Etablierung und Evaluierung eines in vitro humanbasierten fortschrittlichen Modells der Lungenfibrose

Summary

Es wurde ein bildgebendes Verfahren entwickelt, um die Aktivierung von Fibroblasten in menschlichen präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten auf Basis des Fibroblasten-Aktivierungsproteins (FAP) zu bewerten. Diese Methodik schafft eine robuste und reproduzierbare Plattform für das Staging fibrotischer Progression und fördert translationale In-vitro-Modelle für die therapeutische Entwicklung unter Beibehaltung der Genauigkeit der Mikroumgebung des menschlichen Gewebes.

Abstract

Die Lungenfibrose ist gekennzeichnet durch eine irreversible Zerstörung der Alveolarstruktur und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix. Obwohl Tiermodelle in der Lungenfibroseforschung weit verbreitet sind, rekapituliert keines der derzeit verfügbaren Modelle die fortschreitende Natur der IPF oder ihr definierendes histologisches Merkmal, wie z. B. fibroblastische Herde. Fortschrittliche In-vitro-Modelle , einschließlich präzisionsgeschnittener Lungenschnitte (PCLS), gelten oft als das physiologisch relevanteste Lungentestsystem und werden erfolgreich für das Wirkstoffscreening eingesetzt. Nichtsdestotrotz hat die Unfähigkeit, den Grad der Fibrose in der IPF-Lunge zu unterscheiden, zu einer Verblindung und Unsicherheit bei den erhaltenen PCLS geführt. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass das Fibroblasten-Aktivierungsprotein (FAP) die profibrotische Aktivität von ILD bewerten kann, was möglicherweise zu einer frühzeitigen Diagnose und der Auswahl geeigneter therapeutischer Fenster beiträgt. In dieser Studie werden 600 μm PCLS von gesunden Spendern und IPF-Patienten mit einem Schockschneider gewonnen und mit molekularen Sonden bewertet, die auf FAP abzielen, um den Grad der Fibroblastenaktivität basierend auf der Intensität des Fluoreszenzsignals zu bestimmen. Dieser Ansatz bietet ein fortschrittliches In-vitro-Modell und eine Evaluierungstechnik für die Lungenfibroseforschung, die die Fähigkeit zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und zur Bewertung therapeutischer Interventionen verbessert.

Introduction

Die Lungenfibrose (PF) ist eine häufige Form mit unbekannter Ätiologie und besonders schlechter Prognose mit einer medianen Fünf-Jahres-Überlebensrate von nur 25 %¹. Das intratracheale Bleomycin-Verabreichungsmodell ist derzeit das am weitesten verbreitete Tiermodell für präklinische Studien². Die durch Bleomycin induzierte Fibrose ist jedoch vorübergehend und verschwindet mit der Zeit, was in scharfem Kontrast zur irreversiblen Natur von IPF³ steht. Darüber hinaus stellt das intratracheale Bleomycin-Modell aufgrund des heterogenen Schweregrads der Fibrose, die sich aus der endotrachealen Verabreichung ergibt, sowohl chirurgisch als auch nicht-chirurgisch, erhebliche Herausforderungen dar. Diese Einschränkungen der derzeitigen Tiermodelle tragen zur hohen Misserfolgsrate klinischer Studien bei, die auf IPF⁴ abzielen.

