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RASopathien sind genetische Syndrome, die die normale Entwicklung beeinträchtigen und verschiedene Organe und Gewebe betreffen. Diese Zustände werden häufig durch Keimbahn-Gain-of-Function-Mutationen (GoF) in den Schlüsselgenen und Akteuren verursacht, die an der RAS/MAK-Signalübertragung beteiligt sind, was zu einer Hyperaktivierung (erhöhte Phosphorylierung) der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK) führt. ERK reguliert einige grundlegende Prozesse, die während der Entwicklung wichtig sind - das Gewebewachstum -, indem es in den Zellkern transloziert 1,2. Somatische Mutationen in Genen, die am RAS-MAPK-Signalweg beteiligt sind, sind die häufigsten Ereignisse, die zu Krebs führen3. So ist es nicht verwunderlich, dass eine Krebsveranlagung auch bei RASopathien beobachtet wird. Das Noonan-Syndrom (NS), gekennzeichnet durch Entwicklungsverzögerung, Kleinwuchs, kognitive Defizite mit unterschiedlichem Schweregrad und Kardiomyopathie, ist die häufigste Form der RASopathie2. In den meisten Fällen wird die Krankheit durch GoF-Mutationen in PTPN11 verursacht, dem ersten RASopathie-Gen, das Anfang 2000 entdeckt wurde4 und für das Protein Tyrosinphosphatase SHP2 kodiert, das als positiver Regulator des Signalwegs fungiert.
Seitdem werden dank des exponentiellen Einsatzes von Exom-Sequenzierungsansätzen bei nicht diagnostizierten Patienten weiterhin potenziell pathogene Varianten entdeckt, die Faktoren beeinflussen, die an der RAS-MAK beteiligt sind und wahrscheinlich mit verschiedenen Formen von RASopathien in Verbindung stehen, und warten auf eine funktionelle Charakterisierung für eine effiziente Patientenstratifizierung2. Um dieses Ziel zu erreichen, sind experimentelle Protokolle erforderlich, die eine schnelle und aussagekräftige funktionelle Validierung auf organismischer Ebene gewährleisten. Der Einsatz klassischer und standardisierter Säugetiermodelle zur Untersuchung von Varianten mit unbekannter Signifikanz wäre kostspielig, extrem zeitaufwändig und würde invasive Methoden bei intransparenten Großtieren erfordern. Eine solche Strategie ist angesichts der gesellschaftlichen Belastung durch arme oder nicht diagnostizierte RASopathie-Patienten, die derzeit ohne Behandlung oder Behandlung sind, eindeutig nicht mit dem Erfordernis schneller Tests vereinbar. Protokolle zur quantitativen Bewertung wichtiger phänotypischer Merkmale und molekularer Korrelate in ganzen Organismen würden auch dazu dienen, die mögliche klinische Translation von Medikamenten, die möglicherweise RASopathie-Patienten zur Verfügung stehen, durch Umwidmung/Neupositionierung zu beschleunigen.
Der Zebrafisch ist ein ideales Wirbeltiermodell, um Krankheiten zu untersuchen, die die frühe Entwicklung beeinflussen. Zunächst einmal teilen Zebrafische ein hohes Maß an genetischer Homologie mit dem Menschen. Die hohe Fruchtbarkeit erwachsener Fische führt zu einer großen Produktion von Embryonen, die klein sind und sich schnell entwickeln. Embryonen sind in frühen Stadien transparent, so dass wichtige Entwicklungsprozesse - Epibolie, Gastrulation, Achsen und Körperbaubildung - mit der Standardmikroskopie mühelos sichtbar gemacht werden können. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeit transgener Linien, die zur Verfolgung des spezifischen zellulären Verhaltens und dynamischer molekularer Ereignisse in Raum und Zeit während der Entwicklung in Verbindung mit fortschrittlichen Techniken zur Generierung genetischer Modelle verwendet werden können, unschlagbar. Darüber hinaus können phänotypische Messwerte bei Zebrafischen auf mehreren Ebenen (von organismischen bis hin zu zellulären Defekten) bewertet werden, und spezielle Assays sind bereits für mehrere Krankheiten, einschließlich RASopathien5, etabliert. Darüber hinaus ermöglichen relativ einfache Bad-Immersionsmethoden für die Verabreichung von Arzneimitteln in den frühen Stadien, zumindest für wasserlösliche Verbindungen, ein Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening in vivo in einem 96-Well-Format.
