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Vorhersage und Validierung der Regulation der Podozytenschädigung und Behandlung der diabetischen Nierenerkrankung durch Yinhuo Tang

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DOI:

10.3791/67939

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20. Juni 2025

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Unter Verwendung von Netzwerkpharmakologie und experimenteller Validierung enthüllt dieses Protokoll den Wirkmechanismus von Yinhuo Tang (YHT) bei der Behandlung der diabetischen Nierenerkrankung (DKD) und wie YHT die Podozytenschädigung bei DKD-Mäusen durch die Hemmung des PI3K/AKT/NF-κB-Signalwegs reduziert.

Zusammenfassung

Die diabetische Nierenerkrankung (DKD) ist eine chronische Nierenerkrankung, die durch massive Proteinurie und verminderte glomeruläre Filtrationsrate gekennzeichnet ist. Das wichtigste pathologische Merkmal der DKD ist die renale Mikroangiopathie, und ~40% der Diabetiker entwickeln eine DKD. Die Podozyten-assoziierten Proteine CD2AP und WT-1 spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Funktion der Podozyten und der Integrität der glomerulären Filtrationsbarriere. Wenn die Struktur oder Funktion der Podozyten gestört ist - aufgrund von Entzündungen, oxidativem Stress oder anderen pathologischen Beleidigungen - werden das Schlitzzwerchfell und das Aktinzytoskelett beschädigt, was zu einer erhöhten Durchlässigkeit der glomerulären Filtrationsbarriere und zur Proteinurie führt. Yinhuo Tang (YHT) ist ein Rezept der traditionellen chinesischen Medizin, das die Funktion hat, die Proteinurie zu reduzieren und die Verschlechterung der Nierenfunktion zu verzögern. Der Mechanismus der YHT bei der Behandlung von DKD ist jedoch nicht klar. In dieser Arbeit, basierend auf Netzwerkpharmakologie und Tierversuchen, untersuchten wir den Blutzuckerspiegel, die Leberfunktion, die Nierenfunktion, die Blutfette, die Nierenpathologie, die Expressionsniveaus der Podozytenmarkerproteine CD2AP und WT-1 sowie den PI3K/AKT/NF-κB-Signalweg in db/db-Mäusen nach 8-wöchiger Verabreichung von YHT. Unsere Ergebnisse zeigen, dass YHT die Expression von Entzündungsfaktoren reduziert, indem es den PI3K/AKT/NF-κB-Signalweg hemmt und so die Podozytenschädigung reduziert, die eine Rolle bei der Verzögerung des Fortschreitens der DKD spielt.

Einleitung

Die diabetische Nierenerkrankung (DKD) ist eine weit verbreitete und schwerwiegende Komplikation bei Diabetes und nach wie vor weltweit die häufigste Ursache für Nierenversagen im Endstadium1. Die Krankheit schreitet durch eine Reihe komplexer pathologischer Prozesse fort, wie z. B. glomeruläre Vergrößerung, mesangiale Expansion, tubulointerstitielle Fibrose und übermäßige Akkumulation von extrazellulären Matrixkomponenten 2,3. Trotz Verbesserungen im Diabetesmanagement zielen die derzeitigen Therapien hauptsächlich darauf ab, den Blutzuckerspiegel und den Blutdruck zu kontrollieren, was das Fortschreiten der DKD nur verlangsamt, anstatt die zugrunde liegenden pathologischen Veränderungen umzukehren. Dies unterstreicht den dringenden Bedarf an umfassenderen und effektiveren Behandlungsmöglichkeiten 4,5.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat sich als vielversprechende alternative Therapie bei der Behandlung chronischer Erkrankungen wie DKD 6,7,8 herausgestellt. Die TCM legt Wert auf einen ganzheitlichen Behandlungsansatz, der den komplexen, mehrstufigen Charakter der DKD berücksichtigen kann. Unter den verschiedenen TCM-Formulierungen hat sich gezeigt, dass Yinhuo Tang (YHT) mehrere physiologische Funktionen besitzt, wie z. B. die Ernährung von Yin (zur Ergänzung des Blutvolumens), die Tonisierung der Niere (zur Verbesserung der Nierenfunktion), die Beseitigung von Hitze (zur Unterdrückung von Entzündungen) und die Unterdrückung von Yang (zur Senkung des Blutdrucks)9,10,11. Ein umfassendes Verständnis der Mechanismen, durch die YHT die DKD lindert, fehlt jedoch noch.

Das Podozyten-verwandte Protein CD2AP ist ein Schlüsselprotein im Podozyten, das für die Aufrechterhaltung der Integrität der Filtrationsbarriere entscheidend ist, während WT-1 eine entscheidende Rolle bei der Nierenentwicklung und Fibrose spielt 12,13,14,15,16. Daher ist die normale Funktion dieser beiden Proteine für eine normale glomeruläre Filtrationsfunktion von entscheidender Bedeutung. Die vorhandene Literatur deutet darauf hin, dass diese Ziele an der Progression der DKD beteiligt sind, und wir stellen die Hypothese auf, dass die aktiven Komponenten der YHT mit diesen Zielen interagieren können, um therapeutische Effekte zu erzielen. Diese Studie zielt darauf ab, diese Wechselwirkungen zu bestätigen und tiefere Einblicke in die Art und Weise zu liefern, wie YHT die Krankheitswege der DKD moduliert.

In dieser Studie verwenden wir eine Kombination aus Netzwerkpharmakologie und Tierversuchen, um die therapeutischen Mechanismen von YHT bei DKD zu untersuchen. Die Netzwerkpharmakologie, die bioinformatische Werkzeuge zur Analyse der komplexen Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und biologischen Zielen integriert, ermöglicht es uns, die Multi-Target- und Multi-Pathway-Natur der Wirkung von YHT zu erforschen 17,18,19. Traditionelle Methoden der Wirkstoffforschung konzentrieren sich oft auf Einzelziel-Interventionen. Im Gegensatz dazu dient die Netzwerkpharmakologie als prädiktives Instrument, das dabei hilft, potenzielle Signalwege und molekulare Ziele zu identifizieren und erste Einblicke in die möglichen Wirkmechanismen komplexer Therapien zu bieten. Die Netzwerkpharmakologie ersetzt zwar nicht die strengen experimentellen und regulatorischen Schritte, die für die Arzneimittelentwicklung erforderlich sind, kann aber die Hypothesengenerierung leiten und die Forschung in der Frühphase rationalisieren20.

Letztendlich zielt diese Studie darauf ab, die Lücke zwischen traditioneller und moderner Medizin zu schließen und wissenschaftliche Beweise für die Integration von TCM in die Behandlung von DKD zu liefern. Die Ergebnisse dieser Forschung können dazu beitragen, effektivere und sicherere Behandlungsstrategien für DKD zu entwickeln, die eine Alternative zur Standardversorgung bieten, die oft durch Nebenwirkungen eingeschränkt ist. Durch die Aufklärung der molekularen Mechanismen der YHT und die Validierung ihres therapeutischen Potenzials hoffen wir, die breite Anwendbarkeit der TCM in der Behandlung von DKD zu demonstrieren.

Protokoll

Für diese Studie wurden insgesamt dreißig männliche, 6 Wochen alte spontane Typ-II-Diabetikermäuse (C57BL/Ksj db/db) und sechs männliche nicht-diabetische Kontrollmäuse (db/m) mit dem gleichen genetischen Hintergrund ausgewählt. Die Mäuse wurden 2 Wochen lang in einer sterilen Umgebung mit Lichtschutzfaktor im Tierversuchszentrum der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Changchun untergebracht (Lizenznummer: SYXK (JI) 2023-0014). Während dieser Zeit erhielten sie regelmäßiges Erhaltungsfutter und steriles Wasser. Der Nüchternblutzucker wurde bei den db/db-Mäusen zu Beginn und am Ende des 2-wöchigen Zeitraums gemessen, und nur diejenigen mit Ergebnissen von mehr als 11,1 mmol/l in beiden Tests wurden in das Experiment eingeschlossen. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Changchun genehmigt (ID-Nummer: 2024147).

1. Vorbereitung des Arzneimittels

  1. Vorbereitung der YHT (Tabelle 1)
    1. Wählen Sie Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) und Schisandra chinensis (6 g) und spülen Sie die Kräuter mit Wasser ab, um Unreinheiten und Staub von der Oberfläche zu entfernen. Dann 71 g der rohen Kräuter mit 710 ml destilliertem Wasser mischen und 60 Minuten in Keramiktöpfen einweichen
    2. Nach dem Sieden bei 100 °C die Temperatur des Suds für 60 min auf 80 °C senken und dann den Bodensatz durch zwei Schichten medizinischer Gaze abfiltrieren. Lagern Sie die Flüssigkeit im Kühlschrank bei 4 °C.
    3. Geben Sie 710 ml destilliertes Wasser zu den obigen Tropfen und wiederholen Sie das Einweichen aus Schritt 1.1.1 und Schritt 1.1.2 einmal. Lagern Sie die Flüssigkeit im Kühlschrank bei 4 °C.
    4. Mischen Sie die beiden oben genannten medizinischen Flüssigkeiten aus den Schritten 1.1.2 und 1.1.3 und geben Sie sie in die Materialschale des Vakuum-Gefriertrockners. Starten Sie die Vakuumpumpe, um die Luft aus der Gefriertrocknungskammer zu entfernen, stellen Sie die Temperatur auf -40 °C ein und halten Sie sie 6 Stunden lang, um das Wasser in der Arzneilösung in einen festen Zustand zu versetzen. Stellen Sie dann die Temperatur für 36 Stunden auf -20 °C ein, um das Wasser als Eiskristalle zu Gas zu sublimieren. Stellen Sie abschließend die Temperatur auf 40 °C ein, halten Sie sie 24 Stunden lang, um die restliche Feuchtigkeit aus der Arzneimittellösung zu entfernen, schalten Sie die Heizung und die Vakuumpumpe aus und entfernen Sie das gefriergetrocknete Pulver (YHT-Pulver).
    5. Wiegen Sie 0,4615 g, 0,923 g und 1,846 g lyophilisiertes YHT-Pulver, suspendieren Sie es in 1 ml Kochsalzlösung und stellen Sie die Suspension von YHT in den Konzentrationen von 0,4615 g/ml, 0,923 g/ml bzw. 1,846 g/ml her.
  2. Zubereitung von Valsartan
    1. Valsartan (10,29 mg) in 50 ml PEG300 geben und gut schütteln, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
    2. Geben Sie 50 ml Kochsalzlösung in die Lösung aus Schritt 1.2.1 und schütteln Sie sie gut, um zu homogenisieren und eine Valsartanlösung mit einer Konzentration von 10,29 mg/ml zu erhalten.

2. Medikamentöse Behandlungen

HINWEIS: Das Experiment wurde in sechs Gruppen unterteilt: die normale Kontrollgruppe (CON), die Modellgruppe (MOD), die Valsartan-Positiv-Kontrollgruppe (POS), die Niedrigdosisgruppe des YHT (YH-L), die mittlere Dosisgruppe des YHT (YH-M) und die Hochdosisgruppe des YHT (YH-H). Erwachsene Menschen benötigen 71 g YHT pro Tag. Gemäß der Umrechnungsformel der experimentellen Medikamentendosis von Mäusen und Menschen betrug die Tagesdosis für Mäuse ~9,23 g/kg:

Äquivalente Versuchsdosis für Maus (g/kg) = Dosis beim Menschen (g)/Körpergewicht (70 kg) × 9,1

  1. Fassen Sie den Rücken der Mäuse fest mit der nicht-dominanten Hand, so dass ihre Köpfe, Hälse und Körper in einer geraden Linie sind (um ein Kämpfen zu vermeiden) und positionieren Sie die 1-ml-Sondennadel entsprechend in einem Winkel, der der physiologischen Krümmung der Speiseröhre der Mäuse ähnelt. Schieben Sie die Sondennadel durch den Mundwinkel der Mäuse, drücken Sie sie auf die Zunge, drücken Sie sie gegen den Gaumen und schieben Sie sie sanft nach innen in den Magen.
  2. Schieben Sie das Medikament langsam mit dem Zeigefinger der dominanten Hand hinein und ziehen Sie die Nadel vertikal zurück, um die Sondenoperation abzuschließen.
    HINWEIS: Die Dosis des Arzneimittels betrug 10 ml/kg für insgesamt 4 Wochen.
    1. Verabreichen Sie 10 ml∙kg-1∙Tag-1 Kochsalzlösung per Sonde an CON- und MOD-Mäuse.
    2. Verabreichen Sie 10,29 mg∙kg-1∙Tag-1 Valsartan-Suspension durch Sonde an die Mäuse der POS-Gruppe.
    3. Verabreichen Sie diesen Gruppen die folgenden Dosen des YHT durch Sonde: 4,615 g∙kg-1∙Tag-1 an die YH-L-Gruppe; 9,23 g∙kg-1∙Tag-1 an die YH-M-Gruppe; 18,46 g∙kg-1∙Tag-1 an die YH-H-Gruppe.

3. Bewertung der Wirksamkeit von YHT

  1. Nachweis von biochemischen Indizes im Blut und Urin
    1. Nach 8 Wochen kontinuierlicher Verabreichung des Arzneimittels sammeln Sie 24 Stunden Urin von Mäusen mit einem Stoffwechselkäfig, zentrifugieren Sie den gesammelten Urin bei 7.992 × g für 10 Minuten, entfernen Sie den Überstand und messen Sie den Urinproteinspiegel mit dem Urinprotein-Testkit.
    2. Fassen Sie die Rückseite der Maus mit der nicht-dominanten Hand, um die Maus zu fixieren, und verwenden Sie den kleinen Finger und den Ringfinger derselben nicht-dominanten Hand, um den Schwanz der Maus zu fixieren. Sterilisieren Sie die Spitze des Schwanzes der Maus mit Joddampf-Wattebällchen. Halten Sie mit der dominanten Hand eine Blutentnahmenadel fest, um die Schwanzspitze der Maus schnell zu durchstechen, drücken Sie sie von der Schwanzwurzel der Maus zur Schwanzspitze und tropfen Sie das Blut auf das Blutzuckertestpapier.
    3. Fassen Sie mit der nicht dominanten Hand den Schwanz der Maus, während Sie den Schulterblattbereich mit Daumen und Zeigefinger sichern, wobei Sie sicherstellen, dass der Bauch der Maus nach oben zeigt. Halten Sie mit der dominanten Hand eine 1-ml-Spritze, die mit Phenobarbital-Natrium gefüllt ist. Führen Sie die Nadel (3-5 mm tief) in einem Winkel von 30-45° in die Bauchhöhle ein und zielen Sie dabei auf den Bereich zwischen dem Nabel und den Hintergliedmaßen, wobei die Nadel auf den Kopf gerichtet ist. Ziehen Sie den Spritzenkolben langsam zurück, um nach Blut zu suchen. Wenn Blut aspiriert wird, positionieren Sie die Nadel entsprechend.
    4. Injizieren Sie die Pentobarbital-Natriumlösung langsam, um eine gleichmäßige Verabreichung zu gewährleisten, und ziehen Sie die Spritze zurück, nachdem die Injektion abgeschlossen ist. Warten Sie 10 Minuten und kneifen Sie dann mit einer Pinzette in der dominanten Hand vorsichtig die Zehen der hinteren Gliedmaßen der Maus zusammen, um nach einer Reaktion zu suchen. Wenn weiterhin ein Ansprechen beobachtet wird, verabreichen Sie bei Bedarf eine kleine zusätzliche Dosis (10 mg/kg).
      HINWEIS: Unter der Annahme, dass eine Maus 60 g wiegt und die Phenobarbitallösung 1 % w/v enthält, ist 0,06 ml die zusätzliche Dosis, die im Falle eines Ansprechens verabreicht werden muss.
    5. Schneiden Sie mit einer Schere die Schnurrhaare und Haare um die Augen der Mäuse ab und drücken Sie mit der nicht dominanten Hand die Haut um die Augen, von denen die Augäpfel entfernt werden sollen, so dass die Augäpfel hervorstehen. Sterilisieren Sie die Haut um die Augäpfel mit Ethanol, nehmen Sie die Augäpfel mit einer Pinzette schnell heraus, so dass das Blut in die Mikrozentrifugenröhrchen (1,5-2 ml) tropft, inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 7.992 × g und extrahieren Sie die überstehende Lösung.
    6. Messen Sie die Expressionsniveaus von Serumkreatinin (Scr), Blutharnstoffstickstoff (BUN), Albumin (ALB), Alaninaminotransferase (ALT), Aspartataminotransferase (AST), Triglyceriden (TG) und Gesamtcholesterin (TC) im Serum gemäß den Anweisungen des Kits.
  2. Trennung von Nierengewebe
    1. Fixieren Sie die Mäuse nach der Blutentnahme in Rückenlage auf der Operationsplatte, schneiden Sie die Haare der vorderen Brustregion der Mäuse ab, sterilisieren Sie die vordere Brustregion mit Ethanol, schneiden Sie die Bauchhaut mit einer Schere ab und schieben Sie den Dünn- und Dickdarm beiseite, um die Nieren freizulegen.
    2. Entfernen Sie das Nierengewebe der Maus, trennen Sie das Periost mit einer hämostatischen Pinzette stumpf und legen Sie die linke Niere zur Aufbewahrung in einen -80 °C-Gefrierschrank und die rechte Niere in ein 20-ml-Röhrchen mit 4%iger Paraformaldehydlösung, um die Niere zu fixieren.
    3. Nach 24 h die rechten Nieren aus dem Formaldehyd entfernen, 5 min kurz mit destilliertem Wasser spülen, mit einem Gradienten aus wasserfreiem Ethanol (100 % → 95 % → 85 % → 75 %, je 5 min) entwässern, mit Gradientenxylol (2 x 10 min) transparentieren, in Paraffinwachs einbetten und die Wachsblöcke bei Raumtemperatur erstarrenlassen 21. Dann über Nacht in den -20 °C heißen Gefrierschrank stellen.
    4. Entfernen Sie den Wachsblock, schneiden Sie ihn in eine Dicke von 3 μm, legen Sie ihn zum Entfalten in Wasser, fischen Sie ihn dann mit einem Objektträger heraus und stellen Sie ihn in einen Ofen mit konstanter Temperatur bei 40 °C, um ihn 30 Minuten lang zu backen und dann für die anschließende Analyse zu lagern
  3. Histopathologische Analyse der Nieren
    1. Entfernen Sie die rechte Niere, führen Sie eine Gradienten-Xylol-Entparaffinierung und eine wasserfreie Ethanol-Dehydrierung wie oben (Schritt 3.2.3) durch und waschen Sie sie mit destilliertem Wasser.
    2. Führen Sie die Färbung gemäß den Anweisungen der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E), der Periodensäure-Schiff-Färbung (PAS) und der Masson-Färbekits durch.
    3. Führen Sie die Gradienten-Dehydrierung mit wasserfreiem Ethanol und die Xyloltransparenz erneut wie in Schritt 3.2.3 durch.
    4. Nach dem Trocknen bei Raumtemperatur werden die Gewebeabschnitte mit einem Deckglas auf den Objektträgern befestigt, wobei neutrales Gummi als Einbettmedium verwendet wird. Betrachten Sie die Objektträger und bilden Sie sie unter einem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung ab.
  4. Immunhistochemische Analyse von Nierengewebe
    1. Entfernen Sie die rechte Niere, entwachen und dehydrieren Sie die Schnitte wie in Schritt 3.2.3 beschrieben, legen Sie sie in 10 mM Natriumcitratpufferlösung (pH 6,0) und erhitzen Sie sie 5 Minuten lang (125 °C, 103 kPa) für die Antigenreparatur. Nach 10 min die Abschnitte entfernen, auf Zimmertemperatur abkühlen lassen und 3 x 5 min in 1x PBS waschen.
    2. Legen Sie die Schnitte 10 Minuten lang in 3%ige Wasserstoffperoxidlösung, um die endogene Peroxidase zu blockieren, und waschen Sie sie 3 x 5 Minuten in PBS.
    3. Geben Sie 10 % Ziegenserum tropfenweise in die Abschnitte und achten Sie darauf, dass das Ziegenserum den gesamten Abschnitt gleichmäßig bedeckt. Legen Sie die Sektionen in eine Nassbox, inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C und waschen Sie sie 3 x 5 Minuten mit PBS.
    4. Die Primärantikörper COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) tropfenweise zugeben (siehe Materialtabelle) und in einer Nassbox bei 4 °C im Kühlschrank über Nacht inkubieren.
    5. Den Schnitt entfernen, 3 x 5 min mit PBS waschen, Sekundärantikörper (1:3.000) tropfenweise zugeben, 60 min bei 37 °C inkubieren und 3 x 5 min mit PBS waschen.
    6. 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Farbentwicklungslösung für 10 min zugeben, die Farbentwicklungslösung mit destilliertem Wasser abwaschen, 5 min bei Raumtemperatur mit 100 μl Hämatoxylin inkubieren und 5 min mit destilliertem Wasser spülen.
    7. Dehydrieren, transparentisieren und versiegeln Sie wie in Schritt 3.2.3 beschrieben, und sammeln Sie die Bilder mit einem optischen Mikroskop.
  5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Assay-Analyse
    1. Nehmen Sie ~100 mg gefrorenes Nierengewebe in ein 10-ml-Homogenisatorröhrchen, mahlen Sie es gründlich mit einem Stößel, bis keine offensichtliche Gewebemasse mehr vorhanden ist, und fügen Sie dann 1 ml RNA-Extraktionsreagenz zur Homogenisierung hinzu.
    2. 250 μl Chloroform zugeben, in einem Wirbelmischer 10 s schütteln, 5 min auf Eis inkubieren, bei 15.984 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen pipettieren.
    3. 500 μl Isopropanol in die wässrige Phase geben, mit einem Wirbelmischer 10 s gründlich mischen und die Mischung 5 Minuten lang auf Eis inkubieren. Anschließend bei 15.984 × g für 10 min zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet mit 1 ml 75%igem Ethanol. Nach kurzem Vortexen erneut bei 15.984 × g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie das Ethanol und lassen Sie das RNA-Pellet bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
    4. Fügen Sie 30 μl Diethylpyrocarbonatwasser hinzu, um die RNA aufzulösen, und messen Sie die Absorption der RNA-Lösung bei 260 nm und 280 nm mit einem Spektralphotometer, um die RNA-Konzentration zu berechnen.
      HINWEIS: Die RNA-Reinheit wird durch das Verhältnis A260/A280 bewertet. Ein ideales Verhältnis von A260/A280 sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen, was auf eine gute RNA-Reinheit hinweist. Wenn das Verhältnis unter 1,8 liegt, kann dies auf das Vorhandensein einer Protein- oder Phenolkontamination hindeuten, und eine weitere Reinigung ist erforderlich, wie z. B. die Durchführung einer zusätzlichen Phenol-Chloroform-Extraktion oder einer Ethanolfällung, um Verunreinigungen zu entfernen.
    5. Mischen Sie 3 μg Gesamt-RNA, 4 μl 4 gDNA Wiper Mix und RNase-freies ddH2O auf ein Endvolumen von 16 μl, zentrifugieren Sie 10 s lang bei 1.250 × g und inkubieren Sie 2 Minuten lang bei 42 °C. Fügen Sie 4 μl 5x reverse Transkriptase zu 16 μl der obigen Lösung hinzu und zentrifugieren Sie 10 s lang bei 1.250 × g. Führen Sie das reverse Transkriptionsprogramm bei 50 °C (15 min) → 85 °C (5 s) → 4 °C (10 min) durch. Lagern Sie die synthetisierte cDNA bei -20 °C.
    6. Nehmen Sie die cDNA-Lösung aus dem Gefrierschrank und führen Sie eine Vordenaturierung bei 90 °C (10 min) durch, gefolgt von 40 Zyklen von 94 °C (30 s) → 60 °C (30 s) → 72 °C (24 s) und schließlich zur Lyse in der Größenordnung von 95 °C (15 s) → 60 °C (60 s) → 95 °C (350 s, 60 °C), die allmählich auf 95 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,1 °C/s ansteigen.
    7. Berechnen Sie die relative Expression von WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB und IL-1β unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode auf der Grundlage des Ct-Wertes jeder Probe mit Gapdh als interner Referenz (ΔΔCt = Ct-Wert des Zielgens - Ct-Wert des internen Referenzgens) (siehe Tabelle 2).
  6. Analyse des Western-Blot-Assays (WB)
    1. Nehmen Sie ~100 mg gefrorenes Nierengewebe in einem 10-ml-Homogenisatorröhrchen, gefolgt von 500 μl Lyselösung (Proteasehemmer: Phosphatasehemmer: RIPA= 1:1:100) und mahlen Sie es mit einem Stößel ausreichend, bis keine offensichtliche Gewebemasse mehr vorhanden ist.
    2. Das Röhrchen wird 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, 10 Minuten lang bei 15.984 × g zentrifugiert und der Überstand aspiriert.
    3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe mit dem BCA-Assay. Basierend auf den gemessenen Konzentrationen pipettieren Sie gleiche Mengen des Gesamtproteins (z. B. 30 μg) aus jeder Gruppe in neue Röhrchen und passen Sie das endgültige Volumen mit PBS an, um die Konsistenz zu gewährleisten. Als nächstes 5x Proteinladepuffer hinzufügen, 10 min bei 100 °C kochen lassen, dann herausnehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    4. Verwenden Sie eine 12,5%ige SDS-PAGE-Gelelektrophorese, um die Proteine zu trennen. Verwenden Sie zuerst 80 V, um die Probe langsam durch das Konzentrationsgel laufen zu lassen, stellen Sie dann die Spannung auf 120 V ein, bis die Probe zum Boden des Trenngels läuft, und schalten Sie das Gerät aus.
    5. Tränken Sie das Filterpapier in Membrantransferpuffer, halten Sie mit einer Pinzette eine Ecke der PVDF-Membran fest und tauchen Sie sie in Methanol, um sie zu aktivieren. Entfernen Sie das Gel, schneiden Sie mit einer Kunststoffplatte das konzentrierte Gel und den Boden des Trenngels ab und platzieren Sie dann entsprechend der Sandwichstruktur des Filterpapiers/Gels/PVDF-Membran/Filterpapiers zum Einrichten der Membrantransfervorrichtung (Gel als Minuspol, PVDF-Membran als Pluspol) die Einrichtung in einem Membrantransfertank, der mit vorgekühltem Transferpuffer gefüllt ist. Umgeben Sie es mit Eiswürfeln, um eine niedrige Temperatur aufrechtzuerhalten, und führen Sie die Übertragung mit einem konstanten Strom von 200 mA durch.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Transferzeit entsprechend dem Molekulargewicht des Proteins (je größer das Molekulargewicht, desto länger die Transferzeit).
    6. Legen Sie die PVDF-Membran in den Blockierungspuffer, schütteln Sie den Blockierungspuffer 90 min lang bei Raumtemperatur und waschen Sie ihn 3 x 5 min lang mit TBST (50 mL von 20x TBS und 0,5 mL von Tween-20 pro l TBST).
    7. Unter Verwendung von Primärantikörper-Verdünnungsmitteln verdünnte Primärantikörper: WT-1 (1:1.000), CD2AP (1:1.000), P-PI3K (1:1.000), P-AKT (1:1.000), P-NF-κB (1:1.000) und IL-1β (1:1.000) den Primärantikörper auf die PVDF-Membran geben und über Nacht in einer Nassbox in einem 4 °C-Kühlschrank inkubieren (siehe Materialtabelle).
    8. Nehmen Sie die PVDF-Membran aus dem 4 °C Kühlschrank, waschen Sie sie 3 x 5 Minuten lang mit TBST, verdünnen Sie den Sekundärantikörper (1:10000) mit einem Sekundärantikörperverdünnungsmittel, fügen Sie den Sekundärantikörper hinzu, inkubieren Sie ihn 60 min lang bei Raumtemperatur, waschen Sie ihn 3 x 5 Minuten lang mit TBST, legen Sie die PVDF-Membran in den Chemilumineszenz-Imager und fügen Sie die ECL-Lumineszenzflüssigkeit gleichmäßig tropfenweise hinzu (A: B = 1:1).

4. Netzwerkpharmakologische Analyse von YHT zur DKD-Behandlung

  1. Screening von Wirkstoffen und Zielen von YHT
    1. Bestimmen Sie die Wirkstoffe von Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria und Schisandra Chinensis mit der TCMSP-Datenbank (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) und von Maitake aus der BATMAN-TCM-Datenbank (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Legen Sie die orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und die Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,18 als Screening-Kriterien fest, um die Wirkstoffe zu identifizieren.
    2. Durchsuchen Sie die TCMSP-Datenbank (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) nach den Wirkungszielen der Wirkstoffe aus den oben genannten TCMs.
    3. Entschärfen Sie die Ziele der oben genannten Wirkstoffe und integrieren Sie sie in eine Liste für die weitere Analyse. Standardisieren Sie die Namen der Ziele mithilfe der Uniprot-Proteindatenbank (https://www.uniprot.org).
  2. Aufbau des Zielnetzwerks der Wirkstoffe von YHT
    1. Importieren Sie die Wirkstoffe und die entsprechenden Ziele in theoftware: Erstellen Sie das "Wirkstoff-Ziel"-Netzwerk, indem Sie Datei | Importieren | Netzwerk und Laden der relevanten Daten.
    2. Führen Sie eine Netzwerk-Topologie-Analyse durch, indem Sie zu Extras | Netzwerkanalyse | Analyze Network zur Visualisierung der Beziehungen zwischen Medikamenten, Wirkstoffen, Zielen und Krankheiten. In der Netzwerkvisualisierung stellen die Knoten die Wirkstoffe dar, und die Kanten stellen die Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Zielen dar.
  3. Screening von DKD-bezogenen Zielen
    1. Unter Verwendung des Suchbegriffs "Diabetische Nierenerkrankung" und der Festlegung der Spezies als Mensch werden DKD-bezogene Ziele aus den folgenden Datenbanken ausgewählt: GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org); OMIM-Datenbank (http://www.omim.org); TTD-Datenbank (https://www.ttd.cn); Datenbank der DrugBank (http://www.drugbank.ca); DisGeNET-Datenbank (http://www.disgenet.org).
    2. Nachdem Sie die Ergebnisse aus den fünf Datenbanken erhalten haben, führen Sie diese in einer Tabelle zusammen und entfernen Sie Duplikate mit der Funktion Duplikate entfernen im Menü Daten , wobei Sie sicherstellen, dass nur die eindeutigen Namen von DKD-bezogenen Zielen beibehalten werden.
  4. Aufbau von PPI (Protein-Protein-Interaktion) und Screening von Kernzielen
    1. Verwenden Sie eine Tabellenkalkulationssoftware, um die Schnittpunktziele von YHT und DKD zu identifizieren, indem Sie die Liste der YHT-Ziele in eine Spalte und die Liste der DKD-Ziele in eine andere Spalte eingeben. Wenden Sie bedingte Formatierung an, um gemeinsame Einträge in beiden Spalten hervorzuheben und so die Schnittpunktziele zu identifizieren.
    2. Öffnen Sie die Website für die Zeichenfolgendatenbank (https://cn.string-db.org/), wählen Sie Eingabe | Einfügen/Hochladen , um die Daten im Stapel zu importieren, und setzen Sie den Schwellenwert Grad ≥ 1 , um freie Ziele (Ziele ohne Interaktionen) im Netzwerk herauszufiltern.
    3. Wählen Sie Datei | Importieren | Netzwerk, und importieren Sie die gefilterten Schnittpunktziele in die Software, um die endgültige Visualisierung zu erstellen.
    4. Navigieren Sie zu Netzwerkanalyse | Analysieren Sie das Netzwerk, und filtern Sie die Kernziele von YHT-DKD basierend auf dem Gradwert heraus.
  5. Funktionelle Analyse der Genontologie (GO) und Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) Analyse der Anreicherung des Signalwegs
    1. Öffnen Sie die Metascape-Plattform, indem Sie http://metascape.org/gp/index.html besuchen, wählen Sie Analyse starten , um zu beginnen, fügen Sie die Liste der Ziele für YHT und DKD in das Eingabefeld im Abschnitt Benutzerdefinierte Analyse ein, setzen Sie die Spezies aus dem Dropdown-Menü auf Homo sapiens , wählen Sie Benutzerdefinierte Analyse und setzen Sie den P-Wert-Schwellenwert auf <0,01 und klicken Sie auf Senden , um die Analyse auszuführen.
    2. Nachdem die Ergebnisse von Metascape zurückgegeben wurden, gehen Sie zu http://www.bioinformatics.com.cn/, wählen Sie Extras | Anreicherungs-GO-Begriff, fügen Sie die GO-Begriffe aus den Ergebnissen ein und klicken Sie auf Senden , um Blasendiagramme zu generieren. Visualisieren Sie die Top 10 GO-Begriffe, indem Sie sie nach P-Wert sortieren.
    3. Sortieren Sie die KEGG-Pfade basierend auf dem P-Wert aus den Metascape-Analyseergebnissen. Rufen Sie dieselbe Mikrobiologie-Website (http://www.bioinformatics.com.cn/) auf, wählen Sie Go KEGG Pathway Enrichment aus, fügen Sie die ausgewählten Top 10 KEGG Pathways ein und klicken Sie auf Senden , um die KEGG-Blasendiagramme zu visualisieren.

5. Statistische Analyse

  1. Wenn die Daten einer Normalverteilung folgen und die Varianzen homogen sind, verwenden Sie die unidirektionale ANOVA. Wenn die Varianzen nicht homogen sind, verwenden Sie den T3-Test von Dunnett oder einen t-Test einer unabhängigen Stichprobe.
  2. Verwenden Sie für Daten, die keiner Normalverteilung folgen, den Rang-Summen-Test mit nicht-parametrischen Methoden.
  3. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Verbesserung des Blutzuckerspiegels, der Leber- und Nierenfunktion sowie der Fettstoffwechselstörungen bei DKD-Mäusen
Nach 8-wöchiger Verabreichung reduzierten verschiedene Dosen von YHT signifikant die zufälligen Blutzuckerspiegel, 24 h UTP, Scr und BUN, verbesserten die Nierenfunktion (Abbildung 1A-D); Erhöhung des ALB-Niveaus; die Pegel von ALT und AST reduziert; verbesserte Leberfunktion (Abbildung 1E-G); die Konzentrationen von TC und TG gesenkt; und verbesserte die Regulation des Fettstoffwechsels (Abbildung 1H,I). Die obigen Ergebnisse deuteten darauf hin, dass YHT eine schützende Wirkung auf den Blutzuckerspiegel, die Leber- und Nierenfunktion und die Lipidregulation hatte.

Verbesserung der renalen histopathologischen Schädigung bei DKD-Mäusen
Um zu testen, ob YHT die Nierenschädigung bei DKD-Mäusen verbessern kann, wurde das Ausmaß der pathologischen Schädigung im Nierengewebe mittels H&E-, PAS- und Masson-Färbung sowie IHC untersucht. Die H&E- und PAS-Färbung zeigte eine glomeruläre Atrophie, eine Erweiterung der Tunica albuginea-Region, eine Schwellung und Ablösung von tubulären Epithelzellen, eine interstitielle Infiltration von Entzündungszellen und eine offensichtliche glomeruläre Glykogenablagerung in der MOD-Gruppe (Abbildung 2A,B). Die Masson-Färbung zeigte einen signifikanten Anstieg der blauen Kollagenfasern in den Nieren der MOD-Gruppe im Vergleich zur CON-Gruppe (Abbildung 2C,D). Die IHC zeigte, dass die Prozentsätze der Gebiete, die positiv für COI-I und α-SMA waren, in der MOD-Gruppe signifikant höher waren als in der CON-Gruppe (Abbildung 2E-G). Im Gegensatz dazu wurden nach der Anwendung von YHT und POS die glomeruläre Atrophie, die Erweiterung der angebundenen Zone, die Schwellung und Ablösung von tubulären Epithelzellen, der Grad der interstitiellen Infiltration von Entzündungszellen und die glomeruläre Glykogenablagerung signifikant gelindert; Die Fläche der blauen Kollagenfasern wurde signifikant reduziert; und der Anteil der Gebiete, die positiv für COI-I und α-SMA sind, wurde signifikant verringert. Die oben genannten Ergebnisse deuten darauf hin, dass YHT die pathologische Schädigung der Nieren und die Nierenfibrose bei DKD-Mäusen abschwächen kann.

Abschwächung der Podozytenschädigung bei DKD-Mäusen
Die Schädigung der Fußzellen in DKD-Mäusen wurde mittels IHC, PCR und WB beobachtet. Die IHC-Ergebnisse zeigten, dass die Expressionsniveaus der funktionellen Markerproteine der Fußzellen, CD2AP und WT-1, in der MOD-Gruppe im Vergleich zur CON-Gruppe signifikant verringert waren, was darauf hindeutet, dass die renalen Fußzellen geschädigt waren. Die YHT-Behandlung erhöhte die Expression von CD2AP und WT-1 und reduzierte die Schädigung der Fußzellen (Abbildung 3A-C). PCR- und WB-Ergebnisse zeigten, dass die relativen mRNA- und Proteinexpressionsniveaus der funktionellen Markerproteine der Fußzellen, CD2AP und WT-1, in der MOD-Gruppe im Vergleich zur CON-Gruppe signifikant verringert waren, und die relativen mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von CD2AP und WT-1 waren nach der YHT-Behandlung signifikant erhöht (Abbildung 3D-H). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass YHT die Podozytenschädigung bei DKD-Mäusen abschwächen kann.

Aufklärung der potenziellen Ziele und Signalwege, die mit den Auswirkungen von YHT auf DKD verbunden sind, mittels Netzwerkpharmakologie
Die Wirkstoffe von YHT (291) wurden durch TCMSP- und BATMAN-TCM-Datenbanken gescreent, von denen 39 Wirkstoffe die Kriterien von OB ≥ 30% und DL ≥ 0,18 erfüllten. Die Wirkstoffe wurden in der Datenbank durchsucht, um ihre Ziele zu identifizieren, und nach dem Zusammenführen und Löschen doppelter Werte wurden insgesamt 303 Ziele erhalten (Abbildung 4A). Nach der Zusammenführung der Ergebnisse von fünf Datenbanken, darunter GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank und DisGeNET, und dem Entfernen doppelter Werte wurden schließlich 1.867 DKD-bezogene Ziele erhalten. Als nächstes wurde http://www.bioinformatics.com.cn/ verwendet, um die gescreenten YHT-Wirkstoffe mit DKD-Zielen zu schneiden, was zu 84 sich überschneidenden Zielen führte (Abbildung 4B). Diese 84 Ziele wurden in die Cytoscape-Software importiert, um ein PPI-Netzwerkdiagramm zu zeichnen, und es wurden potenzielle Schlüsselziele für die YHT-Behandlung von DKD identifiziert, darunter AKT, IL-1 β, CASP3, APOE und JUN (Abbildung 4C). Die GO-Funktionsanreicherungsanalyse ergab insgesamt 1.246 Elemente, was darauf hindeutet, dass YHT therapeutische Wirkungen auf DKD ausüben kann, indem es biologische Prozesse wie die Reaktion auf Hormone und molekulare Funktionen wie die Proteinhomodimerisierungsaktivität und die Oxidoreduktaseaktivität sowie zelluläre Komponenten wie Membranflöße und Membranmikrodomänen reguliert (Abbildung 4D). Insgesamt wurden 263 KEGG-Anreicherungsergebnisse erzielt, die hauptsächlich den AGE-RAGE-Signalweg in diabetischen Komplexen, alkoholische Lebererkrankungen, Lipid- und Atherosklerose-Signalwege betrafen. Basierend auf dem p-Wert wurden die Top 10 Ergebnisse ausgewählt, um ein KEGG-Visualisierungsblasendiagramm zu zeichnen (Abbildung 4E). Der AGE-RAGE-Signalweg ist in diabetischen Komplexen stark angereichert, und mehrere Kernziele im PPI, wie PI3K, AKT und IL-1β, sind in diesem Signalweg angereichert. Daher wurde dieser Signalweg für die anschließende Validierung ausgewählt.

Abschwächung der Podozytenschädigung durch Hemmung des PI3K/AKT/NF-κB-Signalwegs
Die Expressionsniveaus von Genen und Proteinen, die mit dem PI3K/AKT/NF-κB-Signalweg in Verbindung stehen, wurden weiter mittels PCR und WB untersucht. Die PCR-Ergebnisse zeigten, dass die relativen mRNA-Expressionsniveaus von Pi3k, Akt, Nf-κb und Il-1β in der MOD-Gruppe im Vergleich zur CON-Gruppe signifikant erhöht waren und nach der Verabreichung von YHT signifikant verringert waren (Abbildung 5A-D). Die WB-Ergebnisse zeigten, dass die relativen Proteinspiegel von P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB und IL-1β in der MOD-Gruppe im Vergleich zur CON-Gruppe ebenfalls signifikant erhöht waren, während sie nach der Verabreichung von YHT signifikant erniedrigt waren (Abbildung 5E-I). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YHT den PI3K/AKT/NF-κB-Signalweg hemmen könnte, indem es die Podozytenschädigung in DKD-Mäusen abschwächt.

figure-results-1
Abbildung 1: Verbesserung des Blutzuckerspiegels, der Leber- und Nierenfunktion sowie der Fettstoffwechselstörungen bei DKD-Mäusen. Auswirkungen von YHT auf (A) zufälligen Blutzucker; (B-D) Nierenfunktion, einschließlich 24-Stunden-Urinprotein, Blutkreatinin und Harnstoffstickstoff; (E-G) Leberfunktion, einschließlich Serumalbumin, Alaninaminotransferase und Aspartataminotransferase; und (H,I) Regulierung des Fettstoffwechsels, einschließlich Gesamtcholesterin und Triglyceriden. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen von sechs unabhängigen Stichproben ausgedrückt, verglichen mit der Blindgruppe *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und verglichen mit der Modellgruppe #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, diese statistischen Schreibnotationen werden in allen Abbildungen einheitlich verwendet. Abkürzungen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische Nierenerkrankung; ALB = Albumin; ALT = Alanin-Aminotransferase; AST = Aspartat-Aminotransferase; TC = Gesamtcholesterin; TG = Triglyceride; CON = Kontrollgruppe; MOD = Modellgruppe; POS = Valsartan Positive Kontrollgruppe; YH-L = niedrig dosierte Gruppe der YHT; YH-M = mittlere Dosisgruppe der YHT; YH-H = Hochdosisgruppe der YHT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Verbesserung der histopathologischen Schädigung der Nieren bei DKD-Mäusen. (A,B) Nierenhistologie durch H&E- und PAS-Färbung (Maßstabsbalken = 20 μm); (C) Masson-Färbung zur Beobachtung des Grades der Nierenfibrose und (D) semiquantitative Analyse mit der ImageJ-Software; (E-G) Semiquantitative Analyse der relativen Expressionsniveaus von COI-I und α-SMA in Nierengeweben mittels IHC und ImageJ Software (Maßstabsbalken = 20 μm). Abkürzungen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische Nierenerkrankung; H&E = Hämatoxylin- und Eosin-Färbung; PAS = Periodischer Säure-Schiff-Fleck; COI-I = Kollagen Typ I; α-SMA = α-glattes Muskelaktin; CON = Kontrollgruppe; MOD = Modellgruppe; POS = Valsartan Positive Kontrollgruppe; YH-L = niedrig dosierte Gruppe der YHT; YH-M = mittlere Dosisgruppe der YHT; YH-H = Hochdosisgruppe der YHT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Abschwächung der Podozytenschädigung in DKD-Mäusen. (A-C) IHC detektierte die relativen Expressionsniveaus von CD2AP und WT-1 im Nierengewebe (Skalenbalken = 20 μm); (D,E) Die PCR wies die relative mRNA-Expression von CD2AP und WT-1 in Nierengeweben nach, und die semiquantitative Analyse wurde mit der Image J-Software durchgeführt; (F-H) WB detektierte die relativen Proteinexpressionsniveaus von CD2AP und WT-1 im Nierengewebe, und die semiquantitative Analyse wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt. quantitative Analyse mit der Software Image J. Abkürzungen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische Nierenerkrankung; IHC = Immunhistochemie; WB = Western Blotting; CD2AP = CD2-assoziiertes Protein; WT-1 = Wilms-Tumor 1; CON = Kontrollgruppe; MOD = Modellgruppe; POS = Valsartan Positive Kontrollgruppe; YH-L = niedrig dosierte Gruppe der YHT; YH-M = mittlere Dosisgruppe der YHT; YH-H = Hochdosisgruppe der YHT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Netzwerkpharmakologische Analyse von YHT zur Behandlung von DKD. (A) Wirkstoff-Erkrankungs-Zielplot von YHT zur Behandlung von DKD. (B) Venn-Diagramm der sich überschneidenden Ziele von YHT und DKD. Die orange Farbe steht für die Anzahl der relevanten Ziele für DKD; die grüne Farbe stellt die Anzahl der therapeutischen Ziele der YHT-Wirkstoffe dar; und der sich schneidende Teil stellt die Anzahl der sich schneidenden Ziele dar (die Anzahl der Ziele von YHT für DKD). (C) PPI-Netzwerkdiagramm der sich überschneidenden Ziele von YHT und DKD. (D) GO-Anreicherungsanalyse der 10 wichtigsten Ziele von YHT für die Behandlung von DKD. (E) KEGG-Anreicherungsanalyse der 10 wichtigsten Ziele für die YHT-Behandlung von DKD. Abkürzungen: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetische Nierenerkrankung; PPI = Protein-Protein-Interaktion; GO = Gen-Ontologie; KEGG = Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome; CON = Kontrollgruppe; MOD = Modellgruppe; POS = Valsartan Positive Kontrollgruppe; YH-L = niedrig dosierte Gruppe der YHT; YH-M = mittlere Dosisgruppe der YHT; YH-H = Hochdosisgruppe der YHT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Abschwächung der Podozytenschädigung durch Hemmung des PI3K/AKT/NF-κB-Signalwegs. (A-D) PCR zum Nachweis der relativen mRNA-Expression von Pi3k, Akt, Nf-κb und Il-1β in Nierengewebe. (E-I) WB zum Nachweis der relativen Proteinexpressionsniveaus von P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB und IL-1β in Nierengeweben und eine semiquantitative Analyse wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammensetzung von Yinhuo Tang. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Details zu qRT-PCR-Primern. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Einer der kritischen Schritte in diesem Protokoll ist die Verwendung der Netzwerkpharmakologie, um die aktiven Komponenten von YHT zu identifizieren und ihre Wechselwirkungen mit DKD-bezogenen Zielen vorherzusagen. Dieser Schritt beinhaltet die Analyse großer biologischer Daten mit Hilfe von Bioinformatik-Tools wie Datenbanken (z. B. TCMSP, DrugBank und GeneCards), um die molekularen Signalwege und potenziellen biologischen Netzwerke zu kartieren, die von YHT betroffen sind. Dieser Vorhersage folgte eine experimentelle Validierung durch Tiermodelle der DKD, in denen die hypothetischen Effekte von YHT auf diese Signalwege getestet wurden. Die Integration von computergestützten Vorhersagen mit Daten ist ein entscheidender Aspekt unseres Ansatzes, da sie die Zuverlässigkeit unserer Ergebnisse erhöht und die Lücke zwischen theoretischen Vorhersagen und praktischen Ergebnissen schließt. Darüber hinaus ist die Verwendung von Tiermodellen ein weiterer wichtiger Schritt zur Validierung der therapeutischen Wirkung von YHT. DKD bei Tieren ahmt das Fortschreiten der menschlichen Krankheit genau nach und ermöglicht eine effektive Bewertung des Einflusses von YHT sowohl auf glomeruläre Schäden als auch auf Nierenfibrose. Die sorgfältige Überwachung von Nierenfunktionsmarkern wie Scr, BUN und Proteinurie ist neben histopathologischen Untersuchungen unerlässlich, um die therapeutische Wirksamkeit der YHT zu beurteilen.

Obwohl unser Protokoll leistungsstarke rechnerische und experimentelle Methoden kombiniert, gibt es mehrere Einschränkungen. Erstens stützt sich der netzwerkpharmakologische Ansatz stark auf verfügbare Daten in öffentlichen Datenbanken, und es kann Verzerrungen oder fehlende Informationen in Bezug auf bestimmte Komponenten von YHT- oder DKD-bezogenen Signalwegen geben. Obwohl wir mehrere Datenbanken mit Querverweisen versehen haben, um dieses Problem zu entschärfen, können einige relevante Wechselwirkungen dennoch übersehen werden. Zweitens untersuchte diese Studie nur den Mechanismus der YHT bei der Verringerung der Podozytenschädigung auf der Ebene der Versuchstiere, und zelluläre Experimente und klinische Studien mit großen Stichproben sind erforderlich, um die experimentellen Ergebnisse zu validieren. Schließlich zeigte die Netzwerkpharmakologie, dass die Behandlung von DKD mit YHT auch mit alkoholischen Lebererkrankungen, Fettstoffwechsel und Atherosklerose sowie der Regulation der Lipolyse in Adipozyten verbunden war. In dieser Studie wurde lediglich überprüft, ob die Modulation des PI3K/AKT/NF-κB-Signalwegs durch YHT das Fortschreiten der DKD verzögern kann; Die Ergebnisse müssen weiter untersucht werden.

Der PI3K/AKT/NF-κB-Signalweg ist ein wichtiger intrazellulärer Signalweg, der an der Regulation einer Vielzahl biologischer Prozesse wie Zellwachstum, Proliferation, Überleben und Entzündungsreaktionen beteiligt ist22. Studien haben gezeigt, dass es eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Pedikulozytenverletzung spielt23,24. NF-κB ist eine wichtige nachgeschaltete Komponente des PI3K/Akt-Signalwegs und beteiligt sich an der Übertragung einer Vielzahl von intrazellulären Signalen und der Expression mehrerer Gene. Die Hemmung des PI3K/AKT-Signalwegs führt zum Abbau des NF-κB-inhibitorischen Proteins IκB, was wiederum zur Phosphorylierung von NF-κB und seinem Eintritt in den Zellkern sowie zur Produktion einer Vielzahl von Chemokinen und Entzündungsfaktoren führt, was zu einer Podozytenschädigung und einer interstitiellen Nierenfibrose führt25. Einige Studien haben gezeigt, dass die Hemmung der Aktivierung des PI3K/AKT/NF-κB-Signalwegs Entzündungsreaktionen und Nierenfibrose wirksam unterdrücken und so das Fortschreiten von DKD26 verzögern kann.

Studien haben gezeigt, dass Fettstoffwechselstörungen eine signifikante Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von DKDspielen 27,28. DKD-Patienten zeigen häufig einen abnormalen Fettstoffwechsel, einschließlich erhöhter LDL-, TG- und Fettsäureakkumulation. Diese Anomalien stehen in engem Zusammenhang mit pathologischen Veränderungen wie Glomerulosklerose und tubulointerstitieller Fibrose29,30. Untersuchungen deuten darauf hin, dass Störungen des Fettstoffwechsels das Fortschreiten der DKD über mehrere Signalwege fördern können31,32. Erstens ist der mTOR-Signalweg ein Schlüsselweg bei der Regulation des Fettstoffwechsels; Seine Überaktivierung führt zu Podozytenschädigung und Proteinurie33,34. Ein fettreiches Milieu kann die Lipidakkumulation über die PI3K/AKT/mTOR-Achse fördern, die Podozyten-Apoptose induzieren und letztendlich die Verschlechterung der Nierenfunktion verschlimmern 35,36,37. Zweitens schützt die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK), ein kritischer Regulator des zellulären Energiestoffwechsels, die Niere vor Stoffwechselstörungen, indem sie die Fettsäureoxidation fördert, die Lipidsynthese hemmt und die Lipotoxizität reduziert 38,39,40. Die AMPK-Inaktivierung gilt als wichtiger Mechanismus bei der DKD-Progression. AMPK-Aktivatoren wie Metformin haben signifikante renoprotektive Wirkungen gezeigt und stellen ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für DKD41 dar.

Schließlich haben Studien gezeigt, dass Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren α/γ (PPARα/γ) eine wesentliche Rolle bei der Regulierung des Fettstoffwechsels und DKDspielen 42,43. Die Aktivierung von PPARα fördert die Fettsäureoxidation und reduziert die Lipidakkumulation in der Niere, während PPARγ die Insulinsensitivität verbessert und entzündungshemmend wirkt44,45. PPAR-Agonisten, wie z. B. Fibrate, haben potenzielle klinische Vorteile bei der Verringerung der Proteinurie bei DKD-Patienten gezeigt46. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Störungen des Fettstoffwechsels das pathologische Fortschreiten der DKD über mehrere Signalwege beeinflussen. Die Wechselwirkungen zwischen diesen Signalwegen bilden ein komplexes pathologisches Netzwerk. Die Ausrichtung auf den Fettstoffwechsel könnte neue therapeutische Strategien für DKD bieten.

Die Caspase-Familie (CASP), eine Familie von Cystein-spezifischen Proteasen, ist eine Gruppe von Proteasen, die in Zellen weit verbreitet sind und hauptsächlich an der Regulation von Apoptose und Entzündungsreaktionen beteiligt sind47,48. Mitglieder der CASP-Familie weisen strukturelle Ähnlichkeiten auf und existieren in der Regel als Zymogene, die durch eine Kaskade von Reaktionen aktiviert werden und so Apoptose, Pyroptose und andere programmierte Zelltodprozesse auslösen49. Unter ihnen ist CASP3, ein Mitglied der Caspase-Familie (CASP) mit einer konservierten Struktur, die typischerweise als Zymogen vorliegt, eine Schlüsselprotease in der Ausführungsphase der Apoptose, die die Spaltung spezifischer zellulärer Proteine katalysiert und damit eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des normalen Zellwachstums und der Aufrechterhaltung der internen Homöostase spielt50,51. Caspase-8 fungiert als Initiator apoptotischer Kaskaden und ist an der Modulation von Entzündungsreaktionen durch die Aktivierung von NPK beteiligt, was ein Schlüsselfaktor bei der Regulation des Zellwachstums ist. Caspase-8 fungiert als Initiator der apoptotischen Kaskade und ist auch an der Regulation der Entzündungsreaktion beteiligt, indem es Entzündungsvesikel wie NLRP1 und NLRP3 aktiviert und dadurch die zelluläre Pyroptoseauslöst 52. Aufgrund der wichtigen Rolle des CASP-Signalwegs bei der Vermittlung von Apoptose und Pyroptose in gestielten Zellen sind in Zukunft weitere tiefergehende Untersuchungen der Beziehung zwischen YHT, CASP3/8, gestielten Zellen und DKD gerechtfertigt.

Im Vergleich zu herkömmlichen Wirkstoffforschungsansätzen, die in der Regel klar definierte Einzelzielmechanismen für regulatorische Klarheit und Vorhersagbarkeit betonen, ermöglicht unsere auf Netzwerkpharmakologie basierende Strategie eine systematische Erforschung der Multi-Target-Wechselwirkungen, die TCM-Formulierungen wie YHT inhärent sind. Diese Komplexität spiegelt zwar den ganzheitlichen Charakter der TCM und ihre potenzielle therapeutische Breite wider, unterstreicht aber auch die Herausforderung unbeabsichtigter Off-Target-Effekte, die einer sorgfältigen Validierung und Interpretation bedürfen. Durch die Berücksichtigung der Multi-Target- und Multi-Pathway-Natur der Wirkung von YHT ermöglichen wir ein ganzheitlicheres Verständnis seiner therapeutischen Wirkung bei der Behandlung von DKD. Darüber hinaus ermöglicht die Netzwerkpharmakologie die Vorhersage potenzieller Wechselwirkungen und Nebenwirkungen, was für die Gewährleistung der Sicherheit und Wirksamkeit von Mehrkomponententherapien von entscheidender Bedeutung ist. Die derzeitigen DKD-Behandlungen konzentrieren sich weitgehend auf die Behandlung der Symptome oder die Verlangsamung des Fortschreitens, anstatt die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen anzugehen. Durch die Integration moderner bioinformatischer Werkzeuge mit experimenteller Validierung unterstreicht diese Studie die Bedeutung der Systembiologie für die Verbesserung der Wirksamkeit der TCM, insbesondere bei chronischen Erkrankungen wie DKD.

Mit Blick auf die Zukunft ist diese Technik vielversprechend, um den Anwendungsbereich der Netzwerkpharmakologie in der TCM-Forschung zu erweitern, insbesondere bei der Behandlung komplexer Krankheiten wie DKD. Unser Ansatz könnte angewendet werden, um andere TCM-Formeln oder einzelne Kräuter auf ihr therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von Nierenerkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Stoffwechselstörungen zu untersuchen. Darüber hinaus könnte diese Methodik erweitert werden, um die Umwidmung von Medikamenten zu untersuchen, indem neue Anwendungen für bestehende Medikamente in der DKD-Behandlung identifiziert werden. Eine weitere mögliche Anwendung unseres Ansatzes liegt in der personalisierten Medizin. Durch die Einbeziehung patientenspezifischer Daten könnte die Netzwerkpharmakologie genutzt werden, um TCM-Behandlungsstrategien auf der Grundlage individueller molekularer Profile anzupassen, die Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern und Nebenwirkungen zu minimieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Jilin Provincial Natural Science Foundation (Nr. 20210101201JC) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Wasserfreies EthanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
TierversuchszentrumChangchun Universität für Traditionelle Chinesische MedizinSYXK (JI) 2023-0014
BATMAN-TCM-Datenbankhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm-
SolarbioPC0020
BlockierungspufferBeyotimeP0023B
KeramiktöpfeMideaMD-DG30E103
Chemilumineszenz-BildgebungssystemHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
ChloroformChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 Software----
DAB-Reagenzien-KitServicebioG1212-200T
db/db MäuseNanjing Junke Biological GmbHSCXK (Su) 2020-009
ECL SubstratlösungAffinitätKF8003
Elektrischer Wasserbadtopf mit konstanter TemperaturFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Elektrophorese-Instrument StromversorgungBeijing Longfang Technology Co., LtdLF-600S
GlashomogenisatorSolarbioYA0852
GlasobjektträgerNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Ziege Anti-Kaninchen IgG HRP (Sekundärantikörper)AffinitätS00011:3000 für IHC, 1:10000 für WB
HämatoxylinWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
Kühlzentrifuge mit hoher Geschwindigkeit  Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix für qPCR (+gDNA-Wischer)VAZYMER223-01
Horizontaler ShakerJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
BildgebungssystemNikonNikon DS-U3
Intelligenter digitaler magnetischer HeizrührerHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
IsopropanolChina National Pharmaceutical Group Chemisches Reagenz Co., Ltd80109218
Marker (20-120KD)GenScriptM00521
Masson FärbekitBASOBA4079B
Medizinische GazeJianerkang Medical-
Metascape Plattformhttp://metascape.org/gp/index.html--
MethanolThermo67-56-1
Mikrobiologie Websitehttp://www.bioinformatics.com.cn/-Mikroskop
NikonECLIPSE Ci
MikrowellenherdGalanz Mikrowellenherd Elektrogerät Co., LtdP70D20TL-P4
Multi-Proben-GewebeschleiferShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-24L
Multifunktionale analytische elektronische WaageChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Neutrales HarzWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Normales ZiegenserumSolarbioSL038
OfenShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
PalmenzentrifugeWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
PAS-FärbekitBASOBA4114B
Pathologischer SlicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
PCR-InstrumentHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
PipettenpistoleDragonKE0003087/KA0056573
Primärer AntikörperverdünnungspufferBeyotimeP0023A
Proteinphosphatase-Inhibitor-KomplexMeilunbioMB12707-1
PVDF-Membran (0,22 μ m)SolarbioISEQ00010
Schnelles Primär-/Sekundär-Antikörper-VerdünnungsmittelSolarbioA1811
Kaninchen Anti-CD2APAffinitätDF22981:200 für IHC, 1:1000 für WB
Kaninchen Anti-COI-IAffinitätDF121491:200 für IHC, 1:1000 für WB
Kaninchen Anti-IL-1βAffinityAF51031:1000 für WB
Rabbit anti-P-AKTAffinityAF00161:1000 für WB
Rabbit anti-P-NF-Κ bAffinityAF32191:1000 für WB
Rabbit anti-P-PI3KAffinityAF32421:1000 für WB
Rabbit anti-WT-1AffinityDF63311:200 für IHC, 1:1000 für WB
Rabbit anti-α-SMAAffinityAF10321:200 für IHC, 1:1000 für WB
Rabbit anti-β-AktinAffinityAF70181:1000 für WB
Real-Time-PCR-SystemABIQuantStudio 6
RIPA-LysepufferMeilunbioMA0151
RNase-frei ddH2OSolarbioR1600
Sekundärer AntikörperverdünnungspufferBeyotimeP0023D
Objektträger und DeckglasJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 software----String-Datenbank
Website https://cn.string-db.org/--
Reinstwasser-InstrumentZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus DNA-PolymeraseTIANGENET105-02
TCMSP-Datenbank https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php-
GewebeschleiferSchöne WandMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Ultra Mikro UV sichtbares SpektralphotometerHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Uniprot Proteindatenbankhttps://www.uniprot.org--
Aufrechtes optisches MikroskopNikonNikon Eclipse CI
Urinary Protein Test KitNanjing Jiancheng Bioengineering Research InstituteC035-2
Vakuum-LyophilisiererNingbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
Vertikaler ElektrophoresetankBeijing 61 Instrument FactoryDYCZ-24DN
Vortex-MischerWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Western Blocking BufferSolarbioSW3010
Xylol China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10023418
YihongVerifizierter Lieferant - Wuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdE8090
-BCA-Protein-Assay-Kit -

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