Methodenartikel

Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen

DOI:

10.3791/67852

⸱

13. Juni 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Methode misst die Neigung einer Zelle, ligandenpräsentierende immobilisierte DNA-Duplexen zu brechen, um relative zelluläre Traktionskräfte zu melden. Rupturierte fluoreszierende Oligos werden in die Zelle eingebracht und durch Durchflusszytometrie analysiert, wobei die mechanische Geschichte der Zelle aufgezeichnet wird. Dies ermöglicht die Hochdurchsatzmessung der zellulären Krafterzeugung im Rahmen der zellulären Mechanophänotypisierung.

Zusammenfassung

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Mechanische Kräfte steuern viele kritische zelluläre Prozesse, und der zelluläre mechanische Phänotyp oder Mechanotyp ist bei vielen Krankheiten gestört. Die am weitesten verbreitete Methode zur Quantifizierung zellulärer Kräfte ist die Traktionskraftmikroskopie, die traditionell Kräfte erfasst, die Zellen auf ihre Umgebung ausüben, indem sie hochauflösende Mikroskopie von Zellen erfasst, die elastische Substrate mit fluoreszierenden Kügelchen verformen, Mikropfosten ablenken oder die Konformation von immobilisierten molekularen Spannungssensoren verändern. Wir stellen hier eine Hochdurchsatzmethode vor, um relative zelluläre Zugkräfte mit Hilfe etablierter DNA-Zugsonden zu messen und mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Diese Methode besteht aus fünf Schritten, die im Folgenden beschrieben werden. Zunächst die Expression und Reinigung des hochaffinen Integrin-Liganden Echistatin, der mit einem DNA-bindenden HUH-Tag fusioniert ist; zweitens die Vorbereitung der DNA-Duplex-Sonden, die Reporter und Liganden enthalten; drittens die Oberflächenvorbereitung und Immobilisierung der Sonden; viertens, die Durchführung des Experiments "Rupture and Deliver" mit Spannungsmesssystem und Strömungsmessung. Abschließend werden wir die Datenanalyse und die Interpretation der experimentellen Ergebnisse beschreiben.

Einleitung

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Mechanische Kräfte steuern viele kritische zelluläre Prozesse, von der Migration1 über die Stammzelldifferenzierung2 bis hin zur Fähigkeit einer T-Zelle, an die richtige Antigen-präsentierende Zelle zu binden und von ihr aktiviert zu werden3. Mechanische Variablen sind bei Krankheiten fehlreguliert, was zu messbaren Unterschieden im zellulären mechanischen Phänotyp oder Mechanotyp von Zellen führt 4,5. Mechanotypie ist ein Überbegriff für die mechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben und kann Parameter wie Kontraktilität, Migration, Adhäsion und Verformbarkeit umfassen. Die Zell- oder Gewebesteifigkeit ist der am häufigsten gemessene Aspekt des Mechanotyps, da er im Hochdurchsatz gemessen werden kann. Zum Beispiel sind Krebszellen oft steifer als normale Zellen, während metastasierende Zellen oft nachgiebiger sind 6,7. Die Krafterzeugung durch Zellen ist ein wichtiger Aspekt des bei Krankheitveränderten Mechanotyps, da er spezifische Interaktionen zwischen Zelle und Umwelt untersucht. Die Zugkraftmikroskopie ist die gebräuchlichste Methode zur Messung der zellulären Krafterzeugung und umfasst die Beschichtung von Zellen auf verformbaren, elastischen Substraten, die in fluoreszierende Kügelchen eingebettet sind, oder auf Arrays von Mikropfosten und die Verfolgung von Änderungen der Perlenbewegung oder der Nachbiegung, um die von Zellen ausgeübten Kräfte zu berechnen. Molekulare Zugsensoren wurden auch zur Messung von Zugkräften verwendet und bieten den Vorteil der Empfindlichkeit gegenüber kleineren Kraftgrößen und Messkräften, die von spezifischen Liganden-Rezeptor-Paaren erzeugt werden 9,10. Die Messung zellulärer Kräfte mit herkömmlichen TFM- und Molekularspannungssensoren ist jedoch auf eine hochauflösende Bildgebung angewiesen, was den Messdurchsatz einschränkt.

