenhaftungstyp erstellen" aus, während Sie im Abschnitt "Spezialmodi " die Option "Einzeln oder einzeln " als Drucksequenz auswählen.
    7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Slice, um den G-Code zu generieren.
    8. Öffnen Sie die G-Code-Datei mit der Notepad-Anwendung und entfernen Sie die Zeilen "M104 S200", "M105" und "M109 S200" in Zeile 12 nach dem Satz "; Generiert mit Cura_SteamEngine 4.9.0".
    9. Fügen Sie "G1 Z25" vor der folgenden Zeile "; NETZ: JoVE_Square_rev. STL(6)" und teilen Sie den nächsten in zwei Teile auf: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 und (2) G1 Z0.3.
      HINWEIS: X- und Y-Koordinaten sind nur Beispiele.
    10. Ändern Sie den Z-Wert in jeder Zeile nach " auf Z25 . TIME_ELAPSED" kommentieren jede noch so kleine Schichtanweisung jedes Stücks.
      HINWEIS: Um nur ein einzelnes Stück zu drucken, ist Schritt 2.3.10 nicht erforderlich.

3. Quell-/Abbautest

  1. Vorbereitende Schritte
    1. Nehmen Sie eine sterile 1-ml-Glasspritze (TLL-Terminal) und eine sterile konische 25-G-Düse. Montieren Sie sie und stellen Sie die zusammengebaute Spritze in den Kühlschrank.
    2. Legen Sie die Pipettenspitzen und das SBMe-Matrizenfläschchen am Tag vor dem Experiment über Nacht in den Kühlschrank.
    3. Drucken Sie drei PLA-Gitter (Φ = 20 mm) mit einer kreisförmigen Porengröße von 1 mm x 1 mm und einer seitlichen vertikalen Säule, um sie zu greifen.
  2. Drucken von Konstrukten
    1. Nehmen Sie die zusammengebaute Spritze und das SBMe-Matrixfläschchen aus dem Kühlschrank. Aspirieren Sie 500 μl der SBMe-Matrix und legen Sie sie für 15 Minuten in den Inkubator, um die Gelierung zu ermöglichen.
    2. Nehmen Sie die Spritze aus dem Inkubator und legen Sie sie in den Druckkopf des Bioprinters. Stellen Sie sicher, dass der Spritzenkolben richtig mit dem Schubblock in Kontakt steht.
    3. Befestigen Sie den Spritzenbefestigungskolben und den Flansch des Spritzenzylinders mit den Kolbenhalterungen der Spritze und den Spritzenzylinder mit der Spritzenklemme.
    4. Kalibrieren Sie das System mit der Auto-Home-Einstellung im Bioprinter-Menü, um den Ursprung der Achsen automatisch zu erkennen.
    5. Bewegen Sie den Extruder mit dem Befehl Achsen verschieben , bis die Nadelspitze das PLA-Gitter berührt, um Z0 manuell zu definieren.
    6. Starten Sie den Druck, indem Sie die zu druckende G-Code-Datei im Bioprinter-Menü auswählen.
    7. Legen Sie die Multiwell-Platte für 2 Minuten in den Inkubator, damit sich der SBMe nach der Extrusion absetzen kann.
    8. Nehmen Sie die Multiwell-Platte und geben Sie 2 ml Zellkulturmedium in die drei Vertiefungen, die die biogedruckten Gitter enthalten. Legen Sie die Multiwell-Platte in den Inkubator.
    9. Nehmen Sie zu jedem Zeitpunkt (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 und 14 Tage) jedes Gitter von der Platte und trocknen Sie es mit sauberem Papier, um das überschüssige Medium und Gewicht auf einer Waage zu entfernen. Setzen Sie das Gitter wieder in die Platte und dann in den Inkubator ein, um das Experiment fortzusetzen. Schätzen Sie das Quellverhältnis und die Abbaurate mit den folgenden Formeln:
      figure-protocol-2
      Dabei ist Wt das Gewicht der Konstrukte zu jedem Zeitpunkt und Wt0 das Gewicht der getrockneten Konstrukte.
      figure-protocol-3
      Dabei ist Wi das Gewicht am Ende des Quelltests.

