Extraktion mykobakterieller DNA mittels Bead-Beating in kundenspezifischem Puffer, gefolgt von NGS-Workflow

Summary

Dieses Protokoll zeigt, dass das Bead-Beating in Kombination mit der DNA-Capture-Bead-Reinigung eine schnelle und konsistente Methode zur Extraktion von DNA aus Mycobacterium tuberculosis-Proben bietet, was es zu einer effektiven Wahl für Next-Generation-Sequencing-Anwendungen macht.

Abstract

Tuberkulose ist eine tödliche Krankheit, und das Auftreten von Antibiotikaresistenzen beim Erreger Bakterium Mycobacterium tuberculosis verschlechtert die Behandlungsergebnisse. Eine präzise und schnelle Identifizierung von Arzneimittelresistenzen durch Sequenzierungstechnologien ist erforderlich, um die Ergebnisse von Tuberkulosepatienten durch maßgeschneiderte Therapieschemata zu verbessern. Die DNA-Extraktionsmethode ist für nachgelagerte molekulare Assays von entscheidender Bedeutung und wird durch die zähe Zellwand von Mycobacterium, die geringe Bazillärlast vieler klinischer Proben und die Komplexität der Sputummatrix erschwert. Es gibt zahlreiche DNA-Extraktionsmethoden für M. tuberculosis , aber es gibt derzeit keinen Goldstandard. Darüber hinaus haben sich nur wenige dieser Methoden als konsistent erwiesen, und viele sind nicht für Umgebungen mit geringen Ressourcen und hoher Belastung durch Tuberkulose geeignet. Daher nehmen Laboratorien häufig ihre eigenen Verfahrensmodifikationen vor, was zu einer erheblichen Variabilität der Methoden führt. Hier stellen wir ein kostengünstiges, schnelles und standardisiertes Protokoll für die Extraktion mykobakterieller DNA sowohl aus klinischem Sputum als auch aus Kultur vor, das DNA produziert, die für die qPCR geeignet ist und für den Einsatz in klinischen Diagnostiklabors in Betracht gezogen werden sollte.

Introduction

Die Extraktion hochwertiger DNA aus M. tuberculosis ist für den Nachweis von arzneimittelresistenter Tuberkulose (TB) mittels gezielter Next-Generation-Sequencing (NGS) und Ganzgenomsequenzierung (WGS) notwendig, wird aber oft übersehen. Wir haben ein standardisiertes Protokoll entwickelt, um konsistente, qualitativ hochwertige DNA für klinische NGS-Anwendungen bereitzustellen, einschließlich gezielter NGS-Ansätze wie Deeplex-MycTB (GenoScreen) und Ganzgenomsequenzierung, die jetzt von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für die Diagnose von arzneimittelresistenter Tuberkulose empfohlen werden. Bemerkenswert ist, dass die WHO zwar diese NGS-basierten Diagnosestrategien empfiehlt, aber nicht die spezifischen DNA-Extraktionsprotokolle spezifiziert, die sie unterstützen. Unsere Methode kann sowohl mit von der WHO unterstützten Tests als auch mit neuen Technologien verwendet werden, die eine hochwertige mykobakterielle DNA erfordern.

Die Herausforderung bei der Extraktion ergibt sich aus der einzigartigen Zellwand von M. tuberculosis, die aus Mykolsäuren und Lipiden besteht, die es außergewöhnlich schwierig machen, sie aufzubrechen. Die derzeit veröffentlichten Extraktionslösungen weisen erhebliche Unterschiede bei der Lyse (z. B. Beschallung, chemische, Hitze- und Bead-Beating) und DNA-Extraktionsmethoden (z. B. Phenol-Chloroform-Extraktion, Ethanolfällung, CTAB-basierte und säulen- und beadbasierte Methoden) auf, was zu Unterschieden in der DNA-Ausbeute, Reinheit und Qualität führt 1,2,3,4,5,6,7,8 ^,9,10,11,12,13,14,15,16. Hinzu kommt, dass Forschungsgruppen selten die gleiche DNA-Extraktionsmethode anwenden und den Erfolg oft unterschiedlich messen. Dies macht es schwierig, zu bestimmen, welche Methode am besten funktioniert, da der optimale Ansatz von der Art der molekularen Anwendung abhängt. Zum Beispiel erfordert die Auflösung von M. tuberculosis-Strukturvarianten im Sputum mittels Long-Read-Sequenzierung eine qualitativ hochwertigere DNA und eine genauere Polymerase als die Verwendung eines kostenpflichtigen Diagnoseinstruments, das nur auf eine kleine Region von rpoB abzielt. Mehrere Faktoren erschweren den Erfolg der DNA-Extraktion zusätzlich. Die Menge an DNA, die wir extrahieren können, hängt von der Art der Probe ab, wie viele Bakterien vorhanden sind und ob es Substanzen (co-extrahierte nicht-mykobakterielle DNA und PCR-Inhibitoren) gibt, die den Prozess stören. Auch technische Aspekte wie die Präzision der Pipetten eines Labortechnikers können die Ergebnisse beeinflussen. Die derzeitigen Methoden greifen bei der Verarbeitung von Proben mit geringer bakterieller Belastung oder hohem Gehalt an kontaminierender DNA, wie sie in klinischen Umgebungen häufig anzutreffen sind, oft unzureichend 17,18,19.