Wir haben kürzlich DNA-Duplex-Spannungssonden für eine Hochdurchsatzauslesung der zellulären Krafterzeugung im Rahmen der zellulären Mechanophenotypisierung adaptiert11 (Abbildung 1). Kurz gesagt, DNA-Duplexe, adaptiert von den weit verbreiteten Tension-Gauge-Tether (TGT)-Sonden12, werden in den Vertiefungen von 96-Well-Platten mittels Biotin-Neutravidin-Chemie des "Anker"-Strangs13 immobilisiert. Die erforderliche Bruchkraft der TGT-Duplexe kann durch Variation der Position des Biotins auf dem Ankerstrang eingestellt werden, wodurch sich die Geometrie des Duplex ändert, was entweder zu einer Entpackungskonformation mit geringer Bruchkraft (Abbildung 2A) oder einer Scherkonformation mit hoher Bruchkraft (Abbildung 2B) führt. Der Ankerstrang enthält Biotin und einen Fluoreszenzlöscher, während der "Ligand"-Strang der DNA eine Fluoreszenzsonde und einen Liganden enthält, der einen Zelloberflächenrezeptor erkennt, der an der Mechanosensorik beteiligt ist, wie z. B. ein Integrin. Der Ligand ist kovalent an die DNA gebunden (Abbildung 3) durch die Verwendung eines DNA-verknüpfenden Fusions-Tags, der als HUH-Tag bezeichnet wird und mit dem Ligandenfusioniert ist 14,15. HUH-Tags sind kleine HUH-Endonuklease-Domänen, die an der viralen Replikation und anderen Prozessen beteiligt sind, die eine 9 bp-Sequenz/-Struktur von einzelsträngiger DNA erkennen, sie einnicken und ein kovalentes Phosphotyrosin-Addukt zum 5'-Ende der gekerbten DNA bilden.

Zellen, die auf diesen Sonden plattiert sind, binden an den Liganden und brechen einen Prozentsatz der Sonden, der proportional zu den von ihnen erzeugten Kräften ist. Der fluoreszierende Ligandenstrang, der an seinen Rezeptor gebunden ist, wird anschließend in die Zelle abgegeben. So wird die mechanische Geschichte der Zellen in den interessierenden Zellen über die Größe ihrer Fluoreszenz aufgezeichnet. Die Fluoreszenz kann mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden. Wir nennen diese Methode Rupture and Deliver-TGTS oder RAD-TGTs. Diese Methode misst nicht nur die Fluoreszenz und damit die relative Kraft, die von Tausenden von Zellen gleichzeitig erzeugt wird, sondern bietet auch die Durchflusszytometrie-Auslesung das Potenzial, die Zellen nach ihrem Mechanotyp zu sortieren, was nachgelagerte -Omics-Auslesungen sowie CRISPR-KO oder Wirkstoff-Screenings ermöglicht, die Gene oder Medikamente identifizieren könnten, die den zellulären Mechanotyp verändern.

Im folgenden Protokoll zeigen wir, wie ein RAD-TGT-Experiment vorbereitet und durchgeführt wird. Wir werden die Expression und Reinigung einer Art von HUH hervorheben, die als WDV (aus dem Weizenzwergvirus) bekannt ist, um als Negativkontrolle zu dienen und mit Echistatin fusioniert zu werden, einem Liganden, der eine Familie von Adhäsionsrezeptoren fest bindet, die als RGD-bindende Integrine bekannt sind, um als experimentelle Bedingung zu dienen. Daraus wird gezeigt, wie RAD-TGTs für den experimentellen Einsatz vorbereitet werden können. Wir erklären Ihnen, wie Sie bei Experimenten vorgehen und wie Sie die daraus resultierenden Daten analysieren. Wir werden auch eine Anwendung von RAD-TGTs hervorheben, indem wir messen, wie ein ROCK-Inhibitor die Integrin-vermittelten Kräfte in CHO-K1-Zellen verändert (Abbildung 4). Zusammenfassend hoffen wir, dass dieses Protokoll unabhängig von früheren Erfahrungen als Einstieg in die Mechanobiologie dient; Das Feld befindet sich in der Anfangsphase und alle Hintergründe sind für ein besseres Verständnis unerlässlich.