4. Bioprinting von SBMe-Konstrukten

  1. Vorbereitende Schritte
    1. Nehmen Sie eine sterile 1 mL Glasspritze (TLL-Terminal) und eine sterile konische 25 G Düse und montieren Sie sie unter der Biosicherheitswerkbank. Lege sie in eine sterile Box im Kühlschrank.
    2. Legen Sie die Pipettenspitzen und das SBMe-Matrizenfläschchen am Tag vor dem Experiment über Nacht (4 °C auf Eis) in den Kühlschrank.
    3. Geben Sie 20 μl Trypanblau in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    4. Stellen Sie die Zentrifuge auf 345 × g, 4 °C ein und lassen Sie sie abkühlen (~3-4 h).
    5. Nehmen Sie 5 mL Wasser in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen als Waage für die Zentrifuge.
    6. Phosphatpufferlösung (PBS) und Medien in einem Wasserbad erwärmen.
      HINWEIS: Das Zellkulturmedium besteht aus vollständigem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), Penicillin-Streptomycin und L-Glutamin ergänzt wird.
    7. Stellen Sie den Biodrucker unter die biologische Sicherheitswerkbank. Unter UV-Licht 20 min sterilisieren.
      HINWEIS: Um das ordnungsgemäße Funktionieren des Biodruckers zu gewährleisten, führen Sie die Auto-Home-Funktion aus und überprüfen Sie die korrekten Bewegungen jeder Achse und die Funktion der Endschalter.
  2. Bioink-Vorbereitung
    1. Nehmen Sie den Kolben in den Inkubator mit handelsüblichen murinen Prostatakrebszellen und stellen Sie ihn unter die Biosicherheitswerkbank.
    2. Nehmen Sie das Zellkulturmedium aus dem Kolben.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll angegebenen Volumina gelten für T25-Zellkulturflaschen.
    3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL PBS und aspirieren Sie es dann.
    4. Fügen Sie 500 μl Trypsin hinzu und stellen Sie den Kolben für 5 Minuten in den Inkubator, damit sich die Zellen von der Platte lösen können.
    5. Überprüfen Sie die Zellen auf Trypsinisierung und klopfen Sie gegebenenfalls vorsichtig auf den Kolbenboden.
    6. 4,5 ml Medium in den Kolben geben. Waschen Sie die Platte sorgfältig, um sicherzustellen, dass alle abgelösten Zellen im Zellkulturmedium schwimmen.
    7. Saugen Sie das Medium an und geben Sie es in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    8. Nehmen Sie ein 20 μL Aliquot und mischen Sie es mit dem Trypanblau-Aliquot. Geben Sie dann 10 μl dieser Mischung in die Zellzählkammer, um die lebenden Zellen nach der folgenden Formel zu zählen:
      figure-protocol-4
      wobei f der Verdünnungsfaktor für Trypanblau-Suspension (Verhältnis 1:1) ist; V ist das Zellsuspensionsvolumen [ml].
    9. Die restliche Zellsuspension wird 5 min lang (345 × g, 4 °C) zentrifugiert.
    10. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in der kalten SBMe-Matrix mit der gewünschten Zelldichte (10,6 Zellen/ml)
    11. 800 μl der Matrixsuspension, die Zellen enthält, mit der kalten Spritze aspirieren.
    12. Entfernen Sie die Luftblasen, die in der Spritze eingeschlossen sein könnten, und legen Sie sie in eine sterile Schachtel. Legen Sie es dann für 15 Minuten in den Inkubator, um die Gelierung zu ermöglichen.
  3. Bioprinting-Verfahren
    1. Nehmen Sie die Spritze aus dem Inkubator und stecken Sie sie in den Druckkopf des Bioprinters. Stellen Sie sicher, dass der Spritzenkolben richtig mit dem Schubblock in Kontakt steht.
      HINWEIS: Das Modell und das Volumen müssen mit der für den Versuch verwendeten Spritze übereinstimmen.
    2. Befestigen Sie den Spritzenbefestigungskolben und den Flansch des Spritzenzylinders mit den Kolbenhalterungen der Spritze und den Spritzenzylinder mit der Spritzenklemme.
    3. Verwenden Sie M4-Muttern am unteren Teil des Extruders, um den Federdruck einzustellen und die Spritze zu verriegeln.
      HINWEIS: Die Schritte 4.3.1 bis 4.3.4 sind in Abbildung 7 dargestellt.
    4. Kalibrieren Sie das System mit der Auto-Home-Einstellung im Bioprinter-Menü, um den Ursprung der Achsen automatisch zu erkennen.
      HINWEIS: Dieser Abschnitt gewährleistet immer die richtigen Anfangseinstellungen, unabhängig von der Art des Trägers, den wir für den Druck verwenden.
    5. Platzieren Sie eine 6-Multiwell-Platte auf der Druckebene.
    6. Bewegen Sie den Extruder mit dem Befehl Achsen verschieben , bis die Nadelspitze den Boden der Vertiefung berührt, um Z0 manuell zu definieren.
    7. Wählen Sie die gcode-Datei im Menüpunkt des Bioprinter-Menüs aus und starten Sie den Druck. In jede Vertiefung wird ein quadratisches Gitter mit sechs Schichten (2,6 cm Seite) gedruckt.
    8. Verwenden Sie nach dem Bioprinting-Prozess ein inverses Mikroskop, um sicherzustellen, dass der Druckprozess erfolgreich war, und legen Sie die Multiwell-Platte für 2 Minuten in den Inkubator, damit sich das SBMe nach der Extrusion absetzen kann.
    9. Geben Sie 2 ml Zellkulturmedium in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Das Volumen muss die Konstrukte vollständig abdecken.

