Methodenartikel

Verbesserte Genverabreichung und -expression durch intraossäre Injektion von Chitosan-Nanopartikeln, verkapselten Adenin-Base-Editor-Plasmiden

DOI:

10.3791/68181

⸱

16. Mai 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir einen gentherapeutischen Ansatz vor, bei dem ABE-beschichtetes Chitosan durch intraossäre Injektion direkt ins Knochenmark abgegeben wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verabreichung exogener Plasmide in Versuchstiere ist in der biomedizinischen Forschung von entscheidender Bedeutung, einschließlich der Untersuchung von Genfunktionen, der Aufklärung von Krankheitsmechanismen und der Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten. Die Transfektionseffizienz der aktuellen Methode ist jedoch relativ gering, und die Einführung von Plasmiden für die langfristige Genexpression kann durch das Immunsystem beeinflusst werden. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir eine neuartige Methode entwickelt und untersucht, bei der Chitosan verwendet wird, um Adenin-Base-Editor-Plasmide (ABE) einzukapseln und den Komplex dann durch intraossäre Injektion direkt in das Knochenmark von Mäusen zu bringen. In dieser Studie verwendeten wir Chitosan, um das CaMK II δ-Gen zu verkapseln, das eng mit der Osteoklastendifferenzierung zusammenhängt, um ABE CaMK II δ Plasmide zu verkapseln. Wir injizierten die Plasmidfracht durch intraossäre Injektion direkt in die Knochenmarkhöhle. Die Ergebnisse zeigten eine hohe in vivo Editierungseffizienz von 14,27% am A1-Locus und 10,69% am A2-Locus bei Empfängermäusen. Diese neuartige Strategie eignet sich nicht nur besonders für Krankheiten, die durch eine gestörte Osteoklastenfunktion verursacht werden, sondern birgt auch ein erhebliches Potenzial für die Weiterentwicklung des Feldes der Gentherapie.

Einleitung

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Die Gentherapie hat sich als vielversprechender Ansatz im Bereich der biomedizinischen Forschung erwiesen 1,2. Es bietet das Potenzial, eine Vielzahl von Erkrankungen zu behandeln, indem fremde Plasmide in Versuchstiere eingeführt werden, um die Expression spezifischer Gene zu modulieren und ihre therapeutischen Wirkungen zu untersuchen. Herkömmliche Verabreichungsmethoden sind jedoch auf einige Probleme gestoßen, die ihre Wirksamkeit und Sicherheit einschränken3. Zu den Bedenken gehören eine geringe Transfektionseffizienz, ein hoher biologischer Schaden und eine geringe Genexpressionseffizienz. Daher ist es notwendig, eine neuartige Verabreichungsmethode für die Gentherapie zu etablieren, die diese Einschränkungen überwinden kann.

Chitosan ist ein natürliches Polysaccharid mit guter biologischer Abbaubarkeit und Biokompatibilität 4,5,6, das es leicht macht, es im Tierkörper abzubauen, ohne eine ernsthafte biologische Toxizität zu verursachen. Es wird aufgrund seiner hohen Wirkstoffeinbettungsrate 7,8, seiner verbesserten Verabreichungseffizienz und seiner geringeren Schädigung von Tieren häufig bei der Verabreichung von Arzneimitteln eingesetzt.

Die ABE-Gen-Editing-Technologie, die eine direkte Umwandlung von Basenpaaren von A-T in G-C ermöglicht, ist in der genetischen und medizinischen Forschung vielversprechend. Im Vergleich zur aktuellen Mainstream-Gen-Editing-Technologie kann die ABE-Technologie eine genaue Einzelbasenmutation erzielen, wodurch die Editierung von Nicht-Ziel-DNA-Sequenzen reduziert, Off-Target-Effekte reduziertwerden 9,10 und zu null DNA-Doppelstrangbrüchengeführt werden 11, was das Risiko einer Gen-Editierung erheblich reduziert12. Die ABE-Technologie ist zudem sehr biokompatibel und eignet sich besser für die Erforschung der Krankheitsbehandlung.

