Methodenartikel

Einseitige Lungenvolumenanalyse mittels Mikro-CT zur besseren Beurteilung der Lungenfibrose in präklinischen Modellen

DOI:

10.3791/67837

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20. Juni 2025

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1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Second Department of Elderly Respiratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangdong Provincial Geriatric Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) vor, um beatmete Regionen in einem unilateralen Bleomycin-induzierten Lungenfibrosemodell durch intratracheale Instillation auf der Läsionsseite zu quantifizieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Lungenfibrose (PF) ist eine fortschreitende und irreversible interstitielle Lungenerkrankung, die durch eine schlechte Prognose und begrenzte Behandlungsmöglichkeiten gekennzeichnet ist. Das traditionelle Mausmodell der Lungenfibrose, die durch intratracheale Instillation von Bleomycin induziert wird, kann zu einer ungleichmäßigen Arzneimittelverteilung und hohen Mortalitätsraten führen. Die verfeinerte unilaterale intratracheale Instillationsmethode für die Verabreichung von Bleomycin bei Mäusen ermöglicht die Erstellung eines einheitlicheren und kontrollierteren Lungenfibrosemodells, das eine bessere Simulation der Krankheit beim Menschen ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das mittels Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) beatmete Regionen in einem unilateralen Bleomycin-induzierten Lungenfibrosemodell mittels intratrachealer Instillation auf der Läsionsseite quantifiziert. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung des Gesamtlungenvolumens und der beatmeten Lungenregionen und liefert ein sensitives und genaues Maß für das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf die Behandlung. Diese Studie umfasst die Anästhesie, die präzise Verabreichung von Medikamenten, Mikro-CT-Scans und die Nachbearbeitung mit der 3D-Slicer-Software zur Bildanalyse. Die einseitige Lungenvolumenanalyse nach Bleomycin-Behandlung zeigte eine signifikante Verringerung des Lungenvolumens im Vergleich zu Kontrollen. Die Trichrom-Färbung nach Masson bestätigte das Vorhandensein und die erhöhte Ablagerung von Kollagen bei den BLM-behandelten Mäusen. In dieser Arbeit haben wir die Lungenfibrose in präklinischen Modellen untersucht, indem wir eine einseitige Lungenvolumenanalyse mittels Mikro-CT durchgeführt haben, um den Forschern eine präzise und gründliche Bewertungsmethode für die Bewertung therapeutischer Interventionen in PF-Studien zur Verfügung zu stellen.

Einleitung

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Die Lungenfibrose (PF) ist eine verheerende und irreversible Lungenerkrankung mit begrenzten Behandlungsmethoden. Die weltweite Inzidenz von PF liegt zwischen 1 und 13 pro 100.000 Personen, wobei mit zunehmendemAlter ein signifikanter Anstieg der Prävalenz beobachtet wird. Trotz erheblicher Anstrengungen in den letzten Jahrzehnten ist die therapeutische Landschaft für PF nach wie vor begrenzt: Derzeit sind nur zwei Antifibrotika, Nintedanib und Pirfenidon, für die Behandlung von PF2 zugelassen. Die zugrundeliegende Pathogenese der Lungenfibrose ist hochkomplex und umfasst verschiedene Aspekte der molekularen und zellulären Physiologie3. Experimentelle in vivo-Tiermodelle, die durch verschiedene Wirkstoffe induziert werden, sind derzeit wesentliche Werkzeuge zur Untersuchung pathogener Mechanismen und Krankheitsphänotypen.

Das Bleomycin-induzierte Lungenfibrose-Mausmodell, das mittels intratrachealer Instillation verabreicht wird, ist weithin anerkannt für die Aufklärung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen und für die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele4. Die asymmetrische und nichtselektive Verteilung von intratracheal instilliertem Bleomycin kann jedoch zu hohen Mortalitätsraten führen, vor allem aufgrund von inhomogener Fibrose und bilateraler Lungenschädigung 5,6. Um dieses Problem anzugehen, haben wir einen unilateralen intratrachealen Verabreichungsansatz vorgeschlagen, um eine gleichmäßige Verabreichung von experimentellen Wirkstoffen in der linken Lunge zu gewährleisten und den bei PF-Patienten beobachteten pathologischen Prozess besser nachzuahmen 7,8,9. Darüber hinaus kann die unilaterale Verabreichungstechnik auch zur Bewertung von Arzneimitteln verwendet werden, die eine lokalisierte Verteilung erfordern, oder für andere experimentelle Eingriffe, die auf eine bestimmte Lunge abzielen.