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Ergebnisse

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Bioprinting von Konstrukten aus SBMe mit einem kostengünstigen, maßgeschneiderten, volumetrischen Bioprinter vor. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung und 3D-Druck * zur Verfügung. STL-Dateien zum Aufbau des Systems und wir demonstrieren den potenziellen Einsatz in der Krebsforschung, indem wir ein- und mehrschichtige Strukturen drucken. Jedes 3D-gedruckte Bauteil wurde vor dem Zusammenbau ordnungsgemäß von Stützstrukturen oder unerwünschten Druckrückständen gerei...

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Diskussion

In der translationalen Forschung sind SBMes in einer Vielzahl von Forschungsbereichen besonders wertvoll, vom Tissue Engineering bis zur Wirkstofftestung 2,3. Insbesondere sind sie in der Krebsforschung von grundlegender Bedeutung, da sie mechanische und biochemische Eigenschaften der Tumormikroumgebung replizieren und so die Entwicklung von Modellen ermöglichen, die das Tumorwachstum, die Metastasierung und das Ansprechen auf di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch den Accelerator Award Nr. A26815 mit dem Titel: "Single-cell cancer evolution in the clinic" finanziert, der durch eine Partnerschaft zwischen Cancer Research UK und der Fondazione AIRC (Nr. 22790) und durch die Europäische Union - Next Generation EU, Mission 4, Component 1, CUP D53D23003310006 finanziert wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Multiwell-PlatteSigma-AldrichCLS351143
3D-FDM-DruckerFlashforgeAdventurer 5M Pro
3D-Drucker MotherboardGEETECHGT2560 REV A+
6-Multiwell-PlatteSigma-AldrichM8687
AC-SockelHiLetgohttps://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket
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socket+hiletgo%2Caps%2C173& sr=8-1		15 A 250 V
StellfüßeEXIN DEHCENhttps://www.amazon.it/gp/product/
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search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Höhe 27-40 mm
Kugellager 4 mmQUARKZMAN684ZZAbmessungen 4 x 9 x 4 mm
Kugellager 5 mmXiKe625-2RSAbmessungen 5 x 16 x 5 mm
Riemen geschlossenTurmberg3Dhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Breite 6 mm
Gurt offenFajoedahttps://www.amazon.it/gp/product/
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search_asin_title?ie=UTF8& th=1		Breite 6 mm
Bioprinting-DüseFisher Scientific17780789Corning  Konische Standard-Bioprinting-Düsen
Bü rker ZellzählkammerGLASWARENFABRIK KARL HECHT
ZentrifugeEppendorf5702 R
ZentrifugenröhrchenSigma-AldrichCLS43147015 mL
ZentrifugenröhrchenSigma-AldrichEP00301200861,5 mL
DisplaySigma-AldrichBR718905
DMEM Gibco Thermofisher11965092
FBSSigma-AldrichF7524
Flansch-LinearkugellagerSourcing Maphttps://www.amazon.it/gp/product/
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GlasspritzeFisher Scientific11520062Hamilton GasDicht 1 mL (TLL-Anschluss)
ScharniereYASQZhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1
InkubatorFisher Scientific15481374Eppendorf  Galaxy 48 R CO2  Inkubator, 48 L,
Inverses MikroskopNikonEclipse Ti2-U
ÜberbrückungskabelIverntechhttps://www.amazon.it/Iverntech-XH2
-54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/
B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_
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LCD-EinheitParadisetronic.comhttps://www.amazon.it/Display-controller
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Industrie& sprefix=anzeigen%2B3d%2B
Drucker%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial%
2C143& sr=1-9& th=1		Altes Prusa i3 LCD-Gerät. Link zur handelsüblichen Alternative
