Verwendung von In-vivo-Assemblierung für den hocheffizienten Plasmidbau

Die molekulare Klonierung umfasst eine Reihe von Labortechniken, die zur Herstellung von Plasmiden mit spezifischer rekombinanter DNA^{erforderlich sind 1}. Diese allgegenwärtigen Techniken stellen oft einen Engpass im experimentellen Arbeitsablauf^{dar 2}. Viele molekulare Klonierungstechniken beruhen auf der Assemblierung von DNA-Fragmenten in vitro unter Verwendung einer Reihe enzymatischer Reaktionen vor der Umwandlung in einen Wirtsstamm (z. B. Escherichia coli DH5a) zur Amplifikation 3,4,5,6,7. Da In-vitro-Plasmid-Assemblierungsmethoden auf Enzymen beruhen, kann der Kauf oder die Reinigung von Enzymen sowohl kostspielig als auch zeitaufwändig sein.

Die In-vivo-Assemblierung (IVA) ist eine molekulare Klonierungsmethode, die auf der intermolekularen Rekombination von DNA-Fragmenten in einem geeigneten Wirt^beruht 8,9,10,11,12. Grundlage dieser Methode war die Beobachtung, dass häufig verwendete recA-Klonierungsstämme von E. coli die intermolekulare Rekombination eines einzelsträngigen Primers mit einem durch Restriktionsenzyme gespaltenen Plasmid vermitteln können¹³. Die Verwendung der PCR zur Erzeugung homologer DNA-Enden für die Plasmidassemblierung in E. coli wurde in den 1990er Jahren beschrieben und diese Methode als Rekombinations-PCR ^3,14 bezeichnet. Die Wirksamkeit der Rekombinations-PCR wurde mit etwa 50 % ^angegeben14. Diese Methode wurde jedoch nicht weit verbreitet übernommen, wahrscheinlich aufgrund der hohen Kosten für Primer und des Risikos, unerwünschte Mutationen mit Polymerasen mit geringer Genauigkeit einzuführen, um große DNA-Fragmente zu amplifizieren. Diese Nachteile waren in den 1990er Jahren erheblich und konnten durch den Einsatz von In-vitro-Klonierungsmethoden wie der Restriktionsenzym-vermittelten Klonierung vermieden werden.

In den letzten Jahren sind die Kosten für Primer gesunken, und neue kommerzielle Polymerasen haben die Genauigkeit der PCR-Amplifikation erhöht. Infolgedessen wurde die Rekombinations-PCR als schnelle und kostengünstige molekulare Klonierungstechnik neu interpretiert und in IVA 2,9,15,16 umbenannt. Mit zunehmender Machbarkeit wurde die IVA weiter erforscht und die Methode optimiert, um eine Klonierungseffizienz von bis zu 99 % zu ^erreichen16. Bei den Optimierungen wurden Merkmale der homologen DNA identifiziert, wie z. B. die Anzahl der Basenpaare und die Schmelztemperatur, die die in vivo-Rekombinationseffizienz maximieren ^2,16. Weitere Analysen zeigten, dass bis zu 6 DNA-Fragmente im Bereich von 150 bp bis 7 kbp mit IVA¹⁵ effizient assembliert werden konnten. Darüber hinaus hat unsere Gruppe kürzlich IVA verwendet, um eine Plasmidserie mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzkassetten und Replikationsursprüngen zusammenzusetzen¹⁷. In dieser Studie war die IVA-Klonierung hocheffizient (71-100%), wobei für jedes Plasmid eine kleine Anzahl von Klonen getestet wurde (n = 2)¹⁷. Hier beschreiben wir das von unserem Labor verwendete IVA-Protokoll.

