Method Article

Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

DOI:

10.3791/67980

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July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Implementierung einer kostengünstigen, vielseitigen Photobestrahlungstechnik mit der manuellen IBEX-Methode ermöglicht eine optimale Bildgebung von menschlichem Gewebe mit signifikanter nativer Autofluoreszenz. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Multiplex-Bilder von Ganzobjektträgern aus archivierten klinischen Proben mit einem inversen Mikroskop, weit verbreiteten Reagenzien und Open-Source-Software für die Bildausrichtung und -verarbeitung erhält.

Abstract

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Die Prävalenz von Lungenerkrankungen aufgrund von nicht-tuberkulösen Mykobakterien (NTM) hat weltweit zugenommen. Obwohl NTM-induzierte Lungenerkrankungen häufig mit Bronchiektasen, Lungenknötchen und Kavitärerkrankungen einhergehen, wurde die Wirtsreaktion, die mit diesen unterschiedlichen Lungenverletzungsmustern verbunden ist, in situ nicht gut charakterisiert. Wir versuchten, die Mechanismen der NTM-induzierten Pathologie zu bewerten, indem wir eine tiefe phänotypische Analyse von Immunzellpopulationen im Lungengewebe von Personen mit NTM-Krankheit im Vergleich zu einem Goldstandard für granulomatöse Entzündungen, tuberkulöse (TB) Lungenerkrankungen, durchführten.

Formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Lungenblöcke von Patienten mit disseminierter NTM-, pulmonaler NTM- oder pulmonaler TB-Erkrankung wurden nach einer modifizierten Version des Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX) Bildgebungsverfahrens geschnitten und gefärbt. Die Optimierung der IBEX-Methode war zunächst erforderlich, um die signifikante endogene Fluoreszenz von Lungenschnitten aufgrund der hohen Dichte an Kollagen, Elastin und Erythrozyten im Lungengewebe zu berücksichtigen, die durch die FFPE-Konservierung und das Alter der FFPE-Blöcke verschlechtert wird. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Photobestrahlungsprotokoll und eine modifizierte Antigen-Retrieval-Methode, die die Autofluoreszenz von klinisch archivierten Proben reduziert.

Darüber hinaus bieten wir Anleitungen zum Design von Antikörper-Panels, einschließlich häufiger Herausforderungen wie Kreuzreaktivität, Epitopverlust nach Photobestrahlung, spektrale Überlappung zwischen benachbarten Fluorophoren und geringes Signal-Rausch-Verhältnis für bestimmte Ziele. Um eine effiziente Bildgebung ganzer Lungengewebeschnitte zu ermöglichen, wurden die Objektträger mit einem Weitfeldmikroskop abgebildet und mit Open-Source-Software nachbearbeitet, um die Bildqualität zu verbessern. Zusammen erfüllt dieser Workflow einen kritischen Bedarf, indem dokumentiert wird, wie hochgradig gemultiplexte, hochauflösende Ganzkörperbilder aus anspruchsvollen Proben mit weit verbreiteten Instrumenten und Reagenzien erhalten werden können. Über die quantitative Bildgebung klinischer Proben hinaus können diese Techniken auf verschiedene Probentypen angewendet werden, um sowohl endogene als auch exogene Fluoreszenzquellen zu überwinden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tuberkulose (TB) ist eine der häufigsten Todesursachen, wobei jedes Jahr etwa 1,3 Millionen Menschen an einer TB-Infektion sterben1. Obwohl sie nicht so tödlich sind wie Tuberkulose, gab es in den letzten Jahren einen signifikanten Anstieg von Lungeninfektionen und Folgeerkrankungen, die durch nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) verursacht werden2. Auf Gewebeebene ist die Immunantwort des Wirts auf eine pulmonale Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektion gut untersucht und umfasst die Bildung von Granulomen, heterogenen Aggregaten von Lymphozyten, dendritischen Zellen, Makroph....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Archivierte Autopsie- und chirurgische Resektions-Lungengewebeschnitte wurden gemäß Protokoll 09-H-0172 (NCT00943514), Natural History of Bronchiectasis, im Labor für Pathologie des National Institutes of Health Clinical Center gesammelt. Dieses Protokoll wurde vom IRB genehmigt, und die Teilnehmer gaben eine Einverständniserklärung.

1. Automatisierte Antigengewinnung

HINWEIS: Die Entparaffinisierung und Antigengewinnung wurden unter Verwendung einer automatisierten Forschungsfärbeplattform durchgeführt (Abbildung 1). Frühere Arbeiten zeigten, dass....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entwicklung eines Multiplex-Antikörper-basierten Bildgebungspanels erfordert viel Zeit, Aufwand und Ressourcen12. Diese Herausforderungen sind besonders ausgeprägt bei der Entwicklung eines Panels für archivierte FFPE-Proben aus stark autofluoreszierenden Geweben, wie hier beschrieben (Abbildung 1). Um diese Herausforderungen zu meistern, identifizierten wir zunächst die hellsten Fluorophore, die mit unserem Farbstoffinaktivierungsprotokoll kompatibel sind (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die klinische Lungenpathologie der Lungentuberkulose ist durch eine nekrotisierende granulomatöse Entzündung gekennzeichnet. Die NTM-Lungenpathologie tritt hauptsächlich in zwei unterschiedlichen Patientenpopulationen mit zwei getrennten pathologischen Mustern auf: isolierte Lungenschädigung, die durch granulomatöse Entzündung mit bronchiolärer Obliteration und Kariesbildung bei immunkompetenten Personen gekennzeichnet ist, oder diffuse knotige Erkrankung, die die Lunge und andere Organe.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.R. ist Mitarbeiter bei Leica Microsystems, Inc. Die anderen Autoren erklären, dass keine widerstreitenden Interessen bestehen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das Intramural Research Program von DIR/NIAID, NCI und NHLBI unterstützt. Abbildung 1 wurde unter Verwendung von BioRender im Rahmen einer institutionellen Lizenzvereinbarung mit dem NIH erstellt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,3 % Triton-X-100Sigma-AldrichNr. T8787Lösung zum Blockieren des Puffers
1% BSASigma-AldrichNr. A4503Lösung zum Blockieren des Puffers
1% menschlicher BD Fc BlockBD Biowissenschaften564220Fc-Block zum Blockieren des Puffers erforderlich
150 W LED-LampeAmazonasB07VH3CVSFLED-Lichtquelle für die Gewebe-Photobestrahlung
1x PBS Gibco10010-023Lösung zum Blockieren von Puffer- und Waschschritten
20 Gallonen VorratsbehälterAmazonasB001B1C4G0Behälter für den Photobestrahlungsprozess
40 W RGBW Flut LED-Lampe AmazonasB08QFPJSMDRGB-Lichtquelle für die Photobestrahlung von Gewebe
Ag85BAbcam (Englisch)AB43019/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Alpha-glatte Muskulatur Aktin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Avidin/Biotin BlockierungskitAbcam (Englisch)Artikel-Nr.: ab64212Avidin- und Biotin-Blockierungslösung
BD Cytofix/CytopermBD Biowissenschaften554714Lösung zur Fixierung
BOND EntwachsungslösungLeica BiosystemsNC0221076Lösung zur Entparaffinierung
BOND Epitop-Rückhollösung 1Leica BiosystemsNC0235529Citratbasierte pH 6 Epitop-Rückgewinnungslösung (ER1)
BOND Epitop-Rückhollösung 2Leica BiosystemsNC0235530EDTA-basierte pH-9-Epitop-Rückgewinnungslösung (ER2)
BOND Research DetektionssystemLeica BiosystemsNC0396648Automatisiertes Forschungsfärbereagenz
BOND RX Forschung FärberLeica BiosystemsNAAutomatisierte Färbeplattform für die Forschung
BOND WaschlösungLeica BiosystemsNC0221077Puffer waschen
CD15BD Biowissenschaften347420/AB_400298Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD4 Alexa Fluor 488Forschung & Forschung D-SystemeFAB8165G/AB_2728839Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificNr. A32814/AB_2762838Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Maus IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel-Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488Jackson Immunforschung715-545-020/AB_2340844Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificNr. A32794/AB_2762834Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
EasyDip FärbesystemAngebot für Neueinsteiger5300KITFärbesystem für Objektträger
Fluormount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02Einhängemedien
HoechstBiotium40046Kernfärbung für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Imaris Dateikonverter x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumenteKostenloser Dateikonverter
ImarisViewer Software x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumenteKostenlose Bildbearbeitungssoftware
ImmEdge-StiftVector LaboratorienH-4000Hydrophober Barrierestift
Lithium-Borhydrid (1 Gramm)STREM Chemikalien93-0397Chemikalie zur Farbstoffinaktivierung, kaufen Sie kleine Aliquots dieser Chemikalie (1 Gramm)
Lumican BiotinForschung & Forschung D-SystemeBAF2846Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Micro Cover BrilleVWR48393-241Glas-Diaabdeckungen
Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
PELCO BioWave Pro MikrowellensystemTed Pella Inc36500-230Wissenschaftliche Mikrowelle ohne Erwärmung
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Vollautomatische Temperaturregelung für wissenschaftliche Mikrowellen
SimpleITKOpen-Source-SoftwareRegistrierungs- und Kanalverarbeitungssoftware
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificNr. S11227Markierungsreagenz für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Weitfeld-MikroskopLeica MikrosystemeNALeica Microsystems THUNDER Imager mit LED8-Lichtquelle und LAS X Software (3.7.1.21655). Für die Fluoreszenzbildgebung wurde ein spezieller Quad-Band-Filter mit externem Filterrad (PN: 11536075) mit zwei zusätzlichen Einzelbandfiltern (PN: 8118215) verwendet, um sieben Farbkanäle pro Durchgang abzubilden. Die Filteranregungs-, dichroitischen und Emissionslinien sind (1) Quad-Band-Würfel: dichroitisch bei 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, keine Anregungs- oder Emissionsfilter; (2) Außenfilterrad Position 1: 434/32, Position 2: 520/40, Position 3: 585/20, Position 4: 720/60, Position 5: Durchlauf; (3) Einzelband 1– 585/22 Anregung, 594 dichroitisch, 625/30 Emission; (4) Single-Band 2– 635/20 Anregung, 647 dichroitische, 667/30 Emission.
Zeiss Reiniger für optische GläserAmazonasB00GPVQVCOReiniger für Objektive für Mikroskope
Antikörper
Ag85BAbcam (Englisch)AB43019Polyklonales Kaninchen IgG, Zyklus 1
Alpha-glatte Muskulatur Aktin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, Zyklus 1
CD4 Alexa Fluor 488Forschung & Forschung D-SystemeFAB8165GPolyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegende372906C8/144B, Zyklus 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, Zyklus 1
Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificNr. A32814Polyklonaler Esel, Zyklus 1
Esel Anti-Maus IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificNr. A32787Polyklonaler Esel, Zyklus 1
Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificNr. A32794Polyklonaler Esel, Zyklus 1
HoechstBiotium40046Nukleares Etikett, Zyklus 1
CD15BD Biowissenschaften347420MMA, Zyklus 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, Zyklus 2
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, Zyklus 2
Esel-Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488Jackson Immunforschung715-545-020Polyklonaler Esel, Zyklus 2
Lumican BiotinForschung & Forschung D-SystemeBAF2846Polyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 2
Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, Zyklus 2
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificNr. S11227N/A, Zyklus 2
HoechstBiotium40046Zyklus 2
Lösungen
Blocking Buffer (Zyklus 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichNr. T87870,3 Vol.-%
BSASigma-AldrichNr. A45031 Vol.-%
Mensch BD Fc BlockBD Biowissenschaften5642201 Vol.-%
1x PBS Gibco10010-02397,7 Vol.-%
Primär-Antikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegende3729061:10
Primäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
CD4  Nr. AF488Forschung & Forschung D-SystemeFAB8165G1:10
Ag85BAbcam (Englisch)AB43019/NA1:100
Sekundäre Antikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
Esel Anti-Ziege AF Plus 488Thermo Fisher ScientificNr. A32814/AB_27628381:100
Esel Anti-Kaninchen AF Plus 555Thermo Fisher ScientificNr. A32794/AB_27628341:100
Esel Anti-Maus AF Plus 647Thermo Fisher ScientificNr. A32787/AB_27628301:50
Primäre Antikörper-Färbelösung #3 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)
Triton-X-100Sigma-AldrichNr. T87870,3 Vol.-%
Mensch BD Fc BlockBD Biowissenschaften5642201 Vol.-%
1x PBS Gibco10010-02398,7 Vol.-%
Primäre Antikörper-Färbelösung #4 (Zyklus 2)
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
CD15BD Biowissenschaften3474201:30
Lumican BiotinForschung & Forschung D-SystemeBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
Sekundäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 2)
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
Esel-Anti-Maus IgM AF488Jackson Immunforschung715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificNr. S112271:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2....

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Iterative BleachingMultiplex ImagingAutofluorescent SamplesSpatial ProteomicsFFPE Lung TissuePhotoirradiation ProtocolAntibody Panel DesignWhole Slide ImagingGranulomatous InflammationImmune Cell Mapping

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