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In vitro Cannabis-Exposition von Lungenepithelzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche

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DOI:

10.3791/68102

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20. Juni 2025

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir etablieren ein standardisiertes in vitro Modell zur Untersuchung der Exposition von Cannabisdampf an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit. Dieses Modell bietet einen systematischen Ansatz zur Untersuchung der Auswirkungen von verdampftem Cannabis und adressiert das wachsende Interesse an Cannabis-Vaporizern als Alternative zum Rauchen.

Zusammenfassung

Cannabis wird von schätzungsweise 192 Millionen Menschen auf der ganzen Welt konsumiert. Die meisten Menschen konsumieren Cannabis durch die Inhalation von Cannabisrauch, der Verbrennungsnebenprodukte enthält, die sich negativ auf die Lungengesundheit auswirken können. Das Wissen um diese Risiken hat zu einem wachsenden Interesse an Cannabis-Vaporizern geführt, die die getrockneten Cannabisblüten erhitzen, ohne zu verbrennen. Beim Verdampfen von Cannabis werden immer noch Cannabinoide zur Inhalation freigesetzt, aber das Pflanzenmaterial wird auf eine niedrigere Temperatur erhitzt. Derzeit gibt es kein standardisiertes In-vitro-Modell zur Bewertung der Auswirkungen von trockenem Cannabisdampf. Aus diesem Grund haben wir ein Modell für die Exposition von Lungenzellkulturen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) etabliert, bei dem Zellen apikal verdampftem Cannabis ausgesetzt werden, wodurch die Physiologie der Lungenepithelzellen genauer simuliert wird. Dieses Protokoll gewährleistet eine konsistente und reproduzierbare Abgabe von Cannabisdampf an die Zelloberfläche und bietet eine zuverlässige Plattform für die Untersuchung der zellulären und molekularen Auswirkungen von verdampftem Cannabis. Diese Arbeit ist die erste, die eine In-vitro-Methode zur Verabreichung von Cannabisdampf standardisiert, die als Maßstab für zukünftige präklinische Cannabisforschung dienen kann.

Einleitung

Cannabis wird in der Regel durch das Einatmen von Rauch aus dem Verbrennen der Blüten der Pflanze in Form eines Joints konsumiert, sei es zu Freizeitzwecken oder zu medizinischen Zwecken. Die wichtigsten biologischen Aktivitäten von Cannabis sind auf Cannabinoide wie Δ 9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) und Cannabidiol (CBD) zurückzuführen, die beim Einatmen in den Körper freigesetzt werden. Cannabisrauch enthält auch pyrogene Verbindungen, darunter Karzinogene, Mutagene und Teratogene, die das Potenzial haben, gesundheitsschädliche Folgen zu haben1. Angesichts dieser Bedenken besteht Interesse daran, sich Cannabis-Vaporizern zuzuwenden, die die Cannabisblüten erhitzen, ohne zu verbrennen, in der Hoffnung, dass dies die Freisetzung von Cannabinoiden für die anschließende Inhalation, jedoch ohne Verbrennungsprodukte, ermöglicht. Es wurden einige Arbeiten durchgeführt, um die chemischen Bestandteile von Cannabisdampf zu charakterisieren, wobei das Vorhandensein von Cannabinoiden, aber auch verschiedener Giftstoffe für die Atemwege nachgewiesen wurde, was die Vorstellung, dass diese Geräte sicher sind, in Frage stellt 2,3. Es gibt erhebliche Wissenslücken darüber, wie sich verdampftes Cannabis auf die Lunge und andere Organe auswirkt.

Zellkulturstudien sind in der Toxikologie unerlässlich, um die spezifischen Wirkungen inhalativer Substanzen auf zellulärer Ebene zu isolieren und zu verstehen und so kostengünstige und mechanistische Erkenntnisse mit hohem Durchsatz zu ermöglichen, die für die Humanbiologie relevant sind. Die Methode der Kultivierung der Zellen ist auch eine wichtige Determinante für die Gesamtergebnisse eines In-vitro-Experiments . Die meisten Zellkulturstudien werden unter Wasser durchgeführt, wobei die Zellen auf Kunststoff gezüchtet und apikal wässrigen Medien ausgesetzt werden. Die Epithelzellen der Atemwege stellen in dieser Hinsicht jedoch eine einzigartige Herausforderung dar. Im gesamten Atmungssystem ist die apikale Oberfläche der Epithelzellen in Kontakt mit Luft. Innerhalb der Lungenbläschen produzieren Epithelzellen Tensid, während andere Epithelzellen der Atemwege Schleim produzieren; Zusammen schützt und erhält dies die Lungenfunktion. Submerse Kulturen sind nicht in der Lage, die apikale Luftexposition zu replizieren, was ihre Fähigkeit einschränkt, die In-vivo-Umgebung genau zu modellieren. Eine Alternative zu submersen Kulturmodellen ist die Kultivierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI), bei der respiratorische Epithelzellen auf einer kollagenbeschichteten Membran mit Medien auf der basolateralen Seite gezüchtet werden, während sie apikal der Luft ausgesetzt sind. Epithelzellen, die am ALI kultiviert werden, sind aufgrund ihrer Fähigkeit, in dieser Umgebung zu polarisieren, Tensid oder Schleim zu produzieren und Verbindungen zu bilden 4, genauere Modelle des respiratorischen Epithelszu bilden 4.

