Verwendung von Computer-Vision-Bibliotheken zur Optimierung der Zellkernquantifizierung

Summary

In diesem Artikel werden Schritt-für-Schritt-Methoden zur Automatisierung der bildbasierten Zellkernquantifizierung mithilfe eines ausführbaren Open-Source-Programms beschrieben, das über eine Reihe von Zelldichten validiert wurde. Dieses Programm bietet eine Alternative, die Barrieren in Bezug auf Kosten, Zugänglichkeit für Benutzer mit begrenzten technologischen Fähigkeiten und anwendungsspezifische Validierung beseitigt, die den Nutzen bestehender Technologien einschränken können.

Abstract

Lebendzell-Assays und bildbasierte Zellanalysen erfordern eine Datennormalisierung für eine genaue Interpretation. Eine häufig verwendete Methode ist die Färbung und Quantifizierung von Zellkernen, gefolgt von einer Datennormalisierung auf die Zellkernzahl. Diese Zellzahl wird oft als Zellzahl für einkernige Zellen ausgedrückt. Während die manuelle Quantifizierung mühsam und zeitaufwändig sein kann, werden die verfügbaren automatisierten Methoden möglicherweise nicht von allen Anwendern bevorzugt, sind möglicherweise nicht für diese spezielle Anwendung validiert oder können unerschwinglich sein. Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Erfassung quantifizierbarer Bilder von Zellkernen bereit, die mit fluoreszierenden DNA-Färbungen gefärbt wurden, und die anschließende Quantifizierung der Zellkerne mit einem automatisierten Softwareprogramm zur Objektzählung, das unter Verwendung von Python-Computer-Vision-Bibliotheken entwickelt wurde. Wir validieren dieses Programm auch für eine Reihe von Zelldichten. Obwohl die genaue Zeit für die Programmausführung je nach Anzahl der Bilder und der Computerhardware variiert, konsolidiert dieses Programm die Stunden der Arbeit zum Zählen von Kernen in Sekunden, damit das Programm ausgeführt werden kann. Während dieses Protokoll unter Verwendung von Bildern von fixierten, gefärbten Zellen entwickelt wurde, können mit diesem Programm auch Bilder von gefärbten Zellkernen in lebenden Zellen und Immunfluoreszenzanwendungen quantifiziert werden. Letztendlich bietet dieses Programm eine Option, die kein hohes Maß an technologischem Know-how erfordert und eine validierte Open-Source-Alternative darstellt, um Zell- und Molekularbiologen bei der Rationalisierung ihrer Arbeitsabläufe zu unterstützen und die mühsame und zeitaufwändige Aufgabe der Zellkernquantifizierung zu automatisieren.

Introduction

Funktionelle und bildbasierte Experimente sind entscheidend für das Verständnis der Auswirkungen experimenteller Behandlungen auf die Biochemie und Physiologie der gesamten Zelle. Die valide Interpretation von Daten aus zellbiologischen Experimenten hängt von der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Versuchsprotokolls ab, einschließlich der Datennormalisierung. So ermöglichen Analysen des Sauerstoffverbrauchs und der extrazellulären Versauerungsraten in lebenden Zellen zu Studienbeginn und nach der Behandlung mit spezifischen Arzneimitteln die Beurteilung verschiedener Aspekte des Energiestoffwechsels ^1,....

Protocol

HINWEIS: Ergänzende Dateien finden Sie unter folgendem Link https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Aufnehmen und Speichern von Bildern mit der Fluoreszenzmikroskopie

1. Bereiten Sie Zell- oder Gewebeproben für die Abbildung vor, einschließlich der Färbung mit dem gewünschten DNA-Farbstoff. Um die hier verwendeten Bilder zu erhalten, wurden C2C12-Myoblasten (CRL-1772, American Type Culture Collection) in 6-Well-Platten für 48-72 h unter Standardkulturbedingungen (5% CO₂, 37 °C, befeuchtet), mit oder ohne 50 mM EtOH⁶ gezüchtet und in eiskaltem Methanol fixiert, wie z....

Results

Jeder Batch-Bildlauf erzeugt: 1) einen Satz von Bilddateien mit angewendeten Konturen, die die Umrisse der identifizierten Kerne zeigen (Abbildung 5), und 2) eine .csv Datei (Tabelle), in der die Namen der Bilddateien und die zugehörigen Zählungen verknüpft sind. Durch das Betrachten der Konturen kann der Benutzer die Zählqualität visuell beurteilen. Insbesondere sollten Bilder, die gemäß Abschnitt 1 erhalten wurden, alle (oder fast alle) Kerne von einer durc.......

Discussion

Unser Programm zur Quantifizierung von Kernen hat mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Optionen: Es erfordert nur minimale technologische Fähigkeiten, ist für die spezifische Aufgabe der Kernquantifizierung validiert und Open Source; Letzteres überwindet kostenbezogene Barrieren. Letztendlich bietet dieses Programm Zell- und Molekularbiologen eine zusätzliche Möglichkeit, Zellkerne in Bildern, die mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, schnell und genau zu quantifizie.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer mit Zugriff auf die Ergebnisdatei aus Methode 2 oder 3	–		Siehe Schritt 2.6 (für Methode 2) oder Schritt 3.3.9 oder 3.4.9 (für Methode 3)
Computer mit Internetzugang, moderner Browser	–		z. B. Google Chrome
Computer mit Internetzugang, moderner Browser und Windows-Betriebssystem	variiert		Für Mac, Linux oder andere Betriebssysteme verwenden Sie Methode 3
Computer mit Software für die Bildaufnahme	Zeiss	AxioVision	Andere Software ist akzeptabel; muss mit dem Fluoreszenzmikroskop kompatibel sein
Dateispeicherort für die Ausgabe (Ergebnistabelle und Bildkonturen)	-		Kann ein neuer, leerer Ordner sein
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Axiovert 200M	Andere Fluoreszenzmikroskope sind akzeptabel; müssen mit den entsprechenden Filterwürfeln, dem gewünschten Objektiv und der Kamera ausgestattet sein.
Ordner mit allen zu quantifizierenden Bildern		-	Siehe Schritt 1.12
Python Version 3.10 oder höher	Python	-	Verfügbar zum kostenlosen Download und zur Installation unter https://www.python.org/downloads/
Proben, die abgebildet werden sollen	-	fixiert oder lebend, gefärbt oder gegengefärbt mit fluoreszierenden DNA-Farbstoffen
Tabellenkalkulationssoftware	Microsoft	Excel	Ähnliche Tabellenkalkulationssoftware ist ebenfalls akzeptabel