Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

1.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/67980

⸱

11. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Implementierung einer kostengünstigen, vielseitigen Photobestrahlungstechnik mit der manuellen IBEX-Methode ermöglicht eine optimale Bildgebung von menschlichem Gewebe mit signifikanter nativer Autofluoreszenz. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Multiplex-Bilder von Ganzobjektträgern aus archivierten klinischen Proben mit einem inversen Mikroskop, weit verbreiteten Reagenzien und Open-Source-Software für die Bildausrichtung und -verarbeitung erhält.

Zusammenfassung

Die Prävalenz von Lungenerkrankungen aufgrund von nicht-tuberkulösen Mykobakterien (NTM) hat weltweit zugenommen. Obwohl NTM-induzierte Lungenerkrankungen häufig mit Bronchiektasen, Lungenknötchen und Kavitärerkrankungen einhergehen, wurde die Wirtsreaktion, die mit diesen unterschiedlichen Lungenverletzungsmustern verbunden ist, in situ nicht gut charakterisiert. Wir versuchten, die Mechanismen der NTM-induzierten Pathologie zu bewerten, indem wir eine tiefe phänotypische Analyse von Immunzellpopulationen im Lungengewebe von Personen mit NTM-Krankheit im Vergleich zu einem Goldstandard für granulomatöse Entzündungen, tuberkulöse (TB) Lungenerkrankungen, durchführten.

Formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Lungenblöcke von Patienten mit disseminierter NTM-, pulmonaler NTM- oder pulmonaler TB-Erkrankung wurden nach einer modifizierten Version des Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX) Bildgebungsverfahrens geschnitten und gefärbt. Die Optimierung der IBEX-Methode war zunächst erforderlich, um die signifikante endogene Fluoreszenz von Lungenschnitten aufgrund der hohen Dichte an Kollagen, Elastin und Erythrozyten im Lungengewebe zu berücksichtigen, die durch die FFPE-Konservierung und das Alter der FFPE-Blöcke verschlechtert wird. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Photobestrahlungsprotokoll und eine modifizierte Antigen-Retrieval-Methode, die die Autofluoreszenz von klinisch archivierten Proben reduziert.

Darüber hinaus bieten wir Anleitungen zum Design von Antikörper-Panels, einschließlich häufiger Herausforderungen wie Kreuzreaktivität, Epitopverlust nach Photobestrahlung, spektrale Überlappung zwischen benachbarten Fluorophoren und geringes Signal-Rausch-Verhältnis für bestimmte Ziele. Um eine effiziente Bildgebung ganzer Lungengewebeschnitte zu ermöglichen, wurden die Objektträger mit einem Weitfeldmikroskop abgebildet und mit Open-Source-Software nachbearbeitet, um die Bildqualität zu verbessern. Zusammen erfüllt dieser Workflow einen kritischen Bedarf, indem dokumentiert wird, wie hochgradig gemultiplexte, hochauflösende Ganzkörperbilder aus anspruchsvollen Proben mit weit verbreiteten Instrumenten und Reagenzien erhalten werden können. Über die quantitative Bildgebung klinischer Proben hinaus können diese Techniken auf verschiedene Probentypen angewendet werden, um sowohl endogene als auch exogene Fluoreszenzquellen zu überwinden.

Einleitung

Tuberkulose (TB) ist eine der häufigsten Todesursachen, wobei jedes Jahr etwa 1,3 Millionen Menschen an einer TB-Infektion sterben1. Obwohl sie nicht so tödlich sind wie Tuberkulose, gab es in den letzten Jahren einen signifikanten Anstieg von Lungeninfektionen und Folgeerkrankungen, die durch nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) verursacht werden2. Auf Gewebeebene ist die Immunantwort des Wirts auf eine pulmonale Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektion gut untersucht und umfasst die Bildung von Granulomen, heterogenen Aggregaten von Lymphozyten, dendritischen Zellen, Makrophagen und Neutrophilen3. Während granulomatöse Entzündungen auch ein grundlegendes Merkmal der Immunität des Wirts gegen NTM-Infektionen sind, sind die Immunzellpopulationen und die räumlichen Eigenschaften dieser Reaktion noch wenig untersucht. Ein detailliertes Verständnis der Gewebekomponenten der Immunpathologie im Vergleich zur Wundheilung ist entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen (z. B. wirtsgerichtete Therapien) und präventiven (z. B. Impfstoffe) therapeutischen Strategien.

In dieser Studie hatte unser Team Zugang zu seltenen, archivierten klinischen Proben, die während Lungenresektionen oder Autopsien von Patienten mit Mtb- oder NTM-Infektionen gewonnen wurden. Die Mehrzahl dieser Proben war über 10 Jahre alt und als formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Proben konserviert, so dass ihre Verwendung auf histologische Assays beschränkt war. Um die Markereinschränkungen der traditionellen Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF) zu überwinden, haben wir die Iterative Bleaching Extends Multi-pleXity (IBEX) Methode verwendet, ein Open-Source-Bildgebungsverfahren mit hohem Multiplexpotenzial 4,5. Die Ausweitung der IBEX-Methode auf humane Lungen-FFPE-Proben erforderte eine signifikante Optimierung aufgrund des hohen endogenen Fluoreszenzgehalts, ein gut beschriebenes Hindernis für die Multiplex-Antikörper-basierte Bildgebung6.

