Ein Elektroporationszytometrie-Protokoll für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen unter Verwendung von U2 OS-Zellkulturen

Zusammenfassung

Unter Elektroporation versteht man die Verwendung von gepulsten elektrischen Feldern (PEFs), um transiente Poren in Zellkulturen zu erzeugen und molekulare Fracht einzubringen. Diese Technik ist in letzter Zeit in der Forschung und im klinischen Umfeld weit verbreitet. Hier beschreiben wir Elektroporationstechniken unter Verwendung des kürzlich entwickelten "Electroporation Cytometry System" für die Durchführung von Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen.

Zusammenfassung

Gepulste elektrische Felder (PEFs) haben ein breites Anwendungsspektrum in der medizinischen Forschung und in klinischen Anwendungen. Ein Schwerpunkt der Forschung liegt auf der Elektroporation (reversibel oder irreversibel). Die reversible Elektroporation wird seit mehreren Jahrzehnten für die Übertragung von Molekülen durch Zellmembranen wie Plasmid-DNA verwendet, die typischerweise als Gen-Elektrotransfer (GET) bezeichnet wird. Umgekehrt hat sich die irreversible Elektroporation zu einer beliebten Technik in der Krebsbehandlung entwickelt, da sie eine ungiftige Alternative darstellt, indem Zellen mit PEFs dauerhaft aufgebrochen werden. Dies kann mit verschiedenen Arten von Medikamenten oder Reagenzien kombiniert werden, um die Wirkung zu verstärken, die als Elektrochemotherapie (EKT) bekannt geworden ist. Trotz des breiten Erfolgs in der Praxis ist jedoch weitere Unterstützung von Technologie und Forschung erforderlich, um die derzeitigen Techniken zu verbessern. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Elektroporationszytometrie-System entwickelt, das PEF-Experimente mit lebenden Zellen unterstützt und die Möglichkeit bietet, Langzeit-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Dies geschah in Kombination mit einer stabil exprimierenden FUCCI(CA)5 U2-OS-Zelllinie zur Beurteilung von Veränderungen im Zellzyklus als Reaktion auf PEF-Exposition. Dabei wurde eine Zeitraffermikroskopie von bis zu 30 h erreicht, die Echtzeit-Veränderungen der Zellaktivität auf Basis des FUCCI(CA)5-Reporters liefert. Als Ergebnis konnten phasenspezifische Änderungen für die nachgelagerte Analyse quantifiziert werden.

Einleitung

Gepulste elektrische Felder (PEFs) haben sich zu einem gängigen Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungen in der Biologie und klinischen Anwendung entwickelt¹. Diese lassen sich grob in Elektroporation (EP) und Elektrostimulation (ES) einteilen. Die Elektroporation besteht aus zwei Teilbereichen, die als reversible und irreversible Elektroporation bekannt sind. Die reversible Elektroporation (RE) wird seit Jahrzehnten als wirksames Werkzeug zur Übertragung molekularer Fracht wie Plasmid-DNA in Zellen verschiedener Typen wie Säugetiere, Bakterien und Hefen eingesetzt². In jüngster Zeit hat die irreversible Elektroporation (IRE) als ungiftige Alternative zu den derzeitigen Krebsbehandlungen an Bedeutung gewonnen³. Ein aufstrebendes Teilgebiet wird als Pulsed Field Ablation (PFA) bezeichnet, das sich auf die nicht-thermische Gewebeentfernung konzentriert, insbesondere zur Behandlung bestimmter Herzfunktionsstörungen⁴. In Kombination mit Medikamenten und anderen Reagenzien hat dies zur Entwicklung der Elektrochemotherapie (EKT) geführt. Das derzeitige Verständnis von PEF-Behandlungen wird jedoch von klinischen Anwendungen überholt⁵. Hier stellen wir ein Elektroporationszytometrie-System zur Untersuchung von Elektrochemotherapien vor. Der Zellzyklus stellt einen Schlüsselindikator für die Lebensfähigkeit der Zellen dar, und Veränderungen können phasenspezifische Effekte identifizieren. Durch die Entwicklung dieser Instrumente können Protokolle schneller angepasst werden, was zu effektiveren Behandlungen für ein breiteres Spektrum von Krebsarten führt.

Unser kundenspezifisches Elektrozytometriesystem (Abbildung 1) besteht aus einer Kammer mit parallelen Aluminiumplattenelektroden und einem Deckglasboden sowie einem einfachen Exponentialzerfallspulsgenerator. Die Kammer besteht aus einer 3D-gedruckten Kammer und ein Deckglasboden #1,5 ist mit medizinischem Haftklebstoff befestigt. Die Elektroden bestehen aus einer selbstklebenden Aluminiumfolie, die über in die Kammer eingebaute Stützen gelegt wird und zwei parallele Elektroden im Abstand von 0,4 cm bietet. Dies ist eine gängige Konfiguration für kommerzielle Elektroden und bietet ein robustes Design, das aktuelle Protokolle schnell anpassen kann. Die Kammer passt in Umgebungsgehäuse, die für Objektträger im Format 25 mm x 55 mm ausgelegt sind, was auch ein gängiges Objektträgerformat ist, das von kommerziellen Mikroskopanbietern unterstützt wird. Der Impulsgenerator liefert exponentielle Zerfallspulse von bis zu 330 V, wodurch eine breite Palette von Experimenten durchgeführt werden kann, einschließlich reversibler und irreversibler Elektroporation.

Um die Auswirkungen von PEFs auf den Zellzyklus zu untersuchen, verwendeten wir eine transgene humane Osteosarkom-Zelllinie (U2 OS), die den Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (CA)5 (FUCCI(CA)5), ein fluoreszierendes Reporterkonstrukt für den lebenden Zellzyklus, exprimiert. Das System führt zwei fluoreszierende, verkürzte Formen von Geminin und Cdt1 ein, die während des Zellzyklus zu bestimmten Raten produziert und recycelt werden. Zusätzlich kann die Apoptose während des Experiments mit Hilfe einer stabil exprimierenden FUCCI(CA)5-Linie von U2-OS-Zellen gezielt überwacht werden. Während des Zellzyklus arbeitet der Reporter mit jeder Phase vorhersagbar, da diese mit der gleichen Geschwindigkeit produziert und abgebaut werden wie die funktionellen Versionen, die natürlich in der Zelle exprimiert werden. Wenn Apoptose auftritt, wird dieser Zyklus unterbrochen, wobei sich der Zellzyklus schnell abschaltet. Typischerweise manifestiert sich dies visuell als Fluoreszenzveraltung innerhalb des Zellzyklus, gefolgt von dramatischen morphologischen Veränderungen des Zellkerns, die aufgrund der Lokalisation der Reporter im Zellkern deutlich sichtbar sind⁶. Dies ermöglicht die visuelle Identifizierung jeder Phase in einzelnen Zellen im Zeitverlauf (Abbildung 2). Reversible Elektroporation bewirkt Veränderungen der intrazellulären Bedingungen und es wurde ein 180 V exponentieller Zerfallsimpuls für die Untersuchung ausgewählt. Dieser Impuls wurde so gewählt, dass er den Zelltod so weit wie möglich begrenzt und gleichzeitig die Elektroporation in der Mehrheit der Bevölkerung sicherstellt. Dies wurde auf der Grundlage früherer Forschungen ermittelt, die optimale Elektroporationspulsparameter für sechs Säugetierzelllinien untersuchten. Die Energiedichte eines 180-V-Impulses war etwas niedriger als die optimalen Transfektionsparameter, was zu einer besseren Zellviabilität bei hoher Poration^{führte 7}. Die Wirkung des Pulses wurde an unsynchronisierten Zellen und S-Phasen-synchronisierten Zellen unter Verwendung eines Thymidin-Doppelblocks mit und ohne PEF-Applikation untersucht (Abbildung 3). Die Ergebnisse zeigten eine Abnahme der durchschnittlichen Länge von S und G2 im Vergleich zur Kontrolle. Dies deutet darauf hin, dass die S-Phase empfindlich auf PEF-Exposition reagiert, was zu einem schnelleren Zellzyklus führt. Dabei konnte gezeigt werden, dass das Elektroporationszytometrie-System in der Lage ist, die Verabreichung von PEFs mit der Langzeitbildgebung lebender Zellen zur Untersuchung des Zellzyklus zu kombinieren. Während wir diese Plattform verwendet haben, um die Zellprogression durch den Zellzyklus als Reaktion auf PEFs zu beobachten, ist dies ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung einer Vielzahl von Anwendungen und Bedingungen für PEFs und Zellkulturen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellkultur

1. Bereiten Sie die stabile Linie durch reversible Elektroporation mit den folgenden Parametern vor: 100 μl resuspendierte U2-OS-Zellen (6 × 10⁶ Zellen/ml) mit 5 μg Plasmid-DNA in einer 0,4-cm-Küvette und einem 180-V-Rechteckimpuls für 10 ms.
2. Drucken Sie das kundenspezifische Kammerdesign mit einem geeigneten 3D-Drucker und biokompatiblem Kunststoff wie Polymilchsäure (PLA) in D-Druck (siehe Ergänzende Datei 1). Desinfizieren Sie die fertige Kammer mit Ethanol (70%) und lagern Sie sie vor der Verwendung in einem sterilen Behälter.
3. U2-OS FUCCI(CA)5-Zellen in einer 10-cm-Platte mit 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)-High Glucose mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % PenStrep kultivieren und bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
4. Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreicht, aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellkultur mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und dissoziieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25 % Trypsin für 1,5 Minuten.
5. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie die Zellkultur in 5 ml DMEM-High Glucose (enthält 10% FBS und 1% PenStrep) resuspendieren.
6. Entnehmen Sie aus der resuspendierten Zellkultur eine 100-μl-Probe und legen Sie sie in die Kammer des Elektroporationszytometrie-Systems auf dem unteren Glasdeckglas. Stellen Sie sicher, dass die Kammer nach dem Einbringen der Probe zu 30 % konfluent ist. Wenn die Probe vor der Inkubation überkonfluent zu sein scheint, aspirieren Sie die Probe und verringern Sie das Probenvolumen.
7. Geben Sie langsam 4 ml DMEM-High Glucose (mit 10 % FBS und 1 % PenStrep) in das hintere Ende der Kammer und verhindern Sie, dass die Flüssigkeit die Probe ausspült.
8. Legen Sie einen Standard-Objektträger auf die Kammer und inkubieren Sie die Kammer 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ , wobei Sie sicherstellen müssen, dass die Kultur vollständig am Kammerboden haftet. Optional können Sie Hoechst 33342 (1 μg/ml) zur Färbung von Zellkernen verwenden, um die nachgelagerte Zellquantifizierung sowie die Apoptose zu erleichtern. Führen Sie die Färbung 30 Minuten vor der Zeitraffermikroskopie durch.

2. Vorbereitung des Mikroskops

1. Schalten Sie zunächst ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit Umgebungskontrollen und Kammer ein, damit sich die Bedingungen vor der Elektroporation stabilisieren können.
   HINWEIS: Jedes inverse Fluoreszenzmikroskop mit einem Umgebungssystem, das den Objektträger 25 mm x 55 mm x 16 mm aufnehmen kann. Das Design wurde ursprünglich für die Arbeit mit dem referenzierten inversen Mikroskop (siehe Materialtabelle) und dem entsprechenden Umgebungssystem entwickelt.
   Die Erwärmung des Tisches kann aufgrund der Metallausdehnung zu einer Drift im Bild führen.
2. Während das Umgebungssystem die optimale Temperatur erreicht, schließen Sie ein Digitalmultimeter mit geeigneten elektrischen Kabeln an den Impulsgeneratorkondensator und den Hochspannungsschalter an. Um dieses Protokoll zu befolgen, verwenden Sie "Krokodil"-Clip-Kabel, um eine schnelle Montage und Demontage mit der Elektroporationskammer zu ermöglichen.
3. Wählen Sie anschließend die 20-fache Vergrößerung und stellen Sie mithilfe der Mikroskopsoftware sicher, dass die Kanäle FITC (GFP) und A594 (TexRed/mCherry) (optional DAPI-Kanal für Hoechst 33342) ausgewählt sind, die den beiden fluoreszierenden Proteinen im FUCCI(CA)5-System entsprechen. Verwenden Sie niedrige Belichtungseinstellungen (in der Regel <0,05 s), um Lichtschäden bei Langzeit-Zeitraffern zu vermeiden.
4. Optimieren Sie den Bildfokus und die Bildqualität, indem Sie vor Beginn des Zeitraffers Testbilder aufnehmen.
   HINWEIS: Die Fluoreszenz sollte nur so hell sein, wie es für die Farbvisualisierung erforderlich ist.
5. Programmieren Sie den Zeitraffer so, dass er 24 Stunden lang alle 10 Minuten 3 - 6 Blickwinkel aufnimmt, um eine große Menge an Zellzyklusdaten pro Zeitraffer zu erhalten und gleichzeitig Fotoschäden zu minimieren.
   HINWEIS: Die Dauer kann je nach Zeitskala der zellulären Aktivität variieren.
6. Stellen Sie sicher, dass der Autofokus für den A594-Kanal aktiviert ist, um die besten Ergebnisse bei der Verfolgung der Zellkultur während des Zeitraffers zu erzielen.
7. Lassen Sie die Software im Standby-Modus, bis die Elektroporation durchgeführt wird. Sobald der Impuls abgegeben wird, aktivieren Sie sofort den Zeitraffer, um die höchstmögliche Datengenauigkeit zu gewährleisten.

