Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Induktion einer einseitigen Harnleiterobstruktion (UUO) bei Mäusen, um das Fortschreiten der Gewebefibrose bei obstruktiver Nephropathie zu untersuchen. Es umfasst chirurgische Eingriffe, postoperative Pflege und Methoden zur Beurteilung der Fibrose.
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Methodenartikel
Einseitiges Harnleiterobstruktionsmodell zur Untersuchung der interstitiellen Nierenfibrose
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Nierenfibrose ist das pathologische Endergebnis der fortschreitenden chronischen Nierenerkrankung (CKD). Das Modell der unilateralen Harnleiterobstruktion (UUO) wird häufig verwendet, um die molekularen und zellulären Mechanismen aufzuklären, die der interstitiellen Nierenfibrose zugrunde liegen, und um potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Dieses Modell wird bei Mäusen durch chirurgische Ligatur eines einseitigen Harnleiters etabliert, ein Verfahren, das relativ einfach und einfach durchzuführen ist. Es ist jedoch bekannt, dass das UUO-Mausmodell eine signifikante Variabilität und Inkonsistenz aufweist, die von Faktoren wie Mausstamm, Alter, Geschlecht, Anästhesietyp, Dauer der Operation, Körpertemperatur während des Eingriffs, den chirurgischen Fähigkeiten des Bedieners, den Fütterungsbedingungen und dem allgemeinen Gesundheitszustand der Mäuse beeinflusst wird. Unterschiede in den Operationstechniken, der Nahtplatzierung und der Dauer der Obstruktion tragen zur Variabilität der Ergebnisse bei. Darüber hinaus erhöht die inkonsistente Probenahme verstopfter Nieren die Variabilität bei der Beurteilung der Nierenfibrose weiter. Diese Studie skizziert den Prozess der Entwicklung des UUO-Mausmodells und der Bewertung der interstitiellen Fibrose, diskutiert die technischen Herausforderungen, die zur Unvorhersehbarkeit des Modells beitragen, und schlägt mögliche Lösungen vor. Diese Erkenntnisse zielen darauf ab, einen standardisierten und universell anwendbaren Ansatz für die Untersuchung von Nierenfibrose zu etablieren.
Einleitung
Chronische Nierenerkrankungen (CKD) betreffen über 10 % der Weltbevölkerung, und ihre Prävalenz nimmt zu1. Verschiedene Erkrankungen der Harnwege, darunter angeborene anatomische Anomalien, Nephrolithiasis, Prostatahyperplasie und Blasentumoren, können zu einer Harnleiterobstruktion führen². Daher ist das Mausmodell der unilateralen Harnleiterobstruktion (UUO) ein wichtiges Instrument zur Identifizierung neuer Mechanismen der interstitiellen Nierenfibrose, zum Verständnis des Krankheitsverlaufs und zur Bewertung potenzieller Behandlungsstrategien. Es wurde häufig verwendet, um den Ursprung von Myofibroblasten, (Myo)Fibroblasten-Subclustern, den tubulären Zellstoffwechsel und den Zellzyklusarrest, den partiellen epithelial-mesenchymalen Übergang und andere verwandte Prozesse zu untersuchen 3,4,5,6,7,8.
Neben der UUO-induzierten interstitiellen Nierenfibrose gehören zu den häufig verwendeten Nagetiermodellen der interstitiellen Nierenfibrose toxininduzierte Modelle, wie z. B. Modelle mit Aristolochiasäure, Folsäure und Adenin, sowie chirurgisch induzierte Modelle wie die 5/6-Nephrektomie und die Ischämie-Reperfusions-Schädigung (IRI). Das UUO-Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber alternativen Nierenfibrose-Modellen. Zum Beispiel erfordert die toxininduzierte Nierenfibrose einen relativ langen Modellierungszeitraum (ca. 1-2 Monate), und ihre toxischen Nebenwirkungen auf andere Organe können die Untersuchung der Fibrosemechanismen erschweren 9,10,11. Chirurgisch induzierte Modelle, wie z. B. die 5/6-Nephrektomie, können zu erheblichen Nierenblutungen und Infektionen führen, was das Risiko einer postoperativen Mortalität erhöht. Darüber hinaus korreliert das Ausmaß der induzierten interstitiellen Fibrose direkt mit dem Volumen des resezierten Nierengewebes, was es schwierig macht, bei jeder Maus konsistent den gleichen Grad an Fibrose zu reproduzieren12.