In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Reduzierung der Autofluoreszenz unter Verwendung einer für Lungen-FFPE-Gewebeschnitte optimierten Photobestrahlungsmethodezur Verfügung 7,8. Wichtig ist, dass das hier beschriebene Verfahren einen kostengünstigen, weit verbreiteten Leuchtkasten verwendet, der auf andere Probenvorbereitungen mit hoher Autofluoreszenz erweitert werden kann. Neben der Reduzierung der Autofluoreszenz vor der Bildaufnahme bieten wir Anleitungen zum Design von Antikörper-Panels, wie z. B. die Paarung von Markern mit geringer Abundanz mit hellen Fluorophormarkierungen, die Bewertung des Einflusses der Photobestrahlung auf die Antikörpermarkierung und die Amplifikation mit Sekundärantikörpern in Kanälen mit hoher endogener Fluoreszenz. Im Durchschnitt haben wir fünf Objektträger bearbeitet, die einem Gewebeschnitt entsprechen, jeder von 37 bis 114 mm2. Schließlich zeigen wir, wie man mit einem Weitfeldinstrument Bilder von ganzen Objektträgern aufnehmen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Einführung von IBEX in archivierte klinische Proben beschreibt und zusätzlich eine Anleitung zur Behebung von Problemen bietet, die häufig bei der Bildgebung stark autofluoreszierender Proben auftreten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Archivierte Autopsie- und chirurgische Resektions-Lungengewebeschnitte wurden gemäß Protokoll 09-H-0172 (NCT00943514), Natural History of Bronchiectasis, im Labor für Pathologie des National Institutes of Health Clinical Center gesammelt. Dieses Protokoll wurde vom IRB genehmigt, und die Teilnehmer gaben eine Einverständniserklärung.

1. Automatisierte Antigengewinnung

HINWEIS: Die Entparaffinisierung und Antigengewinnung wurden unter Verwendung einer automatisierten Forschungsfärbeplattform durchgeführt (Abbildung 1). Frühere Arbeiten zeigten, dass ein dualer Antigen-Retrieval-Ansatz, bestehend aus 30 Minuten mit einer Citrat-basierten pH-6-Epitop-Retrieval-Lösung (ER1) und dann 30 min mit einer EDTA-basierten pH-9-Epitop-Retrieval-Lösung (ER2), die besten Immunmarkierungsergebnisse für FFPE-Gewebe lieferte9. Vergleichbare Ergebnisse können durch manuelles Entparaffinieren und duales Antigen-Retrieval unter Verwendung anderer beschriebener Methoden und Unterstützung durch die IBEX Imaging Community erzielt werden10,11.

  1. Sammeln Sie Objektträger und automatisiertes Antigen-Entnahmezubehör (Objektträgerabdeckungen, Forschungsnachweissystem, Citrat-basierte pH-6-Epitop-Entnahmelösung (ER1), EDTA-basierte pH-9-Epitop-Entnahmelösung (ER2) usw.).
  2. Schalten Sie das Gerät ein, lassen Sie es 20 Minuten lang initialisieren, setzen Sie den Forschungsdetektionsarm in das Gerät ein und setzen Sie Reagenzienbehälter in den Boden des Geräts ein.
  3. Öffnen Sie die Software, klicken Sie auf Folie einrichten , wählen Sie Studie hinzufügen aus, und erstellen Sie einen neuen Namen für die Studie.
  4. Wählen Sie Folie hinzufügen aus, und beschriften Sie die Folien wie gewünscht.
  5. Um diesem Protokoll zu folgen, führen Sie ein Bake- und Entwachsungsprotokoll mit einem HIER-Protokoll durch, das aus 30 min ER1 und 30 min ER2 besteht.
  6. Drucken Sie Etiketten und platzieren Sie sie auf den Folien. Entfernen Sie das schwarze Objektträgergestell vom Instrument und legen Sie die gewünschten Objektträger auf das Gerät. Platzieren Sie durchsichtige Objektträgerabdeckungen auf jedem Objektträger, setzen Sie das Objektträgergestell wieder in das Gerät ein und drücken Sie die Taste unter dem Objektträger, um das Gerät aufzufordern, das Barcode-Scannen der Objektträger durchzuführen.
  7. Wählen Sie Wiedergabe | OK und lassen Sie die automatische Antigen-Entnahme mit einer Dauer von ca. 3 h beginnen.