1. Primer oder DNA-Fragmente mit homologen Enden entwerfen

1. Verwenden Sie eine Textverarbeitungssoftware oder eine spezielle DNA-Analysesoftware, um das gewünschte Plasmid künstlich zusammenzusetzen.
   HINWEIS: Es ist oft hilfreich, DNA-Fragmente aus verschiedenen Quellen farblich zu kennzeichnen und homologe Regionen hervorzuheben, die in nachgelagerten Assemblierungsschritten verwendet werden. Darüber hinaus ist es auch hilfreich, homologe DNA farblich zu kodieren, um eine gerichtete Assemblierung zu gewährleisten.
2. Entwerfen Sie Primer, die an jedes DNA-Fragment binden und 15-50 bp der homologen DNA-Sequenz enthalten (Abbildung 1)^2,15.
   1. Um die IVA-Effizienz zu erhöhen, stellen Sie sicher, dass homologe DNA-Fragmente Schmelztemperaturen von 47-52 °C^{aufweisen 2}.
      HINWEIS: Die Schmelztemperatur kann mit der Online-Software¹⁸ oder der Formel bestimmt werden: Schmelztemperatur = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), wobei n = Anzahl von G, C, A oder T in der Sequenz ^6,19 ist.
   2. Vermeiden Sie Primer mit sich stark wiederholenden Sequenzen wie CATCATCATCATCATCATCATCAT, die für ein HIS-Tag kodieren, da sie zu Instabilität²⁰ führen können. Wenn eine endgültige, sich wiederholende Aminosäuresequenz für Anwendungen wie das Einfügen eines Poly-HIS-Tags benötigt wird, verwenden Sie alternative Codons wie CATCACCATCATCACCAC, um die Wiederholung der Nukleinsäuresequenz zu verringern.
      HINWEIS: Grundierungen können bei jedem bevorzugten Anbieter bestellt werden. Wenn DNA-Fragmente synthetisiert werden sollen, sollten homologe Enden in das synthetisierte DNA-Fragment eingebaut werden.

2. Amplifikation von DNA-Produkten, die homologe Enden enthalten

1. Isolierung von Plasmid-DNA oder genomischen DNA-Templates unter Verwendung von handelsüblichen DNA-Isolationskits oder alkalischer Lyse ^6,17.
2. Verwenden Sie Matrizen-DNA (aus Schritt 2.1) und Primer, die homologe Regionen enthalten (Schritt 1.2) in einer PCR-Reaktion mit einer kommerziell erhältlichen High-Fidelity-Polymerase. Um die DNA-Matrizenverschleppung in nachgeschalteten Reaktionen zu begrenzen, verwenden Sie in jeder Reaktion eine geringe Menge an Matrizen-DNA (20 pg-1 ng). Beachten Sie die Empfehlungen des Herstellers für enzymspezifische PCR-Reaktionsgemischkomponenten und die empfohlenen Bedingungen für den PCR-Zyklus. Fahren Sie mit der PCR-Reaktion fort.
   1. Richten Sie die PCR-Reaktionen (50 μl) so ein, dass sie die in Abbildung 2 gezeigten DNA-Fragmente so amplifizieren, dass sie 100 μM dNTPs, 0,2 μM jedes DNA-Primers, Template-DNA (50 pg pSU19 und 1 ng pSU18mCherry), 1x PCR-Reaktionspuffermischung mit Mg²⁺ (2 mM Endkonzentration) und 1 U High-Fidelity-DNA-Polymerase enthalten.
   2. Verwenden Sie ein Touchdown-PCR-Cycling-Programm, um pSU19 und mCherry zu amplifizieren (Abbildung 2). Stellen Sie den anfänglichen Denaturierungsschritt 5 Minuten lang auf 95 °C ein, gefolgt von 10 Zyklen mit 95 °C für 15 s, 55 °C bis 0,5 °C pro Zyklus für 15 s und 72 °C für 1 min und dann 20 weitere Zyklen mit 95 °C für 15 s, 50 °C für 15 s und 72 °C für 1 min. Beenden Sie den PCR-Zyklus mit einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 Minuten.
      HINWEIS: Wenn ein Plasmidrückgrat amplifiziert werden soll, passen Sie die Menge des DNA-Templates basierend auf dem Molekulargewicht an: mit ~20 pg/1 kbp Plasmid-DNA pro 50 μl PCR-Reaktion (50 pg DNA für pSU19 (gezeigt)). Passen Sie außerdem die PCR-Zyklen an, um die Anzahl der während der Amplifikation eingeführten Mutationen zu minimieren: Für die Amplifikation von Plasmidrückgraten sind bereits 20-25 PCR-Zyklen ausreichend.
3. Sobald die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie ein Aliquot (2 μl) der PCR-Reaktion, kombinieren Sie es mit einem Ladefarbstoff (bis zu einer 1-fachen Konzentration) und trennen Sie die DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese²¹. Verwenden Sie einen ultravioletten (UV) oder LED-Transilluminator, um DNA-Fragmente sichtbar zu machen, die in das Agarosegel migriert sind. Stellen Sie fest, ob PCR-Produkte einzigartig sind, und vergleichen Sie die Produkte mit der DNA-Leiter, um zu überprüfen, ob sie das erwartete Molekulargewicht haben (Abbildung 2). Wenn keine PCR-Produkte mit dem richtigen Molekulargewicht sichtbar sind, beziehen Sie sich auf die Empfehlungen des Herstellers zur Optimierung der PCR-Reaktion.
   HINWEIS: Wenn die PCR-Produkte nicht einzigartig sind, aber ein reichlich vorhandenes DNA-Fragment vorhanden ist, das dem erwarteten Molekulargewicht entspricht, kann eine zusätzliche PCR-Reaktion vermieden werden.
4. Wenn mehrere DNA-Fragmente im Agarosegel vorhanden sind, entfernen Sie das DNA-Fragment, das dem erwarteten Molekulargewicht entspricht, aus dem Agarosegel und verwenden Sie ein Agarosegel-Extraktionskit, um das DNA-Fragment zu gewinnen.
5. Um methylierte Template-DNA aus den PCR-Reaktionen zu entfernen, geben Sie 1 μl DpnI direkt in das Reaktionsröhrchen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für 15 Minuten bis über Nacht.
   HINWEIS: Dieser optionale Schritt wird dringend empfohlen, um die Menge an Template-DNA zu begrenzen, die in nachgelagerten Reaktionen weitergetragen wird. Dieser Schritt kann jedoch übersprungen werden, wenn in der PCR-Reaktion sehr geringe Konzentrationen von Template-DNA verwendet werden.
6. Verwenden Sie ein Nukleinsäure-Aufreinigungskit, um verbleibende Enzyme, Salze, Primer-Dimere und andere unerwünschte niedermolekulare DNA-Produkte zu entfernen, die aus enzymatischen Assays resultieren.
   HINWEIS: Die Schritte 2.1-2.6 können übersprungen werden, wenn DNA-Fragmente synthetisiert werden.
7. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration der gereinigten DNA-Fragmente durch Spektrophotometrie oder Gelschätzung.

3. IVA (Abbildung 3)

1. Berechnen Sie die Menge an DNA, die für jede IVA-Reaktion erforderlich ist (empfohlen werden 25-50 ng Plasmid-DNA). Verwenden Sie höhere Mengen an Plasmid-DNA für Plasmide mit höherem Molekulargewicht (z. B. verwenden Sie für Plasmide von 2,3 kbp 25 ng Plasmid, aber wenn Plasmide 9 kbp sind, verwenden Sie 50 ng in jeder Reaktion). Berechnen Sie das Volumen der insertiven DNA, das für die Reaktion benötigt wird. Verwenden Sie ein molares Verhältnis von 1:3 oder 1:5 von Plasmid:Insert-DNA.
   HINWEIS: Online-Biorechner oder die unten angegebenen Formeln können verwendet werden, um die molare Menge eines doppelsträngigen DNA-Fragments zu berechnen und das molare Verhältnis jedes DNA-Fragments zu bestimmen.
   Wir verwenden die folgende Formel, um die molare Menge eines doppelsträngigen DNA-Fragments zu berechnen: pmol = (Gewicht in ng) × 1.000 / (Basenpaare × 650 Dalton). Darüber hinaus können molare Verhältnisse berechnet werden durch: Masse Insert (g) = gewünschtes Insert/Plasmid molares Verhältnis × Masse des Plasmids (g) × Verhältnis von Insert- zu Plasmidlängen⁶.
2. Kombinieren Sie das berechnete Plasmidvolumen, geben Sie die DNA in ein vorgekühltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf.
3. Übertragen Sie das Plasmid und das eingefügte DNA-Gemisch aus Schritt 3.2 in ein Aliquot (25-100 μl) aus aufgetauten recA^- chemisch kompetenten E. coli (z. B. E. coli DH5a;²²).
   HINWEIS: Das Volumen der verwendeten kompetenten Zellen hängt vom Volumen des Plasmid- und Insert-DNA-Gemisches ab. Dieses Gemisch sollte 10 Vol.-% der zuständigen Zellen nicht überschreiten.
4. Fahren Sie mit einer Hitzeschock-Transformation^{fort 23}.
   1. Inkubieren Sie die Mischung aus chemisch kompetenten E. coli und DNA 30 Minuten lang auf Eis.
   2. 1 min in ein 42 °C warmes Wasserbad geben, dann den Schlauch für 2 min auf Eis stellen.
   3. Übertragen Sie LB aseptisch in das Röhrchen, um das Volumen auf 1 ml zu erhöhen.
   4. Übertragen Sie das 1-ml-Volumen in ein Glaskulturröhrchen und stellen Sie es in einen Schüttelinkubator, der auf 37 °C, 220 U/min oder die empfohlene Temperatur eingestellt ist, damit sich der Bakterienstamm und/oder das Plasmid erholen kann (typischer Bereich von 25 °C bis 37 °C), und ermöglichen Sie die Produktion des Plasmid-kodierten Antibiotika-Auswahlmarkers.
5. Nachdem sich die Zellen 30 Minuten bis 1 h erholt haben, wird ein Aliquot (100 μl von 1.000 μl) der Transformationsreaktion auf ein festes Selektionsmedium abgegeben und das Aliquot mit einem sterilen Zellspreizer auf der Agarkulturplatte dispergiert. Sammeln Sie den Rest der transformierten Zellen durch Zentrifugation (13.000 × g für 1 min), entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl sterilem Medium und lagern Sie es wie oben beschrieben auf festes Selektionsmedium ab. Lassen Sie die Flüssigkeit 30 min lang in das feste Medium einziehen, drehen Sie die Kulturplatten um. und legen Sie sie über Nacht bei der für den Bakterienstamm und/oder das Plasmid empfohlenen Temperatur in einen Inkubator.