In präklinischen Modellen hat sich die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) für die Untersuchung von Lungenerkrankungen als immer wertvoller erwiesen und sich als leistungsfähiges Instrument für Längsschnittstudien erwiesen, das in der Lage ist, qualitative und quantitative Daten zur Überwachung des Krankheitsverlaufs sowie des Ansprechens auf Therapieinterventionen zu liefern10. Die Mikro-CT wurde verwendet, um das Gesamtvolumen, die beatmeten und nicht beatmeten Regionen, die Bronchialmorphologie und die Gewebedichte zu bewerten. Basierend auf unseren vorangegangenen Studien haben wir ein neuartiges bildgebendes Verfahren entwickelt, bei dem mittels Mikro-CT das einseitige Lungenvolumen analysiert und die Fibrosewerte in einem murinen Modell der Lungenfibrosebeurteilt wurden 7,8,9. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von belüfteten Lungenregionen und liefert so ein genaueres und sensitiveres Maß für das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf die Behandlung.

In dieser Studie wird eine einseitig beatmete Lungenvolumenanalysemethode vorgestellt, die aus Mikro-CT-Scans bei Mäusen abgeleitet wurde, die mit Bleomycin behandelt wurden. Diese innovative Methode ermöglicht eine präzisere und umfassendere Beurteilung der Lungenfibrose und verändert möglicherweise die Art und Weise, wie wir die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen in präklinischen Studien bewerten. Diese Studie leistet einen hervorragenden Beitrag zur Verfeinerung der Analyse präklinischer Lungenfibrosemodelle und bietet eine leistungsstarke quantitative Analysemethode zur Bewertung von Behandlungseffekten neben dem Fortschreiten der Krankheit.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Guangzhou Medical University genehmigt. Die Experimente wurden an 6-8 Wochen alten, 25-30 g schweren männlichen C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht: 25 Lux) mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht und nach dem Zufallsprinzip Kontroll- und BLM-Gruppen zugeteilt.

1. Einseitige pulmonale intratracheale Instillation

  1. Anästhesieren Sie C57BL/6 männliche Mäuse (6-8 Wochen alt, 25-30 g) mit einer intraperitonealen Injektion von 1% Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg).
  2. Überwachen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie die Atemfrequenz und den Rückzugsreflex der Gliedmaßen beobachten.
  3. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage auf einem Kunststoffbrett, das um 70°-90° abgewinkelt ist und von den Schneidezähnen und Gliedmaßen festgehalten wird.
  4. Verwenden Sie eine sterile Zange mit stumpfen Enden, um die Zunge sanft zurückzuziehen.
  5. Führen Sie mit einem Kleintierlaryngoskop eine spezielle stumpfe 22-G-Nadel in die Luftröhre ein, um die Epiglottis- und Oropharynxstrukturen sichtbar zu machen. Drehen Sie das Brett gegen den Uhrzeigersinn um -70°, um den linken Hauptbronchus parallel zum Hauptbronchus auszurichten. Schieben Sie die Nadel vor, bis ein Widerstand zu spüren ist.
    HINWEIS: Messen Sie die Katheterlänge mit einer Übungsmaus ähnlicher Größe vor, um eine optimale Einführlänge zu gewährleisten.
  6. Drehen Sie die Maschine schnell in einen Winkel von 30° und infundieren Sie 40 μl Bleomycin-Lösung (0,02 mg). Entfernen Sie die Nadel.
  7. Halten Sie die Maus mindestens 30 s lang in Position, um die richtige Verteilung des Arzneimittels zu gewährleisten.
  8. Lassen Sie die Maus auf einer wärmenden Decke liegend zurückkommen.

2. Mikro-Computertomographie (Mikro-CT)

HINWEIS: Die Mäuse wurden mit dem Mikro-CT-System gemäß den Anweisungen des Herstellers gescannt.