2. Antikörpermarkierung vor der Photobestrahlung

  1. Nachdem die Antigen-Entnahme abgeschlossen ist, tauchen Sie die Objektträger in PBS.
    HINWEIS: Bestimmte Epitope sind empfindlich gegenüber Photostrahlung und werden nach nächtlicher Einwirkung der LED abgebaut. Empfindliche Epitope müssen empirisch bestimmt werden, und wenn sie entdeckt werden, sollte die Immunmarkierung dieser Epitope in diesem Schritt erfolgen. Stellen Sie sicher, dass der Objektträger nach der Antigenentnahme jederzeit feucht bleibt.
  2. Entfernen Sie einen Objektträger aus PBS und trocknen Sie überschüssiges PBS auf dem Objektträger mit einem fusselfreien Tuch ab. Achten Sie darauf, das Taschentuch nicht zu berühren. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Rand um das Gewebe. Wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Objektträger. Lassen Sie die hydrophobe Barriere 10 min trocknen.
  3. Bereiten Sie eine Slide Moisture Chamber vor, indem Sie eine kleine Menge Wasser in den Boden jeder Vertiefung geben. Legen Sie die Objektträger in die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers. Leiten Sie PBS aus dem Gewebe ab, ohne die Gewebeprobe direkt zu berühren.
  4. Geben Sie 200 μl Blockierungspuffer (Materialtabelle) zu jedem Objektträger. Stellen Sie die Objektträger-Feuchtigkeitskammer in eine wissenschaftliche Mikrowelle ohne Erwärmung mit einem Mechanismus zur Aufrechterhaltung einer konstanten Temperatur.
  5. Blockieren Sie die unspezifische Antikörpermarkierung durch Ausführen des folgenden Programms, das zuvor festgelegtwurde 4: 2-1-2-1-2-1-2-1-2-Programm, wobei "2" für 2 min bei 100 W und "1" für 1 min bei 0 W steht. Führen Sie das obige Programm einmal aus, um es zu blockieren. Wenn dieses Instrument nicht zur Verfügung steht, blockieren Sie die Gewebeschnitte (5-10 μm) für 1 h bei 37 °C, wie zuvor beschrieben5.
  6. Erstellen Sie die primäre Antikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1) (Materialtabelle) während der Inkubation des Blockpuffers. Bereiten Sie Antikörpermischungen gemäß der Materialtabelle vor. Mischen Sie den Antikörpercocktail vorsichtig und schleudern Sie den Antikörpermix mit einer Minizentrifuge bei 2.680 × g für 30 s herunter.
    HINWEIS: Diese Färbelösung enthält eine Verdünnung von 1:5000 Hoechst, die für die Dauer des Zwei-Zyklus-Versuchs ausreichend sein sollte. Es kann sein, dass Anwender Hoechst und andere Antikörper titrieren müssen, um optimale Ergebnisse für ihr Gewebe und ihre Bildgebungskonfiguration zu erhalten.
  7. Nehmen Sie die Slide Moisture Chamber aus der Mikrowelle, wenn der Zyklus abgeschlossen ist, und leiten Sie die blockierende Pufferlösung von jedem Gewebe ab. Geben Sie 200 μl Primärantikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1) (Materialtabelle) zu jedem Objektträger. Stellen Sie die Kammer mit den Objektträgern zurück in die Mikrowelle und führen Sie das Primärantikörperprogramm ca. 30 Minuten lang aus: Führen Sie das Programm 2-1-2-1-2-1-2-1-2 zweimal für die Markierung des Primärantikörpers aus.
    HINWEIS: Hier sind 200 μl Primärantikörperlösung eine Schätzung. Verwenden Sie eine ausreichende Menge der Lösung, um die gesamte Oberfläche des Gewebeschnitts zu bedecken.
  8. Sobald der Schritt der primären Antikörpermarkierung abgeschlossen ist, waschen Sie jeden Objektträger mit 1.000 μl PBS, indem Sie den Objektträger vertikal kippen, PBS auf das Gewebe pipettieren und das PBS ablaufen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3-5x.
  9. Überschüssiges PBS ableiten und die Objektträger mit 1% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur in der Feuchtigkeitskammer fixieren.
    HINWEIS: Die PFA-Fixierung kann Epitope maskieren und verhindern, dass Antikörper an ihre beabsichtigten Ziele binden. Bei der erstmaligen Etablierung eines Antikörper-Panels empfehlen wir, die Auswirkungen einer schonenden Fixierung (1% PFA für 10 min) zu bewerten, indem das Markierungsmuster von Gewebeschnitten, die mit oder ohne Fixiermittel behandelt wurden, vor der Immunmarkierung verglichen wird. Wenn ein Antikörper empfindlich auf eine 1%ige PFA-Fixierung reagiert, bewegen Sie diesen Antikörper vor dem Schritt nach der Fixierung.
  10. Waschen Sie die Objektträger ausgiebig mit 1.000 μl PBS 3-5x. Lassen Sie PBS bis zum Schritt der Photobestrahlung auf dem Gewebe.

3. Photobestrahlung des Gewebes

  1. Besorgen Sie sich zur Vorbereitung der Photobestrahlungsbox (Abbildung 2) eine 150-W-LED-Lampe, eine 40-W-RGBW-Flut-LED-Lampe, einen großen Kunststoffbehälter (20 Gallonen [75,71 L] Volumen oder mehr), frische 1x PBS und eine Petrischale.
  2. Stellen Sie die Petrischale in die Mitte der 150 W Lampe und füllen Sie sie mit 1x PBS. Verwenden Sie genügend Lautstärke, um die Folien in PBS einzutauchen. Führen Sie den Photobestrahlungsprozess im Kühlraum durch, um die Wärmeentwicklung durch Lampen zu minimieren.
  3. Nehmen Sie die Objektträger aus der Objektträger-Feuchtigkeitskammer und legen Sie sie in eine Petrischale, wobei Sie darauf achten, dass alle Objektträger in PBS getaucht sind.
  4. Platzieren Sie die 40-W-Lampe direkt auf der Petrischale, wobei die Lichtquelle zu den Objektträgern zeigt. Stellen Sie sicher, dass die 40-W-Lampe vor dem Aufstellen auf rote Lichteinstellung eingestellt ist.
  5. Schalten Sie sowohl die 150-W- als auch die 40-W-Lampe ein. Decken Sie die Photobestrahlung mit dem Deckel des Kunststoffbehälters ab. Halten Sie die 40-W-Lampe 2 Stunden lang auf der roten Lichteinstellung und schalten Sie dann für die restlichen 16 Stunden über die mitgelieferte Fernbedienung auf die grüne Lichteinstellung um.
    HINWEIS: Es ist zwingend erforderlich, eine Photobestrahlung bei ca. 4 °C durchzuführen, um einen unerwünschten Wärmeverzug des Objektträgergewebes zu verhindern. Pausenpunkt: Die Photobestrahlung kann über Nacht durchgeführt werden und das Protokoll kann am nächsten Morgen fortgesetzt werden.

4. Antikörpermarkierung nach Photobestrahlung

  1. Nehmen Sie die Objektträger aus der Petrischale und tauchen Sie sie in 1x PBS in ein Coplin-Glas, ein konisches 50-ml-Röhrchen oder einen Eimer aus dem Objektträger-Färbesystem. Bereiten Sie die primäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 1) (Materialtabelle) in den empfohlenen Verdünnungen vor (Tabelle 1). Verwenden Sie 200 μl der Lösung für jeden Objektträger.
  2. Entfernen Sie überschüssiges PBS von jedem einzelnen Objektträger mit einem fusselfreien Tuch und achten Sie darauf, den Bereich um das Gewebe herum zu trocknen, ohne das Gewebe selbst zu berühren. Legen Sie die Objektträger in die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers.
  3. Die primäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 1) vorsichtig vortexen und 200 μl zu jedem Objektträger hinzufügen, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe bedeckt ist.
  4. Stellen Sie die Objektträger-Feuchtigkeitskammer mit den Objektträgern zurück in die Mikrowelle und führen Sie das Primärantikörperprogramm ca. 30 Minuten lang durch, wie in Schritt 2.7 beschrieben.
  5. Während der Markierung des Primärantikörpers stellen Sie die Lösung für die Sekundärantikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1) her (Materialtabelle).
  6. Sobald das Mikrowellenprogramm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Objektträger-Feuchtigkeitskammer und waschen Sie jeden Objektträger 3-5x mit 1.000 μl 1x PBS.
  7. Entfernen Sie überschüssiges PBS von jedem einzelnen Objektträger mit einem fusselfreien Tuch, wirbeln Sie die sekundäre Antikörper-Färbelösung vor und fügen Sie jedem Objektträger 200 μl hinzu.
  8. Stellen Sie die Objektträger-Feuchtigkeitskammer in die Mikrowelle und führen Sie das Sekundärantikörperprogramm aus: Ein 2-1-2-1-2-1-2-1-2-Programm, wobei "2" für 2 min bei 100 W und "1" für 1 min bei 0 W steht. Führen Sie das obige Programm einmal für die Sekundärantikörpermarkierung aus.
  9. Waschen Sie die Objektträger ausgiebig 3-5x mit 1 mL 1x PBS und leiten Sie überschüssiges PBS von jedem Objektträger ab.
  10. Geben Sie die primäre Antikörper-Färbelösung #3 (Zyklus 1) mit direkt konjugierten Antikörpern zu jedem Objektträger. Die Antikörperfärbung wird in der Mikrowelle oder alternativ (1 h bei 37 °C) durchgeführt, wie in Schritt 2.7 beschrieben.
  11. Waschen Sie die Objektträger erneut 3-5x mit 1 mL 1x PBS und saugen Sie überschüssiges PBS vorsichtig von jedem Objektträger ab.
  12. Geben Sie 30 μl Eindeckmedium direkt auf jeden Gewebeschnitt und legen Sie ein Deckglas über den gesamten Gewebeschnitt. Untersuchen Sie die Rutsche auf Luftblasen und drücken Sie die Luftblasen mit leichtem Druck an den Rand der Rutsche. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Objektträger.
  13. Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium mit einem fusselfreien Tuch und verwenden Sie einen optischen Linsenreiniger, um alle Rückstände auf der Oberfläche des Deckglases zu entfernen. Lassen Sie alle Objektträger 10-15 Minuten bei Raumtemperatur aushärten, bevor Sie die Bildaufnahme mit einem Mikroskop durchführen.

5. Mikroskopie-Setup und Bildaufnahme

  1. Schalten Sie das Weitfeldmikroskop und die LED8-Lichtquelle ein. Starten Sie die Software. Wählen Sie das Objektiv aus (hier ein 20x/0,8 trockenes Objektiv). Versetzen Sie die Kamera auf der Registerkarte "Konfiguration" in den 16-Bit-Modus. Wählen Sie die erforderlichen Kanäle basierend auf den in den Antikörper-Panels vorhandenen Fluorophoren aus (siehe Tabelle 1 für weitere Anleitungen).
    HINWEIS: Die folgenden Schritte sind für das referenzierte Mikroskop angegeben. Es könnte ein gleichwertiges Weitfeldmikroskop mit einer vergleichbaren Lichtquelle und Filterwürfeln zur Anregung und Emission mehrerer Fluorophore und einem Präzisionstisch verwendet werden.
  2. Reinigen Sie das Deckglas unmittelbar vor der Aufnahme mit Linsenreiniger und Linsenpapier. Überprüfen Sie das Deckglas visuell und entfernen Sie Staub oder Flusen von der Oberfläche, bevor Sie es fotografieren. Positionieren Sie den Objektträger fest in der oberen linken Ecke (oder einem gleichwertigen Winkel) des Tischeinsatzes, sodass das Gewebe gleichmäßig in der XY-Ebene positioniert wird (entscheidend für die Ausrichtung zyklischer Bilder).
  3. Richten Sie die Akquisitionseinstellungen ein, indem Sie einen Kanal erstellen, der jedem Fluorophor entspricht, das im Antikörperpanel enthalten ist. Wählen Sie für jedes Fluorophor den entsprechenden Filterwürfel und die entsprechende LED aus. Passen Sie die Intensität jeder LED und die Belichtungszeiten für jeden Kanal an. In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der hier verwendeten Bildeinstellungen.
  4. Wählen Sie vor der Bildaufnahme den Hoechst-Kanal aus und aktivieren Sie die Option "Verknüpfte Schattierung". Verwenden Sie den Assistenten für verknüpfte Schattierungen, um dies für das ausgewählte Ziel festzulegen.
    HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt, wie ganze Objektträgerbilder durch die Erfassung großer Kachelscans erstellt werden. Verknüpfte Schattierung oder Schattierungskorrektur ist erforderlich, um ungleichmäßige Beleuchtung in gekachelten Bildern zu überwinden.
  5. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Live , um den Hoechst-Kanal zu visualisieren. Verwenden Sie den groben Fokusknopf, um den Gewebeausschnitt scharf zu stellen.
  6. Wählen Sie jeden Fluoreszenzkanal aus und beurteilen Sie den Gewebeschnitt für das erwartete Färbemuster für alle fluoreszenzmarkierten Antikörper im Zyklus.
  7. Wählen Sie in der Software Navigator aus. Mit der Hoechst-Kanal- und Spiralfunktion im Navigator können Sie den gesamten Gewebeschnitt oder die Region of Interest abbilden, die abgebildet werden soll. Wenn mehrere Gewebeschnitte pro Objektträger abgebildet werden, wiederholen Sie diesen Schritt, um mit dem Navigator eine Karte des Gewebes zu erstellen.
  8. Identifizieren Sie die ROIs, die abgebildet werden sollen, mit dem Polygon, dem Zauberstab oder anderen ROI-Auswahlwerkzeugen im Navigator. Zeichnen Sie den Gewebeumriss sorgfältig, um die wenigsten Kacheln zu erfassen, die benötigt werden, um die gewünschten ROI(s) abzudecken. Löschen Sie zusätzliche Kacheln, um die Gesamterfassungszeit zu verkürzen.
  9. Sobald ROIs erstellt sind, überprüfen und passen Sie die Kanaleinstellungen an, um gesättigte Pixel zu minimieren und das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren. Wählen Sie die Heatmap-Lookup-Tabelle im Bildanzeigefenster aus. Die Farben geben den Füllgrad von Pixeln an, wobei Rot-, Orange-, Gelb- und Weißtöne auf leichter erkennbare Intensitätsschwankungen hinweisen. Blaue Pixel zeigen gesättigte Pixel an. Um Informationsverluste und Beeinträchtigungen der Bildqualität zu vermeiden, reduzieren Sie die Belichtungszeit, um die Anzahl der gesättigten (blauen) Pixel zu minimieren.
  10. Verwenden Sie im Navigator das Werkzeug Fokuskarte , um eine topografische Karte des Gewebes zu erstellen. Setzen Sie alle 3-4 FOVs einen Fokus-Map-Punkt für große Kacheln oder unebene Proben.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Scans großer Kacheln, die für die Abbildung des gesamten Objektträgers erforderlich sind. Im Allgemeinen skaliert die Bildqualität mit der Anzahl der ausgewählten Fokus-Map-Punkte. Dieser Vorgang kann jedoch recht zeitaufwändig sein, insbesondere bei großen Kachelscans.
    1. Erstellen Sie Fokus-Map-Punkte in der Reihenfolge, in der sie vom Mikroskop gescannt werden. Um die Scanreihenfolge der Kacheln des referenzierten Mikroskops anzupassen, wählen Sie Fokus-Map-Punkte entlang eines Serpentinenpfads aus, der dem vom Mikroskop verwendeten Pfad entspricht.
    2. Legen Sie den ersten Fokus-Map-Punkt mit manuellem Fokus fest. Verwenden Sie den Autofokus für die verbleibenden Fokus-Map-Punkte. Setzen Sie sich hin und beobachten Sie, um sicherzustellen, dass für jeden Fokus-Map-Punkt der optimale Fokus ausgewählt ist. Passen Sie die Fokus-Map-Punkte nach Bedarf manuell an. Vergrößern Sie die Reichweite, die zum Auffinden der einzelnen Fokus-Map-Punkte für unebene und/oder große Gewebe verwendet wird.
  11. Richten Sie die Verarbeitung mit den folgenden Parametern ein: Small Volume Computational Clearing (SVCC) mit einem Brechungsindex (RI), der auf das Einbettmedium abgestimmt ist (hier 1.4); Die Stärke ist auf 98 % und die Merkmalsgröße auf 2.000 nm für Membranmarker oder 3.000 nm für nukleare Marker festgelegt. Führen Sie während der Bildaufnahme das Computational Clearing-Protokoll aus.
  12. Starten Sie den Kachelscan. Notieren Sie sich die Kachelnummer und halten Sie die ROIs über alle Zyklen hinweg konstant.
  13. Führen Sie nach der Bildaufnahme die rechnerisch gelöschten Bilder mit der Option Mosaik-Zusammenführung zusammen, die sich auf der Registerkarte Prozess befindet, wobei die Option Glätten ausgewählt ist. Überprüfen Sie jedes Bild visuell auf Stitching-Fehler, und wiederholen Sie die Mosaik-Zusammenführung mit neuen Parametern, wenn Kachelfehler vorhanden sind.
    HINWEIS: Schlecht ausgerichtete Bilder verhindern die Registrierung iterativ erfasster Bilder.
  14. Verwenden Sie bei Bedarf das Modul Farbstoffseparation , um den spektralen Spillover zwischen den Kanälen zu kompensieren, wie zuvor beschrieben5.

6. Zyklen der Farbstoffinaktivierung, der Antikörpermarkierung und der Bildaufnahme

  1. Tauchen Sie die Objektträger nach Abschluss der Bildaufnahme in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit sterilem 1x PBS, bis die Deckgläser abfallen. Wenn das Deckglas nicht abfällt, führen Sie das PBS direkt über den Objektträger oder verwenden Sie eine Pinzette, um das Deckglas vorsichtig zu entfernen.
  2. Bereiten Sie Lithiumborhydrid (LiBH4)-Lösung vor, indem Sie 3-5 mg Pulver in eine Plastikwaage abmessen. Geben Sie diH2O im Verhältnis 1:1 direkt zum Pulver (z. B. 3,2 mg LiBH4 und 3,2 mL diH2O) und homogenisieren Sie die Lösung mit einer Pipette. Verwenden Sie eine Spritze, um die Lösung durch einen 0,2-μm-Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen zu leiten, und notieren Sie die Konzentration und den genauen Zeitpunkt, zu dem die Lösung hergestellt wurde. Lassen Sie die Lösung 3-5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bis große Blasen in der Lösung zu sehen sind.
    HINWEIS: Wir empfehlen, die Farbstoffinaktivierungslösung innerhalb von 4 Stunden nach der Zubereitung zu verwenden. ACHTUNG: Führen Sie die folgenden Schritte in einem chemischen Abzug durch und verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA). Bei dieser Reaktion kann Wasserstoffgas entstehen, das leicht entzündlich ist. Es ist wichtig, immer mit kleinen Mengen LiBH4 (<10 mg) zu arbeiten. Weitere Anleitungen finden Sie in den Tutorial-Videos zur sicheren Vorbereitung von LiBH4 in der IBEX Knowledge-Base10,11.
    Ersetzen Sie die DurchstechflascheLiBH 4 nach 4-wöchiger Anwendung, da die Bleichwirkung nach wiederholter Einwirkung von Luft vermindert ist. Wir empfehlen, kleine Aliquots von LiBH4 (1 Gramm) zu kaufen.
  3. Nehmen Sie jeden Objektträger aus dem 1x PBS-Bad, leiten Sie überschüssiges PBS mit einem fusselfreien Tuch ab und legen Sie es in die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers.
  4. Behandeln Sie jeden nicht abgedeckten Objektträger 30 Minuten lang mit LiBH4 , indem Sie die Lösung direkt auf den Objektträger pipettieren und genügend Volumen haben, um das Gewebe zu bedecken. Entfernen Sie die alte LiBH4-Lösung von jedem Objektträger und aktualisieren Sie sie mit einem neuen Aliquot von LiBH4 nach 10 min und 20 min aus derselben LiBH4-Stammlösung .
  5. Waschen Sie die Objektträger ausgiebig 3-5x mit 1x PBS. Verwenden Sie einen schnellen Austausch von PBS und weichen Sie die Objektträger 1 Minute pro Waschgang ein.
  6. Um ein Bild für die Hintergrundsubtraktion zu erhalten, legen Sie ein neues Deckglas auf jeden Objektträger, wie in den Schritten 4.12-4.13 beschrieben, und nehmen Sie Bilder der Inaktivierung des Gewebes nach dem Färben auf. Erstellen Sie ein neues Projekt für das Subtraktionsbild im Hintergrund und wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.14, um das Bild zu erhalten. Bild mit der gleichen Anzahl von Kacheln, Kanälen, Kanaleinstellungen und FOVs, die für das Bild von Zyklus 1 festgelegt wurden. Behalten Sie die Fokus-Map-Punkte im gleichen Sichtfeld bei, verwenden Sie jedoch den Autofokus, um jeden Fokus-Map-Punkt für dieses neue Bild anzupassen.
    HINWEIS: Verwenden Sie den Kanal, der die Markierung für wiederholte Passermarken (Hoechst) enthält, um einzigartige Strukturen (Kernformen) zu identifizieren, die im Live-Bild (z. B. Subtraktionsbild im Hintergrund) und im vorherigen Bild (Zyklus 1) vorhanden sind.
  7. Um unspezifische Fluoreszenzsignale von biotinylierten Antikörpern im zweiten Antikörperzyklus zu minimieren, führen Sie eine Avidin- und Biotin-Blockierung durch.
    1. Überschüssiges PBS ableiten und Avidin Blockierungslösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf jeden Objektträger auftragen.
    2. Waschen Sie die Objektträger 3-5x mit 1x PBS und leiten Sie überschüssiges PBS ab, wenn die Wäschen abgeschlossen sind.
    3. Tragen Sie Biotin-Blockierungslösung auf jeden Objektträger bei Raumtemperatur für 15 min auf und waschen Sie die Objektträger 3-5x mit 1x PBS wie in Schritt 6.7.2.
  8. Bereiten Sie einen neuen BSA-freien Blockierungspuffer (Zyklus 2) vor (Materialtabelle) für
    Primäre Antikörper-Färbelösung #4 (Zyklus 2) und sekundäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 2).
    HINWEIS: Für diese Lösungen ist kein Rinderserumalbumin erforderlich, da BSA den Avidin/Biotin-Blockierungsschritt beeinträchtigen kann.
  9. Verdünnen Sie die Primärantikörper in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen in der Primärantikörper-Färbelösung #4 (Zyklus 2). Wirbeln Sie diese Lösung vorsichtig durch und fügen Sie sie jedem Objektträger in der Feuchtigkeitskammer hinzu, wobei Sie sicherstellen, dass das Gewebe vollständig mit der primären Antikörperlösung bedeckt ist. Stellen Sie die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers mit den Objektträgern in die Mikrowelle und führen Sie das Primärantikörperprogramm etwa 30 Minuten lang durch, wie in Schritt 2.7-2.8 beschrieben.
  10. Führen Sie die Markierung von Sekundärantikörpern mit der Sekundärantikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 2) durch, wie in den Schritten 4.6-4.9 beschrieben. Sobald die Färbung abgeschlossen ist, legen Sie ein neues Deckglas auf jeden Objektträger, wie zuvor in den Schritten 4.12-4.13 beschrieben. Legen Sie den Objektträger wieder auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie den Objektträger so, dass er sich in der gleichen XY-Ebene wie bei den vorherigen Bildern befindet.
    HINWEIS: Verwenden Sie den Kanal, der die wiederholte Passermarkenmarkierung (Hoechst) enthält, um einzigartige Strukturen (Kernformen) zu identifizieren, die im Live-Bild (z. B. Zyklus 2) und im vorherigen Bild (Zyklus 1) vorhanden sind.
  11. Erstellen Sie ein neues Projekt für das Bild von Zyklus 2 und wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis 5.14, um das Bild von Zyklus 2 zu erhalten. Bild mit der gleichen Anzahl von Kacheln, Kanälen, Kanaleinstellungen und FOVs, die für das Bild von Zyklus 1 festgelegt wurden. Behalten Sie die Fokus-Map-Punkte im gleichen Sichtfeld bei, verwenden Sie jedoch den Autofokus, um jeden Fokus-Map-Punkt für dieses neue Bild anzupassen. Sobald das Bild von Zyklus 2 aufgenommen wurde, fahren Sie mit der Bildausrichtung fort oder wiederholen Sie die Schritte in Abschnitt 6 für weitere Zyklen mit direkt konjugierten Antikörpern. HINWEIS: Verwenden Sie den Kanal, der die wiederholte Passermarkenmarkierung (Hoechst) enthält, um einzigartige Strukturen (Kernformen) zu identifizieren, die im "Live"-Bild (z. B. Bild von Zyklus 2) und im vorherigen Bild (Zyklus 1) vorhanden sind. Zusätzliche Zyklen erfordern direkt konjugierte Antikörper, da IBEX keine Antikörper entfernt.

7. Bildausrichtung

  1. Konvertieren Sie Rohbilder aus dem Mikroskop, geben Sie .lif-Dateien aus, in .ims-Dateien mit dem kostenlosen Dateikonverter und Bildverarbeitung mit der Open-Source-Software, wie zuvorbeschrieben 5 und in den Videos auf der IBEX Knowledge-Base10,11 ausführlich beschrieben.
  2. Bearbeiten Sie die Datei für jeden Imaging-Zyklus und wenden Sie die gewünschten Verarbeitungsschritte an (z. B. Kanalbenennung, Kanal-Pseudofärbung).
    1. Führen Sie Hintergrundsubtraktion und Kanalschwellenwerte mit den für SimpleITK erstellten Kanalarithmetikfunktionen durch, um das Autofluoreszenzsignal (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html) zu verringern.
      HINWEIS: Wir führen diese Schritte für jedes Bild (z. B. Zyklus 1, Zyklus 2) aus, bevor wir sie zu einem zusammengesetzten Bild ausrichten. Dies liegt daran, dass es einfacher ist, an den kleineren, einzelnen Bildern zu arbeiten als an den größeren kombinierten Bildern.
  3. Entwickeln Sie eine konsistente Benennungsstrategie für die Verwendung der Registrierungssoftware. Benennen Sie Kanäle mit einem Präfix-Trennzeichen-Postfix (z. B. 'Cycle1 CD8_AF647') mit einem Leerzeichen als Trennzeichen, um den Kanal zu bezeichnen, in dem der Anti-CD8-Antikörper AF647 im ersten Zyklus verwendet wurde.
    HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der Dateiendung der Hilfe: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. Nachdem alle Kanäle entsprechend benannt wurden, starten Sie die Registrierungssoftware, klicken Sie auf Imaris Extensions | SimpleITK | Affin.
  5. Laden Sie die IMS-Datei für jeden Zyklus hoch, indem Sie auf die Schaltfläche "Durchsuchen" neben "Dateinamen" klicken. Geben Sie das Trennzeichen für das Präfix des Kanalnamens ein. Wenn Sie dem obigen Beispiel folgen, geben Sie ein einzelnes Leerzeichen ein und klicken Sie dann auf Weiter.
  6. Wählen Sie den Registrierungskanal aus, der als gemeinsamer Passermarkenmarker zwischen den Zyklen verwendet wird (z. B. Hoechst).
  7. Wählen Sie das feste Bild aus, das Bild, für das andere Bilder registriert werden.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, sich für Zyklus 2 iterativer Bilder zu registrieren.
  8. Wählen Sie das gewünschte Verzeichnis für die 'Ausgabedatei' aus. Die Option Registrierung bei Auflösung starten ist standardmäßig auf maximale Auflösung eingestellt, um die bestmögliche Registrierung zu ermöglichen. Wenn die Rechenleistung begrenzt ist, reduzieren Sie diesen Parameter.
    HINWEIS: Für die hier beschriebenen Daten (12-15 GB pro Bild) haben wir eine maximale Auflösung von 5 verwendet.
  9. Klicken Sie auf Registrieren , um zu beginnen. Sobald die Registrierung abgeschlossen ist, warten Sie, bis die Schaltfläche Neu berechnen und kombiniertes Bild speichern angezeigt wird, klicken Sie darauf und warten Sie, bis der Fortschrittsbalken abgeschlossen ist.
  10. Öffnen Sie die fertige Ausgabedatei in der Verarbeitungssoftware. Das registrierte Bild mit allen Zyklen und Kanalinformationen steht zur Analyse oder Veröffentlichung bereit.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Entwicklung eines Multiplex-Antikörper-basierten Bildgebungspanels erfordert viel Zeit, Aufwand und Ressourcen12. Diese Herausforderungen sind besonders ausgeprägt bei der Entwicklung eines Panels für archivierte FFPE-Proben aus stark autofluoreszierenden Geweben, wie hier beschrieben (Abbildung 1). Um diese Herausforderungen zu meistern, identifizierten wir zunächst die hellsten Fluorophore, die mit unserem Farbstoffinaktivierungsprotokoll kompatibel sind (

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die klinische Lungenpathologie der Lungentuberkulose ist durch eine nekrotisierende granulomatöse Entzündung gekennzeichnet. Die NTM-Lungenpathologie tritt hauptsächlich in zwei unterschiedlichen Patientenpopulationen mit zwei getrennten pathologischen Mustern auf: isolierte Lungenschädigung, die durch granulomatöse Entzündung mit bronchiolärer Obliteration und Kariesbildung bei immunkompetenten Personen gekennzeichnet ist, oder diffuse knotige Erkrankung, die die Lunge und andere Organe...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

A.J.R. ist Mitarbeiter bei Leica Microsystems, Inc. Die anderen Autoren erklären, dass keine widerstreitenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Intramural Research Program von DIR/NIAID, NCI und NHLBI unterstützt. Abbildung 1 wurde unter Verwendung von BioRender im Rahmen einer institutionellen Lizenzvereinbarung mit dem NIH erstellt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,3 % Triton-X-100Sigma-AldrichNr. T8787Lösung zum Blockieren des Puffers
1% BSASigma-AldrichNr. A4503Lösung zum Blockieren des Puffers
1% menschlicher BD Fc BlockBD Biowissenschaften564220Fc-Block zum Blockieren des Puffers erforderlich
150 W LED-LampeAmazonasB07VH3CVSFLED-Lichtquelle für die Gewebe-Photobestrahlung
1x PBS Gibco10010-023Lösung zum Blockieren von Puffer- und Waschschritten
20 Gallonen VorratsbehälterAmazonasB001B1C4G0Behälter für den Photobestrahlungsprozess
40 W RGBW Flut LED-Lampe AmazonasB08QFPJSMDRGB-Lichtquelle für die Photobestrahlung von Gewebe
Ag85BAbcam (Englisch)AB43019/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Alpha-glatte Muskulatur Aktin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Avidin/Biotin BlockierungskitAbcam (Englisch)Artikel-Nr.: ab64212Avidin- und Biotin-Blockierungslösung
BD Cytofix/CytopermBD Biowissenschaften554714Lösung zur Fixierung
BOND EntwachsungslösungLeica BiosystemsNC0221076Lösung zur Entparaffinierung
BOND Epitop-Rückhollösung 1Leica BiosystemsNC0235529Citratbasierte pH 6 Epitop-Rückgewinnungslösung (ER1)
BOND Epitop-Rückhollösung 2Leica BiosystemsNC0235530EDTA-basierte pH-9-Epitop-Rückgewinnungslösung (ER2)
BOND Research DetektionssystemLeica BiosystemsNC0396648Automatisiertes Forschungsfärbereagenz
BOND RX Forschung FärberLeica BiosystemsNAAutomatisierte Färbeplattform für die Forschung
BOND WaschlösungLeica BiosystemsNC0221077Puffer waschen
CD15BD Biowissenschaften347420/AB_400298Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD4 Alexa Fluor 488Forschung & Forschung D-SystemeFAB8165G/AB_2728839Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAAntikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificNr. A32814/AB_2762838Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Maus IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel-Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488Jackson Immunforschung715-545-020/AB_2340844Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificNr. A32794/AB_2762834Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
EasyDip FärbesystemAngebot für Neueinsteiger5300KITFärbesystem für Objektträger
Fluormount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02Einhängemedien
HoechstBiotium40046Kernfärbung für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Imaris Dateikonverter x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumenteKostenloser Dateikonverter
ImarisViewer Software x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumenteKostenlose Bildbearbeitungssoftware
ImmEdge-StiftVector LaboratorienH-4000Hydrophober Barrierestift
Lithium-Borhydrid (1 Gramm)STREM Chemikalien93-0397Chemikalie zur Farbstoffinaktivierung, kaufen Sie kleine Aliquots dieser Chemikalie (1 Gramm)
Lumican BiotinForschung & Forschung D-SystemeBAF2846Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Micro Cover BrilleVWR48393-241Glas-Diaabdeckungen
Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
PELCO BioWave Pro MikrowellensystemTed Pella Inc36500-230Wissenschaftliche Mikrowelle ohne Erwärmung
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Vollautomatische Temperaturregelung für wissenschaftliche Mikrowellen
SimpleITKOpen-Source-SoftwareRegistrierungs- und Kanalverarbeitungssoftware
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificNr. S11227Markierungsreagenz für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.
Weitfeld-MikroskopLeica MikrosystemeNALeica Microsystems THUNDER Imager mit LED8-Lichtquelle und LAS X Software (3.7.1.21655). Für die Fluoreszenzbildgebung wurde ein spezieller Quad-Band-Filter mit externem Filterrad (PN: 11536075) mit zwei zusätzlichen Einzelbandfiltern (PN: 8118215) verwendet, um sieben Farbkanäle pro Durchgang abzubilden. Die Filteranregungs-, dichroitischen und Emissionslinien sind (1) Quad-Band-Würfel: dichroitisch bei 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, keine Anregungs- oder Emissionsfilter; (2) Außenfilterrad Position 1: 434/32, Position 2: 520/40, Position 3: 585/20, Position 4: 720/60, Position 5: Durchlauf; (3) Einzelband 1– 585/22 Anregung, 594 dichroitisch, 625/30 Emission; (4) Single-Band 2– 635/20 Anregung, 647 dichroitische, 667/30 Emission.
Zeiss Reiniger für optische GläserAmazonasB00GPVQVCOReiniger für Objektive für Mikroskope
Antikörper
Ag85BAbcam (Englisch)AB43019Polyklonales Kaninchen IgG, Zyklus 1
Alpha-glatte Muskulatur Aktin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, Zyklus 1
CD4 Alexa Fluor 488Forschung & Forschung D-SystemeFAB8165GPolyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegende372906C8/144B, Zyklus 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, Zyklus 1
Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificNr. A32814Polyklonaler Esel, Zyklus 1
Esel Anti-Maus IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificNr. A32787Polyklonaler Esel, Zyklus 1
Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificNr. A32794Polyklonaler Esel, Zyklus 1
HoechstBiotium40046Nukleares Etikett, Zyklus 1
CD15BD Biowissenschaften347420MMA, Zyklus 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, Zyklus 2
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, Zyklus 2
Esel-Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488Jackson Immunforschung715-545-020Polyklonaler Esel, Zyklus 2
Lumican BiotinForschung & Forschung D-SystemeBAF2846Polyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 2
Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, Zyklus 2
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificNr. S11227N/A, Zyklus 2
HoechstBiotium40046Zyklus 2
Lösungen
Blocking Buffer (Zyklus 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichNr. T87870,3 Vol.-%
BSASigma-AldrichNr. A45031 Vol.-%
Mensch BD Fc BlockBD Biowissenschaften5642201 Vol.-%
1x PBS Gibco10010-02397,7 Vol.-%
Primär-Antikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegende3729061:10
Primäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
CD4  Nr. AF488Forschung & Forschung D-SystemeFAB8165G1:10
Ag85BAbcam (Englisch)AB43019/NA1:100
Sekundäre Antikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
Esel Anti-Ziege AF Plus 488Thermo Fisher ScientificNr. A32814/AB_27628381:100
Esel Anti-Kaninchen AF Plus 555Thermo Fisher ScientificNr. A32794/AB_27628341:100
Esel Anti-Maus AF Plus 647Thermo Fisher ScientificNr. A32787/AB_27628301:50
Primäre Antikörper-Färbelösung #3 (Zyklus 1)
Blockieren des Puffers (Zyklus 1)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)
Triton-X-100Sigma-AldrichNr. T87870,3 Vol.-%
Mensch BD Fc BlockBD Biowissenschaften5642201 Vol.-%
1x PBS Gibco10010-02398,7 Vol.-%
Primäre Antikörper-Färbelösung #4 (Zyklus 2)
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
CD15BD Biowissenschaften3474201:30
Lumican BiotinForschung & Forschung D-SystemeBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
Sekundäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 2)
BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)Siehe obenNach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen
Esel-Anti-Maus IgM AF488Jackson Immunforschung715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificNr. S112271:200

Referenzen

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
  3. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
  4. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  5. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  6. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
  7. Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
  8. Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
  9. Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
  10. Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  11. Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
  12. Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
  13. Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
  14. Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
  15. Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
  16. Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
  17. Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
  18. Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
  19. Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
  20. Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
  21. Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
  22. Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
  23. Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
  24. Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Multiplex-Imagingautofluoreszierende Probenräumliche ProteomikFFPE-LungengewebePhotobestrahlungsprotokollAntikörper-Panel-DesignWhole-Slide-Imaginggranulomatöse EntzündungImmunzell-Mapping
Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.