Präzisionsgeschnittene Lungenschnitte (PCLS) wurden bei einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt, da sie krankheitsspezifische zelluläre Übersprechnetzwerke und die Mikroumgebung originalgetreu bewahren ^5,6,7. Bei der Lungenfibrose behält PCLS aus IPF-Lungen die native Gewebearchitektur und zelluläre Heterogenität bei, was die Beobachtung verschiedener Zelltypen und Zell-extrazellulärer Matrix-Interaktionen ermöglicht ^8,9 und sie als repräsentatives ex vivo-Modell für die Untersuchung der pulmonalen Pathophysiologie etabliert. Da die Lungenfibrose jedoch durch heterogene fibrotische Läsionen in der Lunge gekennzeichnet ist, ist die PCLS-Probenahme von Natur aus blind. Es ist nicht möglich, visuell zu unterscheiden, ob die erhaltenen Schnitte fibrotische Areale in der Ruhephase, der aktiven Phase oder normales Lungengewebe darstellen. Diese Einschränkung unterstreicht die Notwendigkeit von visuellen Bewertungs- und Screening-Instrumenten. Frühere Forschungen zeigten, dass das Fibroblasten-Aktivierungsprotein (FAP) im Lungengewebe von IPF-Patienten stark und spezifisch exprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass FAP die profibrotische Aktivität von ILD¹⁰ bewerten kann.

In dieser Studie wurde ein einzelkettiger Antikörper gegen FAP mit Indocyaningrün (ICG) markiert, um eine zielgerichtete molekulare Bildgebungssonde mit verbesserter Gewebepenetration zu entwickeln. Die 600 μm PCLS von gesunden Spendern und IPF-Patienten wurden mit dieser Sonde abgebildet, und die Fibroblastenaktivität wurde anhand der Intensität des Fluoreszenzsignals bewertet. Diese Bildgebungsmodalität übertrifft herkömmliche Fibrose-Bewertungstechniken (Western Blotting, qPCR, Masson-Trichrom-Färbung oder Immunfluoreszenz) durch ihre einfache Bedienung, die zytoarchitektonische Integrität und Lebensfähigkeit zu erhalten und gleichzeitig eine longitudinale Verfolgung des pathogenen Fortschreitens zu ermöglichen. Noch wichtiger ist, dass es einfach zu bedienen ist und nur 90 Minuten benötigt. Dies stellt ein fortschrittliches Screening-Tool für das PCLS-In-vitro-Modell zur Verfügung, das die Erforschung von Lungenfibrose erleichtert.

Protocol

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Ersten Krankenhauses der Medizinischen Universität Guangzhou genehmigt (2021G-29). Die IPF wurde auf der Grundlage einer körperlichen Untersuchung und hochauflösender Computertomographie-Befunde des Brustkorbs diagnostiziert, die den diagnostischen Kriterien von ATS/ERS/JRS/ALAT (2022) folgten. Alle IPF-Patientenproben wurden aus einer Lungentransplantation oder Lungenbiopsie gewonnen. Gesunde Lungengewebeproben wurden von Organspendern entnommen, bei denen der Hirntod diagnostiziert wurde10. Vor der Entnahme wurde von jedem Patienten oder seiner Familie eine schriftliche Zustimmung zur Gewebeentnahme eingeholt. Einzelheiten zu allen Materialien, Lösungen und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorbereitung des humanen PCLS

HINWEIS: Patienten werden vor einer Lungentransplantation oder Biopsie routinemäßig auf Viren wie HIV, HCV oder Syphilis untersucht und müssen negativ getestet werden, bevor sie mit nachfolgenden Experimenten fortfahren, um die Arbeitssicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten.

