Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung von frisch gewonnenen (Passage 0) Keratinozyten für die Verwendung in der Lebendzellbildgebung.
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Methodenartikel
Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verfolgung von Stammzellen und dem Verhalten von Vorläufern auf Einzelzellebene in der menschlichen Haut war sowohl in vivo als auch in vitro eine Herausforderung. Die Bildgebung von lebenden Zellen hat zu erheblichen Fortschritten bei der Identifizierung von Unterschieden zwischen Keratinozyten-Stammzellen und dem Verhalten von Vorläufern geführt. Die Bildgebung lebender Zellen ist eine sich entwickelnde und etwas herausfordernde Methode, um das Verhalten von Keratinozyten in vitro zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Keratinozyten bei niedriger Seeding-Dichte zu kultivieren, was eine relativ langfristige Zeitrafferfotografie und die Überwachung des Verhaltens einzelner Zellen ermöglicht. Passage 0 Keratinozyten werden mit klonaler Dichte gezüchtet, und die Zeitrafferfotografie ermöglicht die Dokumentation einzelner Zellteilungen und des Zeitpunkts ihres Auftretens. Für eine maximale biologische Relevanz werden frisch isolierte humane Keratinozyten in vitro platziert. Dieser Ansatz konzentriert sich auf die Proliferation. Dieses Protokoll kann jedoch für den Einsatz in anderen Anwendungen zur Bildgebung lebender Zellen angepasst werden, um das Verhalten einzelner Zellen zu messen, wie z. B. die Messung von Zellmigration, Wundheilung und Motilität.
Einleitung
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Möglichkeit zu bieten, einzelne Keratinozyten in Kultur über einen relativ langen Zeitraum (mehrere Wochen) zu verfolgen, was durch niedrige Seeding-Dichten und Zeitrafferfotografie ermöglicht wird. Die Bildgebung lebender Zellen mit geringer Dichte bietet Forschern die Möglichkeit, das Zellverhalten in vitro auf Einzelzellebene zu visualisieren. Obwohl dies in herkömmlichen Zellkulturen nicht möglich ist, ermöglicht die Bildgebung lebender Zellen die Entwicklung von Stammbäumen in Echtzeit ohne den Einsatz von Markierung, aus denen Informationen über die Teilungskinetik ermittelt werden können, wie z. B. die Dauer des Zellzyklus und den Anteil der Proliferations- und Differenzierungsteilungen in einer Kolonie. Es ermöglicht auch die Untersuchung der Zellmigration und -motilität. Es kann eine technische Herausforderung sein, mit Aspekten, die je nach Zelltyp und den zu erfassenden Daten optimiert werden müssen. Andere Labore haben neonatale Keratinozyten und/oder passageierte Keratinozyten verwendet, die leichter zu züchten sind1.
Zelllinien, die wiederholt passagiert werden, unterscheiden sich jedoch in Verhalten und Morphologie signifikant von ihrem in vivo-Zustand 2. Für die größte biologische Relevanz, um das Verhalten in vivo am nächsten zu bringen, werden Passage-0-Zellen verwendet. In Keratinozytenpopulationen ist es möglich, zwischen der Stammzelle und dem verbindlichen Vorläufer ohne Sortierung oder Markierung zu unterscheiden, da es deutliche Unterschiede im Teilungsverhalten gibt, die mit Hilfe der Lebendzellbildgebung beobachtet werdenkönnen 3.
Wir verwenden Live-Cell-Imaging, um die Kinetik der Keratinozytenproliferation zu untersuchen. Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um die Motilität von kutanen Melanomzellen zu untersuchen, die mit Keratinozyten kokultiviert wurden4, die adhärente Zellmigration von Scratch-Assays5 und wie ROCK-Inhibitoren die Keratinozytenproliferation beeinflussen6. Dieses Protokoll wurde speziell für die Kultivierung von Zellen entwickelt, um die Abstammungsverfolgung durch Lebendzell-Bildgebung zu erleichtern, obwohl es für andere Zwecke angepasst werden kann.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Keratinozyten der Passage 0 zum Zwecke der Lebendzellbildgebung, erörtert Komplikationen, die auftreten können, und enthält Überlegungen, die Änderungen am Protokoll erfordern können (Abbildung 1).
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Protokoll
Für die Verwendung von menschlichem Gewebe ist die Genehmigung des Ausschusses für Humanforschung der Institution erforderlich. Humanproben für die Forschung werden oft aus kommerziellen Quellen gewonnen (z. B. ATCC, Lifeline-Zelltechnologie und Zen-Bio). In unseren Studien werden zum Zeitpunkt der Operation verworfenes Gewebe oder Hautbiopsieproben verwendet, die speziell für Studienzwecke entnommen wurden. Diese Situationen erfordern unterschiedliche Genehmigungen und Zustimmungsverfahren. Alle Gewebe werden nach Genehmigung durch das UCSF-Komitee für Humanforschung unter Verwendung einer schriftlichen Einverständniserklärung und gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki gewonnen.
1. Trennung der Epidermis von der Dermis
- Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Genehmigungen für die Verwendung von menschlichem Gewebe für die Studie eingeholt werden.
- Entnehmen Sie eine Hautprobe und transportieren Sie sie in einem isolierten Behälter mit einem Eisbeutel. Legen Sie die Probe in ein Sammelmedium, das die 5-fache Konzentration von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin enthält.
HINWEIS: Die erforderliche Menge hängt von der Anwendung ab. Nach unserer Erfahrung werden ca. 1.000.000 Keratinozyten procm2 aus erwachsener und gealterter Haut gewonnen. Dies kann jedoch bei jeder Probe erheblich variieren.- Legen Sie die Vorhaut von Neugeborenen in Zellkulturmedien und beginnen Sie die Keratinozytenisolierung nicht länger als 48 Stunden nach der Beschneidung, um den Zelltod zu minimieren. Lagern Sie das Gewebe bis zur Verarbeitung bei 4 °C. Die Verarbeitung von erwachsenen und gealterten Proben beginnt in der Regel innerhalb weniger Stunden nach der Entnahme.
- Erhalten Sie Zugang zu einer Biosicherheitswerkbank mit BS2-Level-Ausrüstung, die für die Arbeit mit Erregern entwickelt wurde, die durch Verschlucken, Schleimhaut oder perkutane Exposition Krankheiten verursachen7. Stellen Sie sicher, dass die Biosicherheitswerkbank mindestens 15 Minuten lang UV-sterilisiert ist und dass alle Oberflächen vor der Verwendung mit 70% Alkohol besprüht werden.
- Ziehen Sie Handschuhe an, besprühen Sie den Auffangbehälter mit 70% Alkohol und stellen Sie den Behälter in den Abzug. Legen Sie ein Kühlkissen unter das Gewebe, um zu verhindern, dass es sich auf Raumtemperatur erwärmt, und um seine Integrität zu erhalten. Wenn das Taschentuch extrem groß ist, schneiden Sie einen Teil für die Verarbeitung ab und halten Sie den Rest im Auffangbehälter feucht.
HINWEIS: Da es sich bei vielen der gealterten Proben um große Bauch- oder Brusthaut von Operationen handelt, dauert es einige Zeit, bis das Gewebe geschnitten und verarbeitet ist. Das Taschentuch sollte niemals direkt auf das Polster gelegt werden, da es durch die extreme Kälte einfrieren kann. Stattdessen sollte es auf eine Zwischenfläche, wie z.B. eine Marmorplatte, gelegt werden. - Platzieren Sie zwei 100 mm x 15 mm Petrischalen und ein steriles chirurgisches Skalpell #23 in der Haube.
- Öffnen Sie die Petrischalen und stellen Sie sie so auf die Oberfläche des Schranks, dass die Innenflächen jeder Schale nach oben zeigen. Geben Sie 10 ml 10% Chlorhexidingluconat in eine der Petrischale. Geben Sie 10 ml 5x Penicillin/Streptomycin/Amphotericin/Gentamycin in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; 5x) zu 2 anderen Petrischale-Hälften (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie eine 6-Well-Platte für den Dispase-Schritt vor. Verwenden Sie für Neugeborenengewebe 3 ml Dispase pro Vertiefung. Für gealterte Gewebeproben verwenden Sie 4 ml. Die Verwendung unzureichender Mengen an Dispase für das Gewebevolumen kann zu Schwierigkeiten bei der Trennung von Epidermis und Dermis führen.
- Schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in kleinere Stücke, damit es besser von Dispase durchdrungen werden kann. Die Dispase dringt nur bis zu 5 mm von den Rändern des Gewebes ein, schneiden Sie also lange Gewebestreifen mit einer Breite von 0,5 bis 1 cm ab. Wenn der Schnitt nicht klein genug ist, kommt es nicht zu einer Trennung der Epidermis von der Haut.
- Schneiden Sie dickeres Gewebe in kleinere Stücke. Schneiden Sie die Vorhaut von Neugeborenen in 3 oder 4 Stücke (~5 mm x 7 mm). Verwenden Sie maximal zwei ganze Vorhäute pro Vertiefung Dispase. Oberflächliche Bauchlappen neigen dazu, viel dünner zu sein, mit minimalem bis keinem Unterhautgewebe, schneiden Sie diese in längere Streifen (~5 mm x 15 mm).
- Platzieren Sie maximal vier Streifen pro Vertiefung Dispase. Wenn das gewonnene Gewebe viel Unterhautfett enthält, schneiden Sie das Unterhautgewebe ab, damit Dispase vollständig in das Gewebe eindringen kann. Wenn das Gewebe zu klein geschnitten wird, kann ein Präpariermikroskop erforderlich sein, um beim Abziehen der Epidermis festzustellen, welche Seite epidermal und welche dermal ist. Das Ziehen an der falschen Seite der Haut kann zu einem zusätzlichen Gewebetrauma führen.
- Legen Sie die epidermale Seite des Gewebes nach unten für 10-20 s in die erste Petrischale, die in Schritt 1.6 vorbereitet wurde und 10 % Chlorhexidingluconat enthält. Übertragen Sie dann die epidermale Seite des Gewebes nach unten in die zweite Petrischale, die 5x Penicillin/Streptomycin/Amphotericin (PSA) mit HBSS enthält, und rühren Sie 10-20 s lang. Übertragen Sie die epidermale Seite des Gewebes nach unten in die dritte Petrischale, die wiederum 5x PSA mit HBSS enthält, und rühren Sie weitere 10 s lang. Die Verarbeitung mehrerer Proben mit derselben Lösung ist akzeptabel.
- Übertragen Sie das Gewebe mit der Epidermisseite nach unten auf die in Schritt 1.7 vorbereitete 6-Well-Dispase-Platte.
HINWEIS: Wir empfehlen die epidermale Seite nach unten, wie in unserer Konvention beschrieben. Andere Protokolle empfehlen Dermis nach unten8. Nicht alle Dispase ist gleich wirksam. Das Abschälen der Epidermis von gealterter Haut erwies sich bei bestimmten Produkten als schwierig, selbst bei Konzentrationen bis zum 4-fachen des vom Hersteller empfohlenen Wertes. Dies führte zum Verlust von Zeit und Proben. Unternehmen verwenden nicht standardisierte Einheiten für die Dispase, was es schwierig macht, zu erkennen, wie sich die Konzentrationen zwischen den Marken unterscheiden. Aufgrund dieser Herausforderungen wird die Verwendung einer der in der Materialtabelle aufgeführten Dispase-Marken dringend empfohlen. - Die 6-Well-Platte mit der Dispase und den Proben beschriften und auf 4 °C erhitzen. Inkubieren Sie Neugeborenenproben für 16-18 Stunden in Dispase und Proben für Erwachsene/gealterte Proben für 24 Stunden.
HINWEIS: Es gibt ein alternatives 2-Stunden-Protokoll, das für Proben verwendet werden kann, bei dem die Probe 2 Stunden lang bei 37 °C in Dispase gelegt und dann die Epidermis geschält wird. Leider funktioniert dies nicht immer, und die Integrität des Gewebes kann nach der Inkubation beeinträchtigt werden, was zu einem Verlust der Probe führt. Wann immer möglich, wird eine Inkubation über Nacht bevorzugt.
2. Isolierung von Keratinozyten
- Legen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA (oder TrypLE), Trypsin-Neutralisationslösung und Keratinozytenmedien 20 Minuten vor Beginn der nächsten Schritte in ein 37 °C heißes Wasserbad.
- Nehmen Sie eine 6-Well-Platte aus 4 °C, besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol und legen Sie sie in eine vorbereitete Biosicherheitswerkbank (siehe Schritt 1.3).
- Legen Sie die sterile Zahnzange und die ungezahnte Pinzette in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 70%igem Ethanol. Wenn Sie sich zunächst außerhalb der Haube befinden, sprühen Sie die Pinzette mit 70 % Ethanol ein, bevor Sie sie in die Haube einsetzen.
- Fassen Sie mit einer chemisch sterilisierten Pinzette ein Stück Gewebe und legen Sie es mit der Epidermisseite nach oben auf eine sterile Oberfläche (verwenden Sie eine Petrischale oder die Innenseite der oberen Hälfte der 6-Well-Platte). Halten Sie den dermalen Teil des Gewebes mit einer Zahnzange mit der nicht dominanten Hand fest und fassen Sie gleichzeitig die Epidermis mit der nicht gezahnten Pinzette fest und ziehen Sie sie von Kante zu Kante ab. Es sollte sich in einem Stück glatt ablösen.
- Legen Sie die Epidermis auf die Innenseite der Lippe eines konischen 15-ml-Röhrchens. Jedes konische 15-ml-Röhrchen sollte eine Epidermis von maximal zwei Vorhäuten haben.
- Effizient arbeiten; Trocknet das Gewebe aus, wird die Ausbeute beeinträchtigt. Wenn die Dispase nicht richtig in das Gewebe eingedrungen ist, kann es zu Schwierigkeiten beim Ablösen der Epidermis kommen. Ziehen/kratzen Sie in einem solchen Fall die Epidermis von der darunter liegenden Dermis ab. Dies führt auch zu einem deutlich geringeren Ertrag und ist nicht zu empfehlen.
- Geben Sie 4 ml 0,05 % Trypsin-EDTA in das konische 15-ml-Röhrchen, verschließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es um, wobei Sie darauf achten, dass die gesamte Epidermis im Trypsin suspendiert ist und nicht an der Seite des Röhrchens/des Deckels kleben bleibt. 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen. Rühren Sie die Zellen alle 2 Minuten von Hand.
HINWEIS: Eine Trypsinisierung für mehr als 10 Minuten kann zu einer geringeren Zellausbeute führen. Wenn die Integrität von Zelloberflächenproteinen ein Problem darstellt, verwenden Sie TrypLE, da es spezifischer für seine Spaltstelle ist, was zu einer geringeren Schädigung der Zellen führt und nachweislich die Expression von Oberflächenantigenen im Vergleich zu Trypsin-EDTA9 nicht signifikant verringert. Darüber hinaus ist das Wasserbad eine häufige Kontaminationsquelle, also stellen Sie sicher, dass es regelmäßig gereinigt wird. Wechseln Sie das Wasser regelmäßig durch entionisiertes Wasser, das Aquaguard-2-Lösung enthält. - Legen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen in die Biosicherheitswerkbank. Schrauben Sie den Deckel ab und setzen Sie ein 100 μm Zellsieb auf die Öffnung des konischen Röhrchens.