3. Elektroporation

1. Platzieren Sie die Elektroporationszytometriekammer in das Mikroskop mit einer geeigneten Klimakammer. Lassen Sie die Kammer vor der Elektroporation bei laufendem Umgebungssystem geschlossen, um sicherzustellen, dass der Zellzyklus nicht beeinträchtigt wird.
2. Befestigen Sie ein Digitalmultimeter an den Impulsgenerator und verbinden Sie den Impulsgenerator mit Hilfe von Krokodilklemmenkabeln mit den Kammerelektroden, indem Sie die Klimakammer öffnen.
3. Laden Sie den Kondensator im Impulsgenerator auf 180 V auf und entladen Sie den Impuls schnell in die Kammer, bis das Digitalmultimeter 0 Volt anzeigt.
4. Entfernen Sie die elektrischen Anschlüsse an der Kammer und setzen Sie den Deckel so schnell wie möglich wieder auf, um die richtigen Anbaubedingungen zu gewährleisten.
5. Aktivieren Sie den Zeitraffer sofort, sobald das Mikroskop-Umgebungssystem an Ort und Stelle ist.

4. Datenerfassung im Zeitraffer

1. Nachdem der Zeitraffer abgeschlossen ist, verwenden Sie die Mikroskopsoftware, um den Zeitraffer als einzelnes Video zu speichern, das auf den Bildern basiert, die über die Länge des Zeitraffers aufgenommen wurden. Verbessern Sie die visuelle Qualität in dieser Phase, um die manuelle Quantifizierung zu unterstützen.
   HINWEIS: Jede Bildrate kann ausgewählt werden. 6 Bilder/s bieten jedoch eine moderate Wiedergabegeschwindigkeit von 1 Videosekunde, was zu 1 h Echtzeit führt.
2. Sobald das Zeitraffervideo erstellt ist, verfolgen Sie die Zellphasen im Laufe der Zeit, indem Sie die Veränderungen der FITC- und A594-Signale beobachten

Ergebnisse

Unter Verwendung des FUCCI-Systems (Abbildung 2) wurden visuelle Zellzyklusdaten erhalten, indem die Zeitspanne gemessen wurde, in der jede Farbe von der Zelle als Ergebnis der Proteinexpression und Unbiquitination exprimiert wurde. Basierend auf den Ergebnissen aus den unsynchronisierten und synchronisierten Experimenten (Abbildung 3) war offensichtlich, dass die S-Phasen-PEF-Exposition den Zellzyklus hochregulierte. Dies wurde durch die Abnahme der durchschnit...

Diskussion

Bei korrekter Durchführung können die Daten der Zellzyklusphase für große Volumina einzelner Zellen über einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden quantifiziert werden. Dieses Protokoll lieferte vergleichbare Zellzyklusdaten wie alternative Methoden wie FACs. Dies ist eine häufig verwendete Methode, bei der Zellen im Laufe des Zellzyklus fluoreszenzmarkiert werden. Nach einer Inkubation von mindestens 24 Stunden werden sie nach Fluoreszenzintensität sortiert, die mit der Menge der Population ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kammerschlitten (3D-gedruckt/montiert)	N/A	N/A
Kulturplatte (10 cm)	Sarstedt	83.3902
Delta Vision	Olympus	N/A	Alternative Mikroskopmodelle können ebenfalls verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Bühne und das Umgebungssystem den Elektroporationskammerschlitten (55 mm x & nbsp;
DMEM –	Gibco	11965092
fötales Rinderserum mit hohem Glukosegehalt	ThermoFisher	A5256701
i3 MK3S 3D Drucker	Prusa N	/A	Es können alternative Druckermodelle verwendet werden, die STL-Dateien verwenden können.
Pen	Strep ThermoFisher	15070063
phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	10010031
tFUCCI(CA)5	Addgene	153521
Trypsin	Sigma-Aldrich	9002-07-07
U2-OS Zelllinie	ATCC	HTB-96