Eine weitere Überlegung, mit der herkömmliche submerse Zellkulturmethoden konfrontiert sind, ist, dass hydrophobe Verbindungen wie Cannabinoide in wässrigen Medien schlecht löslich sind5. Ethanolische Extrakte sind ein gängiges Lösungsmittel zur Untersuchung hydrophober Verbindungen in getauchten Kulturen 6,7,8,9,10,11,12. Mit diesen Extrakten können sowohl hydrophobe als auch hydrophile Verbindungen in einem wässrigen Medium gelöst werden. Eine Einschränkung ist jedoch das Potenzial für die Agglomeration von Verbindungen sowie für Verbindungen, die mit den Medien interagieren, die beide die Bioverfügbarkeit verändern können13,14. In jüngster Zeit wurden Entwicklungen entwickelt, die es ermöglichen, Aerosol-Phasenverbindungen in Abwesenheit eines Lösungsmittels oder Mediums an Zellen abzugeben, wobei fortschrittliche Expositionssysteme wie der expoCube15 (ALI/Transwell in vitro/ex vivo Expositionssystem) und andere verwendet werden. Die direkte Abscheidung von Aerosolen und Partikelsuspensionen unter Verwendung eines fortschrittlichen Expositionssystems eliminiert den für Unterwasserexpositionen entscheidenden Sammel-Resuspensionsprozess, von dem bekannt ist, dass er die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel erheblich verändert16. In dieser Arbeit beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für die Exposition einer alveolären Epithelzelllinie an der ALI.

Protokoll

1. Kultivierung von Lungenepithelzellen am ALI

HINWEIS: Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von A549-Zellen am ALI beschrieben. Bitte überprüfen Sie die Literatur für den Zelltyp, der in der Studie verwendet werden soll. Verschiedene Zelllinien benötigen bei ALI unterschiedlich viel Zeit, um sich zu differenzieren, Tight Junctions zu bilden und Tensid/Schleim zu produzieren.

  1. Zellkultur
    1. Bereiten Sie das Medium vor, indem Sie 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 5 ml Glutamax, 5 ml Antibiotikum-Antimykotikum und 500 μl Gentamycin in eine 500-ml-Flasche DMEM geben.
    2. Legen Sie das vorbereitete Medium für 10-15 Minuten in ein Wasserbad, um es auf 37 °C zu erwärmen.
    3. Besprühen Sie die Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol und wischen Sie es ab. Sobald das Medium erwärmt ist, legen Sie es unter die sterilisierte Biosicherheitswerkbank.
    4. Pipettieren Sie unter der Kulturhaube ca. 10 ml Medium in ein 15-ml-Röhrchen.
    5. Gewinnen Sie Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie durch leichtes Rühren in einem Wasserbad auf.
    6. Pipettieren Sie unter der Kulturhaube die aufgetauten Zellen des Kryofläschchens in das 15-ml-Röhrchen.
    7. Zentrifugieren Sie das 15-ml-Röhrchen bei 300 g für 5 Minuten.
    8. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
    9. Das Pellet mit dem Medium mischen und in den Kolben T75 umfüllen.
    10. Prüfen Sie den Kolben T75 unter dem Mikroskop.
    11. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 bei gesättigter Luftfeuchtigkeit.
    12. Aktualisieren Sie die Zellkulturmedien alle 2-3 Tage.
    13. Passage und Wachstum von Zellen, bis die gewünschte Zellzahl erreicht ist. Um eine 12-Well-Platte zu säen, werden 3 × 106 Zellen benötigt.
  2. Kollagenbeschichtung von Transwells
    1. Herstellung der Kollagenlösung
      1. 10 mg Kollagen Typ IV in 20 ml ddH2O mit 50 μl Eisessig auflösen.
      2. Bei 37 °C 30 Minuten lang inkubieren, dabei gelegentlich schwenken, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
      3. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie durch einen 0,22-μm-Filter filtrieren.
      4. 1,5 mL der Lösung in 15 mL Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
    2. Beschichtung von Transwell-Filtern mit Kollagen Typ IV
      1. Tauen Sie ein Röhrchen Kollagen Typ IV (50 μg/ml) bei -20 °C auf.
      2. Geben Sie 150 μl Kollagen in jeden Transwell-Filter.
        HINWEIS: Nur 12-Well-Platten sind mit dem Belichtungssystem kompatibel.
      3. Teller mit offenem Deckel 18 h in der Biosicherheitswerkbank (BSC) trocknen lassen.
      4. Sterilisieren, indem Sie es 30 Minuten lang ultraviolettem (UV) Licht aussetzen.
    3. Lagern Sie die Platten bei 4 °C, eingewickelt in Parafilm, bis zu 30 Tage.
    4. Spülen Sie vor dem Plattieren der Zellen beide Seiten der Filter mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  3. Aussaat von Zellen in Einschüben und Übergang zu ALI
    1. Vorbereitung der Platten- und Zellsuspension
      1. Pipettieren Sie 1,5 ml vorgewärmtes vorbereitetes Medium in jede Vertiefung der 12-Well-Platte.
      2. Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
      3. Eine Zellsuspension mit einer Konzentration von 5 × 105 Zellen/ml in vorbereiteten Medien herstellen.
    2. Aussäen von Zellen in Einfügevorgängen
      1. Nehmen Sie die vorbereitete Zellkulturplatte aus dem Inkubator und stellen Sie sie unter eine sterilisierte Biosicherheitswerkbank.
      2. Pipettieren Sie 0,5 ml der Zellsuspension (2,5 × 105 Zellen/Einsatz) auf die Oberseite der Membran im Einsatz.
      3. Decken Sie die Platte mit der Tellerabdeckung ab und stellen Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2 wieder in den Inkubator.
    3. ALI einrichten
      1. Entfernen Sie das apikale Medium 24 h nach der Aussaat der Zellen.
      2. Ersetzen Sie das basolaterale Medium durch 0,6 mL vorbereitetes Medium. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen apikal der Luft ausgesetzt, wodurch die ALI etabliert wird.
      3. Kultivieren Sie die A549-Zellen bis zu 2 Wochen lang bei ALI, wobei das Medium alle 2 Tage gewechselt wird, damit sich die Zellen wie zuvor charakterisiert differenzierenkönnen 4.