  1. Führen Sie 3 Wochen nach der Bleomycin-Instillation eine Mikro-CT-Untersuchung an Mäusen durch.
  2. Geben Sie eine angemessene Menge Isofluran in den Verdampfer des Gasanästhesiegeräts für kleine Tiere, schalten Sie den Verdampfer ein, stellen Sie die Induktionskonzentration auf 3% ein und legen Sie die Mäuse in die Induktionsbox, bis sie den Flip-Flop-Reflex verlieren und eine langsame, tiefe Atmung zeigen.
  3. Nehmen Sie die Mäuse aus der Induktionsbox und legen Sie sie in Rückenlage auf den Scantisch, so dass die Mäuse ihre Gliedmaßen ausgestreckt und ihre Körper entlang der Mittellinie ausgerichtet haben.
  4. Stellen Sie die Erhaltungskonzentration von Isofluran in der Scantabelle auf 1 % ein.
  5. Stellen Sie den Micro-CT-Scanmodus ein: queres Sichtfeld 43 mm, Auflösung 2K x 2K, Pixelgröße 0,042 mm, Schichtdicke 0,042 mm.
  6. Legen Sie die Mäuse nach dem Scannen auf eine wärmende Decke, bis sie aufwachen.

3. Mikro-CT-Nachbearbeitung: Einseitige selektive Lungensegmentierung und Volumenanalyse

HINWEIS: Die Bildverarbeitung und quantitative Analyse wurden mit der kostenlosen Open-Source-Software 3D Slicer (http://www.slicer.org) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zur Normalisierung der HU-Bilder wurden klinische Bereiche der Hounsfield Unit (HU) für das Lungenfenster angewendet, wobei das Lungenparenchym in normo-belüftete Regionen ([-1000, -350] HU) segmentiert wurde, wie zuvor berichtetwurde 8,9,11. Der Ablauf der Bildverarbeitung wird wie folgt beschrieben:

  1. Öffnen Sie den 3D-Slicer. Die Betriebsschnittstelle ist in Abbildung 1 dargestellt.
  2. Klicken Sie auf Laden , um Bilddaten im DICOM-Format zu importieren. Axiale, koronale und sagittale Bilder werden in der Hauptschnittstelle angezeigt (Abbildung 2).
  3. Passen Sie die Parameter für die sagittale Ansicht an, wie in Abbildung 3 gezeigt (optional). (1: Versteckte Optionen anzeigen; 2: Aktuelles Volume umbenennen; 3: Neuen Namen eingeben).
  4. Klicken Sie im Modul Segmenteditor auf Hinzufügen , um eine Segmentierung für die selektive Lungenanalyse (rechte Lunge) zu erstellen (Abbildung 4) (1: Volumen; 2: Segmenteditor; 3: Segment hinzufügen; 4: Schwellenwert festlegen; 5: Schwellenwert anpassen; 6: Zur Maskierung verwenden; 7: Kugelpinsel einstellen).
  5. Stellen Sie den Schwellenwert auf [-1000, -350] HU ein und aktivieren Sie die Option Zur Maskierung verwenden .
  6. Verwenden Sie das Malwerkzeug mit einem Kugelpinsel, um die gewünschten Lungenbereiche zu segmentieren.
  7. Wählen Sie das Inselwerkzeug aus und wählen Sie Ausgewählte Insel beibehalten. Markieren Sie die rechte Lunge und klicken Sie dann auf 3D anzeigen , um das 3D-Modell im Visualisierungsfenster anzuzeigen (Abbildung 5) (1: Bearbeiten von Inseln (verbundene Komponenten); 2: Wählen Sie "Ausgewählte Insel beibehalten"; 3: 3D-Modell anzeigen).
  8. Ändern Sie im Bedienfeld Terminologie die Farbe des 3D-Modells in Blau (optional).
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.6 für die linke Lunge. Verarbeiten Sie die axialen Thorax-CT-Bilder Schicht für Schicht, um das beatmete linke Lungenvolumen zu berechnen und ein 3D-Modell zu erstellen (Abbildung 6).
  10. Ändern Sie die Farbe des 3D-Modells der linken Lunge in Gelb (optional).
  11. Legen Sie die Deckkraft der Segmentierung der rechten Lunge auf 0,2 fest.
  12. Exportieren Sie das 3D-Modell nach Bedarf (Abbildung 7).
  13. Nehmen Sie Screenshots der 3D-Ansicht oder des Slic-Bildes auf und speichern Sie sie (Abbildung 8) (1: Anmerkungs-Screenshot; 2: Wählen Sie das Format des Bildes; 3: Ändern Sie den Speicherpfad).
  14. Verwenden Sie das Modul Segmentstatistik, um das Lungenvolumen (mm 3) für jedes Segment zu berechnen und eine quantitative Analyse normo-belüfteter Regionen durchzuführen (Abbildung 9).

figure-protocol-1
Abbildung 1: Die Benutzeroberfläche der 3D Slicer Software. Die Abbildung zeigt die Hauptbedienungsschnittstelle der 3D Slicer-Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: CT-Bilder der Lungenfibrose, die durch einseitige intratracheale Instillation bei Mäusen induziert wird. Axiale, koronale und sagittale Ansichten sowie 3D-Lungenrekonstruktion nach der Bleomycin-Instillation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Anpassung der Parameter der sagittalen Ansicht. Die Abbildung veranschaulicht die Anpassung von Parametern, die eine präzise Visualisierung und Analyse ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-4
Abbildung 4: Bearbeitung der Segmentierung und Parameteranpassungen. Die Abbildung zeigt den Prozess der Segmentierungsbearbeitung und die entsprechenden Parameteranpassungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: 3D-Segmentierung der rechten Lunge. Der Prozess umfasst drei aufeinanderfolgende Schritte: Bearbeiten verbundener Komponenten für die Lungensegmentierung (Schritt 1), Auswählen von Ausgewählte Insel beibehalten , um die rechte Lunge zu isolieren (Schritt 2), und Klicken auf 3D anzeigen , um das Modell im Visualisierungsbereich zu rendern (Schritt 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-6
Abbildung 6: 3D-Rekonstruktion der linken Lunge auf Basis einer Mikro-CT-Analyse. Axiale Thorax-CT-Bilder wurden Schicht für Schicht verarbeitet, um belüftete Bereiche zu segmentieren, das belüftete Volumen zu quantifizieren und ein 3D-Modell zu rekonstruieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-7
Abbildung 7: 3D-Lungenrekonstruktion basierend auf einer Mikro-CT-Analyse des beatmeten Lungenvolumens in einem unilateralen Lungenfibrosemodell. Rekonstruierte Modelle wurden in bestimmten Formaten in vordefinierte Verzeichnisse exportiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-8
Abbildung 8: Anleitung zum Speichern von Bildern. Die Abbildung zeigt die sequenziellen Schritte zum Speichern von Bildern, beginnend mit dem Starten der Speicherfunktion über das Menü Annotation Screenshot über die Auswahl von Formaten bis hin zur Definition von Speicherpfaden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Statistische Analyse auf Basis der Mikro-CT in einem unilateralen Lungenfibrosemodell. Quantitative Daten aus normo-belüfteten Regionen wurden analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Masson-Trichom-Färbung

  1. Fixieren Sie die Lungenprobe über Nacht mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT), dehydrieren Sie sie mit einer abgestuften Ethanolreihe und betten Sie sie in Paraffin ein. Bereiten Sie Scheiben mit einer Dicke von 5 μm mit einem Rotationsmikrotom vor.
  2. Führen Sie die Trichrom-Färbung von Masson an den Abschnitten wie folgt durch.
    1. Spülen Sie die entparaffinisierten und rehydrierten Abschnitte in destilliertem Wasser ab, gefolgt von einer Beizbehandlung in vorgewärmtem Bouin Fluid bei 56-60 °C für 1 h oder über Nacht bei RT.
    2. Nach dem Waschen die Abschnitte 10 min lang mit der eisernen Hämatoxylinlösung von Weigert färben, 10 min unter fließendem warmem Leitungswasser abspülen und 10-15 min in Biebrich-Scharlach-Fuchsin-Lösung tauchen.
    3. Erreichen Sie eine Differenzierung mit Phosphomolybdic-Phosphotungssäurelösung für 10-15 Minuten und überwachen Sie, bis kollagenreiche Regionen von rot zu klar übergegangen sind.
    4. Übertragen Sie dann die Objektträger direkt für 5-10 Minuten in Anilinblaulösung, spülen Sie sie in destilliertem Wasser ab und differenzieren Sie sie 2-5 Minuten lang in 1%iger Essigsäurelösung.
    5. Nach der Dehydrierung durch abgestuftes Ethanol (95 % bis absoluter Alkohol) und Xylol-Reinigung werden die Abschnitte mit einem harzigen Medium eingespannt.