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Protokoll

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1. HUH Ausdruck und Reinigung

  1. Transformieren Sie Escherichia coli mit WDV (± Echistatin) Plasmid, ca. 1,5 μl ~50 ng/μl Plasmid pro Transformation, und wachsen Sie auf Ampicillin-Agarplatten.
  2. Beimpfe 5 mL LB mit einer einzigen Kolonie und züchte sie über Nacht bei 37 °C.
  3. Beimpfen Sie 1 L LB mit der Übernachtkultur und wachsen Sie, bis OD600 ~0,8 erreicht.
  4. Die Temperatur auf 18 °C senken, mit 500 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induzieren und über Nacht inkubieren.
  5. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.750 × g für 30 min. Resuspendieren Sie das Pellet mit 40 mL Lysepuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA).
  6. Lyse der Zellen mit 3 x 90 s Beschallung auf Eis bei 70 % Einschaltdauer, Leistung 7. Bei 24.000 × g 30 min bei 4 °C herunterschleudern und den Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen füllen.
  7. Die Ni-NTA-Harzaufschlämmung wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen (1 ml Beadsuspension/l Kultur) gegeben, 2 Minuten lang bei 700 × g heruntergeschleudert und der Überstand entfernt.
  8. Geben Sie 6 mL Wasser in das Harz und wiederholen Sie den Waschvorgang in Schritt 1.7.
  9. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit Waschpuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 20 mM Imidazol) anstelle von Wasser. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 5 ml Waschpuffer.
  10. Die Bead-Slurry (Schritt 1.9) zu den lysierten Zellen (Schritt 1.6) geben und gründlich mischen. Die lysierten Zellen und Kügelchen mindestens 1 h lang bei 4 °C drehen.
    HINWEIS: Lassen Sie das Harz für den Rest dieses Protokolls niemals trocknen und sammeln Sie alle Proben, die durch die Säule fließen.
  11. Gießen Sie die Mischung auf eine 20-ml-Säule und fangen Sie den Durchfluss auf. Waschen Sie die Säule mit 4 x 25 mL Waschpuffer.
  12. Eluieren Sie mit 1 x 10 mL Elutionspuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 250 mM Imidazol) in ein frisches 15-ml-Röhrchen, wobei Sie die frühe und späte Elution getrennt sammeln (die frühe Elution ist die erste 1 ml, die späte Elution ist die letzte 1 ml).
  13. Analysieren Sie alle gesammelten Fraktionen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), um sicherzustellen, dass der HUH während der Elution gesammelt wurde (siehe Ergänzende Abbildung S1). Für beste Ergebnisse laden Sie ein 4-20%iges Gel und lassen Sie es 45 Minuten lang bei 35 W und 200 V laufen.
  14. Geben Sie das eluierte Protein in den Dialyseschlauch und inkubieren Sie es über Nacht in Dialysepuffer (wie Lysepuffer) bei 4 °C. Um den HIS-Tag zu entfernen, fügen Sie ULP1 ohne Reduktionsmittel direkt zu dem eluierten Protein hinzu, bevor Sie das Protein in den Dialyseschlauch geben.
  15. Bereiten Sie am nächsten Morgen Ni-NTA-Harz wie in den Schritten 1.7-1.9 beschrieben vor und inkubieren Sie mit dem dialysierten Protein. Gießen Sie die Mischung aus dem Protein und dem Ni-NTA-Harz in eine Säule und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule mit 10 ml Dialysepuffer und fangen Sie den Durchfluss auf.
  16. Bewerten Sie die gesammelte Fraktion auf SDS-PAGE gemäß den obigen Einstellungen, um sicherzustellen, dass das Protein vorhanden ist, und konzentrieren Sie auf die gewünschte Konzentration unter Verwendung eines 15-ml-Ultrazentrifugalfilters mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10 kDa (siehe Ergänzende Abbildung S1).
    HINWEIS: Die ideale Endproteinkonzentration liegt zwischen 40 μM und 100 μM.

