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Methodenartikel

Verwendung von Computer-Vision-Bibliotheken zur Optimierung der Zellkernquantifizierung

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DOI:

10.3791/67945

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6. Juni 2025

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1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel werden Schritt-für-Schritt-Methoden zur Automatisierung der bildbasierten Zellkernquantifizierung mithilfe eines ausführbaren Open-Source-Programms beschrieben, das über eine Reihe von Zelldichten validiert wurde. Dieses Programm bietet eine Alternative, die Barrieren in Bezug auf Kosten, Zugänglichkeit für Benutzer mit begrenzten technologischen Fähigkeiten und anwendungsspezifische Validierung beseitigt, die den Nutzen bestehender Technologien einschränken können.

Zusammenfassung

Lebendzell-Assays und bildbasierte Zellanalysen erfordern eine Datennormalisierung für eine genaue Interpretation. Eine häufig verwendete Methode ist die Färbung und Quantifizierung von Zellkernen, gefolgt von einer Datennormalisierung auf die Zellkernzahl. Diese Zellzahl wird oft als Zellzahl für einkernige Zellen ausgedrückt. Während die manuelle Quantifizierung mühsam und zeitaufwändig sein kann, werden die verfügbaren automatisierten Methoden möglicherweise nicht von allen Anwendern bevorzugt, sind möglicherweise nicht für diese spezielle Anwendung validiert oder können unerschwinglich sein. Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Erfassung quantifizierbarer Bilder von Zellkernen bereit, die mit fluoreszierenden DNA-Färbungen gefärbt wurden, und die anschließende Quantifizierung der Zellkerne mit einem automatisierten Softwareprogramm zur Objektzählung, das unter Verwendung von Python-Computer-Vision-Bibliotheken entwickelt wurde. Wir validieren dieses Programm auch für eine Reihe von Zelldichten. Obwohl die genaue Zeit für die Programmausführung je nach Anzahl der Bilder und der Computerhardware variiert, konsolidiert dieses Programm die Stunden der Arbeit zum Zählen von Kernen in Sekunden, damit das Programm ausgeführt werden kann. Während dieses Protokoll unter Verwendung von Bildern von fixierten, gefärbten Zellen entwickelt wurde, können mit diesem Programm auch Bilder von gefärbten Zellkernen in lebenden Zellen und Immunfluoreszenzanwendungen quantifiziert werden. Letztendlich bietet dieses Programm eine Option, die kein hohes Maß an technologischem Know-how erfordert und eine validierte Open-Source-Alternative darstellt, um Zell- und Molekularbiologen bei der Rationalisierung ihrer Arbeitsabläufe zu unterstützen und die mühsame und zeitaufwändige Aufgabe der Zellkernquantifizierung zu automatisieren.

Einleitung

Funktionelle und bildbasierte Experimente sind entscheidend für das Verständnis der Auswirkungen experimenteller Behandlungen auf die Biochemie und Physiologie der gesamten Zelle. Die valide Interpretation von Daten aus zellbiologischen Experimenten hängt von der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Versuchsprotokolls ab, einschließlich der Datennormalisierung. So ermöglichen Analysen des Sauerstoffverbrauchs und der extrazellulären Versauerungsraten in lebenden Zellen zu Studienbeginn und nach der Behandlung mit spezifischen Arzneimitteln die Beurteilung verschiedener Aspekte des Energiestoffwechsels 1,2. Die Messung der Aktivität von Enzymen wie Laktatdehydrogenase im Überstand von Zellkulturen kann bei der Quantifizierung der Integrität der Zellmembran helfen3. Die Färbung kultivierter Zellen mit Annexin V und Propidiumiodid vor der Fixierung ermöglicht die Beurteilung apoptotischer und nekrotischer Zellen4. Unterschiede in der Zelldichte zwischen den Wells beeinflussen jedoch die Ergebnisse der einzelnen Assays. Sich ausschließlich auf die Aussaatdichte zu verlassen, könnte zu irreführenden Ergebnissen führen, da Fehler beim Zählen von Zellen für die Aussaat, Schwankungen der Zelldichte in Medien während der Beschichtung oder unterschiedliche Zellwachstumsraten zwischen Proben oder Behandlungen während der Experimente verursacht werden. Daher ist eine Normalisierung der experimentellen Ergebnisse erforderlich.