Aus molekularer Sicht zeigen Studien mit Standardansätzen wie Immunhistochemie und Immunoblot die Korrelation zwischen ERK-Aktivierung und RASopathie-assoziierten Entwicklungsdefekten in Fischembryonen 6,7. Der kürzlich entwickelte FRET-Biosensor vom EKAR-Typ im Zebrafisch (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) bietet ein zuverlässiges in vivo Werkzeug, um die ERK-Aktivierung während der Embryogenese räumlich und zeitaufgelöst zu registrieren. Daher könnte es für eine bessere Beurteilung dynamischer ERK-Veränderungen und pharmakologischer Modulationen in RASopathie-Fischmodellen wertvoll sein.
Im Teen-Sensor wird ein spezifisches ERK-Substrat im Reporter bei ERK-Aktivierung phosphoryliert, wodurch eine Konformationsänderung ausgelöst wird, die den fluoreszierenden CFP-Donor (D) und den fluoreszierenden Ypet-Akzeptor (A) in die Nähe bringt. Überlappt sich das D-Emissionsspektrum stark mit dem Absorptionsspektrum des A, kann es zu FRET kommen (Energieabsorption von D nach A). Dies ist proportional zum Abstand zwischen D und A und damit in Teen zum ERK-Aktivierungsstatus. Unterschiedliche Bildgebungsprotokolle können sowohl mit Standard- als auch mit fortschrittlichen Bildgebungsmodulen von Standard- oder Konfokalmikroskopen sowohl in lebenden als auch in fixierten Proben eingerichtet werden. Nach D-Anregung gehört die Erfassung von multispektralen Scans entlang eines definierten Emissionsspektrums (λ) von CFP bis YFP, gefolgt von spektralen "Entmischungs"-Algorithmen, zu den zuverlässigsten Methoden zur Registrierung und Quantifizierung von FRET-Daten8. Es kann auch auf lebende Zebrafischproben angewendet werden, um die in vivo Gewebedynamik zu erfassen.
In Anlehnung an frühere Berichte 6,9 und unsere jüngste Anwendung7 beschreiben wir hier den Schritt-für-Schritt-Workflow mit Teen Fish zur Beurteilung der ERK-Aktivierung in Zellen am Rand des tierischen Pols von NS-Modellen zu Beginn der Gastrulation und korrelieren sie mit charakteristischen Defekten der Körperachsen, die erst später in der Entwicklung sichtbar werden. Wir zeigen, wie quantitative FRET-Daten aus lebenden NS-Gastruten vor und nach der Behandlung mit einem verfügbaren MEKi gewonnen und untersucht werden können und wie die Ergebnisse mittels Standardimmunhistochemie gegen phosphoryliertes (aktives) ERK validiert oder korrelative morphometrische Analysen von embryonalen Elongationsdefekten durchgeführt werden können.
Der Workflow könnte angewendet werden, um den Funktionstest von neu auftretenden Varianten und Krankheitsgenen, die mutmaßlich mit RASopathien assoziiert sind, zu verbessern und Einblicke in die Korrelation der ERK-Aktivierungsdynamik räumlich und zeitlich während der Wirbeltierentwicklung und der morphologischen Defekte in Embryonen zu erhalten. Wir zeigen, dass dieses Protokoll auch verwendet werden kann, um die Wirksamkeit von Medikamentenkandidaten zu testen, die die ERK-Aktivierung modulieren.