1. Vorbereitung der Lösungen
   1. Bereiten Sie die phosphatgepufferte Lösung (1× PBS) vor und kühlen Sie sie bei 4 °C ab.
   2. 2%ige Agaroselösung herstellen. Wiegen Sie 2 g Agarose und geben Sie sie in einen Erlenmeyerkolben. Fügen Sie 100 ml PBS hinzu, mischen Sie gründlich und erhitzen Sie es in der Mikrowelle, bis die Mischung ein kräftiges Kochen (≥95 °C) erreicht und völlig klar, homogen und frei von sichtbaren Partikeln oder Streifen wird. Den Kolben während des Erhitzens gelegentlich schwenken, um ein übermäßiges Kochen zu vermeiden. Legen Sie die Lösung bis zur Verwendung in ein Wasserbad bei 37 °C.
2. Präzisionsgeschnittene Lungenscheiben
   1. Waschen Sie die äußere Oberfläche des Lungengewebes mit PBS, um überschüssige Verunreinigungen und Blut zu entfernen.
   2. Verwenden Sie eine 20-ml-Spritze (1,2-mm-Nadel), um ein angemessenes Volumen Agarose abzusaugen und in die Luftröhre einzuführen. Injizieren Sie Agarose langsam in die Lungenlappen, bis sie vollständig aufgeblasen ist. Unterbrechen Sie die Injektion, wenn Sie auf einen ausgeprägten Widerstand stoßen, um ein Austreten von Agarose zu verhindern.
      HINWEIS: Pro Gewebeblock von 5 × 2 × 1 cm sind ca. 10 ml Agarose erforderlich, um einen Überlauf zu vermeiden. Verwenden Sie für kleinere Gewebestücke eine 5-ml-Spritze und Einbettungsformen (z. B. Silikonformen, Kunststoffschalen oder zugeschnittene Zentrifugenröhrchen), um das Einbetten zu erleichtern. Gießen Sie eine 1-2 mm dicke Basisschicht Agarose in die Form und lassen Sie sie halbfest werden. Legen Sie das Lungengewebe vorsichtig auf die halbfeste Agarose und gießen Sie dann langsam zusätzliche Agarose ein, um das Gewebe vollständig zu bedecken und Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Agarose vollständig festigen.
   3. Legen Sie die Lunge für ca. 30 Minuten auf Eis, um die Agarosepolymerisation zu ermöglichen. Überprüfen Sie die Pleura auf Härte und Kühle, um die Polymerisation zu bestätigen. Bei Bedarf weiter kühlen.
   4. Schneiden Sie das Lungengewebe mit einer scharfen Klinge in 1-2 cm große Platten.
   5. Zentrieren Sie die Eisbadschale auf der Schneidebank und füllen Sie sie vorab mit Eiswürfeln zum Vorkühlen.
   6. Schalten Sie den Netzschalter ein und halten Sie die UP-Taste gedrückt, um den Probentisch in eine geeignete Position zu bringen.
   7. Legen Sie die Klinge vorsichtig auf den Messerhalter.
      HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig mit der Klinge um, um Verletzungen zu vermeiden. Entsorgen Sie gebrauchte Klingen in dafür vorgesehenen Behältern für scharfe Gegenstände.
   8. Schneiden Sie ein ca. 3 cm langes und 1 cm breites Stück Klebeband ab. Befestigen Sie die klebrige Seite an der Schale und beschichten Sie die nicht klebrige Seite gleichmäßig mit Cyanacrylatkleber.
   9. Nehmen Sie ein Stück Lungengewebe mit einer Pinzette auf. Tupfen Sie die Oberfläche mit saugfähigem Papier trocken und legen Sie sie auf das mit Klebstoff beschichtete Klebeband. Leicht andrücken, um eine feste Haftung zu gewährleisten.
   10. Nachdem der Kleber ausgehärtet ist, legen Sie das Tablett auf das Eisbadtablett. Füllen Sie mit vorgekühltem PBS, bis der Gewebeblock untergetaucht ist.
   11. Stellen Sie die Vibrationsfrequenz auf "10" und die Schnittgeschwindigkeit auf "2". Drücken Sie die Taste FWD, um mit dem Schneiden zu beginnen. Nachdem die erste Scheibe vollständig geschnitten ist, drücken Sie die STP-Taste , um zu stoppen, und drücken Sie dann die RVE-Taste , um die Klinge zurückzuziehen. Verwerfe die erste Scheibe.
   12. Drehen Sie den Drehteller manuell 6-mal, um die Profildicke auf 600 μm einzustellen. Drücken Sie die Taste FWD, um das Schneiden fortzusetzen, und drücken Sie die STP-Taste , nachdem der Schnitt geschnitten wurde. Drücken Sie RVE , um das Messer zurückzuziehen und die Lungenscheibe mit einer Pinzette herauszunehmen. Legen Sie die Scheibe in PBS, das 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält, und legen Sie sie auf Eis.
   13. Wiederholen Sie die obigen Schneideschritte, um zusätzliche PCLS mit einer Dicke von jeweils ca. 600 μm zu erhalten.
   14. Wenn der aktuelle Gewebeblock fast erschöpft ist, ersetzen Sie ihn durch einen neuen Gewebeblock und wiederholen Sie die Schritte 1.2.4 bis 1.2.13.