Die Injektion von Schwanzvenen ist eine gängige Methode zur In-vivo-Verabreichung von Plasmiden, insbesondere in der Gentherapie. Das Zielgen für diese Studie ist CaMK II δ, das eng mit der Osteoklastendifferenzierung zusammenhängt13,14. Durch die intraossäre Injektion anstelle der Schwanzvene kann das editierte Plasmid direkt in das Knochenmark in die Osteoklasten gelangen. Diese direkte Übertragung auf das Knochenmark erhöht die Effizienz und Stabilität der Genexpression, was für die Behandlung von Krankheiten, die mit einer Osteoklastendysfunktion verbunden sind, von Vorteil ist.

Hier stellen wir eine neuartige Methode vor, bei der das ABE-Plasmid mit Chitosan verkapselt und der Komplex dann durch intraossäre Injektion direkt in Mäuse eingeführt wird. Wir hoffen, mit dieser Methode den Weg für effektivere gentherapeutische Behandlungen für fremde Plasmide zu ebnen, die in Organismen eindringen, insbesondere für Krankheiten, die mit Osteoklastendysfunktion verbunden sind.

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Protokoll

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Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Tiergesundheitsausschuss der Universität Anhui für die Verwendung und Pflege von Tieren genehmigt. In dieser Studie wurde ABE großzügig von Professor Tian Chi (Shanghai University of Science and Technology, Shanghai, China ; Abbildung 1D).

1. Aufbau des ABE-Plasmids

  1. Entwerfen Sie gRNA mit der Sequenz TCCATGATGCACAGACA, wobei PAM durch GAC präsentiert wird.
  2. Gemäß dem Leitfaden der Primerliste des Unternehmens wird der Primer mit dem entsprechenden Volumen von ddH2O angereichert, um eine Konzentration von 100 μM zu erreichen. Dann schütteln und gründlich mischen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Für die Glühreaktion wird eine 10 μM-Lösung hergestellt, indem 10 μl der Stammprimerlösung in das neue Mikrozentrifugenröhrchen und 90 μl ddH2O gegeben und gut gemischt werden.
  3. Geben Sie 5 μl Upstream-Primer, 5 μL Downstream-Primer und 40 μL ddH2O in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Glühreaktion zu erleichtern, tauchen Sie das Rohr 5 Minuten lang in einen mit kochendem Wasser gefüllten Behälter. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand nicht die Öffnung des Rohrs erreicht, um zu verhindern, dass Wasser eindringt und die Zündhütchen verunreinigt. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen, um die Glühreaktion abzuschließen.
  4. 2 μg pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (Abbildung 1D), 1 μl ESP3I, 4 μl Puffer und 33 μl ddH2O in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C für 45 min reagieren lassen.
  5. Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese durch. Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Gel zu, indem Sie 0,5 g Agarose wiegen und in eine Glasflasche füllen. Geben Sie 50 mL 1x TAE-Puffer in die Glasflasche und schütteln Sie, um das Agarosepulver aufzulösen. In der Mikrowelle 2 Minuten erhitzen, bis sie vollständig geschmolzen sind. Fügen Sie 5 μl YeaRed Nukleinsäure-Gel-Färbung hinzu, mischen Sie sie gründlich und gießen Sie sie in die Gelform; Nachdem das Gel fest geworden ist, beginnen Sie mit dem Hinzufügen der Proben.
    HINWEIS: Verwenden Sie zur Herstellung von 1xTAE die in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien.
  6. Geben Sie 1x TAE in den Elektrophorese-Tank und geben Sie den konfigurierten Agarose-Gel-Block hinein, der in TAE getaucht werden soll. 5 μl 1x Ladepuffer zum Aufschlussprodukt aus Schritt 1.4 geben und mischen. Geben Sie die Probe in das Gel. Fügen Sie dem Gel zusätzlich 6 μl Marker hinzu.
  7. Führen Sie das Elektrophoreseprogramm bei einer konstanten Spannung von 110 V für 35 min durch. Bestimmen Sie nach der Elektrophorese die Position der Bande in der Probe entsprechend dem Marker und schneiden Sie den Gelstreifen mit einer sauberen Klinge für die Gelrückgewinnung ab.
  8. Führen Sie den Gel-Wiederherstellungsvorgang gemäß den Anweisungen des Gel-Maxi-Reinigungskits durch. Stellen Sie ein Wasserbad auf 50 °C ein. Geben Sie das entsprechende Volumen der PN-Lösung in das Röhrchen mit dem geschnittenen Gel gemäß dem Kit. Stechen Sie das Gel mit einer Pipettenspitze ein, um das Auflösen zu erleichtern, und geben Sie es dann in das Wasserbad. Schütteln Sie die Tube von Zeit zu Zeit und beobachten Sie den Auflösungsprozess, bis sich der Gelblock vollständig aufgelöst hat.
  9. Nehmen Sie eine Spin-Säule, CA3, aus dem Bausatz. Geben Sie 500 μl BL-Lösung aus dem Kit in die Spin-Säule und zentrifugieren Sie sie 1 Minute lang bei 2.000 x g , um die Säule auszugleichen. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Abfallflüssigkeit am Boden des Auffangröhrchens und setzen Sie die Adsorptionssäule wieder in das Auffangröhrchen ein.
  10. Die Zentrifugation bei 2.000 x g für 1 min fortsetzen. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit am Boden des Zentrifugenröhrchens, fügen Sie 600 μl PN-Lösung hinzu und zentrifugieren Sie 2.000 x g für 30 s; Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit wieder. Wiederholen Sie den Vorgang und entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit erneut.
  11. Ersetzen Sie nach der Zentrifugation das 2-ml-Sammelröhrchen durch ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie ihn 30 Minuten lang an einem belüfteten Ort trocknen, um das Ethanol vollständig zu entfernen. Geben Sie dann vorgewärmte 40 μl ddH2O hinzu, zentrifugieren Sie und eluieren Sie die erforderliche DNA.
    HINWEIS: PN sollte gemäß den Anweisungen mit wasserfreiem Ethanol zugesetzt werden. Die Verwendung von vorgewärmtem Wasser kann die Ausbeute erhöhen.
  12. 7 μl Glühprodukt aus Schritt 1.3, 3 μl Gelrückgewinnungsprodukt aus Schritt 1.11, 1 μl T4-DNA-Ligase, 2 μl 10x T4-Ligase-Puffer und 7 μl ddH2O in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und über Nacht bei 16 °C aufbewahren, um das Ligationsprodukt zu erhalten.
  13. 10 μl Ligationsprodukt und 70 μl DH5α in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 30 min geben. Stellen Sie das Wasserbad auf 42 °C ein. Nach dem Eisbad den Schlauch für 90 s in das Wasserbad legen und dann wieder für 2 min auf Eis legen.
  14. Geben Sie 600 μl Luria-Bertani (LB) flüssiges Medium in das Röhrchen und schütteln Sie es auf einem Shaker für 30 Minuten. Bestrahlen Sie gleichzeitig eine LB-Feststoffmediumplatte in einem Laminar-Flow-Schrank für 30 min. Verteilen Sie nach der Inkubation gleichmäßig 100 μl der Lösung auf der Platte. Stellen Sie die Platte nach dem Beschichten kopfüber in einen 37 °C heißen Bakterieninkubator für die Kultur.
    HINWEIS: DH5α wird in der Regel bei -80 °C gelagert. LB Festmedium wird unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführten Reagenzien hergestellt. LB Flüssigmedium wird unter Verwendung der in Tabelle 3 aufgeführten Reagenzien hergestellt.
  15. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und erweitern Sie die Bakterienkolonie für 14 h auf einem frischen Teller. Nehmen Sie ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 50 ml LB-Flüssigmedium hinzu, fügen Sie 50 μl Ampicillin im Verhältnis 1:1000 hinzu und mischen Sie gut. Teilen Sie dies in neue Röhrchen mit 15 mL pro Röhrchen auf.
  16. Überprüfen Sie die Kulturplatte auf runde weiße Völker mit gutem Wachstum. Wählen Sie diese mit einer 10 μL-Pipette aus und übertragen Sie sie auf das LB-Medium. Kulturieren Sie diese Probe 12 Stunden lang in einem Shaker und senden Sie sie dann zur Sequenzierung.
  17. Vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse mit der Ziel-gRNA, um den Stamm mit der passenden Sequenz, Camk II δ-sgRNA, als Zielstamm zu identifizieren, und extrahieren Sie dann das Plasmid.
  18. Führen Sie die Plasmidextraktion gemäß den Anweisungen des Mini-Plasmid-Kits durch. Geben Sie 500 μl BL in die Adsorptionssäule CP3, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 2.000 x g und entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit. Setzen Sie die Adsorptionssäule wieder in das Sammelröhrchen ein. 500 μl Bakterienlösung zugeben und bei 4.000 x g für 10 min zentrifugieren.
  19. Sammeln Sie den Durchfluss. Zentrifugieren Sie erneut und geben Sie nach Entfernen des Überstands 250 μl P1 in das Zentrifugenröhrchen mit bakterieller Ausfällung und überführen Sie es dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen und einen Wirbel. Fügen Sie 250 μl P2 hinzu und invertieren Sie vorsichtig für 6x-8x. Fügen Sie 350 μl P3 hinzu und invertieren Sie erneut vorsichtig für 6x-8x. Weißer flockiger Niederschlag tritt auf.
  20. 10 min bei 2.000 x g zentrifugieren. Den Überstand in eine neue Adsorptionssäule CP3 überführen, bei 2.000 x g für 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit entfernen. 600 μL PW zugeben, erneut bei 2.000 x g für 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit entfernen. Erneut 600 μL PW zugeben, bei 2.000 x g für 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit entfernen.
  21. Legen Sie die Adsorptionssäule in das Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 2.000 x g , um das restliche PW zu entfernen. Stellen Sie dann die Adsorptionssäule in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen, lassen Sie sie 30 Minuten trocknen, geben Sie 35 μl vorgewärmtes ddH2O in die Mitte des Adsorptionsfilms und lagern Sie das resultierende Produkt bei -20 °C für nachfolgende Tests.
    HINWEIS: PW sollte gemäß den Anweisungen mit wasserfreiem Ethanol zugesetzt werden. Die Verwendung von vorgewärmtem Wasser kann die Ausbeute erhöhen.

2. Extraktion von Knochenmarkzellen

  1. Ausgewählte KM-Mäuse im Alter von 8-9 Wochen, männlich und mit einem Gewicht von etwa 30 g. Fixieren Sie die Mäuse in der linken Hand mit dem Kopf nach unten und injizieren Sie mit der rechten Hand 150 μl 1% Pentobarbital-Natrium von der Seite des Bauches mit einer Spritze. Bestätigen Sie die Anästhesie durch Zehenkneifen.
  2. Führen Sie eine zervikale Luxation von Mäusen durch, entfernen Sie die Tibia mit einer chirurgischen Schere und Pinzette und entfernen Sie das umgebende überschüssige Muskelgewebe. Tränken Sie das entfernte Schienbein in PBS und waschen Sie es, wobei nur saubere Knochen übrig bleiben.
  3. Nehmen Sie 1 ml PBS in einer Spritze, um Knochenmarkzellen von einem Ende der Tibia zu spülen, bis der Knochen weiß ist.
  4. Zellsuspension auffangen und bei 800 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Nach Entfernen des Überstands werden die roten Blutkörperchen mit 500 μl Erythrozytenlysat lysiert. Fügen Sie nach 1 Minute 1 ml Trennpuffer hinzu, um das Erythrozytenlysat zu beenden. Nach dem Zentrifugieren bei 800 x g bei 4 °C für 5 min wird der Überstand entfernt und die Zellen für die spätere Verwendung auf Eis gelegt.
    HINWEIS: Wenn die roten Blutkörperchen vollständig lysiert sind, fallen die Zellen aus und es sind keine roten Blutkörperchen sichtbar. Wenn die roten Blutkörperchen noch zu sehen sind, können sie erneut lysiert werden, aber die Inkubationszeit sollte nicht zu lang sein, um Schäden an anderen Zellen zu vermeiden.

3. Chitosan-Transfektion

  1. Chitosan-Zubereitung: Wiegen Sie 4 mg Chitosan und lösen Sie es in 20 ml 0,2 mg/ml Essigsäurelösung auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,5 mit 10 M NaOH ein. Nehmen Sie 500 μl dieser Lösung und geben Sie sie in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Geben Sie 2 μg, 3 μg, 4 μg und 5 μg ABE-Plasmide in einzelne Röhrchen und lösen Sie sie in 500 μl 30 mM Na2SO4 auf. Mischen Sie 500 μl Chitosanlösung und 500 μl des Plasmids.
  3. Inkubieren Sie sie in einem Wasserbad bei 50-55 °C für 15 Minuten. Nachdem Sie die beiden Lösungen gut vermischt haben, 15-30 s vortexen und 30 min stehen lassen.
  4. Chitosan-Charakterisierung: Analysieren Sie die Durchmesser und Zetapotenziale von Chitosan mithilfe der dynamischen Lichtstreuung (DLS), wobei die Konzentration von Chitosan bei 0,1 mg/ml in ddH2°C gehalten wird. Führen Sie jede Probe 3x durch.
  5. Gießen Sie 0,1 mg/ml-Proben auf einen Siliziumchip. 20 μl der resuspendierten Proben werden in 200-mesh-Gitter gegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gitter 3 min mit 2% Phosphotungstinsäure einfärben und die restliche Flüssigkeit mit Filterpapier entfernen. Beobachten Sie mit einem Transmissionselektronenmikroskop.
  6. Effizienz der Nanopartikelverkapselung: Filtern Sie den Überstand mit einem 0,1 μm-Filter, um die ungefällten Partikel zu entfernen. Laden Sie das Plasmid hoch und messen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer bei 260 nm. Die berechneten Wirkungsgrade von ABE-Plasmid und gRNA-Plasmid betrugen 84 % ± 0,37 % bzw. 85 % ± 0,53 %.
  7. Injizieren Sie 100 μl mit Plasmid eingebettetes Chitosan in Mäuse durch die Knochenmarkhöhle (Schritt 5). Isolieren Sie nach 7 Tagen nach der Injektion die Knochenmarkzellen und lysieren Sie die roten Blutkörperchen, wie in Schritt 2 beschrieben.
  8. Geben Sie 2 ml serumhaltiges DMEM-Medium auf 6-Well-Zellkulturplatten und fügen Sie die Knochenmarkzellen (ca. 1 x 106) hinzu, die in 500 μl serumhaltigem DMEM-Medium suspendiert sind. Messen Sie die Fluoreszenzintensität unter einem Fluoreszenzmikroskop. Das CaMK II δ-sgRNA-Plasmid weist eine rote TagRFP-Fluoreszenz auf, wenn es bei 580 nm angeregt wird (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Serumhaltiges DMEM-Medium wird unter Verwendung der in Tabelle 4 aufgeführten Reagenzien hergestellt.

4. Durchflusszytometrie

  1. Bereiten Sie verschiedene Dosierungen von ABE-Plasmiden vor: 2 μg, 3 μg, 4 μg und 5 μg, und geben Sie sie wie in Schritt 3 beschrieben an Empfängermäuse ab. Isolieren Sie nach 7 Tagen die Knochenmarkzellen von den Mäusen, wie in Schritt 3 beschrieben.
  2. Entnehmen Sie die Knochenmarkzellen und zentrifugieren Sie sie bei 800 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit 500 μl Lysat der roten Blutkörperchen. Nach 1 Minute beenden Sie die Reaktion mit 1 ml Trennpuffer und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler.
  3. 1 x 106 Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und mit 800 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands werden die Zellen mit 500 μl PBS resuspendiert und in ein Durchflussröhrchen überführt. Messen Sie den Wirkungsgrad durch Durchflusszytometrie. Bereiten Sie eine Kontrollgruppe für Durchflusszytometrie vor, wie in Schritt 2 beschrieben.
    HINWEIS: Zelltrümmer und tote Zellen mit den unteren FSC-Signalen, die sich in der unteren linken Ecke des Streudiagramms FSC versus SSC (weniger als 400) befinden, wurden ausgeschlossen (Abbildung 3). Da die Plasmide eine TagRFP-Rotfluoreszenz aufweisen, können sie aussortiert werden.

5. Injektion der Knochenmarkhöhle

  1. Ausgewählte männliche KM-Mäuse im Alter von 8 bis 9 Wochen mit einem Gewicht von etwa 30 g. Betäuben Sie sie mit einer intraperitonealen Injektion von 150 μl 1% Pentobarbital-Natrium (Schritt 2.1). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zusammenkneifen der Zehen.
  2. Fixieren Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch und fixieren Sie den vorderen Schenkel der Maus mit Klebeband.
  3. Desinfizieren Sie das hintere Schienbein von Mäusen mit einem Alkoholtupfer. Füllen Sie das zu injizierende Plasmid in eine 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel. Entfernen Sie die Luftblasen und bereiten Sie die Injektion vor.
  4. Berühren Sie das Schienbein der Maus und halten Sie das Schienbein der Maus mit den Fingern fest. Bestimmen Sie die Position der Injektionsnadel so, dass der Tibiaschaft vom Tibiaplateau am Kniegelenk der Maus durchdrungen wird. Drehen Sie die Injektionsnadel parallel zur Tibia, stechen Sie in die Knochenmarkhöhle und injizieren Sie langsam (ca. 3 s), um den Schaden an den Mäusen zu minimieren.
  5. Ziehen Sie nach der Injektion die Nadel langsam heraus (ca. 3 s) und verwenden Sie sofort einen Alkoholtupfer, um die Blutung zu stoppen und die Einstichstelle zu desinfizieren.
  6. Setzen Sie die Mäuse vorsichtig in eine warme Umgebung (20-26 °C), warten Sie, bis sich die Mäuse von der Narkose erholt haben, und beobachten Sie ihre Genesung.

6. Sanger-Sequenzierung

  1. Sammeln Sie nach 7 Tagen nach der Injektion Knochenmarkzellen der Maus, wie in Schritt 2 beschrieben, und isolieren Sie genomische DNA mit einem Extraktionskit. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie 1 Minute lang bei 2.000 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 200 μl GA-Lösung hinzu und vibrieren Sie mit einem Vortex-Mischer. 20 μl Proteinase K und 200 μl GB zugeben, mischen und dann für 10 min in ein 70 °C heißes Wasserbad legen.
  2. Nach der Inkubation fügen Sie 200 μl wasserfreies Ethanol hinzu, schütteln Sie es 15 s lang und geben Sie dann die gemischte Flüssigkeit in die unterstützende Adsorptionssäule. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 2.500 x g, entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit am Boden des Röhrchens und fügen Sie 500 μl GD-Lösung hinzu. Zentrifugieren und entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit, waschen Sie das Pellet 2x mit PW und trocknen Sie es abschließend, indem Sie es mit 40 μl reinem Wasser eluieren.
    HINWEIS: PW sollte gemäß den Anweisungen mit wasserfreiem Ethanol zugesetzt werden.
  3. Amplifizieren Sie das Zielgen CaMKIIδ mittels PCR mit der Forward-Primersequenz gctaaggtgataaatgtggcact und der reversen Primersequenz von ctagtgtgcgggccagattc. Bereiten Sie die PCR-Reaktion vor, indem Sie 25 μl 2x Puffer, 1 μl dNTP Mix, 2 μl Forward-Primer, 2 μl Reverse-Primer, 1 μl DNA-Polymerase, 2 μl Template-DNA und 17 μl ddH2O hinzufügen. Führen Sie das folgende PCR-Programm durch: 95 °C für 3 Minuten, 95 °C für 15 s, 53,7 °C für 30 s, 72 °C für 60 s, 12 °C für die Wärmespeicherung.
  4. Bereiten Sie nach der PCR ein 1%iges Agarosegel vor und führen Sie eine Agarosegelelektrophorese bei 110 V für 35 min durch (Schritt 1.5, Schritt 1.6). Schneiden Sie den Zielgelbereich nach der Elektrophorese und senden Sie ihn zur Sanger-Sequenzierung (Abbildung 4).

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro Plasmide wurden Mäusen durch intraossäre Injektion injiziert (Abbildung 1A). Die durchschnittliche Partikelgröße der Nanopartikel betrug etwa 202,9 nm, das Potential 2,77 mV und der PDI 0,22 (Abbildung 1B). Abbildung 1C zeigt die Oberflächenform der Nanopartikel, die elektronenmikroskopisch als kugelförmig betrachtet wurden. Abbildung 1D zeigt die Plas...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für die biomedizinische Forschung besteht die Herausforderung bei der Verabreichung exogener Plasmide an Tiere darin, die Effizienz der Verabreichung und der Genexpression zu verbessern und gleichzeitig den Schaden für die Tiere zu minimieren, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen15,16. Wir stellen eine neuartige Methode zur intraossären Injektion von Chitosan-vermittelten ABE-Plasmidabgabe in die Knochenmarkzelle...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Anhui (2208085MC74, 2208085MC51) und der Scientific Research Foundation des Bildungsministeriums der Provinz Anhui, China (KJ2021A0055) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 ml PCR-Röhrchen, flacher VerschlussLABSELECT  PT-02-C
1 mL SpritzeAnhui Jiangnan medizinische Geräte Co., Ltd/
1% Pentobarbital-Natrium//
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenLABSELECTMCT-001-150
10 & mal; DNA-LadepufferVazymeNr. P022-01
10X T4 DNA Ligase Puffer 1 mlTaKaRa Biotechnologie (Dalian) Co., LTD2011A
1250 μ l Pipettenspitze 102,1 mmLABSELECTT-001-1250
200 μ l Pipettenspitzen 50,55 mmLABSELECT  Tel. T-001-200
2x Phanta Max PufferaVazymeNr. P505-d1
4 ? ZentrifugeThermo Fischer75002425
50 ml ZentrifugenröhrchenLABSELECTNr. T-012-50
6-Well-ZellkulturplattenLABSELECT11110
AgarSangon BiotechA505255-0250
AmpereAbiowell/
ChitosanSangon BiotechA600614-0500
Kulturschüttler mit konstanter TemperaturShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LTDZWY-200D
Gräfin Automatisierter ZellzählerThermo Fisher ScientificGräfin II/II FL
Countess Cell Counting Chamber Slides und Halter, EinwegThermo Fisher ScientificNr. C10228
CutSmart-PufferNeuengland BiolaboreB7204SVIAL
DH5αAllgemeine BiosystemeCS01010
DMEMGibcoC11995500BT
dNTP-MischungVazymeNr. P505-d1
Esp3I-EnzymNEBiolabsNr. R0734S
EthylendiamintetraessigsäureVETEC (sigma-aldrich)V900106
Fötales RinderserumOriCellArtikel-Nr.: FBSAD-01011-500
DurchflusszytometerBD FACSCalibur342975
DurchflussrohrBeyotime BiotechnologieFFC005-1Beutel
Fluoreszenz-MikroskopLeica427019
Gel Maxi AufreinigungssetTIANGENDP210
Kit zur Extraktion genomischer DNATIANGENDP304
EisessigChina National Pharmaceutical Group Corporation10000218
GoldBand DL2.000 DNA-MarkerYESENArtikel-Nr.: 10501ES60
EismaschineShanghaiZhengqiaoBNS-30Labor reserviert
ImunoSep PufferPrecision Biomedicals Co., Ltd604050
Megafuge 8 Kleine Tischzentrifugen-SerieThermo Fisher Scientific75004250
MEMLebenstechnik11140050
NanoDrop 2000 Thermo Fisher Scientific, USA
NaOHSIGAMNr. S5881-500G
PBSXiGeneXG3650
PCMV-SPRY-ABE8E Vektor//
PCR-AmplifikationsgerätThermo FischerAKC96300441
Penicillin/Streptomycin Solarbio GmbHNr. P1400
PeptonSangon BiotechA505247-0500
Phanta Max Super-Fidelity DNA-PolymeraseVazymeNr. P505-d1
Lysat der roten BlutkörperchenBeyotimeNr. C3702
NatriumchloridChina National Pharmaceutical Group Corporation10019318
NatriumsulfatAladdinS433911
T-001-10 10μ l Pipettenspitzen 31,65 mmLABSELECT  Nr. T-001-10
T4-DNA-LigaseTaKaRa Biotechnologie (Dalian) Co., LTD2011A
TrisBioFroxx GmbHArtikel-Nr.: 1115KG001
TryptonSangon BiotechA505250-0500
Vortex-MischerSigmaZ258423
WasserbadShanghaiyihengDK-80
YeaRed Nukleinsäure-Gel-FärbungYESENArtikel-Nr.: 10203ES76
HefeextraktBBIA610961-0500
Zetasizer NanoMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS
β-mercaptoethanol Sigma444203