4. Screening auf korrekte Plasmidassemblierung

1. Nach der Inkubation (Schritt 3.5) nehmen Sie die Kulturplatten aus dem Inkubator und zählen Sie die Kolonien durch direkte Zählung auf, wenn sich auf jeder Kulturplatte mehrere isolierte Bakterienkolonien befinden. Wählen Sie mehrere Kolonien (1-10) für das Screening aus, um festzustellen, ob sie das gewünschte zusammengesetzte Plasmid enthalten.
   1. Sterile Wachstumsmedien, die mit geeigneten Antibiotika ergänzt sind, in sterile Kulturröhrchen (Glas oder Kunststoff) überführen. Beimpfen Sie das Nährmedium, indem Sie 1 Kolonie mit einer sterilen Transfernadel oder -schlaufe berühren und die Zellen mit der Transfernadel in das Kulturröhrchenmedium übertragen. Legen Sie die Kulturröhrchen in einen Schüttelinkubator und inkubieren Sie sie 16-18 Stunden lang bei der für den Bakterienstamm und/oder das Plasmid empfohlenen Temperatur (typischer Bereich von 25 °C bis 37 °C).
2. Am nächsten Tag isolieren Sie die Plasmid-DNA aus den Bakterienkulturen durch alkalische Lyse⁶ oder unter Verwendung eines handelsüblichen Plasmid-Isolationskits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Stellen Sie fest, ob die Plasmide korrekt zusammengesetzt sind.
   1. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration der isolierten Plasmide durch Spektrophotometrie oder Gelschätzung.
   2. Verwenden Sie ein Aliquot (50-150 ng) Plasmid-DNA für eine diagnostische Restriktionsverdauungsreaktion (10 μl Endvolumen). Wählen Sie Restriktionsenzyme danach aus, wo sie die zusammengesetzte Plasmid-DNA spalten sollen.
      HINWEIS: Wir empfehlen zwei getrennte Reaktionen: (1) Behandlung von Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, von dem erwartet wird, dass es das Plasmid an einer einzigen Stelle spaltet, und (2) Behandlung von Plasmid-DNA mit zwei Restriktionsenzymen, von denen erwartet wird, dass sie das eingefügte DNA-Fragment ganz oder teilweise herausschneiden. Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und sollten gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
   3. Sobald die Restriktionsenzymreaktion abgeschlossen ist, kombinieren Sie es mit dem Ladefarbstoff (bis zu einer 1-fachen Konzentration), laden Sie das gesamte Gemisch auf ein Agarosegel und trennen Sie die DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese²¹. Verwenden Sie einen UV- oder LED-Transilluminator, um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen, die im Agarosegel migriert sind. Vergleichen Sie eingeschränkte DNA-Fragmente mit der Molekulargewichtsleiter, um festzustellen, ob es sich um das/die erwartete(n) Molekulargewicht(e) handelt (Abbildung 4). Beachten Sie die Plasmide mit den erwarteten Enzymrestriktionsmustern ( sogenannte positive Klone); Entsorgen Sie die Röhrchen mit Plasmiden, die nicht das erwartete Restriktionsmuster aufweisen (sogenannte negative Klone).
4. Um sicherzustellen, dass positive Klone die erwartete Nukleotidsequenz aufweisen, senden Sie ein Aliquot positiver Plasmidklone zur Sequenzierung.
   HINWEIS: Es wird eine Ganzplasmid-Sequenzierung empfohlen (z. B. Nanoporen-Sequenzierung).

Als Beispiel für die Verwendung von IVA folgten wir in diesem Manuskript dem bereitgestellten IVA-Workflow, um den offenen mCherry-Leserahmen in die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pSU19 zu klonen, um ein Plasmid zu erzeugen, das mit pSU19mCherry identisch ist (Abbildung 3)17. Die für IVA geeigneten Primer wurden auf der Grundlage der Protokollschritte 1.1 und 1.2 entwickelt. Anschließend wurde ein Plasmidisolationskit verwendet, um pSU19 und pSU18mCherry zu isolieren, die als Templates für PCR-Reaktionen zur Amplifikation des Plasmidrückgrats bzw. zur Insertion von DNA dienten (Protokollschritt 2.1). Das pSU19-Plasmid-Rückgrat wurde PCR-amplifiziert (Primerpaare: pSU19_F: TAGGGTACCGAGCTCGAATTC und pSU19_R CCCGGGGATCCTCTAGAGTC) und der offene mCherry-Leserahmen wurde PCR-amplifiziert von pSU18mCherry (Primerpaare mCherry_F: ctctagaggatccccgggATGGTATCAAAAGGAGAGGAAG und mCherry_R: gaattcgagctcggtaccctaTTATCATTACTTGTACAGTTC; die kleingeschriebene Nukleotidsequenz in den mCherry-Primern weist auf Nukleotide hin, die homolog zu den Primern sind, die zur Amplifikation des pSU19-Rückgrats verwendet werden; Protokollschritt 2.2). Die spezifische PCR-Amplifikation wurde durch Agarose-Gelelektrophorese verifiziert (Protokollschritt 2.3; Abbildung 2) und die PCR-Produkte wurden dem Rest des Tages-1-Workflows unterzogen (Protokollschritte 2.5-3.5; Abbildung 3).

Am nächsten Tag wurden die Kolonien auf der Transformationsplatte gezählt (Protokollschritt 4.1; Abbildung 3, Tag 2). In diesem Experiment waren sechs Kolonien sichtbar; Die Anzahl der Kolonien kann erhöht werden, indem ein größeres Aliquot der zurückgewonnenen Kultur plattiert oder die Menge an DNA, die in die zuständigen Zellen umgewandelt wird, erhöht wird. Sind keine Kolonien auf Transformationsplatten vorhanden, ist es wichtig, zunächst zu überprüfen, ob die kompetenten Zellen eine hohe Transformationseffizienz aufweisen. Wir haben erfolgreich kompetente Zellen mit Transformationseffizienzen von 10,7 bis 109 koloniebildenden Einheiten/μg transformierter pUC19-DNA verwendet. Wenn die Transformationseffizienz keine Rolle spielt, kann es erforderlich sein, die Menge der in die kompetenten Zellen transformierten DNA zu erhöhen und/oder das Volumen der kompetenten Zellen zu erhöhen, wenn IVA mit Plasmiden mit höherem Molekulargewicht durchgeführt oder viele DNA-Fragmente assembliert werden.

Wir wählten zwei Kolonien aus, um sie auf korrekte Plasmidassemblierung zu untersuchen (Protokollschritte 4.1-4.3.3). Am nächsten Tag folgten wir dem Workflow für Tag 3 (Abbildung 3). Nach der Plasmidisolierung ist jedes Plasmid entweder mit XbaI oder XbaI und EcoRI zu behandeln, von denen erwartet wird, dass sie das korrekt zusammengesetzte Plasmid ein- oder zweimal spalten (Abbildung 4). Wie in Abbildung 4 zu sehen ist, führten beide Enzymreaktionen zu einem einzigen DNA-Produkt, das 2,3 kbp für Plasmidklon 1 entspricht, was darauf hindeutet, dass es sich dabei nur um pSU19 handelt. Enzymbehandlungen von Plasmidklon 2 führten zu einem einzelnen ~3 kbp DNA-Produkt nach der Behandlung mit XbaI und zwei DNA-Produkten (2,3 kbp und 770 bp) nach der Behandlung mit XbaI und EcoRI. Die korrekte Assemblierung von Plasmidklon 2 wurde dann durch eine Ganzplasmidsequenzierungsanalyse verifiziert (Protokollschritt 4.4; Abbildung 3, Tag 3). In diesem Beispiel betrug der Wirkungsgrad der korrekten Plasmidassemblierung 50 %. Wir untersuchen selten mehr als zwei Klone auf korrekte Plasmidassemblierung und haben in der Regel eine Effizienz von 50-100 % bei der Plasmidassemblierung. Unserer Erfahrung nach enthalten negative Klone in der Regel entweder (i) ein Plasmidrückgrat, das von der Matrizen-DNA übernommen wird, die rezirkuliert wurde, oder (ii) ein hybrides DNA-Produkt, das aus Matrizen-DNA besteht, die zu einem Hybrid-Plasmid rekombiniert wurde. DPNI-Behandlung (Protokollschritt 2.5) begrenzt die Anzahl der negativen Klone. Wenn dies die IVA-Effizienz nicht verbessert, wird empfohlen, das PCR-Primer-Design zu überprüfen und die Plasmidrückgrate und PCR-Produkte erneut zu amplifizieren.

Abbildung 1: Designstrategie für IVA-Primer. Der erste Schritt (Schritt 1) beim IVA-Primer-Design besteht darin, mithilfe von Software eine Sequenzdatei des gewünschten assemblierten Plasmids in silico zu erstellen. Der zweite Schritt (Schritt 2) besteht darin, Primer zu entwerfen, die das Plasmidrückgrat in der Nähe der Verbindung zwischen dem Plasmid und der eingefügten DNA-Sequenz amplifizieren. Die Primer für die Insertsequenz sollten genügend Nukleotide enthalten, um das gewünschte DNA-Produkt spezifisch zu binden und zu amplifizieren, und 15-50 bp des angrenzenden Plasmidrückgrats für die homologe Rekombination enthalten. Bereiche der Homologie im Plasmiddesign sind farbcodiert. Abkürzung: IVA = in vivo Assemblierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: PCR-Amplifikation von Plasmid- und Insert-DNA. Gezeigt ist ein repräsentatives Bild von PCR-amplifizierten DNA-Fragmenten, die Plasmid- und Insert-DNA entsprechen, die Regionen der Homologie enthalten. DNA-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese getrennt und durch UV-Transillumination sichtbar gemacht. Die DNA-Produkte wurden mit dem Molekulargewichtsmarker (M) verglichen, um das scheinbare Molekulargewicht jedes PCR-Produkts zu bestimmen. Das erwartete Molekulargewicht der Plasmid- (pSU19) und Insert-DNA (mCherry) beträgt 2,3 kbp bzw. 770 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs bei der In-vivo-Montage. Die DNA wird PCR-amplifiziert, um homologe 5'- und 3'-Regionen zu erzeugen. DPNDie I-Behandlung wird verwendet, um die Matrizen-DNA zu spalten. Ein Nukleotid-Aufreinigungskit wird verwendet, um Salze und Enzyme aus der PCR-amplifizierten DNA zu entfernen. Die UV-Spektrophotometrie wird zur Bestimmung der DNA-Konzentration verwendet, und ein molares Verhältnis von Insert zu Plasmid von 3:1 wird in einem vorgekühlten Mikrofuge-Röhrchen kombiniert. Die kombinierte DNA wird in ein eiskaltes Mikrofuge-Röhrchen übertragen, das ein Aliquot von aufgetauten E. coli DH5α-kompetenten Zellen enthält. Die DNA wird durch Hitzeschock in E. coli DH5α umgewandelt, auf feste Selektionsmedien aufgetragen und 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden einzelne Kolonien, die Plasmidklone enthalten, in Kulturröhrchen überführt, die steriles flüssiges Medium und Antibiotikum enthalten, und dann bei 37 °C inkubiert und 18 Stunden lang gerührt. Am nächsten Tag wird Plasmid-DNA aus den Zellen isoliert und eine Restriktionsenzymbehandlung verwendet, um nach positiven Klonen zu suchen. Positive Klone werden dann zur Sequenzierungsanalyse geschickt, um die DNA-Sequenz der Plasmide zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Gelelektrophorese zum Screening auf positive Plasmidklone. Zwei verschiedene Plasmidklone wurden isoliert und mit Restriktionsenzymen behandelt, von denen erwartet wurde, dass sie positive Klone einmal spalten, um das Plasmid zu linearisieren, oder zweimal, um die eingefügte DNA freizusetzen. Nach der Behandlung mit Restriktionsenzymen wurden die Proben durch Gelelektrophorese getrennt und durch UV-Transillumination sichtbar gemacht. Das Molekulargewicht wurde durch Vergleich mit dem Molekulargewichtsmarker geschätzt. Das erwartete Molekulargewicht eines linearisierten positiven Klons (Plasmid + Insert) betrug 3,07 kbp, und die erwarteten Molekulargewichte von DNA-Fragmenten nach zweimaliger Spaltung eines positiven Klons betrugen 2,3 kbp (Plasmidrückgrat) und 770 bp (Insert). Plasmid-Klon 1 ist negativ (leeres Plasmid) und Klon 2 ist ein positiver Klon. Abkürzungen: FM = einfaches Dekolleté; DC = doppelte Spaltung; M = Molekulargewichtsmarker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.