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Mausmodell der fortgeschrittenen Parodontitis, die durch eine Nylonligatur im zweiten oberen Molaren induziert wird

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DOI:

10.3791/67848

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30. Mai 2025

 ,  , 
1Undergraduate Program of Dental Surgeon, Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala), Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Innate Immunity Laboratory, Biomedicine Research Unit (UBIMED), FES-Iztacala, UNAM, 3Doctoral Program in Biological Sciences, UNAM

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine modifizierte 6-0-Nylon-Ligaturmethode zur Induktion von Parodontitis bei Mäusen, die hochgradig reproduzierbar ist und eine Alternative für Forscher darstellt, um Parodontalerkrankungen von ihrer Entwicklung bis zu ihren pathologischen Folgen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Parodontitis (PD) ist eine entzündliche Erkrankung, die das Stützgewebe der Zähne betrifft und eine der weltweit am weitesten verbreiteten Erkrankungen ist. Ihre schwere Form, die Parodontitis, führt zur Zerstörung von Weichgewebe, Zähnen und Knochen. Tiermodelle der Parodontitis wurden mit Primaten, Hunden, Miniaturschweinen und Mäusen entwickelt. Unter diesen bietet das ligaturinduzierte Mausmodell Vorteile wie schnelles Fortschreiten der Krankheit, Reproduzierbarkeit, Vorhersagbarkeit und niedrige Kosten bei gleichzeitiger effektiver Replikation wichtiger Aspekte der menschlichen Parodontitis. Mausmodelle, die Ligaturen verwenden, haben wertvolle Einblicke in die mikrobiologischen und immunologischen Mikroumgebungen von parodontalem Gewebe geliefert und die entscheidende Rolle von Biofilmen bei Immunantworten und ihre Assoziation mit systemischen Erkrankungen hervorgehoben. In dieser Studie wird eine modifizierte Nylon-Ligaturmethode zur Induktion von Parodontitis bei Mäusen vorgestellt. Bei der Modifikation wird eine Nylonnaht anstelle einer Seidennaht verwendet und unter der interproximalen Kontaktfläche platziert, anstatt sie durch den Kontaktpunkt zu führen. Dieser Ansatz vereinfacht die Technik und induziert effektiv Parodontitis. Die detaillierte Methodik zur Nahtplatzierung wird grafisch dargestellt und der Verlauf der Parodontitis durch histologische und histometrische Analysen dargestellt.

Einleitung

Die Parodontitis (PD) ist eine entzündliche Erkrankung des Stützgewebes der Zähne und gehört zu den weltweit am weitesten verbreiteten Erkrankungen1; Die Inzidenz von Parkinson liegt weltweit zwischen 20 % und 50 %2. Parkinson hat unterschiedliche Progressionsgrade; Seine milde Form, Gingivitis genannt, betrifft nur Weichteile, und seine schwere Form, Parodontitis (PT) genannt, betrifft Hartgewebe wie Knochen3. Da es sich bei PT um eine entzündliche Erkrankung handelt, muss sie als komplexe Immunantwort angesehen werden, die durch mehrere Risikofaktoren modifiziert werden kann, die den Krankheitsprozess verändern können4, wie z. B. Diabetes mellitus5, Herz-Kreislauf-Erkrankungen6, hormonelle Wechselwirkungen wie ungünstige Schwangerschaftsergebnisse7 oder Präeklampsie8, entzündliche Erkrankungen9 und sogar Augenveränderungen10 oder Demenz11.

Um die Ätiologie zu verstehen, die mit der Entwicklung oder Prävalenz von PT verbunden ist, um neue oder wirksamere therapeutische Strategien zu testen oder um einen Zusammenhang zwischen systemischen Erkrankungen und PT oder der parodontalen Mikrobiota zu identifizieren, sind Tiermodelle erforderlich12.

Die Wahl einer effektiven Forschungsmethode ist entscheidend, um die Entwicklung der PT zu verstehen und Forschungsfragen angemessen zu beantworten13. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Tiermodelle für die Erforschung der PT entwickelt; Modelle wie Primaten, Hunde, Kaninchen und Miniaturschweine sind jedoch teuer und komplex in der Anwendung 14,15,16. Mausmodelle der PT, insbesondere das Ligations-induzierte PT-Modell, haben zahlreiche Vorteile, darunter schnelle Entwicklung, Reproduzierbarkeit, Vorhersagbarkeit und niedrige Kosten 17,18,19.

