Methodenartikel

Bestimmung der mitochondrialen Morphologie in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

DOI:

10.3791/68167

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3. Juli 2025

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1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Studie beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll und betonen die wichtigsten Details zur Bestimmung morphologischer Eigenschaften von Mitochondrien in lebenden Zellen, einschließlich Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenanalyse. Diese Methode wird häufig verwendet, um die mitochondriale Morphologie zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Das dynamische Gleichgewicht von mitochondrialer Fusion und Spaltung trägt direkt zur mitochondrialen Homöostase bei, die neben der Homöostase von Adenosintriphosphat (ATP) zahlreiche zelluläre Funktionen beeinflusst. Daher ist die Beurteilung der mitochondrialen Morphologie unter Stressbedingungen für die mechanistische Forschung unerlässlich. Diese Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Analyse der mitochondrialen Morphologie, das die Herstellung einer MitoTracker-Lösung, die Färbung der Mitochondrien, die Optimierung der Bildgebungsparameter und die Detektion morphologischer Merkmale umfasst. MitoTracker sind häufig verwendete, kostengünstige Mitochondrien-spezifische Farbstoffe. Einige Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie können jedoch aufgrund unsachgemäßer Handhabung auftreten, die nicht wahrnehmbar sein können und nicht den wahren Zustand der Mitochondrien widerspiegeln. Daher ist es notwendig zu verstehen, wie Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie mit MitoTrackern analysiert werden können. Das Protokoll verwendete SH-SY5Y-Zellen, die mit 1-Methyl-4-phenylpyridiniumiodid (MPP+) stimuliert wurden, um das Protokoll der mitochondrialen morphologischen Analyse zu veranschaulichen. Im Vergleich zu Kontrollzellen wiesen MPP+-stimulierte Zellen kleinere und stärker fragmentierte Mitochondrien auf, wobei morphologische Parameter auf einen verringerten mitochondrialen Fußabdruck hindeuteten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MitoTracker-Färbung eine effektive und praktikable Methode für die mitochondriale morphologische Analyse ist, die (mit geringfügigen Modifikationen) zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen angewendet werden kann.

Einleitung

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Die mitochondriale Morphologie wird durch das dynamische Gleichgewicht der mitochondrialen Fusion und Spaltung aufrechterhalten und beeinflusst daher die Energiehomöostase und zahlreiche andere zelluläre Funktionen, was zu verschiedenen Pathologien wie neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Entzündungen führt 1,2,3,4,5 . Um die mitochondriale Morphologie zu beobachten, wurden mehrere mitochondrienselektive Färbungen, die sowohl Sonden als auch Antikörper enthalten, für die Verwendung mit einem konfokalen Mikroskop entwickelt. Einige mitochondrienspezifische Sonden, wie Tetramethylrosamin und Rhodamin 123, funktionieren auf der Grundlage des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), was ihre Anwendbarkeit in Studien zu MMP-störenden Bedingungen einschränkt 6,7. Umgekehrt bietet die Antikörperfärbung eine MMP-unabhängige morphologische Beurteilung zur Untersuchung der mitochondrialen Morphologie in fixierten Zellen. Obwohl eine geeignete Färbung die Beurteilung der mitochondrialen Morphologie in fixierten Zellen ermöglicht, bleibt die Untersuchung der mitochondrialen Morphologie in lebenden Zellen, die durch einige Induktoren beeinträchtigt sind, eine Herausforderung. MitoTracker, eine zellpermeable kationische und mitochondrienspezifische Fluoreszenzsonde, bietet eine Lösung für diese Herausforderung, indem sie die Färbung sowohl lebender als auch fixierter Zellen ermöglicht. Diese Sonde wurde häufig zur Untersuchung der mitochondrialen Morphologie in Studien zu verschiedenen Krankheiten eingesetzt 8,9,10,11. Dennoch haben einige Studien über Probleme wie ein hohes Hintergrundsignal und eine unspezifische Bindung berichtet, selbst wenn die Sonde streng nach den vom Hersteller bereitgestellten Richtlinien verwendet wird. Diese Beobachtungen unterstreichen, wie wichtig ein gründliches Verständnis der Probenvorbereitung und Bildaufnahme für die erfolgreiche Analyse der mitochondrialen Morphologie ist.

Um die Analyse der mitochondrialen Morphologie zu erleichtern, wurden verschiedene Bildverarbeitungsprogramme und -algorithmen entwickelt 12,13,14,15,16. In dieser Studie haben wir das Makrowerkzeug Mitochondrial Network Analysis (MiNA) in ImageJ verwendet, um die mitochondriale Morphologie zu analysieren13. Dieses Tool identifiziert und charakterisiert effektiv morphologische Merkmale mitochondrialer Netzwerke, indem es neun beschreibende Parameter berechnet, darunter die Anzahl der Individuen (Strukturen ohne Veräste), die Anzahl der Netzwerke (Anzahl der Objekte mit mindestens einem Verbindungspixel), die mittlere Länge (durchschnittliche Länge aller Stäbchen und Äste), die mediane Länge (mediane Länge aller Stäbchen und Äste), die Längenstandardabweichung (Standardabweichung der einzelnen Längen), Mittlere Netzwerkgröße (die durchschnittliche Anzahl von Verzweigungen pro Netzwerk), Median der Netzwerkgröße (der mittlere Wert der Anzahl der Verzweigungen pro Netzwerk), Standardabweichung der Netzwerkgröße (Standardabweichung der Anzahl der Verzweigungen pro Netzwerk) und der mitochondriale Fußabdruck (gesamte Signalfläche nach Hintergrundtrennung). In diesem Protokoll wurde der mitochondriale Fußabdruck als repräsentativer Parameter ausgewählt.

Das Ziel dieser Studie ist es, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die mitochondriale morphologische Analyse zu erstellen, das sich auf wichtige Details konzentriert. Wir verwendeten MPP+-induzierte SH-SY5Y-Zellen, um dieses Protokoll zu demonstrieren. MPP+ hemmt den Komplex I der mitochondrialen Atmungskette in dopaminergen Neuronen, was zu einer Schädigung der mitochondrialen Morphologie und Funktion führt 8,17. Das in dieser Studie beschriebene morphologische Analyseprotokoll ermöglicht die Aufnahme hochauflösender Bilder und die Bewertung relevanter Parameter, um morphologische Merkmale mitochondrialer Netzwerke zu definieren.

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Protokoll

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1. Vorbereitung

  1. MPP+ mit Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer 1 mM Stammlösung auflösen und bei -30 °C im Dunkeln lagern (siehe Materialtabelle).
  2. 50 μg MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) werden in 94 μl DMSO gelöst, um eine 1 mM Stammlösung herzustellen. Die Stammlösung in mehrere Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bis zur weiteren Verwendung lichtgeschützt bei -30 °C lagern.
  3. Inkubieren Sie SH-SY5Y-Zellen in Kolben mit Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Medium, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 °C. Für die Passage die Zellen mit 0,05%iger Trypsinlösung für 1 min ablösen und 3 min bei 100 × g zentrifugieren.

2. MPP+ Stimulation

  1. SH-SY5Y-Zellen auf konfokalen Schalen mit Glasboden säen und über Nacht in DMEM/F12-Medium mit 1 % (v/v) FBS ergänzen.
  2. Tauschen Sie das Kulturmedium aus und inkubieren Sie die Zellen mit oder ohne MPP+ für 24 Stunden.

3. MitoTracker-Färbung

  1. DMEM/F12 vorwärmen und dann die MitoTracker-Stammlösung mit DMEM/F12 verdünnen, um eine 50 nM Arbeitslösung zu erhalten. Bewahren Sie die Lösung während des gesamten Vorgangs vor Licht geschützt auf.
  2. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die konfokalen Schalen 2x mit frischem DMEM/F12.
  3. Die Zellen werden in jeder Schale mit 1 ml der MitoTracker-Arbeitslösung 15 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert.
  4. Entfernen Sie die MitoTracker Arbeitslösung und waschen Sie sie 2x mit DMEM/F12.
  5. Geben Sie 1 ml DMEM/F12 in jede Schale und inkubieren Sie vor der Bildgebung im Zellinkubator.

4. Bildgebende Parameter für das Konfokalmikroskop

  1. Äquilibrieren Sie das Mikroskop für nachfolgende Operationen. Passen Sie im Erfassungsfenster die lichtwegbezogenen Parameter an, indem Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen einstellen.
  2. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Lochblende, 1,2 AE; Pixelscangröße, 1.024 x 1.024; Pixelverweilzeit, 2,4 μs (durchschnittlich 2x)  (halten Sie sie für Kalibrierungszwecke konsistent).

5. Optimierung der Bildgebungsparameter

ACHTUNG: Vermeiden Sie es, das Auge sowohl direkter als auch gestreuter Strahlung von einem sichtbaren und/oder unsichtbaren Laser auszusetzen.

  1. Verwenden Sie das Halogenlicht, um die Zellen mit einer planapochromatischen 60-fach-Objektivlinse (1,4 NA) zu fokussieren, um Phototoxizität zu vermeiden.
  2. Stellen Sie die Laserleistung und die Hochspannung (HV) auf knapp unter den Sättigungsgrad ein, stellen Sie den Zoomfaktor auf 3 ein und nehmen Sie dann die Bilder auf.
  3. Verschieben Sie den Interessenbereich und fokussieren Sie sich auf die Zellen, um Bilder aufzunehmen, ohne die Einstellungen zu ändern.

6. Datenanalyse

HINWEIS: Die Daten wurden mit ImageJ analysiert, auf dem das MiNA-Plug-in13 vorinstalliert war. Um genaue, relevante Messungen zu erhalten, sollten Bilder unabhängig aufgelöste Mitochondrien mit sauberer und heller Färbung erfassen.

  1. Um die Bildqualität vor der binären Transformation und Skelettierung zu verbessern, öffnen Sie das Bild und führen Sie eine vorläufige Verarbeitung durch. Verwenden Sie das ROI-Werkzeug, um den Bereich einer einzelnen Zelle auszuwählen. Wenden Sie den Prozess an | Filter | Unscharf maskieren, um die Schärfe zu verbessern, und verwenden Sie die Funktion Prozess | Die Funktion "Kontrast verbessern", um die Überverstärkung des Rauschens zu reduzieren. Um Salz- und Pfefferrauschen speziell zu entfernen, verwenden Sie die Schaltfläche Prozess | Filter | Medianfunktion (siehe Ergänzende Abbildung S1).
  2. Um ein vereinfachtes morphologisches Modell zur Berechnung beschreibender Parameter zu erstellen, konvertieren Sie das Bild über Schwellenwerte in ein binäres Bild (klicken Sie auf Prozess | Binär | Als Binär erstellen) und skelettieren Sie dann das Binärbild mit der Funktion Skelettieren (klicken Sie auf Prozess | Binär | Skelettieren) (siehe ergänzende Abbildung S2).
  3. Gruppieren Sie alle Pixel innerhalb des Skeletts mit der Schaltfläche Analysieren | Skelett | Funktion Skelett analysieren (2D/3D). Vereinfachen Sie die Analyse, indem Sie mit dem MiNA-Tool neun beschreibende Parameter im skelettierten Bild berechnen (siehe Ergänzende Abbildung S3).

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes, schrittweises Verfahren für die mitochondriale morphologische Analyse durch drei voneinander abhängige Optimierungsmodule: Standardisierung von Probenvorbereitungsprotokollen, systematische Optimierung optischer Parameter für die konfokale Mikroskopie und Richtlinien für die computergestützte Bildverarbeitung. Ein optimales Probenvorbereitungsprotokoll ist entscheidend für die Gewinnung zuverlässiger mitochondrialer Bildgebungsdaten. Die systematische Auswertung der MitoTrac...

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Diskussion

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Die vorliegende Arbeit etabliert eine systematische Methodik zur Analyse der mitochondrialen Morphologie in lebenden Zellen unter Stressbedingungen. Zu den entscheidenden Verfahrensschritten in der mitochondrialen Bildgebung gehören: eine angemessene Konzentration der MitoTracker-Sonden, das gründliche Spülen des konfokalen Geschirrs vor der Bildaufnahme, die Minimierung von Störungen des zellulären Zustands und die Einstellung geeigneter Bildgebungsparameter.

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81974501) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Methyl-4-phenylpyridiniumiodid (MPP+)MacklinM875357Wird verwendet, um oxidativen Stress zu induzieren
Konfokale SchaleNEST801001Wird verwendet, um die Zellen zu kultivieren
Konfokales MikroskopNikonC2Wird zum Aufnehmen von Bildern verwendet
Dulbecco's Modifiziertes Eagle Medium/Nährstoff-Gemisch F-12ThermoFisher Scientific11320033Wird verwendet, um Zellen mit Nährstoffen zu versorgen
Dimethylsulfoxid (DMSO)BeyotimeST038Wird verwendet, um die Mitotracker-Sonde aufzulösen
Fötales Rinderserum (FBS)ThermoFisher ScientificA3161001CWird verwendet, um Zellen mit Nährstoffen zu versorgen
BildJNationale GesundheitsinstituteBildJWird zur Analyse der mitochondrialen Morphologie verwendet
MitoTracker Red CMXRosThermoFisher ScientificM7512Wird verwendet, um Mitochondrien zu visualisieren
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)ThermoFisher ScientificC10010500BTWird verwendet, um die Zellen auf konfokalen Schalen zu waschen
SH-SY5Y ZelleATCCCRL-2266Wird verwendet, um den Arbeitsablauf bei der Analyse der mitochondrialen Morphologie zu demonstrieren
TI-SH-U TischadapterNikonMEC59110Wird zur Sicherung von Proben verwendet

Referenzen

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  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
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Schlagwörter

MitoTracker StainingSH SY5Y CellsMitochondrial FusionMitochondrial FissionFluorescence ImagingSkeletonization AnalysisMPP StimulationImage Segmentation

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