5. Massons Analyse des maschinellen Lernens von Trichrom-Färbungen

  1. Histopathologische Beurteilung der Kollagenzusammensetzungsanalyse in kontrollierten und mit Bleomycin behandelten Lungen unter Verwendung der Masson-Trichrom-Färbung.
  2. Um beobachterabhängige Verzerrungen zu reduzieren, erfassen Sie hochauflösende digitale Bilder von gefärbten Lungenschnitten mit einem Ganzbildscanner.
  3. Analysieren Sie dann die Kollagenbereiche quantitativ mit einer automatisierten Software-Orbit-Bildanalyse 8,9,12. Der Trainingsprozess wird im Folgenden kurz beschrieben.
    1. Beschreiben Sie manuell mehrere repräsentative Annotationen für jede Gewebekategorie (z. B. Kollagen, normales Gewebe und fibrotisches Gewebe). Verwenden Sie die extrahierten pixelweisen Features aus annotierten Trainingsbereichen, um den Trainingssatz für die Support Vector Machine (SVM) zu erstellen.
    2. Definieren Sie für Masson-gefärbte Schnitte die Gewebeklassifizierung in drei Kategorien: Kollagen, normales Gewebe und Hintergrund.
      HINWEIS: Das Modell des maschinellen Lernens wird durch wiederholte Annotation und Verfeinerung iterativ auf Gesamtobjektträgerbildern (WSIs) trainiert, bis die vom Pathologen validierten Auswertungen die genaue Gewebekategorisierung bestätigen. Sobald eine zufriedenstellende Klassifizierungsgenauigkeit erreicht ist, wird der Prozess vollständig automatisiert: Merkmale werden aus jedem Pixel innerhalb gültiger Regionen von Interesse (ROIs) extrahiert, und das SVM prognostiziert anschließend die entsprechende Gewebekategorie mit hoher Präzision.

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Ergebnisse

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Abbildung 10A-D zeigt die Ergebnisse der Lungenvolumenänderungen und der Färbeanalyse.

Um den Einfluss von Bleomycin (BLM) auf das Lungengewebe zu bewerten, führten wir eine vergleichende Analyse des Lungenvolumens zwischen mit Kochsalzlösung behandelten Gruppen (Ctrl) und BLM-behandelten Gruppen unter Verwendung von 3D-Bildgebungsverfahren durch. Das linke Lungenvolumen ist in der BLM-Gruppe im Vergleich zur Ctrl-Gruppe signifika...

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Diskussion

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Lungenfibrose ist eine verheerende Krankheit, die durch eine fortschreitende Vernarbung des Lungengewebes gekennzeichnet ist, die zu einer Verschlechterung der Lungenfunktion und schließlich zu Atemversagen führt1. Das Lungenfibrose-Mausmodell, das durch verschiedene pharmakologische Wirkstoffe und Verabreichungsmethoden induziert wird, ist ein wesentliches Instrument zum Verständnis des Krankheitsverlaufs und zur Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Therapeutik...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82300092) und der Independent Research of State Key Laboratory of Respiratory Diseases (SKLRD-Z-202302) sowie der Finanzierung des Projekts zum Aufbau von Innovationskapazitäten der Forschungsinstitute der Provinz Guangdong (KD032024001) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9% KochsalzlösungHopebioHBPP008-100
22G stumpfe NadelBD383922
3D-Schneidemaschine  Bildverarbeitungsplattform3D-Schneidemaschine https://www.slicer.org/
BleomycinMCEHY-17565
IsofluranRWDNr. R510-22
Masson Flecken-SetYeasenArtikel-Nr.: 60532ES58
Mikro-CTPinsengSNC-100
UmlaufbahnOrbit-Bildanalysehttps://www.orbit.bio/
Pentobarbital-NatriumSigmaNr. P3761
Laryngoskop für KleintiereYuyan InstrumenteCG-02M
SPSSIBMVersion 19.0 
Warme DeckeLabor Anim TechLAT-16-0323

Referenzen

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Schlagwörter

Mikro CT Bildgebungunilaterales Bleomycin3D SlicerLungensegmentierungKollagendepositionMasson Trichrom F rbungventilierte Lungenregionen

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