2. RAD-TGT-Vorbereitung

  1. Assemblieren Sie Duplexe in einem molaren Verhältnis von 1,1:1 von Ankerstrang (mit Quencher) zu Ligandenstrang (mit Fluorophor) bei einer Endkonzentration von 40 μM Ligandenstrang in einer Lösung von 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl und 1 mM EDTA.
  2. Glühen durch Inkubation bei 98 °C für 5 min, gefolgt von Abkühlen bei Raumtemperatur für 1 h; Vor Licht schützen.
    HINWEIS: Proben mit geringem Volumen verdampfen leicht und können nur schwer vollständig wiedergewonnen werden. Bereiten Sie größere Mengen als nötig vor.
  3. Reagieren Sie die geglühten Duplexe mit HUH (unter Verwendung der Konzentration des am wenigsten häufig vorkommenden Strangs beim Glühen, in diesem Fall des Ligandenstrangs) in einem molaren Verhältnis von 1:2 bei einer Endkonzentration von 10 μM Duplex und 20 μM HUH in einer Lösung, die 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES (pH 8) und 50 mM NaCl enthält.
  4. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 37 °C in einem Thermocycler oder einem lichtgeschützten Wärmeblock. Nach der Inkubation vom Herd nehmen und mit einer Tisch-Minifuge die nun zusammengebauten TGTs abschleudern. Die TGTs entweder sofort auf einer Plattierung platzieren oder bei 4 °C im Dunkeln lagern.

3. Vorbereitung der Oberfläche

  1. Decken Sie sofort nach dem Öffnen einer 96-Well-Glasbodenplatte alle Wells mit selbstklebender PCR-Plattenfolie ab, um unbenutzte Wells für die spätere Verwendung zu erhalten. Schneiden Sie die Folie mit einer Rasierklinge über den gewünschten Vertiefungen (vorzugsweise Vertiefungen ohne Kanten) aus und geben Sie 100 μl kaltes PBS in die gewünschten Vertiefungen.
    HINWEIS: Sobald Flüssigkeit in die Vertiefungen gegeben wurde, lassen Sie die Vertiefungen nicht austrocknen. Kommt es zu einer Trocknung, wirkt sich die unspezifische Adsorption von Biomolekülen an der Oberfläche negativ auf die Daten aus. Bewahren Sie 100 μl überschüssiges Volumen kontinuierlich in der Vertiefung auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
  2. Geben Sie 200 μl kaltes PBS in die Vertiefungen, pipettieren Sie vorsichtig 2-5x und entfernen Sie 200 μl PBS. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Wäschen.
    HINWEIS: Halten Sie beim Hinzufügen und Entfernen von Flüssigkeit aus den Vertiefungen die Pipettenspitze in einem Winkel von 45° am Rand der Vertiefung, um eine Störung der Oberfläche zu vermeiden. Tun Sie dies für alle Handhabungen der Platte, außer beim Plattieren von Zellen.
  3. Für experimentelle Vertiefungen bereiten Sie eine Lösung von 0,1 mg/ml biotinyliertem BSA in PBS vor und geben Sie 80 μl der Lösung in die gewünschten Vertiefungen. Bereiten Sie für Kontrollvertiefungen die gleiche Lösung unter Zugabe von 18,75 μg/ml Fibronektin vor und geben Sie 80 μl in die jeweiligen Vertiefungen. Pipettieren Sie vorsichtig alle verwendeten Vertiefungen, legen Sie den Deckel auf die Platte und decken Sie sie mit Folie ab. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Entfernen Sie 80 μl Volumen aus den Vertiefungen und waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie Schritt 3.2 wiederholen. 80 μl 0,1 mg/ml Neutravidin in PBS-Lösung werden auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.3 zugegeben.
  5. Nach der Inkubation werden 80 μl Volumen aus den Vertiefungen entnommen und Schritt 3.2 wiederholt. Verdünnen Sie die zusammengesetzten TGTs (RAD-TGT-Vorbereitung Schritt 2) auf 0,1 μM in PBS und 80 μl Lösung in den Vertiefungen auf ähnliche Weise wie in Schritt 3.3. Entweder die Vertiefungen mit Klebefolie abdecken und dunkel bei 4 °C lagern oder vor Licht schützen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, bevor mit den Experimenten fortgefahren wird.
    HINWEIS: Wir empfehlen, Schritt 3.5 als Haltepunkt zu behandeln und bis zum nächsten Tag zu warten, um mit den Experimenten fortzufahren.

4. RAD-TGT Versuchsprotokoll

  1. Nachdem die TGTs ausreichend Zeit zum Anhaften hatten, waschen Sie die Vertiefungen (siehe Schritt 3.2) 3x mit PBS, gefolgt von zwei Wäschen mit serumfreien Medien. Lassen Sie das Medium nach der letzten Wäsche in den Vertiefungen. Geben Sie 200 μl PBS in die peripheren Vertiefungen, um Kanteneffekte zu mildern, und geben Sie die Platte in einen 37 °C-Inkubator, um die Platte vorzuwärmen.
  2. Entnehmen Sie die interessierenden Zellen mit ~80% Konfluenz und aspirieren Sie das Medium, gefolgt von der Zugabe und Aspiration von PBS, um die Zellen zu waschen. Geben Sie ein entsprechendes Volumen Trypsin hinzu und stellen Sie die Platte in einen 37 °C Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen dissoziieren (~5-10 min).
  3. Sobald die Zellen dissoziiert sind, geben Sie das ursprüngliche Volumen des vollständigen Zellmediums, das zur Erhaltung der Zellen verwendet wird, auf die Platte und resuspendieren Sie es mit einer serologischen Pipette. Geben Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 300 × g , saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Pellet in PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration, resuspendieren Sie sie dann in 5 mL serumfreiem Medium und wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration. Resuspendieren Sie die Zellen in ~2 mL serumfreiem Medium.
  5. Bestimmen Sie die Dichte der resuspendierten Zellen und stellen Sie die Konzentration wie gewünscht ein.
    HINWEIS: Unser Ziel ist es, ~15.000 Zellen pro Vertiefung zu plattieren, also bereiten wir die Zellen auf eine Konzentration von 150.000 Zellen/ml vor, was es ermöglicht, 15.000 Zellen mit 100 μl resuspendierten Zellen zu plattieren.
    1. Optional: Wenn die Wirkung von Arzneimitteln oder anderen pharmakologischen Wirkstoffen getestet werden soll, geben Sie die entsprechende Konzentration des Arzneimittels in die Zellen und stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator. Warten Sie eine angemessene Vorinkubationszeit, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  6. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator (Schritt 4.1) und entnehmen Sie das Volumen des Mediums, das aus der Spülung aus den Versuchsvertiefungen in der vorgewärmten Platte übrig geblieben ist. Einmal mit dem gewünschten Medium waschen. Pipettieren Sie vorsichtig 100 μl der resuspendierten Zellen in die gewünschten Vertiefungen. Übertragen Sie die plattierten Zellen für 90 Minuten in den Inkubator.
    HINWEIS: Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig in die Mitte der Vertiefungen und versuchen Sie, die Pipette senkrecht zu halten.
  7. Entfernen Sie nach der Inkubation ~125-170 μl Volumen aus den Vertiefungen. Waschen Sie die Zellen bei Bedarf vorsichtig mit 200 μl erwärmtem PBS. Geben Sie 50 μl Trypsin in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, bis die Zellen zu dissoziieren beginnen (5-10 Minuten).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Bohrloch nie trocken wird und dass es nicht zu einer Übertrypsinisierung kommt.
  8. Geben Sie 160 μl frisch zubereiteten Fließpuffer (1 mM EDTA, 2 % w/v Rinderserumalbumin, in kaltem PBS) in die Vertiefungen. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu dissoziieren, geben Sie 196 μl dieser Zellsuspension in PCR-Röhrchen, gefolgt von 4 μl Propidiumiodid, und mischen Sie vorsichtig. Bereiten Sie eine Kontrollprobe ohne Propidiumiodid vor, die als Kontrolle für das Viabilitäts-Gating dient.
  9. Legen Sie die Röhrchen in einen Eiskübel, wobei der Deckel das Licht blockiert, und fahren Sie mit der Messung der Fluoreszenzintensität mit einem Durchflusszytometer fort.

5. Datenerhebung und -analyse

  1. Analysieren Sie jede Probe mit einem Durchflusszytometer. Ziel ist es, mindestens 2.000 lebende Einzelzellen pro Probe zu sammeln.
    HINWEIS: Minimieren Sie die Lichteinwirkung für Proben, die noch nicht analysiert wurden, und bewahren Sie sie auf Eis auf.
  2. Sobald alle Daten gesammelt sind, übertragen Sie die Dateien an die Software Ihrer Wahl und koppeln Sie die Zellen.
    1. Gate für Zellen nach Vorwärtsstreufläche (FSC-A) vs. Seitenstreufläche (SSC-A).
    2. Gate für Singlelets innerhalb der Zellpopulation durch FSC-A vs. Forward Scatter Height (FSC-H).
    3. Gate für lebende Zellen aus der Singulett-Population, indem ein vertikales Gate auf dem Histogramm der Intensität der Propidiumiodid-Fläche auf den höchsten Wert für die in Schritt 4.8 vorbereitete Kontrolle ohne Propidiumiodid gesetzt wird. Alle Ereignisse, die das Gate nicht überschreiten, sind lebende Zellen
    4. Setzen Sie ein vertikales Gate auf ein Histogramm der Intensität des Cy5-Bereichs (Cy5-A) der Einzelstücke, um alle nicht fluoreszierenden Ereignisse auf dem Cy5-A-Kanal zu entfernen, die durch Zelltrümmer verursacht werden. Stellen Sie sicher, dass dieses vertikale Gate einen Wert hat, der kleiner ist als die der analysierten unmarkierten Zellen, aber größer als 0 Fluoreszenzintensität.
    5. Um Zellpopulationen zu analysieren, setzen Sie ein Winkelgatter am 99. Perzentil der jeweiligen Negativkontrolle.
    6. Wenden Sie ein Gate mit der gleichen Intensität wie die entsprechenden experimentellen Bedingungen an, und erfassen Sie den Prozentsatz der Zellen, die das negative Kontrollgate für jede Bedingung überschreiten.
      HINWEIS: Die Prozentsätze können durch geeignete statistische Analysen direkt zwischen biologischen Replikaten verglichen werden. Siehe repräsentative Daten.
  3. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der medianen Cy5-Fluoreszenz, dividieren Sie die mediane Intensität des Liganden-WDV durch den Median des WDV allein und vergleichen Sie diese Werte zwischen den Replikaten.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um den Nutzen und die einfache Anwendung von RAD-TGTs zu demonstrieren, analysierten wir die Auswirkungen von Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitoren auf den Mechanotyp von CHO-K1-Zellen. Der ROCK-Signalweg ist an der Organisation des Aktins und der Myosinaktivierung beteiligt. Frühere Studien mit TGTs haben gezeigt, dass die ROCK-Hemmung den Bruch von Scher-TGTs verringert 16,17,18. Scher- oder Hochkraft-TGTs berichten über kontraktile K...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben Protokolle zur Einrichtung und Durchführung von RAD-TGT-Experimenten erstellt, um Wissenschaftler in allen Lebenswissenschaften zu ermutigen, die Mechanotypisierung in ihren Arbeitsablauf zu integrieren. Ein wesentlicher Vorteil von RAD-TGTs, insbesondere für solche mit Proteinproduktionskapazitäten, ist die Verwendung von HUH-Endonukleasen zur Ligation von Liganden an DNA-Duplexen mit hoher Genauigkeit ohne chemische Vernetzung und/oder Reinigung. HUH-Endonukleasen umfassen ei...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. bedankt sich für die Finanzierung durch das NIH R35GM119483. Biorender wurde verwendet, um Figurenschemata zu erstellen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL konisches RöhrchenSarstedt62.554.205
96-Well-GlasbodenplatteCellvisP96-1.5H-N Selbstklebende PCR-Plattenfolie
Thermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicillinApex Bioresearch Produkte 25-530
Bio-Rad 20 mL SäuleBio-Rad7321010
Biotinyliert BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Kompetent E. coliNew England BiolabsC2527H
RinderserumalbuminThermo Fisher ScientificBP9703100
Zellkultur-InkubatorThermo Fisher Scientific51030284
ZentrifugeThermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
DialyseschlauchThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Durchfluss ZytometerBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazolThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
Ligand StandIntegrierte DNA-Technologienbenutzerdefiniertes OligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lysogeny Broth (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidin ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA Harz Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
PetrischaleVWR25384-342
PropidiumiodidlösungCayman Chemicals10008351
SDS-PAGE GelBio-Rad4561096
Serum Freie MedienThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem Gebrauchte, alternative serumfreie Medien sind in Ordnung zu verwenden
ScherankerstrangIntegrierte DNA-Technologienvom Benutzer entwickelt Oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
UltraschallgerätThermo Fisher Scientific15-345-139
ThermocyclerBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
ultrazentrifugaler Filter, 10 kDa CutoffAmikon
Unzipping Anchor StrangIntegrierte DNA-Technologienbenutzerdefinierte Oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlasmidAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049rekonstituiert in DMSO

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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