2. Dosimetrische Beurteilung der Exposition gegenüber Cannabisdampf mittels LC/MS

HINWEIS: In diesem Teil des Protokolls wurden zellfreie Methoden verwendet, um die Dosis des in jeder Vertiefung abgelagerten Cannabisdampfs durch Analyse der Δ 9-THC-Konzentrationen zu charakterisieren. Δ9-THC haftet an Kunststoffen, daher sollten für die Probenentnahme nur Glasfläschchen verwendet werden. Diese Methode setzt voraus, dass die gewählte Cannabissorte Δ9-THC enthält.

  1. Vorbereitung und Aufbau des Belichtungssystems
    1. Richten Sie die Schläuche für das Expositionssystem entsprechend dem angegebenen Strömungsweg ein (Abbildung 1A, B): ENDS-Einheit > Kondensator > Puffpumpe > isometrische Probenahmebaugruppe mit Aeroneb-Pumpe > expoCube > Feuchtigkeitssensor mit Filter > expoCube Exposure Flow Port.
    2. Schalten Sie die Temperaturregelung ein, um das System auf 35 °C und 50 °C zu heizen.
    3. Führen Sie Durchflusstests durch, um sicherzustellen, dass das System leckagefrei ist und die Drücke korrekt eingestellt sind (siehe SCIREQ Technote: Ein Leitfaden zur Fehlerbehebung bei ungleichmäßigen Strömungen im expoCube).
    4. Starten Sie die Aeroneb-Pumpen, um eine relative Luftfeuchtigkeit von mehr als 75 % zu erreichen.
  2. Dosimetrieprüfung und Vorbereitung des Verdampfers
    1. Zubereitung des Cannabis-Vaporizers
      1. Mahle die Cannabisblüten mit einer Kräutermühle.
      2. Wiegen Sie 0,25 g Aliquote ab und verwenden Sie einen Tablettenseparator, um jede Portion zu organisieren.
      3. Platzieren Sie Edelstahleinsätze in der Belichtungsreihe der 12-Well-Transwell-Platte innerhalb des Belichtungssystems.
  3. Exposition von Edelstahleinsätzen gegenüber Cannabisdampf
    1. Belichtung starten
      1. Fülle den Vaporizer-Ofen mit 0,25 g Cannabis.
      2. Befestigen Sie den Cannabis-Vaporizer mit einer sicheren Dichtung an der ENDS-Einheit des Belichtungssystems und beginnen Sie mit dem gewünschten Zugprogramm. Stellen Sie den Vaporizer auf die Temperatureinstellung Smart Path Level 2 ein.
        HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Expositionssystem verfügt über vier intelligente Pfadstufen zur Auswahl, darunter Stufe 1 (176-188 °C), Stufe 2 (188-199 °C), Stufe 3 (199-210 °C) und Stufe 4 (210-221 °C).
      3. Erstellen Sie ein Puff-Profil in der flexiWare-Software (Datenerfassungssoftware; siehe SCIREQ Technote: A Guide to Creating Profiles for flexiWare 8). Verwenden Sie für dieses Protokoll ein Puffvolumen von 70 mL mit einer Frequenz von 4 Puffs/min.
      4. Lassen Sie den Vaporizer für trockene Kräuter 5 Minuten lang laufen, bevor Sie das Cannabis wechseln, indem Sie die Cannabisblüten aus dem Vaporizer-Ofen nehmen und frische 0,25 g Cannabis in den Vaporizer geben. Wechseln Sie zwischen zwei Verdampfern für eine kontinuierliche Belichtung.
      5. Fahren Sie mit den Schritten 2.3.1.1 bis 2.3.1.4 fort, bis die gewünschte Belichtungszeit erreicht ist.
    2. Entfernen Sie nach jeder Belichtung vorsichtig mit einer Pinzette die Einsätze aus dem Belichtungssystem und bereiten Sie sie wie unten beschrieben für die Probenentnahme vor.
  4. Entnahme und Vorbereitung von Proben für die LC/MS-Analyse
    1. Platzieren Sie mit einer Pinzette die für jede Exposition entsprechenden Filter in ein beschriftetes Glasfläschchen mit 10 ml Methanol in LC/MS-Qualität (z. B. Exposition 1, Exposition 2, Exposition 3).
    2. Waschen Sie die Einlage.
      1. Legen Sie jeden freiliegenden Edelstahleinsatz in ein beschriftetes Glasfläschchen mit 10 ml Methanol in LC/MS-Qualität.
      2. Beschriften Sie die Fläschchen je nach Exposition (z. B. Exposition 1, Vertiefung 1-4).
    3. Extrakt Δ9-THC
      1. Verwenden Sie ein Ultraschallbad, um die Fläschchen mit Einsätzen 10 Minuten lang zu beschallen, um Δ9-THC zu extrahieren.
      2. Übertragen Sie die Einsätze in einen zweiten Satz Glasfläschchen mit 10 mL frischem Methanol und beschallen Sie es für weitere 10 Minuten.
    4. Senden Sie alle vorbereiteten Proben (Vertiefungen, Waschen und Filter) für eine LC/MS-Analyse, um den Δ 9-THC-Gehalt zu quantifizieren.
  5. Dosimetrische Berechnungen
    1. Berechnen Sie anhand der LC/MS-Analyseergebnisse die Menge des abgeschiedenen Δ9-THC, um die Dosimetrie des Expositionsflusses (im Filter abgelagerte Menge) und die Dosimetrie in der Vertiefung zu bestimmen.
    2. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen dem Belichtungsstromfilter und der Vertiefungsabscheidung für Δ9-THC.
    3. Verwenden Sie dieses Verhältnis, um die Dosis zu bestimmen, die während der Exposition an die Zellen abgegeben wird.

3. Dosimetrische Beurteilung der Exposition gegenüber Cannabisdampf mit einer Quarzkristall-Mikrowaage

HINWEIS: Diese Methode beschreibt den Aufbau und die Kalibrierung einer Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) zur Beurteilung der Masse der Cannabisdampfpartikel, die sich während der Exposition ablagern. Jedes QCM bietet Echtzeitmessungen, die eine präzise Dosimetrie der Exposition von Cannabisdampf ermöglichen.