Obwohl mehrere Methoden zur Induktion von PT verwendet werden, wie z. B. die orale bakterielle Inokulation, die Lipopolysaccharid-Injektion und die Ligaturinduktion10,20, hat jede Vor- und Nachteile17, ähnelte das Mausmodell der PT, das durch Nylonligatur induziert wurde, dem menschlichen Mechanismus für seine Entwicklung 20,21,22,23. PT tritt durch die Retention der residenten Mikrobiota auf, was zu Entzündungen und Gewebeverlust führt. Darüber hinaus können Mäuse genetisch verändert werden, um verschiedene Zellpopulationen oder Moleküle zu untersuchen, die für die Untersuchung von PT von Interesse sind.

Die Zahnligatur kann mit verschiedenen Materialien durchgeführt werden, wie z. B. kieferorthopädischen Drähten, Seidennähten24,25 oder Nylonnähten26. Das gebräuchlichste Material zur Induktion von PT durch Ligation bei Mäusen ist Seide; Diese Methodik wurde von verschiedenen Autoren wie Marchesan et al.18, Abe et al.27 und Chadwick et al.22 erklärt, jeder mit seinen eigenen Modifikationen, und alle diese Methoden wurden von mehreren Forschern erfolgreich eingesetzt28. Das Platzieren einer Seidennaht um die oberen Backenzähne bei Mäusen kann jedoch komplex sein. Marchesan et al. schlugen die Verwendung eines "Ligaturhalters" vor; Abe et al. und Chadwick et al. platzierten die Naht durch den Kontaktpunkt, obwohl Chadwick et al. sie um die Molaren M1 und M2 platzierten.

Nylonnähte unterschiedlicher Dicke wurden für die PT-Entwicklung in verschiedenen Tiermodellen verwendet 29,30,31. Lima et al.31 verwendeten 5-0 Nylonnähte; In früheren Studien haben wir 6-0 Nylon-Nähte mit ähnlichen Ergebnissen verwendet28.

Im Vergleich zu Multifilament-Nähten sind Nylon-Nähte nicht resorbierbare monofile synthetische Nähte und weisen eine geringere Entzündungsreaktion des Gewebes auf32; Darüber hinaus ermöglichen Nylonnähte auch eine mikrobielle Akkumulation33,34, und es gibt Hinweise auf die Adhäsion von Fusobacterium nucleatum und Porphyromona intermedia35,36 zusammen mit fakultativen anaeroben Bakterien in Nylonnähten 12,14,17,19,24,27,35,37 (Tabelle 1).

Diese Eigenschaften könnten es ermöglichen, dass sich die Entzündungsreaktion hauptsächlich auf die Bakterienakkumulation und nicht auf die Materialakkumulation konzentriert. Darüber hinaus hat Nylon bessere mechanische Eigenschaften, wie z. B. die Zugfestigkeit, als Seide38.

Daher induzierte in der vorliegenden Studie die 6-0-Nylonnaht, die um M2 unter der interproximalen Kontaktfläche platziert wurde, die Entwicklung einer Parodontitis im fortgeschrittenen Stadium bei der Maus. Dieser Ansatz ermöglicht die Platzierung der Ligatur mit einer normalen Pinzette, und die Ergebnisse sind konsistent. Nach 30 Tagen kann die Entwicklung der PT durch histometrische und histologische Analysen bestätigt werden.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Versuchstieren wurden in strikter Übereinstimmung mit dem "Ethischen Rahmenwerk für die biomedizinische Forschung an Labortieren" nach dem offiziellen mexikanischen Standard NOM-062-ZOO-1999 durchgeführt. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala) gemäß Protokoll CE/FESI/072024/1765 genehmigt. Die Mäuse wurden in Tierkammern mit freiem Zugang zu Futter und Wasser in einer pathogenfreien Umgebung in der Tieranlage FES-Iztacala untergebracht. Dieses Protokoll ist eine Modifikation der zuvor von Abe et al.27 beschriebenen Methode. Sechs bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (mit einem Gewicht von 16 g) wurden in Kontroll- (CTL) und Parodontitis- (PT) Gruppen eingeteilt. Die Parodontitis wurde durch das Platzieren einer 6-0-Nylonnaht an Tag 0 induziert, um eine anhaltende bakterielle Adhäsion zu fördern und ein schweres, chronisches Fortschreiten der Krankheit auszulösen. Nach 30 Tagen wurden alle Mäuse eingeschläfert (gemäß institutionell anerkannten Protokollen), um Gewebeschäden und Attachmentverlust (AL) durch histometrische Analyse zu beurteilen (Abbildung 1). Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Anästhesie

  1. Bereiten Sie eine Verdünnung von Xylazin und Ketamin (1:10) mit injizierbarem Wasser (Brühe) vor. Bei 4 °C lagern und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen.
  2. Identifizieren und wiegen Sie jede Maus. Bereiten Sie eine gewichtsabhängige Dosis von Xylazin (1 mg/kg) und Ketamin (2 mg/kg) für die intramuskuläre Anwendung mit einer Insulinspritze vor.
  3. Injizieren Sie 50% der Gesamtdosis der Anästhesielösung in die Hinterhand. Wiederholen Sie den Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite.
  4. Setzen Sie die Mäuse in eine tiefe Box (10 cm³) und lassen Sie sie einschlafen, was ca. 3-5 Minuten dauert.
  5. Beugen Sie Augentrockenheit und Hornhautschäden durch Anästhesie vor, indem Sie alle 15 Minuten einen Hypromellose-Tropfen auf jedes Auge auftragen, bis die Mäuse vollständig wach sind und normal blinzeln können.
    HINWEIS: Die Mäuse müssen 45 Minuten lang unter Beobachtung gehalten werden, was der ungefähren Dauer der Anästhesie entspricht. Wenn eine Maus den Ruhezustand aktiviert, bevor der Vorgang abgeschlossen ist, sollte der Vorgang angehalten und die Maus ausgetauscht werden.

2. Positionierung der Tiere

  1. Sobald sich die Maus im Ruhezustand befindet, legen Sie sie mit dem Kopf nach oben auf einen Arbeitstisch und richten Sie den Kopf zum Bediener. Ziehen Sie vorsichtig und ohne Spannung an jedem Bein und sichern Sie sie mit Mikroporenband, um plötzliche unwillkürliche Bewegungen zu verhindern. Decken Sie die Maus mit einer Decke oder Gaze ab, um die Körperwärme zu erhalten.
  2. Um die Schnauze offen zu halten, legen Sie ein Ende eines kieferorthopädischen Gummibandes um die oberen Schneidezähne und befestigen Sie das andere Ende ohne Spannung an einer oberen Halterung. Legen Sie ein zweites kieferorthopädisches Gummiband um die unteren Schneidezähne und befestigen Sie es mit einem Gummiband an einer untergeordneten Halterung.
  3. Platzieren Sie die Wangentrenner und bewegen Sie die Zunge vorsichtig zur Seite, um eine bessere Sichtbarkeit zu gewährleisten.
  4. Positionieren Sie das Mikroskop so, dass eine angemessene Visualisierung der oberen Molaren möglich ist, beginnend mit dem Objektiv mit der niedrigsten Vergrößerung. Sobald Sie es gefunden haben, passen Sie die Vergrößerung an, um optimalen Komfort und Fokus für den Bediener zu gewährleisten.

3. Platzierung der Ligatur

  1. Sobald das Bild klar ist, identifizieren Sie die drei oberen Molaren: den größten und proximalen Molaren (M1), den nächsten Molaren (M2) und den kleinsten und distalen Molaren (M3). Legen Sie eine Naht aus 6-0 Nylon an, da ihr Durchmesser die Platzierung der Ligatur erleichtert und das Gewebe weniger mechanisch schädigt als breitere Nähte.
    1. Lokalisieren Sie die distale Seite von M2, halten Sie die Spitze der 6-0-Nylonnaht mit einer Pinzette fest und platzieren Sie die Spitze an der Basis der Papille vom Gaumen aus. Üben Sie leichten Druck durch die Basis des interproximalen Gaumenraums auf die bukkale Oberfläche aus (Abbildung 2A).
    2. Sobald sich die 6-0-Nylonnaht kreuzt, ziehen Sie sie durch den interproximalen Raum in Richtung der bukkalen Seite (Abbildung 2B).
  2. Platzieren Sie die Spitze der 6-0 Nylonnaht an der Basis des interproximalen Bereichs an der mesialen Oberfläche von M2 von der bukkalen Seite. Schieben Sie die Spitze der Naht vorsichtig unter den Interproximalraum und führen Sie sie durch den Wangenraum zurück zum Gaumen (Abbildung 2C).
  3. Ziehen Sie vorsichtig an der Naht 6-0 Nylon, halten Sie die Spitze mit einer Pinzette fest, stellen Sie sie um M2 ein und befestigen Sie die Naht mit drei einfachen Knoten.
  4. Schneiden Sie die Naht 6-0 Nylon mit einer feinen Schere ab (Abbildung 2D).