Gewindespindel M8RS PRO280-408
Gewindemutter M8Comiokehttps://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4?
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Schrauben Gewindemutter T8Aipaidehttps://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref
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Leitspindel T8VBESTLIFEhttps://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref
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L-GlutamminSigma-AldrichG7513
EndschalterCESFONJERhttps://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8& psc=1
Linearkugellager (LM4UU)A ABSOPROhttps://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Abmessungen 4 x 8 x 12 mm
Linearkugellager (LM8LUU)Fdithttps://www.amazon.it/LM8LUU-Linear
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Fdit& nsdOptOutParam=wahr& qid=17347
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Linearkugellager (LM8UU)ARCELIhttps://www.amazon.it/gp/product/
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MagneteOCEUMAOAhttps://www.amazon.it/gp/product/
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search_asin_title?ie=UTF8& d=1		8 x 3 mm
MatrigelGibco ThermofisherLOT 0202003SBMe
Motortreiber Longrunerhttps://www.amazon.it/gp/product/
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_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Treiber A4988
PBSMicroGem, VWRTL1006-500ML
Penicillin-StreptomycinGibco Thermofisher15070063
PipettenspitzenSigma-AldrichZ740058MARKE  Filterspitzen, im Rack, TipBox (Volumen 50-1000 μ L)
PlexiglasplattenMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti-
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E& dib_tag=se& Schlüsselwörter=Lastra+Plexiglas+
2+mm& nsdOptOutParam=wahr& qid=1734702823& sr=8-14		2 mm stark, transparente Platte, 21 x 32,5 cm
PlexiglasplattenMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
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& Schlüsselwörter=Lastra+Plexiglas+2+mm& nsd
OptOutParam=true& qid=1734702823& sr=8-15		2 transparente Platten, 2 mm Stärke, 20 x 20 cm
PlexiglasplattenMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
-plexiglas-trasparente-decorazione/dp/B0C
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N_E& dib_tag=se& Schlüsselwörter=lastra+plexigl
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Polymilchsäure (PLA) FilamentFlashforgeBlack 100102
NetzteilSQUADOhttps://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore
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dib_tag=se& keywords=Stromversorgung+sup
-SCHICHT+AC+EINGANG%3A+110-220V%2
C+DC+AUSGANG%3A+12V+15A& n
sdOptOutParam=wahr& qid=173471
4722& sr=8-6		Old Prusa i3 Netzteil (AC-EINGANG: 110-220 V, DC-AUSGANG: 12 V 15 A). Link zur handelsüblichen Alternative
Riemenscheibe 5 mmVooGenzekhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Bohrung 5 mm, Breite Riemenabstand 6 mm
Riemenscheibe 8 mmYxtaiihttps://www.amazon.it/gp/product/
B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& d=1		Bohrung 8 mm, Breite Gurtabstand 6 mm
FlachbandkabelQUARKZMANhttps://www.amazon.it/sspa/click?ie
=UTF8& spc=MTo0NDgyNTkwNzU
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c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN
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AN-connettore-Lunghezza-Comput
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J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D
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wSgrpnkMhhsJj3NRo8Mvht8ev5H
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