Zu den aktuellen Normalisierungsmethoden für funktionelle und bildbasierte Zelldaten gehören die Proteinkonzentration5 oder die Zellkern- oder Zellzahl6. Um die Daten auf die Proteinkonzentration zu normalisieren, müssen die Zellen nach dem Assay in gleichen Volumina Lysepuffer mit Proteaseinhibitor extrahiert werden, und ein zusätzlicher Assay (z. B. Bicinchoninsäure-Assay, Bradford-Assay usw.) muss zur Proteinquantifizierung durchgeführt werden. Die Genauigkeit dieser Methode beruht auf einer vollständigen Zellextraktion; Das Zurücklassen von Proteinen trägt zu Fehlern bei der Quantifizierung bei. Das Zählen von Zellkernen oder Zellen bietet eine Alternative, bei der keine Zellen von der Oberfläche entfernt werden müssen, auf der sie gezüchtet werden. Stattdessen werden lebende oder fixierte Zellen mit kolorimetrischen oder fluoreszierenden Färbungen gefärbt oder gegengefärbt, und die Zählung kann auf der Grundlage von Bildern ganzer Zellen oder nur von Zellkernen durchgeführt werden. Die Quantifizierung von Zellkernen wird für Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie und zur Normalisierung von Daten in fusionierten Zellen (z. B. Myotuben) oder Geweben gegenüber ganzen Zellen bevorzugt. Zur Quantifizierung von Zellkernen unter Verwendung eines Fluoreszenzansatzes werden fluoreszierende DNA-Farbstoffe (z. B. 4′,6-Diamidino-2-phenylindoldichlorid (DAPI), Hoechst 33342, Hoechst 33358, DRAQ5 usw.) auf lebende oder fixierte Zellen aufgebracht und mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. DAPI, Hoechst und DRAQ5 binden bevorzugt an adenin-thyminreiche Regionen der DNA 7,8,9 und bieten so ein Mittel zum Nachweis von Zellkernen. Die Optimierung der Farbstoffkonzentration verhindert eine Off-Target-Bindung (d. h. an mitochondriale DNA, die zu punktförmiger zytosolischer Fluoreszenz führt)10. Der Optimierungsprozess kann durch die Verwendung von kommerziell erhältlichen Einbettmedien, die DAPI enthalten, für fixierte Zellen (z. B. VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium mit DAPI) und veröffentlichten Färbekonzentrationen für lebende Zellen (z. B. Hoechst) (z. B. Hoechst) vereinfacht werden6,11,12. Nach der Färbung werden Zellkerne in lebenden oder fixierten Zellen mit dem entsprechenden Anregungsfilter (z. B. Ultraviolett [DAPI und Hoechst] oder dunkelrot [DRAQ5]) sichtbar gemacht. Anregungsmaxima für DAPI, Hoechst und DRAQ5 liegen an beiden Enden des Spektrums für die Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Attribut sowie die DNA-Spezifität dieser Farbstoffe und ihre Verwendung in optimalen Konzentrationen minimieren die Off-Target-Fluoreszenz. Die resultierenden Bilder zeigen helle Zellkerne vor schwarzem Hintergrund, und diese Zellkerne werden als Maß für die Zellzahl für einkernige Zellen quantifiziert. Während es andere genaue färbebasierte Methoden zur Quantifizierung von Zellkernen gibt, die histologische Färbungen und Hellfeldmikroskopie13 verwenden, ist die Automatisierung mit diesen Ansätzen schwieriger, wenn auch möglich.

Die manuelle Quantifizierung von Kernen ist zwar nach wie vor der Goldstandard, aber mühsam, zeitaufwändig und anfällig für potenzielle menschliche Fehler bei längerer Zählung. Obwohl es automatisierte Zellzählprogramme gibt, werden sie nicht von allen Benutzern bevorzugt, können unerschwinglich sein und die Validierung für bestimmte Anwendungen kann minimal sein. Python hat sich in den letzten Jahren zu einer wertvollen und zugänglichen Ressource für Biologen entwickelt. Python-Computer-Vision-Bibliotheken sind besonders nützlich für die Bildanalyse14. Hier finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verwendung unseres ausführbaren Programms, das mit Python-Code entwickelt wurde, um Kerne zu quantifizieren, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt und mit Fluoreszenzmikroskopie abgebildet wurden. Programmierkenntnisse sind nicht notwendig, um das hier beschriebene Programm zu nutzen. Dieser Arbeitsablauf ist spezifisch für Zellen oder Gewebe, auf die fluoreszierende DNA-Farbstoffe aufgetragen werden. Es ist nicht für die Verwendung mit Hellfeldbildern vorgesehen. In Abschnitt 1 wird beschrieben, wie mit der Fluoreszenzmikroskopie aufgenommene Bilder in einer Weise aufgenommen und gespeichert werden, die mit diesem Arbeitsablauf kompatibel ist. Abschnitt 2 enthält Anweisungen zum Ausführen des Kernquantifizierungsprogramms als ausführbare Datei und zum Abrufen der Ausgabe. Das ausführbare Programm kann direkt aus der bereitgestellten .exe Datei ausgeführt werden und erfordert keine Änderungen, um Kerne in qualitativ hochwertigen Bildern zu quantifizieren. Für diese ausführbare Datei ist ein Windows-basierter PC erforderlich. Abschnitt 3 enthält Anweisungen zum Ausführen des Programms als Python-Skript und nicht als ausführbare Datei (erforderlich für Mac- oder Linux-basierte Systeme, optional für Windows-basierte Systeme) und ermöglicht bei Bedarf die Optimierung des Codes. In Abschnitt 4 wird beschrieben, wie die Ergebnisse für die Normalisierung verwendet werden. Diesen Protokollen folgen repräsentative Ergebnisse, einschließlich Validierungsdaten aus unserem Labor.

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Protokoll

HINWEIS: Ergänzende Dateien finden Sie unter folgendem Link https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Aufnehmen und Speichern von Bildern mit der Fluoreszenzmikroskopie

  1. Bereiten Sie Zell- oder Gewebeproben für die Abbildung vor, einschließlich der Färbung mit dem gewünschten DNA-Farbstoff. Um die hier verwendeten Bilder zu erhalten, wurden C2C12-Myoblasten (CRL-1772, American Type Culture Collection) in 6-Well-Platten für 48-72 h unter Standardkulturbedingungen (5% CO2, 37 °C, befeuchtet), mit oder ohne 50 mM EtOH6 gezüchtet und in eiskaltem Methanol fixiert, wie zuvor beschrieben13. Fixierte Zellen wurden unter Verwendung eines DAPI-haltigen Eindeckmediums15 eingehängt und vor der Bildgebung im Dunkeln getrocknet.
  2. Schalten Sie alle Komponenten des Fluoreszenzmikroskops und des Computers gemäß den festgelegten Standardarbeitsanweisungen ein. Öffnen Sie die mit dem Mikroskop verknüpfte Software.
  3. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Proben durch das Okular sichtbar werden. Überprüfen Sie das Ziel. Drehen Sie den Objektivrevolver bei Bedarf auf das gewünschte Objektiv. Stellen Sie sicher, dass das Softwareprogramm das gewünschte Objektiv ausgewählt hat, um eine genaue Anzeige des Bildbereichs zu erhalten. Hier wurden Bilder mit einem 10-fach-Objektiv aufgenommen.
  4. Legen Sie die Probe (Objektträger, Teller oder Schale) bei ausgeschaltetem Licht auf den Tisch. Schalten Sie die Live-Bildgebung mit dem entsprechenden Filter ein und stellen Sie die Belichtungszeit entweder auf eine vorher festgelegte Dauer oder auf automatische Belichtung ein. Hier wurde ein DAPI-Filter und eine Belichtungszeit von 61-62 ms verwendet. In der Tabelle zur Fehlerbehebung finden Sie eine Anleitung zum Einstellen der Belichtungszeit, insbesondere bei Bildern mit hoher Zelldichte.
  5. Stellen Sie mit dem Okular den Fokus langsam mit dem Brutto-Einstellknopf ein, bis die gefärbten Kerne sichtbar sind, und stellen Sie dann mit dem Feineinstellknopf den Fokus langsam ein, bis die Kerne klar und scharf erscheinen.
    HINWEIS: Beispiele für geeignete Bilder sind in Abbildung 1 dargestellt.
    1. Wenn eine übermäßige Hintergrundfärbung auftritt oder wenn die Kerne sehr dunkel erscheinen, passen Sie die Belichtungszeit manuell an. In einem einzigen Bild kann es sichtbare Unterschiede in der Signalintensität für einige Kerne geben; Die runde Form sollte jedoch für alle Kerne mit minimalen Signalstörungen sichtbar sein.
      HINWEIS: Das Programm, das in Downstream-Anwendungen verwendet wird, ist robust gegenüber unterschiedlichen Intensitäten. Rohbilder, die für die Entwicklung und Validierung des Kernquantifizierungsprogramms verwendet werden, umfassen Bilder mit einer Reihe von Signalintensitäten und sind über das Open Science Framework Repository verfügbar (siehe oben erwähnter Link).

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Abbildung 1: Beispielbilder von DAPI-gefärbten Zellkernen. Diese Bilder zeigen Zellkerne mit (A) niedriger, (B) mittlerer oder (C) hoher Zelldichte mit minimalem Hintergrund. Beachten Sie die unterschiedliche Signalintensität der Kerne in Bild C; Dies beeinträchtigte die Quantifizierung nicht. Der Maßstabsbalken (C) zeigt 100 μm an; Maßstabsbalken sollten bei Bildern, die für die Quantifizierung von Kernen verwendet werden, weggelassen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Sobald die Kerne durch das Okular scharf gestellt sind, schalten Sie den Detektionsmodus auf die Kamera. Stellen Sie den Fokus mit dem Feineinstellknopf ein.
  2. Passen Sie die Belichtungszeit bei Bedarf an. Notieren Sie sich die endgültige Belichtungszeit für die Verwendung mit nachfolgenden Proben und Bildern.
    HINWEIS: Obwohl die Verwendung der gleichen Belichtungszeit für alle Bilder ideal ist, sind Schwankungen der Belichtungszeit für diese Anwendung akzeptabel, da die Fluoreszenzintensität nicht quantifiziert oder über Proben hinweg verglichen wird.
  3. Nehmen Sie das Bild mit der entsprechenden Bildaufnahmetaste in der Software auf. Wenn auf Proben mehrere Färbungen angewendet wurden, schalten Sie den Filter um (z. B. auf FITC, TRITC oder Cy5) und beleuchten Sie denselben Bereich zum Zusammenführen.
  4. Betätigen Sie den Verschluss, um die Lichteinwirkung der Probe zu minimieren. Speichern Sie das Bild in einem universellen Figurendateiformat (.tif, .png oder .jpg, ohne eine Maßstabsleiste einzubrennen, in einem speziellen Ordner. Stellen Sie sicher, dass jeder Bilddateiname angemessen beschreibend ist oder dass die für Dateinamen verwendete Codierung über eine entsprechende verknüpfte Dokumentation verfügt.
    HINWEIS: Dies wird zum Bildverzeichnis für das Quantifizierungsprogramm. Wenn mehrfarbiges Imaging verwendet wurde, kopieren Sie nur Bilder von Zellkernen in einen separaten, dedizierten Ordner. Dies kann auch am Ende der Bildgebungssitzung erfolgen. Bilder, die mit den Standardexporteinstellungen der meisten Imaging-Software exportiert werden, haben in der Regel eine ausreichende Auflösung für die Verwendung mit diesem Programm, vorausgesetzt, es wurden qualitativ hochwertige Bilder aufgenommen. Die Bilder sollten jedoch nach dem Export visuell überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Morphologie der Zellkerne klar ist. Wenn Bilder in .jpg Format gespeichert werden, sollte darauf geachtet werden, dass die Bilder nicht übermäßig komprimiert werden und die Qualität erhalten bleibt.
  5. Öffnen Sie den Verschluss, kehren Sie zur Live-Bildgebung zurück und scannen Sie die Probe zur Bildgebung an eine andere Stelle. Wiederholen Sie die Schritte 1.8 bis 1.9 nach Bedarf. Für Bilder von Zellen, die in 6-Well-Platten ausgesät wurden, die bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden, nehmen Sie 10-15 Bilder pro Well auf (abhängig von der Konsistenz der Zelldichte im gesamten Probenbereich).
  6. Nachdem alle Bilder für ein einzelnes Beispiel erfasst wurden, führen Sie eine der folgenden Optionen aus.
    1. Fahren Sie mit dem nächsten Beispiel fort und wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.10.
    2. Pausieren Sie das Protokoll und kehren Sie zu einem anderen Zeitpunkt zurück. Die Proben sollten vor Licht geschützt bleiben. Diese Option wird nicht empfohlen, wenn mit lebenden Zellen gearbeitet wird.
  7. Stellen Sie nach Abschluss der Bildgebung sicher, dass alle Proben lichtgeschützt sind, bevor Sie die Raumbeleuchtung einschalten. Wenn der Ordner mit den Bildern lokal gespeichert ist, übertragen Sie die Dateien auf einen USB-Stick, einen Cloud-Speicherort oder ein anderes Netzlaufwerk, auf das der Computer zugreifen kann, auf dem das Quantifizierungsprogramm ausgeführt wird. Speichern Sie in einem speziellen Ordner.
  8. Schalten Sie alle Teile des Mikroskops und des Computers gemäß den festgelegten Standardarbeitsanweisungen aus.
  9. Die Bildgebung ist nun abgeschlossen. Analysieren Sie die Dateien mit dem automatisierten Quantifizierungsprogramm, wie in Abschnitt 2 beschrieben, oder indem Sie das Programm als Python-Skript ausführen, wie in Abschnitt 3 beschrieben.

2. Ausführen des automatisierten Kernquantifizierungsprogramms als ausführbare Datei

HINWEIS: Diese Methode, bei der das Programm als ausführbare Datei ausgeführt wird, ist mit Windows-basierten PCs kompatibel und wird für Benutzer des Windows-Betriebssystems empfohlen. Mac OS oder andere Nicht-Windows-Benutzer sollten das Programm als Python-Skript ausführen (siehe Abschnitt 3).

  1. Stellen Sie sicher, dass Python auf dem Computer installiert ist. Installieren Sie bei Bedarf Python von python.org/downloads (bevorzugt) oder mit Anaconda oder Miniconda. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung wurde dieses Programm mit den Python-Versionen 3.10-3.12 getestet.
  2. Öffnen Sie den Browser und navigieren Sie zu https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases. Laden Sie die neueste Version der Datei mit dem Namen count_nuclei.zip herunter.
  3. Klicken Sie im Ordner Downloads mit der rechten Maustaste auf die Zip-Datei , und extrahieren Sie alle Dateien an den gewünschten Speicherort auf dem lokalen Computer (siehe Abbildung 2A). Lassen Sie diesen Dateispeicherort geöffnet. Dieser Dateipfad wird in Schritt 2.5 verwendet (siehe Abbildung 2B).
    HINWEIS: Count_nuclei sollte jetzt als Anwendungsdatei angezeigt werden. Dies ist die ausführbare Datei.
  4. Öffnen Sie eine Eingabeaufforderung, indem Sie CMD oder Eingabeaufforderung in der Suchleiste suchen. Verwenden Sie den Befehl cd, um das Verzeichnis in den Dateipfad für die ausführbare Datei zu ändern (siehe Abbildung 2C), und drücken Sie die Eingabetaste. Beispiel für eine Befehlszeile: C:\Users\janedoe>cd [Leerzeichen nach cd, dann Dateipfad kopieren/einfügen]
  5. Geben Sie in der nächsten Befehlszeile Folgendes ein, und drücken Sie die Eingabetaste.
    count_nuclei.exe --img_dir "Pfad/zu/Bildern" --output_dir "Pfad/zu/Ausgabe" --save_images --output_count_filename "results.csv"
    wobei path/to/images der Dateipfad zu dem Ordner ist, der die zu analysierenden Bilder enthält (siehe Schritt 1.14); path/to/output ist der Dateipfad zu dem Ordner, in dem die .csv Datei gespeichert werden soll (standardmäßig das aktuelle Arbeitsverzeichnis, wenn nicht angegeben); und results.csv ist der Dateiname, unter dem die resultierenden Zählungen gespeichert werden (wenn nicht angegeben, wird der Name der Ausgabedatei standardmäßig auf count_results.csv gesetzt).
    HINWEIS: In der Befehlszeile sind Anführungszeichen erforderlich. Stellen Sie sicher, dass nach Anführungszeichen vor dem Dateipfad keine Leerzeichen stehen (siehe Abbildung 2C).
  6. Wenn die nächste Befehlszeile angezeigt wird, ist die Verarbeitung abgeschlossen. Die Konturlinien und die Ergebnistabelle sind nun an dem Ort verfügbar, der in Schritt 2.5 als Ausgabeverzeichnis angegeben wurde (d.h. Pfad/zum/Ausgabe; siehe Abbildung 2C).
  7. Überprüfen Sie die Konturen visuell, um die Zählqualität zu überprüfen. Die Ergebnisse können nun verwendet werden, um Daten zu normalisieren, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
    HINWEIS: Wenn Konturen fehlende Kerne zu enthalten scheinen (z. B. scheinen Kerne zu schwach zu sein) oder Gruppen von Kernen in einem einzigen Element zu gruppieren (z. B. überbelichtetes Bild, zu viel Hintergrund, Artefakte), sollte der Benutzer die Fehlerbehebungstabelle lesen und muss möglicherweise zu Abschnitt 1 zurückkehren, um die Bildaufnahme zu optimieren, bevor er mit Abschnitt 4 fortfährt.

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Abbildung 2: Beispiele für wichtige Teile des Workflows für Abschnitt 2. (A) Extrahieren Sie Dateien aus dem Downloads-Ordner, wobei Sie darauf achten, auf den richtigen Ordner zu klicken, wie durch den Pfeil angezeigt, um die Extraktion (B) zum gewünschten Ziel in Schritt 2.3 zu ermöglichen. (C) Beispiele für Befehle für die Schritte 2.4 und 2.5 und die nächste Befehlszeile, die den Abschluss in Schritt 2.6 anzeigt. Beachten Sie, dass der Dateipfad in Schritt 2.4 (C) mit dem Speicherort für die Extraktion in Schritt 2.3 (B) übereinstimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Ausführen des automatisierten Programms zur Quantifizierung von Kernen als Python-Skript

  1. Stellen Sie sicher, dass Python auf dem Computer installiert ist. Installieren Sie bei Bedarf Python von python.org/downloads (bevorzugt) oder mit Anaconda oder Miniconda. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung wurde dieses Programm mit den Python-Versionen 3.10-3.12 getestet.
  2. Öffnen Sie den Browser und navigieren Sie zu https://github.com/rbudnar/nuclei_counter. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Grüner Code" und dann auf "ZIP herunterladen ", um das Code-Repository herunterzuladen (siehe Abbildung 3A).
  3. Verwenden Sie die folgenden Anweisungen für das Windows-Betriebssystem. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 3.4 für Mac OS-basierte Computer.
    1. Klicken Sie im Ordner Downloads mit der rechten Maustaste auf die Datei und wählen Sie Alle extrahieren aus, um die Dateien auf einen lokalen Computer zu extrahieren (siehe Abbildung 3B-C).
    2. Öffnen Sie am Speicherort der extrahierten Datei den Ordner mit dem Namen nuclei_counter-main. Dies ist das Code-Repository.
      HINWEIS: Dies muss nur heruntergeladen werden, wenn dieses Programm zum ersten Mal verwendet wird. Verschieben Sie einfach die extrahierten Dateien an einen zugänglichen Netzwerkspeicherort und notieren Sie sich diesen Speicherort.
    3. Öffnen Sie eine Eingabeaufforderung, indem Sie CMD oder Eingabeaufforderung in der Suchleiste suchen. Wenn Python von Anaconda oder Miniconda installiert wurde, öffnen Sie die Anaconda-Eingabeaufforderung anstelle einer Standard-Eingabeaufforderung. Dies finden Sie, indem Sie Anaconda Prompt in die Suchleiste eingeben.
    4. Verwenden Sie den Befehl cd, um das Verzeichnis in das Code-Repository zu ändern, und drücken Sie die Eingabetaste. Weitere Informationen finden Sie in der folgenden Codezeile, in der zwischen Groß- und Kleinschreibung unterschieden wird. Stellen Sie sicher, dass der Ordner mit dem Namen nuclei_counter-main geöffnet ist, wenn Sie den Dateipfad kopieren. Die Datei mit dem Namen pyproject oder pyproject.toml sollte sichtbar sein (siehe Abbildung 3D). Beispiel für eine Befehlszeile: C:\Users\janedoe>cd [Leerzeichen nach cd, dann Dateipfad kopieren/einfügen]
    5. Geben Sie in der nächsten Befehlszeile Folgendes ein, einschließlich des Leerzeichens und des Punktes (siehe Abbildung 3D):
      pip install -e .
      HINWEIS: Die Schritte 3.3.5 und 3.3.6 müssen nur ausgeführt werden, wenn dieses Programm zum ersten Mal auf einem Computer ausgeführt wird. Wenn dies bereits abgeschlossen ist, fahren Sie mit Schritt 3.3.7 fort. Die Initialisierung des Installationsvorgangs kann einige Augenblicke dauern.
    6. Drücken Sie die Eingabetaste. Durch das Ausführen dieses Befehls werden die erforderlichen Bibliotheken zum Ausführen dieses Skripts installiert und das Repository in einem bearbeitbaren Modus installiert, falls Codeanpassungen erforderlich sind (siehe Abbildung 3D).
    7. Geben Sie Folgendes in die nächste Befehlszeile ein, um das Verzeichnis in das Hauptverzeichnis des Quellcodes zu ändern (siehe Abbildung 3E):
      CD "nuclei_counter"
    8. Geben Sie in der nächsten Befehlszeile Folgendes ein, und drücken Sie die Eingabetaste (siehe Abbildung 3E):
      python count_nuclei.py --img_dir "Pfad/zu/Bildern" --output_dir "Pfad/zu/Ausgabe" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      Dabei ist path/to/images der Dateipfad zu dem Ordner, der die zu analysierenden Bilder enthält (Schritt 1.14); path/to/output ist der Dateipfad zu dem Ordner, in dem die .csv Datei gespeichert werden soll (standardmäßig das aktuelle Arbeitsverzeichnis, wenn nicht angegeben); und results.csv ist der Dateiname, unter dem die resultierenden Zählungen gespeichert werden (wenn nicht angegeben, wird der Name der Ausgabedatei standardmäßig auf count_results.csv gesetzt).
      HINWEIS: In der Befehlszeile sind Anführungszeichen erforderlich. Stellen Sie sicher, dass nach Anführungszeichen vor dem Dateipfad keine Leerzeichen stehen. Das Python-Skript liest die Dateien im angegebenen Dateipfad und führt das Kernzählprogramm für alle Bilder im Verzeichnis aus (siehe Abbildung 3E). Die resultierenden Zählungen werden in den Ergebnissen .csv Datei am angegebenen Speicherort gespeichert.
    9. Wenn die nächste Befehlszeile angezeigt wird, ist die Verarbeitung abgeschlossen (siehe Abbildung 3E). Die Konturlinien und die Ergebnistabelle sind nun an dem Speicherort verfügbar, der in Schritt 3.3.8 als Ausgabeverzeichnis angegeben wurde (d. h. Pfad/zu/Ausgabe).

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Abbildung 3: Beispiele für wichtige Teile des Workflows für Abschnitt 3 unter Verwendung des Windows-Betriebssystems. Um auf den Code zuzugreifen, klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Code und (A) laden Sie die Zip-Datei herunter (gekennzeichnet durch Pfeile). (B) Extrahieren Sie, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Zip-Datei (blau dargestellt) klicken und (C) das gewünschte Ziel festlegen. (D) Nach dem Öffnen der Eingabeaufforderung Beispiele für Befehle für die Schritte 3.3.4 und 3.3.5. Beachten Sie, dass sich der Befehl für Schritt 3.3.5 in einer Zeile befindet; Der Text, der mit "Datei abrufen" in der nächsten Zeile beginnt, erscheint nach dem Drücken der Eingabetaste (Schritt 3.3.6; d.h. Ausführen des Befehls). (E) Beispiele für Befehle für die Schritte 3.3.7 und 3.3.8, einen Fortschrittsbalken nach der Ausführung von Schritt 3.3.8 und die Befehlszeile, die den Abschluss in Schritt 3.3.9 anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Verwenden Sie die folgenden Anweisungen für Mac OS.
    1. Klicken Sie im Ordner Downloads auf das Menü Datei und wählen Sie Öffnen , um die Dateien auf den lokalen Computer zu extrahieren (siehe Abbildung 4A).
    2. Öffnen Sie am Speicherort der extrahierten Datei den Ordner mit dem Namen nuclei_counter-main. Dies ist das Code-Repository.
      HINWEIS: Dies muss nur heruntergeladen werden, wenn dieses Programm zum ersten Mal verwendet wird. Verschieben Sie einfach die extrahierten Dateien an einen zugänglichen Netzwerkspeicherort und notieren Sie sich diesen Speicherort.
    3. Öffnen Sie ein Terminal, indem Sie Befehl + Leertaste drücken, um das Spotlight zu öffnen. Suchen Sie dann nach "Terminal".
    4. Verwenden Sie den Befehl cd, um das Verzeichnis in das Code-Repository zu ändern, und drücken Sie die Eingabetaste. Weitere Informationen finden Sie in der folgenden Codezeile, in der zwischen Groß- und Kleinschreibung unterschieden wird. Geben Sie den Dateipfad in ein Textdokument ein und kopieren Sie ihn in das Terminal. Stellen Sie sicher, dass der Dateipfad mit dem Text beginnt, der unmittelbar vor cd steht (z. B. /Users/userid in Abbildung 4B). Beispiel für eine Befehlszeile: /Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
    5. In der nächsten Befehlszeile wird nach der Benutzer-ID ein Dollarzeichen angezeigt (siehe Abbildung 4B). Stellen Sie sicher, dass nach dem Dollarzeichen ein Leerzeichen steht, und geben Sie Folgendes ein, einschließlich des Leerzeichens und des Punktes am Ende des Befehls. Fügen Sie die entsprechende Python-Version unmittelbar nach pip ohne Leerzeichen ein: pip3 install -e .
      HINWEIS: Die Schritte 3.4.5 und 3.4.6 müssen nur ausgeführt werden, wenn dieses Programm zum ersten Mal auf einem Computer ausgeführt wird. Wenn dies bereits abgeschlossen ist, fahren Sie mit Schritt 3.4.7 fort. Die Initialisierung des Installationsvorgangs kann einige Augenblicke dauern.
    6. Drücken Sie die Eingabetaste. Durch Ausführen dieses Befehls werden die erforderlichen Bibliotheken zum Ausführen dieses Skripts installiert und das Repository in einem bearbeitbaren Modus installiert, falls Codeanpassungen erforderlich sind.
    7. Stellen Sie in der nächsten Befehlszeile sicher, dass nach dem Dollarzeichen ein Leerzeichen steht, und geben Sie dann Folgendes ein, um das Verzeichnis in das Hauptverzeichnis des Quellcodes zu ändern (siehe Abbildung 4C):
      CD "nuclei_counter"
    8. Geben Sie in der nächsten Befehlszeile die folgende Befehlszeile ein. Ersetzen Sie die Nummer nach Python durch die richtige Versionsnummer, wenn Sie eine andere Version als 3 verwenden. Drücken Sie dann die Eingabetaste (siehe Abbildung 4C):
      python3 count_nuclei.py --img_dir "Pfad/zu/Bilder" --output_dir " Pfad/zu/Ausgabe" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      wobei path/to/images der Dateipfad zu dem Ordner ist, der die zu analysierenden Bilder enthält (Schritt 1.14); path/to/output ist der Dateipfad zu dem Ordner, in dem die .csv Datei gespeichert werden soll (standardmäßig das aktuelle Arbeitsverzeichnis, wenn nicht angegeben); und results.csv ist der Dateiname, unter dem die resultierenden Zählungen gespeichert werden (wenn nicht angegeben, wird der Name der Ausgabedatei standardmäßig auf count_results.csv gesetzt).
      HINWEIS: In der Befehlszeile sind Anführungszeichen erforderlich. Stellen Sie sicher, dass nach Anführungszeichen vor dem Dateipfad keine Leerzeichen stehen. Das Python-Skript liest die Dateien im angegebenen Dateipfad und führt das Kernzählprogramm für alle Bilder im Verzeichnis aus (siehe Abbildung 4C). Die resultierenden Zählungen werden in den Ergebnissen .csv Datei am angegebenen Speicherort gespeichert.
    9. Wenn die nächste Befehlszeile angezeigt wird, ist die Verarbeitung abgeschlossen (siehe Abbildung 4C). Die Konturlinien und die Ergebnistabelle sind jetzt an dem Speicherort verfügbar, der in Schritt 3.4.8 als Ausgabeverzeichnis angegeben wurde (d. h. Pfad/zu/Ausgabe).
  2. Überprüfen Sie die Konturen visuell, um die Zählqualität zu überprüfen. Die Ergebnisse können nun verwendet werden, um Daten zu normalisieren, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
    HINWEIS: Wenn bei Konturen Kerne fehlen (z. B. scheinen Kerne zu schwach zu sein) oder Gruppen von Kernen in einem einzigen Element zusammengefasst sind (z. B. überbelichtetes Bild, zu viel Hintergrund, Artefakte), sollte sich der Benutzer auf Tabelle 1 beziehen und muss möglicherweise zu Abschnitt 1 zurückkehren, um die Bildaufnahme zu optimieren, bevor er mit Abschnitt 4 fortfährt.

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Abbildung 4: Beispiele für wichtige Teile des Workflows für Abschnitt 3 unter Mac OS. Nach dem Herunterladen des Codes (siehe Abbildung 3A) extrahieren Sie (A), indem Sie auf die Zip-Datei (blau dargestellt) klicken und das gewünschte Ziel festlegen. (B) Nach dem Öffnen des Terminals Beispiele für Befehle für die Schritte 3.4.4 (Ändern des Verzeichnisses in das Code-Repository) und 3.4.5 (Installieren von pip). (C) Beispiele für Befehle für die Schritte 3.4.7 und 3.4.8, ein Fortschrittsbalken nach der Ausführung von Schritt 3.4.8 und die Befehlszeile, die den Abschluss in Schritt 3.4.9 anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Verwenden von Zählungen zur Normalisierung experimenteller Daten

  1. Öffnen Sie die results.csv Datei und verknüpfen Sie jedes Bild mit der mit dem automatisierten Programm ermittelten Zellkernquantifizierung.
  2. Entscheiden Sie sich für die Normalisierungsmethode: 1) Bild-für-Bild-Basis (z. B. bei Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie), 2) Normalisierung der Daten als Verhältnis der durchschnittlichen Kernzahl pro Probe zu einer Referenzprobe (oder -bedingung), 3) Normalisierung zur Kernzahl pro Probe (z. B. Extrapolation der Gesamtkernzahl auf die Probenfläche). Empfehlungen für die Normalisierungsmethode finden Sie im Abschnitt Diskussion.
    1. Wenn die Normalisierung auf Bild-für-Bild-Basis durchgeführt wird, dividieren Sie einfach die experimentellen Daten für jedes Bild durch die Anzahl der Kerne für dieses Bild.
    2. Um Daten als Verhältnis zu normalisieren, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
      1. Berechnen Sie für alle Proben, bei denen mehrere Bilder für ein einzelnes Replikat aufgenommen wurden (z. B. 10-15 Bilder, die von einem einzelnen Well in einer 6-Well-Platte aufgenommen wurden), die durchschnittliche Anzahl von Kernen pro Bild. Diese Kernzahlen werden als die Zellzahl betrachtet, wobei einkernige Zellen oder eine Anzahl von Zellen in mehrkernigen Zellen (z. B. mit Myotuben) miteinander verschmolzen werden.
      2. Wählen Sie entweder eine Referenzstichprobe oder eine Referenzbedingung (z. B. durchschnittliche Anzahl über alle Stichproben aus der Kontrollbedingung) aus und notieren Sie sich die Anzahl.
      3. Dividieren Sie die Anzahl für alle Stichproben durch diese Referenzanzahl, was zu einem Normalisierungswert führt. Wenn eine Referenzstichprobe verwendet wurde, verwenden Sie den Normalisierungswert für die Referenzstichprobe als 1.
        HINWEIS: Wenn eine Referenzbedingung verwendet wurde, beträgt der durchschnittliche Normalisierungswert über die Bedingung jetzt 1. Proben mit weniger Kernen als die Referenz (d. h. weniger dicht) haben Normalisierungswerte von weniger als 1, und Proben mit mehr Kernen als die Referenz (d. h. dichter) haben Normalisierungswerte von mehr als 1.
      4. Dividieren Sie die experimentellen Daten für jede Vertiefung durch den entsprechenden berechneten Normalisierungswert.
    3. Um die Daten auf die Kernzahl pro Probe zu normalisieren, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
      1. Berechnen Sie für alle Proben, bei denen mehrere Bilder für ein einzelnes Replikat aufgenommen wurden (z. B. 10-15 Bilder, die von einem einzelnen Well in einer 6-Well-Platte aufgenommen wurden), die durchschnittliche Anzahl von Kernen pro Bild. Diese Kernzahlen werden als die Zellzahl unter der Annahme von einkernigen Zellen oder als die Anzahl der Zellen betrachtet, die in mehrkernigen Zellen (z. B. mit Myotuben) miteinander verschmolzen sind.
      2. Bestimmen Sie die Oberfläche des Objektträgers (Deckglas), der Vertiefung oder der Schale, von der die Daten abgeleitet wurden. Diese Informationen finden Sie im Abschnitt "Spezifikationen" auf den Produktwebsites.
      3. Bestimmen Sie den Bereich jedes aufgenommenen Bildes. Diese Informationen sind oft als Metadaten in der Bildgebungs- oder Analysesoftware verfügbar.
      4. Stellen Sie sicher, dass die Probenoberfläche und der Bildbereich in denselben Einheiten ausgedrückt werden (z. B.mm 2). Wenn nicht, konvertieren Sie in die gewünschte Einheit.
      5. Berechnen Sie die Gesamtanzahl für jede Stichprobe mit der folgenden Gleichung:
        TC = AC • (SA/IA)
        wobei TC die Gesamtzählung, AC die Durchschnittszahl, SA die Oberfläche und IA die Bildfläche ist.
      6. Teilen Sie die experimentellen Daten durch den entsprechenden TC für die Probe.
  3. Normalisieren Sie experimentelle Daten und verwenden Sie sie gegebenenfalls für statistische Analysen.

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Ergebnisse

Jeder Batch-Bildlauf erzeugt: 1) einen Satz von Bilddateien mit angewendeten Konturen, die die Umrisse der identifizierten Kerne zeigen (Abbildung 5), und 2) eine .csv Datei (Tabelle), in der die Namen der Bilddateien und die zugehörigen Zählungen verknüpft sind. Durch das Betrachten der Konturen kann der Benutzer die Zählqualität visuell beurteilen. Insbesondere sollten Bilder, die gemäß Abschnitt 1 erhalten wurden, alle (oder fast alle) Kerne von einer durc...

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Diskussion

Unser Programm zur Quantifizierung von Kernen hat mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Optionen: Es erfordert nur minimale technologische Fähigkeiten, ist für die spezifische Aufgabe der Kernquantifizierung validiert und Open Source; Letzteres überwindet kostenbezogene Barrieren. Letztendlich bietet dieses Programm Zell- und Molekularbiologen eine zusätzliche Möglichkeit, Zellkerne in Bildern, die mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, schnell und genau zu quantifizie...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health/National Institute on Aging (R01AG084597; DEL und HYL) und durch Start-up-Fonds der Texas Tech University (DEL). Die Autoren danken den Programmen Undergraduate Research Scholars und TrUE Scholars der Texas Tech University für die finanzielle Unterstützung der Undergraduate-Forscher, die zu dieser Arbeit beigetragen haben (REH, MRD, CJM, AKW). Wir danken auch Dr. Lauren S. Gollahon und Dr. Michael P. Massett für die freundliche Bereitstellung ihrer Laborräume und -geräte.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Computer mit Zugriff auf die Ergebnisdatei aus Methode 2 oder 3–Siehe Schritt 2.6 (für Methode 2) oder Schritt 3.3.9 oder 3.4.9 (für Methode 3)
Computer mit Internetzugang, moderner Browser–z. B. Google Chrome
Computer mit Internetzugang, moderner Browser und Windows-BetriebssystemvariiertFür Mac, Linux oder andere Betriebssysteme verwenden Sie Methode 3
Computer mit Software für die BildaufnahmeZeissAxioVisionAndere Software ist akzeptabel; muss mit dem Fluoreszenzmikroskop kompatibel sein
Dateispeicherort für die Ausgabe (Ergebnistabelle und Bildkonturen)-Kann ein neuer, leerer Ordner sein
FluoreszenzmikroskopZeissAxiovert 200MAndere Fluoreszenzmikroskope sind akzeptabel; müssen mit den entsprechenden Filterwürfeln, dem gewünschten Objektiv und der Kamera ausgestattet sein.
Ordner mit allen zu quantifizierenden Bildern-Siehe Schritt 1.12
Python Version 3.10 oder höherPython-Verfügbar zum kostenlosen Download und zur Installation unter https://www.python.org/downloads/ 
Proben, die abgebildet werden sollen-fixiert oder lebend, gefärbt oder gegengefärbt mit fluoreszierenden DNA-Farbstoffen
TabellenkalkulationssoftwareMicrosoftExcelÄhnliche Tabellenkalkulationssoftware ist ebenfalls akzeptabel

Referenzen

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