4. Bergung der Tiere

  1. Um die Maus zu lösen, entfernen Sie die Wangentrenner, das Mikroporenband von den Beinen und die kieferorthopädischen Gummibänder. Entfernen Sie zuerst das Gummiband um die unteren Schneidezähne und dann das Gummiband um die oberen Schneidezähne.
    1. Nehmen Sie die Maus vom Arbeitstisch, wickeln Sie sie in Gaze oder Tuch ein und legen Sie sie mit der Vorderseite nach oben. Halten Sie die Zunge zur Seite, um die Atemwege offen zu halten und eine Verstopfung zu vermeiden.
  2. Halten Sie das Tier warm, mit einem Tuch oder Gaze bedeckt und unter Beobachtung, bis es vollständig wach ist. Setzen Sie sie dann in ihre normalen Käfige.
  3. Tragen Sie einen Hypromellose-Tropfen in jedes Auge auf, bis die Maus normal blinzeln kann.
  4. Halten Sie das Tier unter normalen Bedingungen.

5. Ligatur-Prüfung

  1. Überprüfen Sie wöchentlich die Dauerhaftigkeit der Nylonligatur (Abbildung 3A,B).
  2. Nimm die Maus, halte den Kopf und den Körper fest und öffne die Schnauze mit einer Pinzette. Beobachten Sie die 6-0 Nylonnaht um M2 im Licht einer Lampe.
  3. Etablierung der Entwicklung von Parodontitis auf der Grundlage von Biofilmakkumulation und mechanischer Reizung. Überprüfen Sie dies durch histologische Analysen.

6. Histologie

  1. Nach 30 Tagen werden die Mäuse in einer CO2 - Kammer eingeschläfert (nach institutionell anerkannten Protokollen). Ernten Sie die Oberkiefer, wie bereits berichtet39. Waschen Sie das entnommene Gewebe in einer 0,9%igen NaCl-Lösung und legen Sie es in neue, markierte Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Die Proben werden 2 h lang unter Rühren in einer 4%igen Paraformaldehydlösung fixiert.
  3. Waschen Sie die Proben 2 h lang mit Leitungswasser.
  4. Um Mineralien aus den Knochen zu entfernen und hochwertige Paraffinschnitte herzustellen, entkalken Sie die Proben in zwanzig Volumina einer 4%igen EDTA-Lösung (pH 7,3) für 20 Tage in Mikrozentrifugenröhrchen, wechseln Sie die EDTA alle 4 Tage40.
  5. Betten Sie die Proben in Paraffin ein. Schneiden Sie 5-μm-Abschnitte des M2-Bereichs und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin (H&E)41.

7. Datenanalyse

  1. Betrachten Sie die gefärbten histologischen Schnitte unter einem optischen Mikroskop, um eine deskriptive Analyse der Veränderungen in der Konfiguration des Sulkusepithels, der Zahnfleischfasern, der Parodontalfasern, der Höhe und der Integrität des Alveolarkamms durchzuführen.
  2. Bestimmen Sie den Attachmentverlust (AL), indem Sie den Abstand zwischen dem Zementschmelzübergang (CEJ) und dem höchsten Punkt des Knochenkamms messen. Zeichnen Sie mit einem digitalen Bearbeitungsprogramm eine Linie zwischen diesen beiden Punkten. Führen Sie histometrische Analysen an der bukkalen und palatinalen Oberfläche gemäß der von Semenoff et al.42 beschriebenen Methodik durch (Abbildung 4).