- Nehmen Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit der aufgeschlossenen Probe aus dem Wasserbad, trocknen Sie es gründlich ab und sprühen Sie es mit 70 % Alkohol ein, bevor Sie es wieder in die Biosicherheitswerkbank legen. Klopfen Sie das konische Rohr 3x gegen die Oberfläche des Abzugs und drehen Sie es dann 6x um. Wiederholen Sie den Klopf-Inversionszyklus 3x.
- Geben Sie 6 ml Trypsin-neutralisierende Lösung in das konische Röhrchen. Durch das Zellsieb in das konische 50-ml-Röhrchen aus Schritt 2.7 gießen.
- Spülen Sie das konische 15-ml-Röhrchen, das die Probe enthält, mit 5 mL Trypsin-neutralisierenden Lösungen (TNS). Durch ein Zellsieb in das konische 50-ml-Röhrchen gießen. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren.
- Nehmen Sie den Überstand sofort aus der Zentrifuge und pipettieren Sie ihn, um einen Zellverlust in das Medium zu verhindern. Es sollte nur das Pellet mit einer kleinen Flüssigkeitsansammlung übrig bleiben. Es kann schwierig sein, das Pellet von kleineren Gewebeproben zu erkennen.
HINWEIS: Im Überstand ist Trypsin enthalten, daher ist es am besten, so viel wie möglich zu entfernen, ohne das Pellet zu verlieren. - Resuspendieren Sie das Keratinozyten-Pellet in 2 ml Keratinozytenmedium.
HINWEIS: Hier gibt es zwei Überlegungen. Erstens, welche Medien verwendet werden sollen. Zu diesem Zweck empfiehlt sich serumfreie Medien ohne Kollagen. In der Vergangenheit war der Standard für Keratinozyten-Zellkulturen Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) +10 % fötales Rinderserum (FBS) +Ham's F-12 auf einer Fibroblasten-Feeder-Schicht (3t3-J2s)10. Mit dem Aufkommen serumfreier Medien und der Verfügbarkeit von Kollagen bleiben jedoch mehrere andere Möglichkeiten praktikabel (siehe Diskussion)11. Die zweite Überlegung ist, ob die Verwendung von Antibiotika im Kulturmedium für die Anwendung der Lebendzellbildgebung geeignet ist. Dies hängt von der Bildgebungszeit, der Dauer und der Erfahrung mit dem Bildgebungssystem ab. Die Kolonien werden über mehrere Wochen mit einem gemeinsamen Bildgebungssystem abgebildet, so dass der Einsatz von Antibiotika trotz der möglichen Auswirkungen auf die Kulturen ein bevorzugter Ansatz ist (siehe Diskussion). Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B und Gentamicin-haltiges Keratinozytenmedium werden während der Resuspension verwendet, gefolgt von einem Wechsel zu Penicillin/Streptomycin-haltigen Medien nach dem anfänglichen Medienwechsel. Diese Methode hat eine Kontamination während der erweiterten Bildgebung von lebenden Zellen effektiv verhindert. - Zählen Sie die Zellen und säen Sie die Platte (siehe Diskussion für Kommentare zur Auswahl der Setzdichte). Um eine gleichmäßige Verteilung der Aussaat zu gewährleisten, resuspendieren Sie die Keratinozytenzellen vor dem Plattieren in der Gesamtmenge des zu plattierenden Mediums. Nach sanftem Rühren durch Inversion 1-2 s leicht wirbeln und aufschlagen. Bewegen Sie dann die Mikroplatte in einem kreuzförmigen Muster (oben-unten, links-rechts) 3x im Inkubator.
- Legen Sie die Platte nach 24 Stunden in den Inkubator des Lebendzell-Imaging-Systems. Führen Sie eine 10-fache Bildgebung von lebenden Zellen durch, wobei alle 20 Minuten Bilder aufgenommen werden. Legen Sie die Proben bei 37 °C und 5 % CO2 in den am Mikroskop angebrachten Inkubator.