2. Aufreinigung von FAP-Antikörpern

HINWEIS: Generieren Sie den FAP-spezifischen Einzeldomänen-Antikörper mit einem C-terminalen His-Tag, wie zuvor beschrieben^11,12.

1. Führen Sie eine Phagen-Präsentation durch, um eine Hochdurchsatz-Selektion von FAP-spezifischen Antikörperfragmenten (scFv) zu ermöglichen, indem kombinatorische Bibliotheken wiederholt gegen immobilisierte oder Lösungsphasen-Ziele gepannt werden. Gewinnen Sie gebundene Phagen durch stringentes Waschen und Elution zurück. Amplifizieren Sie Phagen durch Reinfektion von E. coli und reichern Sie die Zielbinder über 3-4 Zyklen an. Validierung von Klonen mittels Phagen-ELISA und DNA-Sequenzierung zur Identifizierung hochaffiner Antikörper¹².
2. Klonieren Sie die DNA-Sequenz, die für das anti-FAP-Fragment der Einzelkettenvariablen kodiert, in den pET-28a(+)-Vektor, der mit einem His-Tag für die Expression in E. coli¹³ fusioniert ist.
3. Wandeln Sie das rekombinante Plasmid in E. coli BL21 (DE3)-Zellen um. Induktion der Proteinexpression mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in Schüttelkolbenkulturen, die über Nacht bei 20 °C inkubiert wurden¹⁴.
4. Reinigen Sie den FAP-Antikörper aus dem Überstand mit Nickel-Nitrilotriacetinsäure (Ni-NTA)-Kügelchen. Führen Sie einen Pufferaustausch mit PBS für nachgelagerte Anwendungen durch.
5. Beurteilung der Antikörperreinheit durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Eine einzelne dominante Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht weist auf eine hohe Reinheit hin.

3. Bewertung der Affinität zu FAP-Antikörpern

1. Kultivieren Sie humane embryonale Nieren-293T-Zellen (HEK 293T) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Fügen Sie Lentivirus-überexprimierendes humanes Fibroblasten-Aktivierungsprotein (hFAP) zu 293T-Zellen bei 90% Konfluenz hinzu. 96 Stunden inkubieren, um eine stabile 293T-hFAP-Zelllinie zu erzeugen.
3. Verdauen Sie sowohl 293T- als auch 293T-hFAP-Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA und sammeln Sie die Zellen.
4. Waschen Sie die Zellen mit PBS und inkubieren Sie mit FAP-Antikörpern, gefolgt von Alexa Fluor 488-konjugiertem Anti-His-IgG.
5. Analyse der Fluoreszenzintensität mit einem NovoCyte Durchflusszytometer^15,16.

4. scFv-FAP-ICG-Molekülsondenmarkierung

1. Passen Sie die Konzentration von FAP-scFv mit PBS auf 2 mg/ml an.
2. Fügen Sie Indocyaningrüner NHS-Ester (ICG-NHS) hinzu, um ein molares Verhältnis von 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv) zu erreichen.
3. Durch Vortexen und Schütteln gründlich mischen.
4. Die Reaktion wird im Dunkeln bei Raumtemperatur 2 h lang inkubiert.
5. Entfernen Sie den ungebundenen Farbstoff mit einer Entsalzungssäule. Lagern Sie das konjugierte Endprodukt bei 4 °C im Dunkeln.