Das renale IRI-Modell ist eine primäre Methode zur Induktion einer akuten Nierenschädigung bei CKD und hat eine signifikante klinische Relevanz. Der Schweregrad der Fibrose kann durch Anpassen der ischämischen Zeit und der Körpertemperatur moduliert werden. Im Vergleich zum UUO-Modell ist sie jedoch chirurgisch komplexer, und die Induktion der interstitiellen Fibrose erfordert eine längere Dauer13. Im Vergleich zu diesen Modellen hat das UUO-Modell mehrere Vorteile, darunter eine kurze Modellierungsdauer, minimale Variabilität, Wiederholbarkeit und ein relativ einfaches chirurgisches Verfahren. Das UUO-Mausmodell, das keine Toxine enthält, wird durch Liligation eines Harnleiters hergestellt, was innerhalb von zwei Wochen zu einer obstruktiven Nephropathie führt. Dies führt zu Hydronephrose, tubulärer Dilatation und interstitieller Fibrose, die dem pathologischen Prozess, der beim Menschen beobachtet wird, sehr ähnlichsind 14. Der Schweregrad der Fibrose - leicht, mittelschwer oder schwer - kann durch Anpassung der Versuchsdauer kontrolliert werden.
Obwohl das UUO-Mausmodell einfacher durchzuführen ist als andere Insult-induzierte Modelle zur Untersuchung von CKD, können mehrere Faktoren seine Stabilität erheblich beeinflussen. Zu diesen Faktoren gehören der Stamm der Maus, das Alter, das Geschlecht, die Art der Anästhesie, die Operationsdauer, die Körpertemperatur während der Operation, die chirurgischen Fähigkeiten des Bedieners sowie die Fütterungsbedingungen und der Gesundheitszustand der Mäuse15,16.
Die Minimierung von chirurgischem Stress und Infektionen bei gleichzeitiger gleichmäßiger und organisierter Durchführung des Eingriffs unter Narkose ist für die Erstellung eines reproduzierbaren UUO-Mausmodells unerlässlich. Darüber hinaus kann die Erforschung der Mechanismen und potenziellen therapeutischen Ziele von CKD durch unerfahrene Bediener beeinträchtigt werden, was zu einem erhöhten Mausverlust und einer größeren Heterogenität der Modelle führt. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, werden wichtige technische Aspekte des chirurgischen Prozesses – vor, während und nach dem Eingriff – skizziert und kritische Aspekte hervorgehoben, die Aufmerksamkeit erfordern. Darüber hinaus wird die Bewertungsmethodik für das UUO-Mausmodell detailliert beschrieben, um den Forschern einen konsistenten und zuverlässigen Ansatz zu bieten.
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Protokoll
Alle Tierversuche werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Behörde durchgeführt und von der Institutionellen Tierethikkommission der Nanjing Medical University genehmigt. Um Unterschiede zwischen Geschlecht und Stamm auszuschließen und die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, werden nur männliche CD1-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen mit einem Gewicht von 22-25 g verwendet. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung von Tieren und Instrumenten
- Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation.
- Wiegen und betäuben Sie die Mäuse (nach institutionell anerkannten Protokollen). Schließen Sie das Inhalationsanästhesiegerät ordnungsgemäß an und legen Sie die Mäuse in die Induktionskammer mit 2% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff bei 1-2 l/min. Setzen Sie dann die Mausnase mit konstanter Betäubung in den Nasenkonus ein. Bestätigen Sie den angemessenen Grad der Sedierung, indem Sie das Fehlen einer Reaktion auf ein Zehenklemmen beurteilen.
HINWEIS: Überprüfen Sie regelmäßig die Atemfrequenz und beurteilen Sie den Grad der Anästhesie anhand des Pedalreflexes der Mäuse. Passen Sie das Isofluran entsprechend an. - Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein elektronisches Heizkissen, wobei Kopf und Hals ausgestreckt sind, um die Atemwege offen zu halten. Sichern Sie die Pfoten mit wenig Klebeband.
- Verwenden Sie ein Thermometer, um die Umgebungstemperatur zu überwachen und auf 37-38 °C zu halten. Führen Sie eine rektale Sonde ein und halten Sie die Körperkerntemperatur der Mäuse während des Eingriffs bei etwa 36,5-37 °C.
- Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um Verletzungen der Hornhautxerose zu vermeiden.
- Rasieren Sie das Haar über dem Operationsbereich mit Haarentfernungscreme und desinfizieren Sie es dreimal mit Betadinlösung.
2. Chirurgischer Eingriff
HINWEIS: Sobald sich die Körpertemperatur auf dem Sollwert stabilisiert hat und der Zehenquetschreflex nicht mehr vorhanden ist, leiten Sie die folgenden chirurgischen Eingriffe ein.
- Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen vertikalen chirurgischen Schnitt von etwa 1 bis 1,5 Zentimetern von der Blase bis zum unteren linken Rand der Rippen zu machen, um die Bauchhöhle freizulegen.
- Bewegen Sie den Darm mit einem Wattestäbchen, das mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet ist, auf die rechte Seite der Bauchhöhle, um die linke Niere freizulegen, die sich unterhalb der Milzrückseite und neben der Wirbelsäule befindet.
- Verwenden Sie eine gebogene Iriszange, um das Fett und das Bindegewebe um den linken Harnleiter herum zu reinigen. Nach der sanften Isolierung wird der linke Harnleiter in der Nähe des unteren Pols der Niere mit einer 3/0-Seidenflechtnaht ligiert. Führen Sie eine zweite Ligatur des linken Harnleiters zwischen der ersten Ligatur und der Blase durch.
HINWEIS: Um die Variabilität zwischen den Mäusen zu minimieren, stellen Sie sicher, dass die Ligaturposition bei allen Probanden konsistent bleibt. Mit der linken Pinzette wird die Naht in die Spitzen der rechten Pinzette eingeführt und die Naht wieder unter den Harnleiter17 geschoben. Vermeiden Sie es, überschüssiges Fett und Bindegewebe in die Ligatur aufzunehmen, da dies zu einer unvollständigen Nierenobstruktion führen kann. Erreichen Sie dies, indem Sie den Harnleiter sanft mit trockenen Wattestäbchen streicheln. - Positionieren Sie den Darm vorsichtig wieder in die Bauchhöhle. Vernähen Sie die Muskel- und Hautschichten separat mit einer 3/0 Seidenflochnäht.
HINWEIS: Das Zusammennähen von Haut und Muskelschichten kann zu Nahtwundenrissen und Schäden an den Baucheingeweiden führen. - Wenn Sie an mehreren Mäusen operieren, reinigen Sie die chirurgischen Instrumente mit fließendem Wasser und 75 % Ethanol, bevor Sie zur nächsten Maus übergehen.
3. Nachsorge und Überwachung
- Injizieren Sie intraperitoneal 0,5 ml warme normale Kochsalzlösung, um eine Dehydrierung zu verhindern.
- Setze die Mäuse zurück in einen sauberen Käfig, bis sie wieder bei vollem Bewusstsein sind.
- Verabreichen Sie Buprenorphin (50 μg/kg) durch subkutane Injektion für 3 Tage. Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Anzeichen von mangelnder Pflege, vermindertem Fressen und abnormaler Körperhaltung.
4. Postoperative Untersuchungen
- Histologie
- Die Mäuse werden mit einer Überdosis Isofluran eingeschläfert (nach institutionell anerkannten Protokollen). Entnahme der verstopften und kontralateralen nicht verstopften Nieren18 nach der Euthanasie.
- Verwenden Sie für die histologische Untersuchung die größte Schnittfläche des Nierenschnitts.
- Fixieren Sie das Nierengewebe in 4% Paraformaldehyd und schneiden Sie die erhaltenen Proben in 4 μm große Abschnitte.
- Färben Sie Nierenschnitte mit periodischer Säure-Schiff (PAS), Masson-Trichrom-Färbung (MTS) oder Sirius-Rot-Färbung, um Nierentubulusschäden und Nierenfibrose zu erkennen.
- Wählen Sie zehn zufällige Felder der Nierenschnitte unter einem Lichtmikroskop bei einer Vergrößerung von 200× aus.
- Berechnen Sie den Anteil der kollagenpositiven blauen Fläche mit der ImageJ-Software.
- Western-Blot
- Extrahieren Sie etwa 20 mg Nierengewebe aus demselben Pol der UUO-Nieren unter Verwendung des Radioimmunpräzipitationsassays (RIPA) Puffer18.
- Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe eines Bicinchoninsäure-Assays19 quantifiziert.
- Laden Sie gleiche Mengen an Proteinproben für die Elektrophorese auf 4%-10%ige Bis-Tris-Gele und übertragen Sie sie auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen.
- Blockieren Sie die PVDF-Membranen mit 5% Milch in Tris-Buffered Saline Tween (TBST) und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern.
- Waschen Sie die PVDF-Membranen mit TBST und inkubieren Sie sie mit Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für 1 h.
- Ermitteln Sie den Proteingehalt mit einer ECL-Methode (Enhanced Chemilumineszenz) und analysieren Sie sie mit der ImageJ-Software, wobei die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als Belastungskontrolle dient.
- Nierenfunktion
- Betäuben Sie die Mäuse mit inhalativem Isofluran (siehe Schritt 1.2).
- Entnahme von Blutproben retroorbital nach der Anästhesie.
- Zentrifugieren Sie Blutproben bei 3.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur.
- Messen Sie das Serumkreatinin und den Blutharnstoffstickstoff (BUN) mit einem automatischen trockenchemischen Analysator zur Überwachung der Nierenfunktion.
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Ergebnisse
Histologie
Die periodische Säure-Schiff (PAS)-Färbung zeigte eine tubuläre Dilatation, einen Verlust der Bürstenränder, eine Gipsbildung und eine röhrenförmige Epithelschwellung. Die Trichrom- und Sirius-Rotfärbung nach Masson zeigte eine interstitielle Fibrose nach UUO, im Gegensatz zu den normalen kompakten Tubuli mit erkennbaren Lumen, die in der Scheingruppe beobachtet wurden. Der Grad der interstitiellen Nierenfibrose, der in der Masson-Trichrom-Färbung durch blaue Bereiche und in der Sirius-Rot-...
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Diskussion
Es wird ein umfassendes Verfahren zur Etablierung des UUO-Modells, einem weit verbreiteten Ansatz zur Untersuchung der interstitiellen Nierenfibrose, vorgestellt. Darüber hinaus wird die Identifizierung und Bewertung des Modells, einschließlich der Bewertung der Nierenfunktion und histologischer Veränderungen, demonstriert. Es werden die Variablen, die zur Heterogenität des Modells beitragen, und die veränderbaren technischen Faktoren diskutiert.
Die Anfälligk...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation of China Grants (82370686/2024YFA1107704), das Jiangsu Specially-Appointed Professor Grant, das Nanjing Science and Technology Innovation Project, das Jiangsu Province Hospital High-level Talent Cultivation Program (Phase I) (CZ0121002010037), die Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20240055) und das Jiangsu Medical Innovation Team to JR; Jiangsu Province Hospital (das erste angeschlossene Krankenhaus der Nanjing Medical University) Projekt zur Verbesserung der klinischen Kapazität (JSPH-MA-2023-4), vorrangige akademische Programmentwicklung der Jiangsu Higher Education Institutions (China) und der National Natural Science Foundation of China (81970639/82151320) an HM.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mL Spritze | Mingankang | / | |
| 4/0 chirurgisches Nahtmaterial | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75% Ethanol | Lircon | 6303060031 | |
| Anästhesie-Luftpumpe | RWD Life Science | R510-29 | |
| Anästhesie-Induktionskammern | RWD Life Science | V102-V | |
| Tierhaarschneider | Jinke | / | |
| Betadin-Lösung | Lircon | 6303030036 | |
| Buprenorphin (Analgetikum) | RWD Life Science | / | |
| Gebogene Iriszange | Jinke | / | |
| Elektronisches Wärmekissen | Reptizoo | AHM23 | |
| feine gerade Pinzette | Jinke | / | |
| Gasfilterkanister | RWD Life Science | R510-31-6 | |
| Mullbinden | Winner Medical | 601-026576 | |
| Irisschere | Jinke | / | |
| Isofluran (Anästhetikum) | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| Tieranästhesiegerät mit mehreren Ausgängen | RWD Life Science | R550IE | |
| Nadelhalter | Jinke | / | |
| Ophthalmic Salbe | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| Steriles Wattestäbchen | Winner Medical | 601-015213 | |
| Sterile Kochsalzlösung | Shimen H20066533 |
Referenzen
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