Das Raupenschlagen in einem benutzerdefinierten Puffer, gefolgt von einem Protokoll zur Reinigung der Raupe, bietet entscheidende Vorteile gegenüber anderen Methoden. Es handelt sich um einen einfachen und schnellen Arbeitsablauf, der die Möglichkeit einer bedienerabhängigen Variation reduziert und die DNA-Integrität für nachgelagerte NGS-Anwendungen beibehält. Dieser standardisierte Ansatz eignet sich besonders für klinische Labore, die zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse mit den von der WHO empfohlenen NGS-Arzneimittelresistenztests und allen WGS-Anwendungen suchen.

Protocol

Diese Studie wurde an der University of California San Francisco (UCSF) mit Genehmigung des Institutional Biosafety Committee (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) durchgeführt und folgt den Forschungsethikrichtlinien der UCSF. Wir erhielten Sputumreste, die von Discovery Life Sciences im Rahmen eines vom IRB genehmigten Waiver of Consent-Protokolls von Personen mit Atemwegserkrankungen ohne TB entnommen wurden.

1. Vorbereitung der Puffer

1. Benutzerdefinierter Triton-Puffer (Tabelle 1): Um 100 ml benutzerdefinierten Triton-Puffer herzustellen, beginnen Sie mit der Kombination von 2 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 m Tris-HCl (pH 8), 1 ml Triton X-100 und 0,2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Fügen Sie Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 mL zu bringen. Filter vor Gebrauch sterilisieren. Der letzte Puffer enthält 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 1 % Triton X-100.
2. Niedriger EDTA-TE-Gehalt (Tabelle 2): Zur Herstellung von 100 ml Puffer mit niedrigem EDTA-Gehalt kombinieren Sie 1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8) und 0,02 ml 0,5 M EDTA. Fügen Sie Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 mL zu bringen. Der letzte Puffer enthält 10 mM Tris-HCl und 0,1 mM EDTA.

2. Vorbereitung der Lyseröhrchen

1. Schneiden Sie mit einer Skalpellklinge vorsichtig den Boden eines 1,5-ml-Schraubverschlussröhrchens direkt unterhalb des Wendepunkts ab.
2. Schneide die Spitze von einer P1000-Spitze ab, schneide einen V-förmigen Keil am Ende ab und klemme den vorbereiteten Boden des Schraubverschlussrohrs darin ein. In Abbildung 1 finden Sie ein Diagramm des Scoops.
3. Füllen Sie einen sterilen Behälter (z. B. ein Reservoir oder eine Petrischale) mit 0,1 mm Zirkonoxid-Silikat-Kügelchen und verteilen Sie mit dem vorbereiteten Löffel einen Löffel voller Kügelchen (~200 mg) in 1,5-ml-Schraubverschlussröhrchen.

Abbildung 1: Interne Raupenverteilung. Die Schaufel wurde für den einfachen Transfer von ~200 mg 0,1 mm Zirkoniumkügelchen in Verarbeitungsröhrchen entwickelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Vorbereitung der Eingabe

HINWEIS: Die gesamte Probenvorbereitung sollte gemäß den Biosicherheitsprotokollen Ihrer Einrichtung durchgeführt werden. Wir empfehlen dringend, infektiöse Materialien in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) zu handhaben, um das Risiko einer Aerosolexposition zu minimieren.