5. scFv-FAP-ICG molekulare Sonde zur Bestimmung des Grades der Fibroblastenaktivität bei PCLS

1. Legen Sie nach dem Schneiden des PCLS einen Abschnitt pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte. Spülen Sie jede Füllung zweimal mit 1 ml PBS aus, um Blutreste und Ablagerungen zu entfernen.
2. Tauchen Sie das PCLS in 1 mL DMEM ohne FBS. scFv-FAP-ICG in einer Endkonzentration von 5 μg/ml zugeben. Inkubieren Sie auf einem Schüttler bei Raumtemperatur 1 h lang unter leichtem Schütteln und vor Licht geschützt.
3. Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS jeweils 5 Minuten lang.
4. Erfassen Sie ICG-Fluoreszenzbilder von PCLS mit dem In-vivo-Tierbildgebungssystem mit den folgenden Einstellungen: Anregungswellenlänge bei 785 nm und Emissionswellenlänge bei 810 nm.
5. Beurteilen Sie die Fibroseaktivität von PCLS anhand der Fluoreszenzintensität. Definieren Sie Regions of Interest (ROI) mit kompatibler Software, wobei die Fluoreszenzstrahlung als Photonen/s/cm²/sr ausgedrückt wird.
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche ROI auswählen , damit die Software den pseudofarbigen Bereich automatisch umrandet. Wenn die ROI-Platzierung ungenau ist, passen Sie sie manuell an. Klicken Sie auf Berechnen , um die Signalstärke innerhalb der Region zu bestimmen. Wenn mehrere Unterbereiche ausgewählt sind, summieren Sie die Werte aus allen Unterregionen.

Results

Das Verfahren zur Aufbereitung von PCLS aus menschlichem Lungengewebe ist in Abbildung 1 dargestellt. Menschliches Lungengewebe wurde in Agarose eingebettet und anschließend mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm³ große Gewebeblöcke getrimmt. Beschnittenes und abgeflachtes Gewebe wurde auf einer Plattform befestigt, um es mit einem Mikrotom bei einer Dicke von 600 μm zu schneiden (Abbildung 1A,B). PCLS wurden in 12-Well-Platten inkubiert (

Discussion

Mit den oben genannten Untersuchungsmethoden wurden PCLS von gesunden Spendern und IPF-Patienten präpariert. Gleichzeitig wurden Säugetierzellen verwendet, um einkettige variable Fragmente von FAP zu exprimieren, und ihre Reinheit und Spezifität wurde verifiziert. Eine molekulare Sonde, die auf FAP abzielt und mit ICG markiert ist, wurde verwendet, um die FAP-Expressionsniveaus zu detektieren, die den Grad der Fibroblastenaktivierung widerspiegeln. Dieser Ansatz bietet eine fortschrittli...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco	15050-057
2-fach; Farbe SYBR Grün qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
20 ml Spritze	Gewinner	V532159
293T Zelle	Beyotime	C6008
502 Kleber	Zhuolide	D-40
Agarose, niedrige Geliertemperatur	Sigma Aldrich	A9414-25G
Anti-Kollagen I Antikörper	abcam	ab138492
Anti-Fibronektin-Antikörper	abcam	ab2413
Anti-His-Tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
Color Reverse Transcription Kit (mit gDNA-Entferner)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Blue Super Fast Färbelösung	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
Erlenmeyerkolben	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP Kaninchen mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
Pinzette	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
Mikrowaage	Secura	Secura225D-1CN
Mikrowelle	Mideo	PM2002
Multi-Mode In Vivo Animal Imaging System	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte Durchflusszytometer	ACEA  Biowissenschaften	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Universal RNA Purification	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratom	DOSAKA	DTK-1000N
β-Aktin Kaninchen pAb	Yeasen	30102ES
Primer
β-Aktin Primer-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-Aktin Primer-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATCACGCACGAT
FAP Primer-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP Primer-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
Kollagen-I Primer-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Kollagen-I Primer-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Fibronektin Primer-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Fibronektin-Primer-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA