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Methodenartikel

Spatel Montevideo Gerät für die Vitrifizierung von Säugetierembryonen

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DOI:

10.3791/68176

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6. Juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Animal Biotechnology Unit, Institut Pasteur de Montevideo, 2Centro de Esterilidad Montevideo, 3Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal de Uruguay

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir das Spatel-Montevideo-Protokoll für die Vitrifizierung von Präimplantationsembryonen von Mäusen und Schafen vor, das aus einem hausgemachten Spatel und der Verwendung hausgemachter Lösungen besteht. Die Embryonen werden schnell in zwei Kryoprotektiva-Lösungen mit zunehmender Konzentration äquilibriert, auf den Spatel geladen, in flüssigen Stickstoff getaucht und schließlich mit einem 0,5-ml-Strohhalm versiegelt.

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine effiziente und kostengünstige Vitrifikationsmethode für die Kryokonservierung von Maus- und Schafembryonen, die als Spatula Montevideo (MVD) bekannt ist. Bei diesem Protokoll wird ein selbstgemachter Spatel als Trägergerät verwendet, der mit einer Gelladerspitze vorbereitet ist. Die Embryonen werden schnell in zwei hausgemachten Kryoprotektiva-Lösungen mit zunehmender Konzentration äquilibriert, in den Spatel geladen und dann direkt in flüssigen Stickstoff getaucht. Etwa 30-40 Mausembryonen aus dem Präimplantationsstadium können auf den Spatel geladen werden, der anschließend mit einem 0,5-ml-Strohhalm verschlossen wird. Die Verwendung von Spateln anstelle von Kryoröhrchen, die häufig zur Lagerung von vitrifizierten Embryonen verwendet werden, optimiert den Platz in den Flüssigstickstoff-Dewars. Darüber hinaus erfordert der Erwärmungsprozess nur eine hausgemachte Saccharoselösung mit abnehmender Konzentration, um die Embryonen zu rehydrieren und ihre Morphologie wiederherzustellen. Unser Labor verwendet den Spatel Montevideo seit über 10 Jahren erfolgreich für Präimplantationsembryonen von Mäusen und Schafen. Der Spatel Montevideo hat bei Mausembryonen eine durchschnittliche Heilungsrate (geborgene/vitrifizierte Embryonen) von 84 % und eine Überlebensrate (lebensfähige/wiedergewonnene Embryonen) von 97 % gezeigt. Die Vitrifikation von murinen Embryonen hat zu besseren Ergebnissen geführt als das langsame Einfrieren, obwohl keine Unterschiede in den Fortpflanzungsergebnissen (Schwangerschaft, Geburt und Geburtenrate) beobachtet wurden. Bei Schafembryonen wurden mit dem Spatel Montevideo im Vergleich zu einem kommerziellen Gerät ähnliche Überlebens- und Embryoentwicklungsraten erzielt. Obwohl die Trächtigkeitsrate bei dem kommerziellen Gerät höher war, unterschied sich die Überlebensrate der Lämmer nicht signifikant zwischen den Geräten. Die Vitrifikationsmethode des Spatels Montevideo ist eine einfache Kryokonservierungstechnik, die zur Lagerung überschüssiger Embryonen, zur Sicherung genetisch veränderter Mauslinien und Schafmodelle und zur Erleichterung ihres Austauschs zwischen Forschern weltweit verwendet werden kann.

Einleitung

Die Effizienz der Erzeugung gentechnisch veränderter (GV) Tiere hat sich durch die Entwicklung von Endonukleasen-basierten Methoden, insbesondere CRISPR/Cas9, erheblich erhöht. Viele Labore weltweit produzieren verschiedene gentechnisch veränderte Maus- und Rattenlinien, die kryokonserviert werden sollten, um genetische Drift zu verhindern und die Integrität des ursprünglichen Phänotyps1 zu erhalten. Darüber hinaus entfällt durch die Archivierung die Notwendigkeit einer ständigen Zucht, die oft zu einer übermäßigen Anzahl von Tieren führt. Einige Laboratorien senden gentechnisch veränderte Mauslinien als kryokonservierte Embryonen oder Spermien an internationale Repositorien, um den Austausch dieser Modelle zu erleichtern und gleichzeitig den Transport lebender Tiere zu vermeiden. Dies gewährleistet die Zugänglichkeit zu den Linien ohne die wiederholte Generierung identischer gentechnisch veränderter Tiermodelle2. Aus diesen Gründen ist die Kryokonservierung von Embryonen und Spermien in jeder GV-Tiereinrichtung von größter Bedeutung. Im Allgemeinen wird die Kryokonservierung von Embryonen für die Lagerung von GV-Linien bevorzugt, da Embryonen das vollständige diploide Genom mit Modifikationen enthalten und leicht durch Embryotransfer gewonnen werden können.

Die Vitrifikation ist ein Nichtgleichgewichtsprozess, der durch ein Ungleichgewicht zwischen Wasser, das in die Zelle eindringt, und Wasser, das extrazelluläre Kristalle um sie herum bildet, gekennzeichnet ist. Diese Methode verhindert die Bildung von intrazellulären Eiskristallen und unterscheidet sie von der Slow Freezing Method (SLF)3 (siehe Abbildung 1). Die hohe Konzentration an Kryoprotektiva und der direkte Kontakt mit flüssigem Stickstoff (LN2) ermöglichen eine ultraschnelle Abkühlung (~40 °C/s), wodurch innerhalb von Sekunden ein glasartiger Zustand der Proben erreicht wird. Darüber hinaus ist die Vitrifikation schneller, einfacher und kostengünstiger als das langsame Einfrieren4. Es werden nur minimale LN2 benötigt und in der Regel einfache Geräte verwendet, die kommerziell erworben oder selbst hergestellt werden können5 (siehe Abbildung 1).

Darüber hinaus ist der Erwärmungsprozess in der Regel schnell und replizierbar. Sie sollte schnell durchgeführt werden, um eine Toxizität des Kryoprotektivums zu vermeiden und den glasartigen Zustandaufrechtzuerhalten 3. Beim Einfrieren von Embryonen berücksichtigen viele Labore die Bequemlichkeit des Trägergeräts, seine Zuverlässigkeit, Robustheit, Haltekapazität und Kosten.

Wir bevorzugen die Vitrifikationsmethode mit Spachtel mit minimalem Volumen für die routinemäßige Kryokonservierung von Schaf- und Mausembryonen mit dem Spatel Montevideo (MVD) 6. Anfangs haben wir die Methode des langsamen Einfrierens7 angewendet, sind aber schnell zur Vitrifikation übergegangen. Um ein einfacheres und platzsparenderes Gerät für den LN2 Dewar zu schaffen, haben wir den selbstgemachten Spatel von Tsang and Chow (2009)8, der in ein Kryoröhrchen gesteckt wird, modifiziert, um den Spatel MVD zu entwickeln, der mit einem 0,5 mL Strohhalm verschlossen wird (siehe Materialtabelle). Der Spatel verfügt über eine Gelladerspitze (siehe Materialtabelle), bei der eine Plattform von ca. 1 mm² gebildet wird, indem die Spitze mit einer feinen Pinzette sanft geschmolzen wird, wodurch eine blütenblattartige Platte zum Laden der Embryonen entsteht. Diese Plattform kann bis zu 40 Mausembryonen in einem kleinen Vitrifikationstropfen aufnehmen. Eine Verschlussstange zur Identifizierung (siehe Materialtabelle) wird in das offene Ende der Gelladerspitze eingeführt.

Ziel dieser Methode ist es, Embryonen auf eine einfache, schnelle und kostengünstige Weise zu vitrifizieren, die zudem Platz im Stickstoffdewar spart. Dieses System wird seit vielen Jahren erfolgreich eingesetzt und bietet hervorragende Überlebensraten (~97%) und Fortpflanzungsergebnisse, insbesondere bei Mausembryonen. Da der Spatel MVD im Labor hergestellt wird, ist er im Vergleich zu kommerziellen Geräten eine kostengünstige Methode9. Darüber hinaus spart es im Vergleich zur Verwendung von Kryoröhrchen 8,10 Platz im Stickstoffdewar.

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Abbildung 1: Vergleich der beiden wichtigsten Techniken, die für die Kryokonservierung von Embryonen verwendet werden. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Crispo et al.1 geändert. Erstellt im BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

Tiere, die zur Gewinnung von Mausembryonen verwendet wurden, wurden gemäß dem nationalen Gesetz 18.611 und den internationalen Tierhaltungsrichtlinien11 untergebracht und behandelt. Das Versuchsprotokoll (Genehmigungsnummer #007-18) wurde zu gegebener Zeit vom Ausschuss für Tierpflege und -verwendung des Institut Pasteur de Montevideo genehmigt (schriftliche Zustimmung). Die Versuchsprotokolle für Eizellen/Embryonen von Schafen wurden vom Institutional Animal Care Committee Fundación IRAUy (Protokoll #001-2017) genehmigt, die den ARRIVE-Richtlinien12 entsprechen und in Übereinstimmung mit den internationalen Tierhaltungsrichtlinien11 durchgeführt wurden.

1. Vitrifikation (Abbildung 2)

  1. Spatel MVD Vorbereitung
    1. Kürzen Sie die Spitze des Gelladers (siehe Materialtabelle), indem Sie die ersten 10 mm und den Spitzenkegel abschneiden.
      HINWEIS: Dadurch entsteht eine kürzere, gerade Spitze, die die endgültige Versiegelung mit dem 0,5-ml-Strohhalm erleichtert (siehe Materialtabelle).
    2. Halten Sie das Ende der Gelladerspitze mit der Pinzette #5 des Uhrmachers (siehe Materialtabelle) ca. 1,0 cm von der Spitze entfernt. Legen Sie die Spitze vorsichtig in die Flamme eines Bunsenbrenners (siehe Materialtabelle) und halten Sie sie 8-10 s lang, um eine blütenblattartige Plattform von ca. 1 mm2 zu bilden.
    3. Von der Flamme nehmen und mit der Pinzette 5 s fest halten.
    4. Überprüfen Sie mit einem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle), ob die blütenblattartige Plattform (~ 1 mm2) gebildet und der distale Rand versiegelt ist.
      HINWEIS: Die Plattform muss am distalen Ende geschlossen werden, um eine Infiltration von LN2 während der Vitrifikation zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Plattform sauber und frei von Kunststofffäden ist. Wenn es zu klein ist oder Fäden hat, schneiden Sie die Spitze ab und wiederholen Sie den Vorgang.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4, um die erforderliche Anzahl von Spateln vorzubereiten (1 Spatel = bis zu 40 Mausembryonen).
    6. Sterilisieren Sie die Spatel mit ultravioletten (UV) Strahlen oder Ethylenoxid und bewahren Sie sie in einer sterilen Tube oder Box auf.
    7. Nehmen Sie am Tag der Vitrifikation die Spatel und berühren Sie sie vom gegenüberliegenden Ende der Plattform. Führen Sie in jeden Spatel einen Identifikationsstab (siehe Materialtabelle) ein und legen Sie ihn auf die Stereomikroskopbasis. Beschriften Sie den Stab mit einem Permanentmarker oder einem Aufkleber mit flüssigem Stickstoff.
      HINWEIS: Vermeiden Sie immer, die Plattform zu berühren, wenn Sie mit den Spateln hantieren. Die Gesamtlänge des gesamten Geräts (Spatel + 0,5 ml Strohhalm + Identifikationsstab) sollte nicht mehr als 1 cm der Länge des Bechers überschreiten.
  2. Herstellung von Vitrifikationslösungen
    1. Bereiten Sie die FS-Lösung vor: Lösen Sie 1,5 g Dichtegradientenmedium (siehe Materialtabelle) und 0,85 g Saccharose (siehe Materialtabelle) in 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; siehe Materialtabelle). In einem kochenden Wasserbad erhitzen, bis es sich vollständig aufgelöst hat, dann mit einem 0,22-μm-Filter sterilisieren (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
    2. Bereiten Sie die Vor-Vitrifikationslösung (PV) vor: Mischen Sie am Tag der Vitrifikation 10 % Ethylenglykol (siehe Materialtabelle), 10 % Dimethylsulfoxid (siehe Materialtabelle) und 80 % M2 Medium (siehe Materialtabelle). Für 5 Spatel wird ein Gesamtvolumen von 100 μL benötigt.
    3. Bereiten Sie die Vitrifikationslösung (V) vor: Mischen Sie am Tag der Vitrifikation 15 % Ethylenglykol, 15 % Dimethylsulfoxid, 10 % M2 Medium und 60 % FS-Lösung. Für 5 Spatel wird ein Gesamtvolumen von 100 μL benötigt.
  3. Dehydrierung und Vitrifikationsprozess des Embryos
    1. LN2 vorbereiten: Gießen Sie LN2 in ein geeignetes Gefäß (z. B. einen isolierten Styroporbehälter von 10 cm x 30 cm x 20 cm) und legen Sie so viele 0,5-ml-Strohhalme wie Spatel zur Verwendung.
      HINWEIS: Um die Visualisierung der Spachtelplattform während der Manipulation unter LN2 zu erleichtern, wird empfohlen, einen farbigen, bodenisolierten Polystyrolbehälter zu verwenden, um einen Kontrasteffekt zu erzielen.
      ACHTUNG: Tragen Sie beim Umgang mit LN2 eine geeignete Schutzbrille und Handschuhe (siehe Materialtabelle).
    2. Lösungen vorbereiten: Geben Sie die folgenden Tropfen auf eine 100-mm-Petrischale aus Kunststoff (siehe Materialtabelle): 100 μl M2, 20 μl PV-Lösung und 20 μl V-Lösung für jeden Spatel.
    3. Vitrifizierende Embryonen: Legen Sie die zu vitrifizierenden Embryonen in den M2-Tropfen. Behandeln Sie 30-40 Embryonen auf einmal, inkubieren Sie sie 30 s lang in der PV-Lösung und dann weitere 30 s bei Raumtemperatur (RT) in der V-Lösung.
    4. Verwenden Sie eine gezogene Glaskapillare (siehe Materialtabelle) mit einer Aspiratorrohrbaugruppe (siehe Materialtabelle). Belasten Sie die Kapillare mit mindestens 1 μl der jeweiligen Lösung, bevor Sie die Embryonen einsetzen.
      HINWEIS: Die Embryonen befinden sich in den Tropfen auf unterschiedlichen Höhen, stellen Sie also das Stereomikroskop-Mikrometer ein, um sie zu lokalisieren. Entnehmen Sie Embryonen aus jedem Tropfen, wenn noch 10 s übrig sind. Alle Manipulationen an Embryonen müssen unter dem Stereomikroskop durchgeführt werden.
    5. Embryonen laden: Aspirieren Sie die Embryonen mit minimaler V-Lösung (z. B. ~ 0,1 μL) und legen Sie sie schnell auf die Spatelplattform.
    6. Eintauchen in LN2: Nach dem Laden der Embryonen tauchen Sie die Spatelplattform sofort für 5 s in LN2 ein (halten Sie den Spatel mit der Hand, an seinem Stab). Halten Sie den Spatel dann in LN2-Dämpfen und verschließen Sie ihn mit einem 0,5-ml-Strohhalm mit einer langen Pinzette aus Edelstahl (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Entfernen Sie LN2 vor dem Versiegeln aus dem Strohhalm, um eine Ausdehnung während der Erwärmung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass der Spatel und der Strohhalm richtig ausgerichtet sind, um einen Kontakt zwischen dem Embryotropfen und der Strohhalmwand zu vermeiden. Der Einfachheit halber können versiegelte Spatel im LN2-Behälter verbleiben, bis alle Spatel mit Embryonen beladen sind, und bei Bedarf mit LN2 nachgefüllt werden.
    7. Wiederholen Sie das Verfahren: Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3 bis 1.3.7 für jede Gruppe von Embryonen mit einem frischen Paar PV- und V-Tropfen.
    8. Lagerung: Füllen Sie den Spachtel in Becher (siehe Materialtabelle) und dann in einen LN2 Lagerdewar (siehe Materialtabelle).

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Abbildung 2: Schema des Vitrifikationsprozesses mit Spatel MVD. Weitere Informationen finden Sie im Text. Erstellt in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Erwärmung (Abbildung 3)

  1. Vorbereitung der Lösung
    1. Bereiten Sie eine 1 M Saccharoselösung vor, die 0,85 g Saccharose in 2,5 ml M2-Medium auflöst. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter.
      HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 1 Woche bei 4 °C zubereitet und gelagert werden.
    2. Bereiten Sie 0,5 M und 0,25 M Saccharoselösungen vor, indem Sie die 1 M Saccharoselösung mit dem entsprechenden Volumen M2 Medium verdünnen.
    3. Die Saccharoselösungen auf einer heißen Platte (siehe Materialtabellen) bis zum Beginn der Erwärmung bei 37 °C halten.
  2. Vorbereitung der Warmhalteplatte
    1. Geben Sie auf eine 100 mm Petrischale aus Kunststoff die folgenden Lösungstropfen: einen 500 μl Tropfen 0,5 M Saccharose, einen 50 μl Tropfen 0,5 M Saccharose und einen 50 μl Tropfen 0,25 M Saccharose für jeden zu erwärmenden Spatel. Geben Sie drei Tropfen M2 Medium (je 100 μl) zum Waschen.
  3. Prozess der Erwärmung
    HINWEIS: Der Erwärmungsprozess findet bei RT, z.B. 20-22 °C, an der Basis eines Stereomikroskops statt.
    1. Nehmen Sie die versiegelten Spachtel aus dem Dewar. Platzieren Sie sie in einem geeigneten Behälter mit LN2. Siehe Abbildung 3.
    2. Legen Sie die Warmhalteplatte auf das Stereomikroskop. Halten Sie den Boden des Spatels nacheinander mit einer Edelstahlpinzette fest und ziehen Sie mit einer behandschuhten Hand den Identifikationsstab und dann den Strohhalm heraus. Tauchen Sie die Plattform mit den Embryonen schnell in den 0,5 M Saccharosetropfen von 500 μl.
    3. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen in den Tropfen gefallen sind. Bewegen Sie den Spatel bei Bedarf vorsichtig, um das Lösen zu erleichtern. Laden Sie die Embryonen in eine gezogene Glaskapillare, legen Sie sie in den 50-μl-Tropfen 0,5 M Saccharoselösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.
    4. Legen Sie die Embryonen in den 50 μl Tropfen 0,25 M Saccharoselösung und inkubieren Sie weitere 2 Minuten.
      HINWEIS: Bevor Sie die Embryonen in jede Lösung legen, laden Sie die Kapillare mit der zu verwendenden Lösung.
    5. Zum Schluss waschen Sie die Embryonen dreimal in verschiedenen Tropfen M2-Medium, um die Saccharose zu entfernen.
    6. Die Embryonen werden vor der Verwendung mindestens 1 Stunde lang unter für jede Art geeigneten Bedingungen inkubiert.

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Abbildung 3: Schema des Spatel-MVD-Erwärmungsprozesses. Weitere Informationen finden Sie im Text. Erstellt in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

Zunächst verwendeten wir die traditionelle Methode des langsamen Gefrierens, die auf Propylenglykollösungen, Strohhalmen und Gefriergeräten mit kontrollierter Rate basiert7. Nachdem wir jedoch die Vitrifikationsmethode als potenziell einfachere und kostengünstigere Option betrachtet hatten, führten wir eine Studie durch, um die Ergebnisse des traditionellen langsamen Einfrierens (SLF) mit dem MVD des Spatels bei 8-zelligen in vivo abgeleiteten und 2-z...

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Diskussion

Der Spatel MVD ist ein einfach zu montierendes, kostengünstiges Vitrifikationsgerät mit minimalem Volumen mit hoher Embryoaufnahmekapazität und optimaler Flüssigstickstoff-Dewar-Belegung. Diese Methode hat sich als einfach, schnell und robust erwiesen. Im Durchschnitt haben wir nicht nur eine hohe Embryogenesungs- und Überlebensrate von vitrifizierten Embryonen (~90%) erzielt, sondern auch gute Reproduktionsergebnisse beim Embryotransfer bei Mäusen (~80% Schwangerschaftsrate und ~30% Geb...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken Alejo Menchaca für seinen Beitrag zur Entwicklung des Spatels MVD. GS erhielt eine Förderung durch das Postgraduiertenprogramm Biotechnologie - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (Fördernummer: GS 2437 347). GS, MNM und MC erhielten eine Finanzierung durch FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) (Fördernummer: COF 03/11). GS und MC sind Stipendiaten des Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay. (https://www.anii.org.uy/). Die Geldgeber (Postgraduiertenprogramm für Biotechnologie - Facultad de Ciencias - Universidad de la República; FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur; Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay) spielte keine Rolle bei der Konzeption der Studie, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m Filter Schneidermuskel16534Minisart Spritzenfilter 0,2 &Mikro; L
0,5 mL Strohhalm Miniröhre13408/0044Mittlere Paillette französischer Typ
Montage des Absaugrohrs SigmaNr. A5177
Bunsenbrenner Indulab7000134
Dimethylsulfoxid SigmaNr. D2650
Ethylenglykol Sigma102466
Ficoll PM70 SigmaNr. F2878Dichtegradient mittel
Gellader-SpitzeEppendorf 10411193
Glaskapillare Marienfeld2900000Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen
Handschuhe für LN2 Handhabung TempshieldCE0338Kryohandschuhe
KelchgläserMiniröhre16913/1133
Schutzbrille für LN2 Handhabung   3M  40661-00000-10Anti-Beschlag-, Anti-Kratz-Beschichtung
KochplatteLabecLA-SH-II-5BDigitales Modell
Identifikationsstab IMV-Technologien6326Unsteril LG48 mm
Isolierter Styroporbehälter
LN2 Dewar für LagerungTaylor-WhartonXT21-AIKryowissenschaften
Lange Pinzette aus EdelstahlWerkzeuge für die Feinwissenschaft11000-25
M2 SigmaNr. M7167
PBS HausgemachtPhosphatgepufferte Kochsalzlösung. In der Regel wird 1 L konzentrierter 5x Puffer hergestellt und dann auf 1x verdünnt. Rezeptur: 40 g Natriumchlorid, 1 g Kaliumchlorid, 7,2 g wasserfreies Dinatriumphosphat, 1,2 g Monokaliumphosphat. Destilliertes Wasser hinzufügen und im Autoklaven sterilisieren.
Petrischale aus KunststoffFalke    351029Nicht TC-behandelte bakteriologische Petrischale
Stereomikroskop OlympSZ2-LGB
Saccharose SigmaNr. S1888
Uhrmacher" s #5 Pinzette Werkzeuge für die Feinwissenschaft11254-20

Referenzen

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