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
  2. Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med. 26 (8), e3721(2024).
  3. Chen, J., Wang, K., Wu, J., Tian, H., Chen, X. Polycations for gene delivery: Dilemmas and solutions. Bioconjug Chem. 30 (2), 338-349 (2019).
  4. Tong, H., et al. Progress and prospects of chitosan and its derivatives as non-viral gene vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 9 (6), 495-502 (2009).
  5. Alizadeh, L., Zarebkohan, A., Salehi, R., Ajjoolabady, A., Rahmati-Yamchi, M. Chitosan-based nanotherapeutics for ovarian cancer treatment. J Drug Target. 27 (8), 839-852 (2019).
  6. Dimassi, S., Tabary, N., Chai, F., Blanchemain, N., Martel, B. Sulfonated and sulfated chitosan derivatives for biomedical applications: A review. Carbohydr Polym. 202, 382-396 (2018).
  7. Maity, S., Mukhopadhyay, P., Kundu, P. P., Chakraborti, A. S. Alginate coated chitosan core-shell nanoparticles for efficient oral delivery of naringenin in diabetic animals-an in vitro and in vivo approach. Carbohydr Polym. 170, 124-132 (2017).
  8. Abnoos, M., et al. Chitosan-alginate nano-carrier for transdermal delivery of pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biol Macromol. 118 (Pt A), 1319-1325 (2018).
  9. Lee, H. K., Smith, H. E., Liu, C., Willi, M., Hennighausen, L. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol. 3 (1), 19(2020).
  10. Lee, S. N., Jang, H. S., Woo, J. S. Heterologous expression and purification of a CRISPR-cas9-based adenine base editor. Methods Mol Biol. 2606, 123-133 (2023).
  11. Tang, J., Lee, T., Sun, T. Single-nucleotide editing: From principle, optimization to application. Hum Mutat. 40 (12), 2171-2183 (2019).
  12. Newby, G. A., et al. Base editing of hematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 595 (7866), 295-302 (2021).
  13. Lu, D. Z., et al. Camkii(δ) regulates osteoclastogenesis through erk, jnk, and p38 mapks and creb signalling pathway. Mol Cell Endocrinol. 508, 110791(2020).
  14. Sato, K., et al. Regulation of osteoclast differentiation and function by the camk-creb pathway. Nat Med. 12 (12), 1410-1416 (2006).
  15. Li, X., et al. Viral vector-based gene therapy. Int J Mol Sci. 24 (9), 7736(2023).
  16. Gonçalves, G. A. R., Paiva, R. M. A. Gene therapy: Advances, challenges and perspectives. Einstein. 15 (3), 369-375 (2017).
  17. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther. 11 (4), 321-330 (2011).
  18. Mingozzi, F., et al. Cd8(+) t-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med. 13 (4), 419-422 (2007).
  19. Dong, L., Li, Y., Cong, H., Yu, B., Shen, Y. A review of chitosan in gene therapy: Developments and challenges. Carbohydr Polym. 324, 121562(2024).
  20. Rizeq, B. R., Younes, N. N., Rasool, K., Nasrallah, G. K. Synthesis, bioapplications, and toxicity evaluation of chitosan-based nanoparticles. Int J Mol Sci. 20 (22), 5776(2019).
  21. Mansouri, S., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: Strategies to improve transfection efficacy. Eur J Pharm Biopharm. 57 (1), 1-8 (2004).
  22. Zhou, C., et al. Off-target rna mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature. 571 (7764), 275-278 (2019).
  23. Betzler, B. K., Chee, Y. J. Bin Abd Razak, H.R. Intraosseous injections are safe and effective in knee osteoarthritis: A systematic review. Arthrosc Sports Med Rehabil. 3 (5), e1557-e1567 (2021).
  24. Lin, Y. W., Aplan, P. D. Leukemic transformation. Cancer Biol Ther. 3 (1), 13-20 (2004).

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