8. Statistische Auswertung

  1. Analysieren Sie die Daten aus den CTL- und PT-Gruppen mit dem Mann-Whitney U-Test. Betrachten Sie p < 0,05 als statistisch signifikant. Verwenden Sie Statistik- und Grafiksoftware für die Analyse.

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Ergebnisse

Diese Methode ermöglicht es induzierten Mäusen, ab der zweiten Woche eine Parodontitis (PT) zu entwickeln. Die Mäuse wurden wöchentlich überwacht, um das Vorhandensein der Ligatur zu überprüfen. Die Euthanasie wurde am 30. Tag durchgeführt. Die klinischen Merkmale aller Gruppen wurden beurteilt. Die Kontrollgruppe behielt im Laufe der Zeit normale Merkmale wie Farbe und Struktur der marginalen Gingiva bei. Im Vergleich zu denen in der CTL-Gruppe zeigten die Gewebe der PT-Gruppe Entzündungen, Blutungen und parodontale Tas...

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Diskussion

Mehrere Tiermodelle der Parodontitis wurden verwendet, um verschiedene Aspekte, wie z. B. mikrobiologische und Immunreaktionen, zu bewerten, und weisen einige Ähnlichkeiten mit menschlichen Krankheitenauf 43. Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf die Rahmenbedingungen von Parodontalerkrankungen, wie z. B. die Rolle von Biofilmen, die Immunantwort und Wechselwirkungen mit systemischen Erkrankungen44,45.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch den Rat für Wissenschaft und Technologie des Bundesstaates Mexiko (COMECYT) mit der Fördernummer [FICDTEM-2021-072] und dem Förderprogramm für Forschungsprojekte und technologische Innovation (PAPIIT)-UNAM, Fördernummer [IN-217021] finanziert. Wir danken dem Spezialisierungsprogramm in Endoperiodontología, FES Iztacala, UNAM für die zur Verfügung gestellten Einrichtungen für die Erstellung dieses Videos und Rosalba Yañez Ortiz, DDS, für ihre Unterstützung bei der Erstellung dieses Videos. Einige Figuren wurden mit dem Biorender-Programm erstellt (Vertragsnummer ME282NWCI1).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % NaCl-Lösung PiSARinse maxillae 
6-0 Nylon-NahtAtramat, Internacional Farmacé uticaPE1946-NLigaturplatzierung
Amscope 3.7 Programm für DigitalkameraAmscope x64 vom 4.11.21973.20230107Datenerfassung
EDTA-Lösung Sigma– AldrichE5134Entkalkung 
Feine ScheregenerischZum Schneiden der 6-0 Nylon-Naht
Feine Gewebezangegenerisch6-0 Nylon
Naht-Mull-PadgenerischUm die körperliche Temperatur zu halten 
GraphPad PrismaGraphPad PrismaVersion 8.3.0Datenanalyse 
HypromelloseGenerika Augengleitmittel
Injizierbares WasserPisaVerdünnung der Anästhesielösung
KetaminAnesket, PisaAnesthetic
Mikrozentrifugenröhrchen  Cellpro801501Zur Eindämmung von Gewebe während der Entkalkung 
Mikroporen3M 1533Zur Reparatur von Maus
Mikroskop DigitalkameraAmscope MU1603Histologie 
MikroröhrchenAxygenMCT-150-CLagerung Anästhesieverdünnung
Optisches Mikroskop UNICOSerie G380Histologie 
Orhodontische GummibänderTP Orthodintics, Inc blauUm die Schnauze offen zu halten 
Paraformaldehyd-LösungSigma– Aldrich158127Gewebefixierung 
ParaplastLeica39601006Histologie 
Operationsmikroskop Carl Zeiss GmbH Berlin6-0 Nylon-Nahtmaterial
Ultrafeine Insulinspritzen 6 mm U-100, 0,3 mLBD326385Zur Injektion der Anästhesielösung 
Universelle Gummibänder generischUm die Schnauze offen zu halten 
ArbeitstischGenerisch Holzsockel zur Unterstützung von Mäusen 
XylazinPorcin, PisaPräanästhetikum

Referenzen

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Murines Periodontitis ModellParodontalerfahrungLigatur induzierte PeriodontitisBiofilmbildungHistologische AnalyseAttachmentverlustAlveolarknochenverlustEntz ndungsreaktionOrale Chirurgie bei M usen

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