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Ergebnisse
Angesichts der zahlreichen Variablen, die in dieser Methode manipuliert werden können und letztendlich zu einer Vielzahl von Ergebnissen führen, skizzieren wir hier häufige Fehltritte und die daraus resultierenden Ergebnisse sowie beispielhafte Ergebnisse und die dahinter stehenden Umstände.
Wie bei jeder Zellkulturtechnik ist eine Kontamination möglich (Ergänzendes Video 1). Neben sorgfältigen sterilen Techniken sollten Sie die Verwendung von...
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Diskussion
Hier haben wir eine Methode für die Primärkultur von humanen Keratinozyten zum Zwecke der Bildgebung lebender Zellen detailliert beschrieben. Diese Methode passt bestehende Zellkulturtechniken mit Low-Density-Plattierung und Langzeitkultur an, um erfolgreiche Lebendzell-Imaging-Studien zu ermöglichen. Die bevorzugte Methode zur Dissoziation dieses Zelltyps beinhaltet einen zweistufigen enzymatischen Verdau, der nachweislich zu Keratinozyten führt, von denen 3 % bis 4 % in der Lage sind, ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Besonderer Dank geht an T. Richard Parenteau, MD/PhD, und Alexandra Charruyer, PharmD/PhD, die mir beigebracht haben, wie man Keratinozyten kultiviert. Vielen Dank an Merisa Piper, MD, für die Bereitstellung von Proben, aus denen wir Keratinozyten isolieren konnten. Abschließender Dank an Dr. Michael Rosenblum, der uns Zugang zu seinem Lebendzell-Bildgebungssystem gewährt hat, um die Experimente durchzuführen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X), 100 mL | Gibco | 25300-054 | |
| 100-μm-Zellfilter | Corning | 352360 | |
| 15 cc Falcon | Corning | 352096 | |
| 50 ccm konischer Falcon | Corning | 352070 | |
| 6-Brunnen-Mikroplatte | Corning | 3516 | |
| 70 % Reagenz Alkohol, 4 L | VWR Chemicals | BDH1164-4LP | Alternativ können Sie Ihre eigene verdünnen |
| Amphotericin B, 50 ml | Corning | 30-003-CF | Verdünnen auf 5X (50 ug/mL) |
| Dipase, 100 ml | Corning | 354235 | 1:1 mit HBSS verdünnen, 1x Gentamycin hinzufügen, filtersterilisieren |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Fügen Sie HKGS hinzu, ziehen Sie Antibiotika in Betracht und ziehen Sie Antibiotika in Betracht |
| Fetal Rinderserumwert Hitzeinaktivierter FBS, 500 ml | Gibco | A52568-01 | FBS |
| Zange | |||
| Gentamicin, 10 ml | Gibco | 15750-060 | Verdünne auf 50 μG/ml für 5X |
| Hanks ausgewogene Salzlösung (1X), 500 ml | Gibco | 14170-112 | (HBSS) |
| HBSS 5X PSAG | Das ist HBSS + 5-fache Konzentrationen von Pen/Strep/Ampho/Gent | ||
| Hibiclens, Gallone | Molnlycke | 57591 | Verdünnen Sie auf 10 % mit deionisiertem H2O |
| Humanes Keratinozytenwachstumsserum, 5 mL | Gibco | S-001-5 | Epilife hinzugefügt |
| Penicillin/Streptomycin, 100 ml | Corning | 30-002-Cl | Verdünne auf 5X (kommt im 100x-Original) für 5X PSA – 1X für Medienwechsel |
| Petrischale 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Skalpellklinge NR. 23 | VWR | 76457-480 | |
| TrypLE | Gibco | 12604021 | Eine weniger ätzende Alternative zu normalem Trypsin |
| Trypsin-neutralisierende Lösung | (TNS), das ist HBSS mit 10 % FBS (manche verwenden weniger Serum, 5 %) |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