  1. Vorbereitung und Aufbau des QCM im Belichtungssystem
    1. Konfigurieren Sie das Belichtungssystem wie zuvor beschrieben.
    2. Schließen Sie jedes QCM über den Clip-Anschluss an sein Elektronikmodul an und verbinden Sie das Modul mit einem 7-poligen Stecker mit den Eingängen des inExpose-Geräts (Inhalationsexpositionsplattform).
    3. Platzieren Sie die QCM-Einsätze in einer Well-Platte auf der Belichtungsseite des Belichtungssystems und stellen Sie sicher, dass das QCM gut ausgerichtet ist.
    4. Heizen Sie das Belichtungssystem mit angeschlossenen QCMs vor, bis sich das System bei den Zieltemperaturen von 35 °C und 50 °C stabilisiert hat.
    5. Mikroflüsse und Expositionsflüsse entsprechend den Versuchseinstellungen aktivieren.
  2. Kalibrierung des QCM
    1. Verwenden Sie den Kalibrierungsassistenten der Datenerfassungssoftware, um das QCM vor jedem Belichtungslauf zu kalibrieren.
    2. Warten Sie, bis sich der blaue Kalibrierungsbalken stabilisiert hat, und wählen Sie dann Weiter , um die QCM-Resonanzfrequenz für genaue Massenberechnungen aufzuzeichnen.
      HINWEIS: Der erwartete Kalibrierungsbereich beträgt -15 % bis 15 %. Abweichungen können auf Probleme wie ein verschmutztes QCM oder einen nicht angeschlossenen LEMO-Stecker hinweisen.
  3. Echtzeitüberwachung von QCM-Signalen
    1. Überwachen Sie die QCM-Ausgänge; Das System gibt die kumulierte abgeschiedene Masse aus. Der Wert wird in der Datenerfassungssoftware sowohl als Teil eines Diagramms als auch als tatsächlicher Barwert angezeigt.
      HINWEIS: Für jeden Versuchslauf werden auch die maximale und minimale Ablagerung in der Software angegeben.
  4. Reinigen des QCM
    1. Um die Genauigkeit zu erhalten, reinigen Sie das QCM nach jedem Experiment.
    2. Geben Sie 1 ml 70%igen Isopropylalkohol in jeden QCM-Einsatz.
    3. Pipettieren Sie die Alkohollösung 2-3 Mal auf und ab, um Rückstände aufzulösen.
    4. Entfernen Sie die Alkohollösung und lassen Sie den QCM vor dem nächsten Gebrauch vollständig in einer staubfreien Umgebung an der Luft trocknen.

4. Ergebnisse der Exposition der Zellen gegenüber Cannabisdampf

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Auswirkungen von Cannabisdampf auf Atemwegszellen zu bewerten, die bei ALI mit dem expoCube-System kultiviert wurden. Postexpositions-Assays, einschließlich 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und Laktatdehydrogenase (LDH), geben Einblicke in die dosisabhängige Zytotoxizität und metabolische Aktivität.

  1. Abgabe von Cannabis-Dampf
    1. Richten Sie das Expositionssystem wie oben beschrieben ein: Stellen Sie sicher, dass das System eine Temperatur von 35 °C und 50 °C und eine relative Luftfeuchtigkeit von über 75 % erreicht hat.
    2. Wenn Sie ein QCM verwenden, schließen Sie das Gerät über den Clip-Anschluss an sein Elektronikmodul an und verbinden Sie das Modul mit einem 7-poligen Stecker mit den Eingängen der Inhalationsexpositionseinheit. Platzieren Sie den einzelnen QCM-Einsatz in einer Well-Platte auf der Belichtungsseite des expoCube, um sicherzustellen, dass der QCM gut ausgerichtet ist.
    3. Öffnen Sie das Belichtungssystem und setzen Sie die Zellkulturplatte hinein.
    4. Beginnen Sie das Zugprogramm für die gewünschte Dauer, basierend auf Abschnitt 2. Die Verwendung des QCM ermöglicht eine Echtzeit-Verfolgung des gesamten abgelagerten Dampfes.
    5. Bringen Sie die Zellen nach der Exposition bis zum gewünschten Assay-Zeitpunkt in den Inkubator zurück.
    6. Entnehmen Sie bei Bedarf Proben aus verschiedenen Kompartimenten, einschließlich des basolateralen Kompartiments, der apikalen Kompartimentwaschung (für Tensid oder Schleim) und des Zelllysats.
    7. Dosisauswahl-Assays: Verwenden Sie LDH- und MTT-Assays, um die optimale Dosis und die potenzielle Zytotoxizität zu bestimmen.
  2. LDH-Assay für Zellen am ALI
    1. Medien sammeln: Sammeln Sie zum gewünschten Zeitpunkt nach der Belichtung Medien aus dem basolateralen Fach.
    2. Übertragen Sie 100 μl des gesammelten Mediums auf eine durchsichtige 96-Well-Mikroplatte.
    3. 100 μl frisch zubereitetes LDH-Reaktionsgemisch in jede Vertiefung geben.
    4. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (15-25 °C) und schützen Sie sie vor Licht.
    5. Messen Sie die Extinktion bei 490-492 nm mit einer Referenzwellenlänge über 600 nm.
    6. Berechnen Sie die Zytotoxizität mit der folgenden Formel:
      Zytotoxizität (%) = (Versuchswert-Negativkontrolle)/(Positivkontrolle-Negativkontrolle) x 100
  3. MTT-Assay für Zellen am ALI
    1. Kultur von A549-Zellen am ALI, wie zuvor etabliert.
    2. Nach der Expositionsabgabe im Expositionssystem werden die Zellen bis zum gewünschten Assay-Zeitpunkt wieder in den Inkubator zurückgebracht.
    3. Löse 1 mg MTT in 1 ml PBS auf, um die MTT-Lösung herzustellen.
    4. Geben Sie 500 μl MTT-Lösung auf die apikale Seite der Zellen und 500 μl MTT-Lösung in das basolaterale Kompartiment.
    5. Stellen Sie die Zellen für 1 h in den 37 °C Inkubator zurück.
    6. Entfernen Sie vorsichtig alle Medien.
    7. Geben Sie 500 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) auf die apikale Seite und 1.000 μl DMSO auf die basolaterale Seite.
    8. 1 h inkubieren, um Formazankristalle aufzulösen.
    9. Sammeln und kombinieren Sie die Lösung sowohl von der apikalen als auch von der basolateralen Seite.
    10. Messen Sie die Extinktion bei 540 nm (OD540) mit einer Referenz bei 690 nm (OD690).
    11. Berechnen Sie die Zellviabilität mit der folgenden Formel:
      Zellviabilität (%) = 100 × (durchschnittliche OD_exposure/durchschnittliche OD_negative Kontrolle)