1. Bakterielle Zellkultur
   1. Zentrifugieren Sie ~ 5 mL M. tuberculosis-Kultur (entweder MGIT oder trübe Flüssigkultur) in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei maximaler Geschwindigkeit (≥ 3.000 x g) für 10 Minuten.
   2. Entfernen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig alle bis auf ~ 500 μl des Überstands, ohne das Pellet zu beschädigen. Entfernen Sie den restlichen Überstand mit einer P1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören.
   3. Resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl speziellem Triton-Puffer, indem Sie es auf und ab pipettieren. Falls erforderlich (d. h. um Proben für die Verarbeitung außerhalb einer BSL-3 zu entnehmen), inaktivieren Sie die Probe gemäß den Standardarbeitsanweisungen.
2. Vorbereitung des Auswurfs
   1. 1-5 ml Sputumprobe (spontan oder induziert) in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
3. DVB-T-Verflüssigung
   1. Geben Sie vier Volumina mit 100 mM Dithiothreitol in die Sputumprobe (Volumen kann variieren). Wenn Sie ein handelsübliches Reagenz verwenden, befolgen Sie die Verdünnungsanweisungen des Herstellers.
   2. 30 s lang gründlich vortexen. Bei Raumtemperatur (20-25 °C) 7 Min. inkubieren. Erneut für 30 s wirbeln.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1. und 3.3.2. 1x, für sehr viskose Proben, führen Sie bis zu 5 Inkubations-Wirbelzyklen durch.
   4. Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (≥ 3.000 x g) für 10 min. Entsorgen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig alle bis auf ~ 500 μl des Überstands. Entfernen Sie den restlichen Überstand mit einer P1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören.
   5. Resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl speziellem Triton-Puffer.
4. NALC-NaOH-Verflüssigung
   1. Befolgen Sie zur Herstellung der NALC-NaOH-Lösung die Anweisungen des Herstellers zur Vorbereitung und Verdünnung.
   2. Geben Sie vier Volumina NALC-NaOH-Lösung in die Sputumprobe (spontan oder induziert, das Volumen kann variieren).
   3. 30 s lang wirbeln. Bei Raumtemperatur (20-25 °C) 7 Min. inkubieren. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 und 3.4.2. 1x. Bei sehr viskosen Proben können bis zu 5 Inkubations-Vortex-Zyklen durchgeführt werden.
   4. Geben Sie PBS bis zur 50-ml-Markierung. Zum Mischen kurz vorziehen. Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (≥ 3.000 x g) für 10 min.
   5. Entsorgen Sie mit einer serologischen 50-ml-Pipette vorsichtig alle bis auf ~ 500 μl des Überstands. Entfernen Sie den restlichen Überstand mit einer P1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören.
   6. Resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl speziellem Triton-Puffer. Falls erforderlich (d. h. um Proben für die Verarbeitung außerhalb einer BSL-3 zu entnehmen), inaktivieren Sie die Probe gemäß den Standardarbeitsanweisungen.

4. Extraktion von DNA

1. Übertragen Sie die inaktivierte Bakteriensuspension (350 μl aus Schritt 3) in ein neues, gut markiertes 1,5-ml-Schraubverschlussröhrchen mit ~250 μl 0,1 mm Zirkonoxid-Silikat-Kügelchen.
2. Die Wulst schlug das Lysat bei 6,5 m/s für 45 s mit 2 min Pause zwischen den Läufen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt drei Bead-Beat-Zyklen.
3. Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei maximaler Drehzahl (≥ 12.000 x g) und überführen Sie 150 μl des Überstands in ein neues, gut markiertes Röhrchen. Achten Sie darauf, keine Kügelchen oder Zellreste zu übertragen.
4. Lassen Sie die Reinigungsmagnetbeads 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen und wirbeln Sie sie gründlich auf, um eine vollständige Resuspension vor der Verwendung zu gewährleisten.
5. Fügen Sie 180 μl (1,2-faches Volumen) der magnetischen Reinigungskügelchen hinzu und mischen Sie, indem Sie 10x auf und ab pipettieren. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Auf ein Magnetgestell legen und ~ 2 Minuten warten, bis die Lösung klar ist. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P200-Pipette, ohne die Magnetkügelchen zu stören.
7. Während sich das Röhrchen noch auf dem Magnetgestell befindet, fügen Sie 500 μl frisch zubereitetes Ethanol mit 70 % (v/v) hinzu und geben Sie es entlang der gegenüberliegenden Röhrchenwand auf die Magnetkügelchen. Warten Sie 30 s.
8. Wiederholen Sie die Schritte 4.5. - 4.7. für insgesamt zwei Wäschen. Entfernen Sie am Ende des letzten Waschgangs Ethanolreste mit einer P10-Pipette. Die Kügelchen ~ 2 min kurz trocknen lassen.
9. Unmittelbar nachdem das Bead-Pellet undurchsichtig geworden ist, nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie es erneut in 20 μl Low EDTA Tris Buffer. Lassen Sie die Kügelchen nicht trocken und rissig werden.
10. Mischen Sie durch Pipettieren oder Vortexen, um sicherzustellen, dass alle Kügelchen in Lösung sind. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
11. Auf ein Magnetgestell legen und ~ 2 Minuten warten, bis die Lösung klar wird. Übertragen Sie die eluierte DNA in ein neues, gut markiertes Röhrchen für die nachgelagerte Analyse. Aspirieren Sie <20 μl extrahierte DNA, um eine Verschleppung durch magnetische Beads zu vermeiden.

5. qPCR-Zählung von mykobakterieller DNA

1. Zur Quantifizierung der mykobakteriellen DNA mittels einer quantitativen PCR, die auf 99 Nukleotide des mykobakteriellen atpE (Rv1305) abzielt, wird ein 10-μl-Reaktionsgemisch pro Probe auf Eis zusammengestellt, das 5 μl Universalsonden-Mastermix (2x), je 0,4 μl Forward-Primer (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) und Reverse-Primer (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL TaqMan-Sonde (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μl DNA-Template und 2 μl nukleasefreies Wasser (Tabelle 3).
2. Die Reaktion wird unter den folgenden Bedingungen des Temperaturwechsels durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 60 s, gefolgt von 35 Zyklen von 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s (mit einer Erfassung hier mit einer Rampenrate von 2,11 °C/s; Tabelle 4).
   HINWEIS: In diesem Fall wurde die qPCR unter Verwendung eines TaqMan-Assays mit VIC-markierter Sonde auf einem QuantStudio 3 Real-Time PCR-System durchgeführt.
3. Führen Sie alle Stichproben, Standards und Kontrollen in technischen Tripplikaten aus. Erstellung von Standardkurven unter Verwendung serieller Verdünnungen von gereinigter M. tuberculosis-DNA . Führen Sie eine relative Quantifizierungsanalyse mit Hilfe einer Analysesoftware durch.
4. Exportieren Sie die resultierenden relativen Quantifizierungswerte in das CSV-Format und visualisieren Sie sie mit R Studio (Version 2024.09.1+394), um Boxplots zu erstellen, in denen DNA-Ausbeuten über verschiedene Extraktionsmethoden hinweg verglichen werden.

Results

Wir testeten das DNA-Extraktionsprotokoll sowohl an kultivierten M. tuberculosis - als auch an M . tuberculosis-Sdot-Sputumproben (n = 3 für jede Bedingung). Unter Verwendung von kultiviertem M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 standardisierten wir den Input auf 8,4 x 10⁶ Zellen pro 50 μL, was 1 mL einer MGIT-Kultur bei 200 GU entspricht. Für Sputum-Experimente haben wir 1 ml Sputum von Personen mit Nicht-TB-Atemwegserkrankungen (kommerziell erhältlich) mit zwei verschiedenen Bakterienkon...

Discussion

In dieser Arbeit stellen wir ein robustes, validiertes Protokoll für die Extraktion hochwertiger M. tuberculosis-DNA durch Bead-Beating mit magnetischer Bead-Cleanup für nachgelagerte molekulare und NGS-Anwendungen vor.

Die Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden DNA-Extraktionsprotokollen von M. tuberculosis . Während die herkömmliche Phenol-Chloroform-Extraktion in der Regel mehrere Tage dauert und gefährliche Chemikalien frei...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 mm Zirkonoxid-Silikat-Perlen	Biospec-Produkte	Artikel-Nr.: 11079101z	Kügelchen, die für den Bead-Beating-Schritt zur Lyse von Mykobakterienzellen verwendet werden
AMPure XP Perlen	Beckman Coulter	Nr. A63880	Magnetische Kügelchen für die DNA-Aufreinigung nach der Lyse
EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9260G	Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten
Fastprep 24	MPbio, Vereinigte Staaten von Amerika	116004500	Ausrüstung für das Wulstschlagen mit 6,5 m/s
Vorwärts-Grundierung	Thermo Fisher Scientific	Kundenspezifische Synthese	Primer-Sequenz: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (Wasser, molekularbiologische Qualität)	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: BP2819-1	Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten
Luna Universalsonde	Neuengland Biolabore	M3004	qPCR-Reagenz für die Zählung mykobakterieller DNA
MycoPrep Kit	BD	SKU/REF-240863	BD MycoPrep Probenaufschluss für die NALC-NaOH-Sputumverarbeitung
NaCl (Natriumchlorid, 5M-Lösung)	Thermo Fisher Scientific	AM9759	Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten
PBS	Millipore Sigma	Nr. P2272	Sputum-Verarbeitung
Umgekehrte Grundierung	Thermo Fisher Scientific	Kundenspezifische Synthese	Primer-Sequenz: GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqMan Sonde	Thermo Fisher Scientific	Kundenspezifische Synthese	Sondensequenz: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9855G	Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	28314	Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten