Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

Sanjna Rana; Antonio Torlentino; Pavana Suresh; W. Todd Miller; Erwin London

doi:10.3791/68008

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Methodenartikel

Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

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DOI:

10.3791/68008

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21. März 2025

Sanjna Rana^*¹ , Antonio Torlentino^*¹ , Pavana Suresh² , W. Todd Miller¹ , Erwin London³

¹Department of Physiology and Biophysics, Stony Brook University, ²Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, ³Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Verwendung von Cyclodextrin, um den Austausch zwischen Lipiden der Plasmamembran und exogenen Lipiden zu vermitteln. Diese Technik kann mit Experimenten kombiniert werden, in denen Transmembranproteine untersucht werden, die sich in Lipid-Raft-ähnlichen Umgebungen anders verhalten als in nicht-Raft-ähnlichen Umgebungen.

Zusammenfassung

Lipid Rafts sind dynamische, geordnete Domänen in der Plasmamembran, die häufig während der Clusterbildung und Signalübertragung von Membranproteinen gebildet werden. Die Lipididentität des äußeren Segels treibt die Neigung der Membran zur Bildung von Lipidflößen an. Die flüchtige Natur von Lipid Rafts macht es schwierig, sie in lebenden Zellen zu untersuchen. Methoden, die Raft-bildende Lipide an der äußeren Falte lebender Zellen hinzufügen oder entfernen, erleichtern daher die Untersuchung der Eigenschaften von Rafts, wie z. B. ihrer Auswirkungen auf Membranproteine. Bei Lipidaustauschexperimenten, die in unserem Labor entwickelt wurden, werden lipidbeladene Cyclodextrine verwendet, um exogene Phospholipide zu entfernen und hinzuzufügen, um die Lipidkonstitution der Plasmamembran zu verändern. Die Substitution der Membran durch ein Raft- oder nicht-Raft-bildendes Lipid kann helfen, die Auswirkungen auf die Transmembranproteinaktivität zu untersuchen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zum Lipidaustausch auf dem äußeren Segel der Plasmamembran unter Verwendung von lipidbeladenem Cyclodextrin. Wir demonstrieren die Aufbereitung des Austauschmediums und die anschließende Behandlung von anhaftenden Säugetierzellen. Außerdem zeigen wir, wie Sie die Effizienz des Austauschs mit HP-TLC messen können. Dieses Protokoll führt zu einem nahezu vollständigen Ersatz des äußeren Segels durch exogene Lipide, ohne die zelluläre Lebensfähigkeit zu verändern, was weitere Experimente an modifizierten intakten Plasmamembranen ermöglicht.

Einleitung

Die Plasmamembran besteht aus einer Lipiddoppelschicht, die mit verschiedenen Membranproteinen angereichert ist, darunter Transmembranrezeptoren und Ionenkanäle. Lipiddomänen innerhalb der Membran wurden durch detergenslösliche und unlösliche Bereiche aufgeklärt, die in Fraktionierungsexperimenten mit detergensresistenten Membranen (DRM) identifiziert wurden¹. Die unlöslichen Fraktionen zeichneten sich dadurch aus, dass sie mit Cholesterin, dicht gepackten Sphingomyelinen und gesättigten Phospholipiden angereichert waren und höhere Schmelzpunkte aufwiesen, im Gegensatz zu den löslichen Fraktionen, die überwiege....