Ergebnisse

Während der Experimente mit dem expoCube-System werden vier Vertiefungen der Cannabisdampf-Exposition ausgesetzt, vier Vertiefungen werden als Vehikelkontrollen konditionierter Luft ausgesetzt und die restlichen vier Vertiefungen sind als Negativkontrollen vollständig eingeschlossen (Abbildung 1C)17. Dieser Aufbau ermöglicht einen präzisen Vergleich zwischen behandelten, Fahrzeug- und negativen Bedingungen. Das System wird befeuchtet, um eine für Zellkulturen geeignete Umgebung zu schaffen (Abbildung 2), und die Temperaturregelung innerhalb des Systems verbessert die Partikelabscheidung durch Thermophorese, was eine effiziente Abgabe von verdampften Verbindungen an die Zellenermöglicht 18. Um die Exposition zu quantifizieren, messen wir die Menge an Δ9-THC als Marker für die Ablagerung von Cannabisdampf an der Expositionsstelle der Zellen. Diese Quantifizierung ist entscheidend für die Optimierung von Expositionszeiten und -dosen und ermöglicht es den Forschern, die aktiven Expositionszeiten anzupassen, um die gewünschten Dosen in Zellkulturexperimenten zu erreichen (Abbildung 3). Durch die Berechnung des Verhältnisses von Δ9-THC, das im Expositionsflussfilter gesammelt wird, zu der Menge, die in den einzelnen Vertiefungen abgelagert wird, können wir die tatsächliche Dosis abschätzen, die an die Zellen abgegeben wird (Tabelle 1). Diese berechnete Dosis gibt Aufschluss über den gewünschten Expositionsbereich und hilft bei der Bestimmung optimaler Parameter für die konsistente und messbare Untersuchung der zellulären Reaktionen auf Cannabisdampf. Dies kann für andere Cannabinoide durchgeführt werden, abhängig vom Cannabinoidprofil der ausgewählten Cannabissorte. Darüber hinaus kann eine QCM-Analyse durchgeführt werden, um die Abscheidung von Cannabisdampf in Echtzeit zu messen. Abbildung 4 zeigt die Ablagerung von Cannabisdampf über einen Zeitraum von 30 Minuten, in dem der Verdampfer und das Cannabismaterial alle 5 Minuten gewechselt wurden. Jede Vertiefung zeigte eine konstante Zunahme der Masse im Laufe der Zeit, was auf eine effektive und kontinuierliche Ablagerung ganzer Cannabisdampfpartikel hinweist.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des ALI/Transwell in vitro/ex vivo Expositionssystems für die Exposition von Cannabisdampf am ALI. (A) Der DaVinci MIQRO Vaporizer wurde zur Erzeugung von Cannabisdampf verwendet. Diese Probe wird befeuchtet und durch den isokinetischen Probenehmer in die Expositionsstelle transportiert. Das Steuergerät ermöglicht die Einstellung von Luftstromleistungen und Temperaturgradienten. (B) Fotos der Einrichtung des Belichtungssystems. (C) Das Innere des expoCube ist in drei Reihen unterteilt: eine Testreihe für die Exposition gegenüber Cannabisdampf, eine Fahrzeugkontrollreihe mit klimatisierter Luft und die geschlossene negative Kontrollreihe, die von jeglichem Luftstrom unberührt bleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Aufgezeichnetes Profil der relativen Luftfeuchtigkeit (%) im Laufe der Zeit. Diese Daten zeigen die relative Luftfeuchtigkeit, wenn die Aeronebs aktiviert sind und eine durchschnittliche Luftfeuchtigkeit von 75 % erreicht und aufrechterhalten wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Quantifizierung der Δ 9-THC-Ablagerung mittels LC/MS-Analyse nach 30-minütiger Exposition gegenüber Cannabisdampf. (Ein-C) Die Δ 9-THC-Ablagerung wurde in jeder Vertiefung nach drei unabhängigen 30-minütigen Dampfexpositionen gemessen, bei denen jeweils 1,5 g einer Cannabissorte mit hohem THC-Gehalt verwendet wurden. Der Δ 9-THC-Gehalt wurde durch LC/MS quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: QCM-Messungen der Cannabisdampfabscheidung im ALI/Transwell In-vitro/Ex-vivo-Expositionssystem über ein 30-minütiges Expositionsschema. (A-D)Jedes Diagramm stellt die kumulative Ablagerung von Cannabisdampfpartikeln in den Vertiefungen 1 bis 4 dar, wobei die Masse im Laufe der Zeit in Mikrogramm (μg) gemessen wird. Die Ablagerungsrate zeigt eine stetige Akkumulation über alle Bohrlöcher hinweg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abscheidung des Primärdurchflussfilters (μg)Well-Abscheidungen (μg)Prozentsatz des Primärdurchflusses, der im Bohrloch abgelagert wurde (%)
Exposition 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Exposition 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Exposition 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Durchschnitt2422.94.30.18
Standardabweichung292.80.40.03

Tabelle 1. Vergleich der Δ 9-THC-Ablagerung im ALI/Transwell in vitro/ex vivo Expositionssystem zwischen dem Expositionsflussfilter und der Zellexpositionsstelle.

Diskussion

Die Kultivierung von Zellen am ALI ist eine wichtige Methode in der Atemwegsforschung, da sie im Vergleich zu herkömmlichen Unterwasserkulturen in vivo die Atemwegsbedingungen genauer darstellen kann19. Die Kultivierung am ALI ermöglicht es, Lungenepithelzellen auf ihrer apikalen Oberfläche direkt der Luft auszusetzen, während essentielle Nährstoffe aus dem Kulturmedium auf der basolateralen Seite erhalten bleiben. Dieser Aufbau ermöglicht es den Zellen, Tensid oder Schleim zu produzieren, Schlüsselkomponenten des respiratorischen Abwehrmechanismus, die für das Einfangen und Entfernen von eingeatmeten Partikeln und Krankheitserregern entscheidend sind 20,21,22. A549-Zellen werden häufig für In-vitro-Studien verwendet, sind aber nur eine von vielen respiratorischen Epithelzellkulturen, die für ALI verwendet werden können. Silva et al. haben Zelllinien und Primärkulturen des respiratorischen Epithels auf ALI von der Nasenhöhle bis zu den Lungenbläschen überprüft22. Die Flexibilität des vorgestellten ALI-Expositionssystems ermöglicht es, es für verschiedene Zelllinien und Primärzellen anzupassen.

ALI-Kulturen gelten zunehmend als "Goldstandard" für In-vitro-Inhalationsstudien , insbesondere für die Erforschung von Luftschadstoffen, Feinstaub und anderen inhalierbaren Stoffen23. Ein Hauptvorteil von ALI-Modellen liegt in ihrer Fähigkeit, Erkenntnisse zu liefern, die besser auf In-vivo-Effekte auf den Menschen übertragbar sind. Ein bemerkenswerter Nachteil ist jedoch das Fehlen standardisierter Protokolle für ALI-Expositionen, was sich auf die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen Studien auswirkt. Eine der Lücken ist ein standardisierter Belichtungs-Workflow. Durch die Exposition der Zellen gegenüber Cannabisdampf am ALI können die Auswirkungen von Cannabis auf die zelluläre Funktion, Lebensfähigkeit und Zytotoxizität bewertet werden. Diese Expositionen ermöglichen eine detaillierte Bewertung der biologischen Ergebnisse, einschließlich Marker für Zytotoxizität, Entzündungen und oxidativen Stress. Die präzise Quantifizierung der abgelagerten Cannabinoide ermöglicht reproduzierbare Studien über die zellulären Wirkungen von Cannabisdampf (und anderen Formen von Cannabisprodukten) und erweitert unser Verständnis seiner potenziellen Auswirkungen auf die Gesundheit in einer kontrollierten Laborumgebung.

Fortschrittliche Expositionssysteme beheben die Einschränkungen traditioneller Unterwasserkulturen, indem sie eine direkte Partikelabscheidung auf der Zelloberfläche ermöglichen und so physiologisch relevantere Expositionen ermöglichen. Dadurch werden auch die möglichen Auswirkungen der Lösungsmittel oder Träger reduziert. Durch die direkte Partikelabscheidung ohne diese Lösungsmittel tragen Expositionssysteme dazu bei, fahrzeugbedingte Effekte zu minimieren. Dennoch bleiben einige fahrzeugbezogene Überlegungen bestehen. So kann beispielsweise eine unkontrollierte Luftfeuchtigkeit zu unerwünschtem Zellstress führen24, der sich möglicherweise auf die Versuchsergebnisse auswirkt. Die Sicherstellung, dass die Luftfeuchtigkeit sorgfältig reguliert wird, um ein optimales Niveau zu erreichen, ist unerlässlich, um die Zellstabilität und Genauigkeit der Ergebnisse zu erhalten. Darüber hinaus hat jedes Partikel-, Aerosol- oder Gasgemisch seine eigenen einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften, die die Ablagerung auf der Zelloberfläche verändern könnten25. Es ist daher wichtig, für jedes einzelne Produkt ein Expositionsschema zu charakterisieren. Zu den Faktoren, die sich auf die Partikelabscheidung auswirken könnten, gehört die Thermophorese, die Bewegung von Partikeln aus einem Bereich mit höherer zu niedrigerer Temperatur26. Die Thermophorese hilft dabei, Partikel auf die Zellen zu lenken und die Abscheidungseffizienz zu verbessern.

Konsistenz und Präzision der Dosierung sind weitere Herausforderungen bei der Arbeit mit Expositionssystemen am ALI, insbesondere wenn es sich um Aerosole oder Partikel handelt. Die In-vivo-Partikelablagerung in der Lunge ist ein komplexer Prozess, der von der Partikelgröße, -form, -dichte und -löslichkeit sowie von der spezifischen Region der Lunge, die exponiert wird, beeinflusstwird 27. Diese Faktoren führen zu unterschiedlichen Abscheidungsraten, die in vitro schwer zu replizieren sein können. Mathematische Modelle, wie z. B. die Mehrwege-Partikeldosimetrie (MPPD), sind nützliche Werkzeuge zur Schätzung der In-vivo-Abscheidungsraten und zur Steuerung der In-vitro-Dosistranslation 28. Die Anpassung der In-vitro-Dosierung an die In-vivo-Expositionsszenarien bleibt jedoch eine Herausforderung, insbesondere bei komplexen Aerosolen mit heterogenen Zusammensetzungen.

Für die charakterisierung der zellfreien Dosis ist es wichtig zu beachten, dass Edelstahl-Insert-Waschungen dazu neigen, die Ablagerung zu überschätzen, da Verbindungen sowohl an den Wänden des Inserts als auch an der Basis haften können, wo sich die Zellen typischerweise befinden. Das QCM bietet hier einen Vorteil, indem es nur die direkt an der Zellkulturstelle abgeschiedene Masse misst und so eine genauere Beurteilung der spezifisch für die Zellexposition relevanten Ablagerung ermöglicht.

Da sich die Toxikologie in Richtung physiologisch relevanterer Modelle bewegt, wird die Einführung einheitlicher ALI-Expositionsprotokolle von grundlegender Bedeutung sein, um die Lücke zwischen In-vitro-Ergebnissen und In-vivo-Reaktionen des Menschen zu schließen und letztendlich eine zuverlässigere Bewertung von Atemwegsgiften und ihren Auswirkungen auf die Gesundheit zu unterstützen.

Offenlegungen

PG und BU sind bei SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. beschäftigt. ETW absolvierte ein Praktikum bei SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. im Rahmen des Mitacs Accelerate Program. Die anderen Autoren haben keine Konflikte offenzulegen

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Project Grant 162273 der Canadian Institutes for Health Research (CIHR) unterstützt. CJB wurde vom Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS) unterstützt. Diese Studie wurde auch durch einen Mitacs-Zuschuss unterstützt, der an ETW #IT34076 wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL Zentrifugenröhrchen, Gestell (Polystyrol-Gestell), SterilMontreal Biotech Inc.
30 mL GlasfläschchenThomas Scientific1755F32
A549 ZellenATCCCCL-185
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)Wisent450-115-EL
Cannabis Kräutermühle  Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
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97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
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OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
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vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
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GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
keywords=herb%2Bgrinder& qid=1736346511&
sprefix=herb%2Bgrinder%2Caps%
2C168& sr=8-10& th=1
Kollagen aus der menschlichen Plazenta, Typ IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm Transwell, 0,4 µ m pore Polyester Membran EinsätzeStemcell Technologies38023
Zytotoxizitätsnachweis Kit (LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C TrockenkräuterverdampferDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich34869
DMEM MediumWisent319-005-CL
Getrocknete CannabisblütenSocié té qué bé coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Wert&fv1=THC		Cannabinoid-Gehalt: 17– 23% THC-Gehalt < 0,1% CBD-Gehalt;
Fötales RinderserumWisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Version 8.4.1
GentamycinWisent450-134-XL
EisessigSigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube In-vitro-Expositionspaket   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
LC/MS-MethanolSigma-Aldrich106035
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC Surface, FilterkappeThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC Surface, FilterkappeThermoFisher Scientific
Thiazolylblaues TetrazoliumbromidSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
UltraschallreinigerbadVWR18303Sonicator Bath
Wöchentlicher TablettenorganizerHealthSmart640-8223-0000
MBI601051C156499

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