Method Article

Multimodale Analyse von Mikroplastik im Trinkwasser mit Hilfe einer Silizium-Nanomembran-Analyseleitung

DOI:

10.3791/68200

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June 13th, 2025

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1SiMPore Inc., 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3URnano, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein optisch transparentes und flaches Substrat für die optimierte Erfassung und Analyse von Schadstoffpartikeln im Trinkwasser zeigt. Hier wird die Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) vorgestellt: eine flexible Pipeline für die Abscheidung, Quantifizierung und Identifizierung von Partikeln in flüssigen Medien.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die biologischen Auswirkungen der Verschmutzung durch Mikroplastik in menschlichen Nahrungs- und Wasserquellen sind weitgehend unbekannt, und Trinkwasserquellen sind von dieser Mikroplastikkontamination nicht ausgenommen. Hier zeigen wir einen optimierten Ansatz zur Erfassung, Quantifizierung und Identifizierung von Mikroplastik im Trinkwasser. Wir stellen einen analytischen Arbeitsablauf vor, der als Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) bezeichnet wird und neuartige Siliziumnitrid-Nanomembranen nutzt, die einen signifikanten "Konzentrationsfaktor" ermöglichen, der suspendierte Partikel in einem planarisierten Beobachtungsbereich für die individuelle, quantifizierbare und multimodale Partikelanalyse auf demselben Substrat konsolidiert. Die Hauptvorteile von SNAP ergeben sich aus der Verwendung ultradünner Membranen auf Siliziumnitrid-Basis, die in Filterscheiben konventioneller Größe untergebracht sind und die direkte Erfassung und Analyse von polymeren MP auf einem nichtpolymeren Hintergrund ermöglichen. Trinkwasserproben aus der Region Rochester, NY, wurden aus Leitungsquellen in Wohngebieten entnommen und mit SNAP analysiert. Die Partikel in jeder Probe wurden durch optische und Rasterelektronenmikroskopie (REM), Raman-Spektroskopie und energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) charakterisiert, und verschiedene identifizierte Bestandteile wurden proportional zu den insgesamt eingefangenen Partikeln quantifiziert.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplastik ist definiert als synthetische Polymere mit einer Größe von weniger als fünf Millimetern in der Größe 1,2. Die Verschmutzung durch Mikroplastik (MP) ist ein wachsendes Problem für die menschliche Gesundheit, die Umwelt und die Umwelt. MP-Kontaminationen wurden in Wasserquellen aller Art gefunden; Süßwasser, Ozeane und sogar Trinkwasserquellen3. MP werden aus der Aufschlüsselung von Primärkunststoffquellen4 sowie synthetischen Textilien 5,6,7 generiert. MP sind allgegenwärtig und wurden in menschlichen Geweben wie menschlicher Plazenta, Kot und Blut gefunden 8,9,10. Das Interesse an der MP-Forschung steigt, wie mehr als 4.100 bzw. 4.600 Veröffentlichungen in den Jahren 2023 und 2024 belegen (PubMed-Daten; Stichwort "Mikroplastik"), sowie eine zunehmende Besorgnis der Öffentlichkeit über die Exposition des Menschen gegenüber MP. Als Reaktion auf die wachsende Besorgnis der Öffentlichkeit haben mehrere staatliche Regulierungsbehörden wie der Bundesstaat Kalifornien11 und mehrere EU-Länder12, wurden (oder werden) Verordnungen über MP-Werte im Trinkwasser erlassen. In Anbetracht all dessen hat die US-Umweltschutzbehörde kürzlich die Abgeordneten als neuen besorgniserregenden Schadstoff eingestuft. Die Risikobewertung für den Menschen wird jedoch durch einen Mangel an Methoden für den zuverlässigen und reproduzierbaren Nachweis von MP stark erschwert.

Die Charakterisierung von MP stützt sich auf analytische Methoden wie optische und Elektronenmikroskopie13 sowie spektroskopische und spektrometrische Techniken 1,14,15, um die visuellen Eigenschaften von MP7 bzw. ihre Zusammensetzung zu verstehen. Proben, die MP enthalten, sollten mehrere Analysen zur Charakterisierung, Identifizierung und Quantifizierung von MP enthalten und mindestens Spektroskopie/Spektrometrie (d. h. Raman-Spektroskopie, Infrarotspektroskopie oder Pyrolyse-Gaschromatographie-Massenspektrometrie usw.) erfordern, wie z. B. Science of the Total Environment16. Die Raman-Spektroskopie ist vielseitiger als die Infrarotspektroskopie (IR), insbesondere im Hinblick auf die Materialidentifizierung in biologischen Proben. Die Raman-Spektroskopie ist eine Lichtstreutechnik, die es ermöglicht, kleinere Partikel leichter zu analysieren als IR, eine lichtabsorbierende Technik, die größere Partikel erfordert und mehr Einschränkungen bei der Probenplatzierung hat17. Es wurde bereits vorgeschlagen, dass Substrate für die Raman-Spektroskopie, die Silizium oder Siliziumoxid enthalten, zuverlässige Ergebnisse mit minimalem Hintergrundrauschen liefern können18.

Substrate für bestimmte Analysetechniken, die normalerweise mit einer Art von Analyse kompatibel sind (z. B. goldbeschichtete Substrate, die für die IR-Spektroskopie erforderlich sind), sind oft nicht mit der Transmissions- und/oder Reflexionslichtmikroskopie kompatibel. In der Folge ist die Replikat-Teilprobenahme bei den Prüfärzten beliebt, um Proben zu erzeugen, die für jede einzelne Analyse geeignet sind, aber die Unterprobenahme ist zeitaufwändig und könnte Partikel mit geringer Abundanz ausschließen 1,2,6. In der Regel ist eine manuelle Übertragung von Partikeln von einem Substrat auf das nächste erforderlich, um dasselbe Partikel zur Charakterisierung und Identifizierung durch verschiedene Analyseverfahren zu analysieren, aber diese langsamen, manuellen Übertragungen erhöhen die Wahrscheinlichkeit von Verzerrung, Kontamination und Verlust und beschränken die Analyse von MP auf die größten Partikel, die manuell manipuliert werden können13. Diese suboptimalen Arbeitsabläufe führen zu zahlreichen Herausforderungen und Zuverlässigkeitsproblemen, die zu der in der Literatur berichteten signifikanten Variabilität bei der MP-Quantifizierung beitragen 3,7.

Hier stellen wir einen analytischen Arbeitsablauf vor, den wir Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) nennen, um MP zu erfassen, zu charakterisieren, zu identifizieren und zu quantifizieren, und demonstrieren den Nutzen von SNAP durch die Analyse von Trinkwasserproben aus der Region Rochester, NY. SNAP wird durch konventionell große Filterscheiben mit einem Durchmesser von 25 mm und integrierten Silizium-Nanomembranen ermöglicht (siehe ergänzende Tabelle S1 für Membraneigenschaften), die ein einheitliches Substrat für die Konzentration und Analyse von MP aus Trinkwasser unter Verwendung mehrerer Techniken bieten15,19. Nach der sequentiellen Konzentration und dem Einfangen von MP auf Nanomembranen mit abnehmenden Cut-off-Größen (20 μm mikroporöses Siliziumnitrid (MPSN) mit zylindrischen Poren und 8,0 μm Mikrospalt-Siliziumnitrid (MSSN) mit rechteckigen Prismenporen) ermöglicht SNAP drei aufeinanderfolgende Analyseschritte: 1) Probenfärbung, optische Mikroskopie und MP-Quantifizierung, 2) Partikelidentifizierung mittels Raman-Spektroskopie, gefolgt von 3) Partikelcharakterisierung mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM), Dies ermöglicht die Mehrfachanalyse derselben Partikel, die auf einem Nanomembransubstrat eingefangen werden.

Wir demonstrieren mehrere SNAP-Pipelines, indem wir sowohl unbeschichtete Silizium-Nanomembran (SiN)-Filterscheiben als auch goldbeschichtete Silizium-Nanomembran (Au-SiN)-Filterscheiben verwenden: Pipeline A) SNAP wird an SiN durchgeführt und dieselben MP sequentiell durch mehrere Analysetechniken charakterisiert; Pipeline B) SNAP an Au-SiN mit Raman-Spektroskopie; und Pipeline C) SNAP, durchgeführt an Au-SiN mit REM, das mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX) ausgestattet ist (Abbildung 1). SNAP-Variationen sind somit flexible, optimierte analytische Arbeitsabläufe, die für eine Reihe von Probentypen und Analysetechniken verwendet werden können. Im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Methoden, die auf polymeren Membranenberuhen 11, ergeben sich die Vorteile von SNAP aus der Verwendung von Silizium-Nanomembranen, bei denen synthetische Polymer-MP auf einer nichtpolymeren Membran auf Siliziumbasis eingefangen werden, was die Identifizierung von MP auf einem nicht-polymeren Hintergrund ermöglicht. Darüber hinaus bieten Silizium-Nanomembranen im Gegensatz zu polymeren Membranen, die zu Falten neigen, gleichmäßige Fokusebenen, was mehrere automatisierte Mikroskopie- und Spektroskopietechniken ermöglicht.

Wir haben zuvor die Verwendung von Silizium-Nanomembranen für MP-Analysen durch analytische Modellierung, Modellpartikelherausforderungen und Trinkwasser- und Luftproben19,20 sowie durch den Vergleich ihrer Filtrations- und optischen Mikroskopieeigenschaften unter Verwendung von Modellpartikeln mit vier weit verbreiteten Membranen15 charakterisiert. In diesem Protokoll demonstrieren wir heuristisch den Nutzen von SNAP für die Analyse von MPs in vier Trinkwasserproben. Die Proben wurden von vier verschiedenen Wasserquellen im Großraum Rochester, NY, entnommen. Jede Probe, die in diese Studie einbezogen wurde, stammte aus einer bestimmten Oberflächenwasserquelle, wie z. B. dem Ontariosee, dem Hemlock Lake, einer Mischung aus Hemlock und Ontario, und dem Canandaigua Lake (Abbildung 2). Zu den aufgefangenen Partikeln aus diesen Trinkwasserquellen gehörten weit verbreitete Kunststoffe wie Polystyrol (PS) und Polyethylen (PE), Schwermetalle wie Eisen, Siliziumdioxid und nichtsynthetische Partikel.

Protocol

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1. Qualitätskontrollverfahren und Zubereitungen ultrareiner Lösungen

  1. Reinigung von Laminar-Flow-Hauben und Handschuhen
    1. Don PSA (persönliche Schutzausrüstung): Laborkittel aus 100 % Baumwolle und Nitrilhandschuhe.
      HINWEIS: Die PSA ist während des gesamten Protokolls durchgehend.
    2. Nitrilhandschuhe mit 99%igem Isopropylalkohol (IPA) besprühen. Reiben Sie die Hände aneinander und spülen Sie sie dann mit ~18 MΩ, 0,22 μm gefiltertem Wasser ab. Tun Sie dies 3x, um das Trennmittel von den Handschuhen zu entfernen.
    3. Falten Sie ein zartes Tuch aus Naturfasern in Viertel und besprühen Sie es dann mit 70 % IPA. Wischen Sie die Oberfläche der Haube in langen Zügen von hinten nach vorne ab und falten Sie das empfindliche Arbeitstuch alle zwei Züge auf eine unbenutzte Oberfläche. Reinigen Sie die Dunstabzugshaube weiter, bis alle Oberflächen gereinigt sind, und ersetzen Sie das Tuch durch ein neues, sobald es verschmutzt ist.
    4. Decken Sie die Silikonrollenmatte ab und rollen Sie über die Oberfläche der Haube, um verbleibende Partikel aufzunehmen. Zur Reinigung der Silikonrolle mit 99% IPA besprühen und mit einer behandschuhten Hand schrubben, dann mit 18 MΩ, 0,22 μm gefiltertem Wasser abspülen. 3x wiederholen, dann in der Haube an der Luft trocknen lassen.
    5. Spülen Sie die Handschuhe wie in Schritt 1.1.2 erneut aus.
  2. Reinstwasser und IPA-Erzeugung.
    1. Füllen Sie ein 1-Liter-Becherglas mit 18 MΩ Wasser und setzen Sie es in die Haube ein.
    2. Entlüften Sie eine 60-ml-Spritze und einen angebrachten 0,22-μm-Cut-off-Spritzenfilter, indem Sie mindestens 200 mL 18-MΩ-Wasser durch die Spritze und den angebrachten Filter filtrieren.
      HINWEIS: Eine Spritzenpumpe spart Zeit, ist aber keine Voraussetzung für die Durchführung des beschriebenen Protokolls.
    3. Spülen Sie einen Glasbehälter mit Schraubverschluss 3x mit 18 MΩ, 0,22 μm gefiltertem Wasser. Mit 0,22 μm spritzengefiltertem 18 MΩ gefiltertem Wasser auffüllen.
    4. Die Schritte 1.2.1 bis 1.2.3 werden mit der gewünschten prozentualen Konzentration von IPA anstelle von 18 MΩ und 0,22 μm gefiltertem Wasser wiederholt, um hochreines IPA zu erzeugen.

2. Partikelabscheidung aus flüssigen Proben durch Filtration

HINWEIS: Das folgende Protokoll kann mit anderen flüssigen Proben als Wasser verwendet werden. Validierte Probenentnahmemethoden sollten dem Prüfer auf der Grundlage der Erfordernisse seiner Studie und der Probe überlassen bleiben.

  1. Ziehen Sie PSA an.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Handschuhe und Haubenoberflächen gemäß den Schritten 1.1.2-1.1.5 gereinigt werden.
  2. Sprühen Sie eine Silikondichtung mit Ultrapure 99% IPA ein, schrubben Sie sie mit den behandschuhten Fingern und spülen Sie sie dann mit Reinstwasser ab. Wiederholen Sie dies 3x für jede Dichtung.
    HINWEIS: Die Anzahl der Dichtungen, die bei der Filtration verwendet werden sollen, entspricht der Anzahl der zu verwendenden Filterscheiben plus 1. In Abbildung 1B finden Sie die Grafik der visuellen Assemblierung.
  3. Spülen Sie mit der in Schritt 1.1.2 vorbereiteten Spritze das Innere der 60-ml-Spritze mit Reinstwasser, indem Sie 30 ml Reinstwasser und 30 ml Luft in die Spritze aufnehmen. Schrauben Sie einen Spritzenvorsatzfilter auf, schütteln Sie ihn kräftig und geben Sie ihn ab. Wiederholen Sie dies 3x.
    HINWEIS: Je nach Probenvolumen kann eine Spritze jeder Größe verwendet werden.
  4. Montieren Sie die Filtrationsvorrichtung wie in der visuellen Montagegrafik in Abbildung 1B gezeigt.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine saubere Pinzette, um Filterscheiben und Dichtungen während der Montage und Demontage zu handhaben.
    1. Stellen Sie bei sequenziellen Filtrationen sicher, dass sich zwischen der Scheibe und der Stützfritte, zwischen jeder Scheibe eine Dichtung und zwischen der Scheibe und dem Filtertrichter eine Dichtung befindet.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben so angeordnet sind, dass sich der größte Sperrfilter oben im Stapel und der kleinste Dichtfilter unten befindet.
  5. Schalten Sie das Vakuum des Geräts ein, so dass ein negativer Durchfluss durch den Filterscheibenstapel entsteht.
  6. Messung der Hintergrundkontamination
    HINWEIS: Der folgende Prozess ermöglicht eine Bewertung der Spritzenreinigung und der Erzeugung ultrareiner Medien sowie eine Bestimmung der Hintergrundpartikel, die von den Komponenten des Systems beigesteuert werden.
    1. Geben Sie mit der gespülten Spritze langsam 50 ml Reinstwasser über die Nanomembran in der Mitte der oberen Scheibe ab, um sicherzustellen, dass die gesamte abgegebene Flüssigkeit gefiltert wird.
      HINWEIS: Wenn Sie größere Probenvolumina (z. B. >50 ml) filtrieren, wird ein Glasfiltrationstrichter empfohlen. Reinigen Sie den Glasfiltertrichter wie in Schritt 2.3. Zusätzliches Laborgerät kann ein zusätzliches Risiko einer Partikelkontamination darstellen. Seien Sie bei den Reinigungsverfahren vorsichtig und bestätigen Sie die Sauberkeit immer mit Blank-Filtrationen, bevor Sie die interessierenden Proben verwenden.
    2. Lassen Sie das Reinstwasser filtrieren. Lassen Sie das Vakuum nach der Filtration eine weitere Minute lang eingeschaltet. Sobald die Probe vollständig getrocknet ist, schalten Sie das Vakuum aus.
    3. Entfernen Sie die Filterscheiben vorsichtig mit einer sauberen Pinzette aus den Dichtungen und legen Sie die Scheiben zur Aufbewahrung in den entsprechenden sauberen und beschrifteten Behälter, z. B. eine Petrischale aus Glas oder eine abgedunkelte Box.
    4. Bilden Sie die Filterscheiben für die optische Analyse, Partikelzählung usw. unter dem Mikroskop ab.
  7. Bei flüssigen Proben ist eine zusätzliche Dichtung wie in Schritt 2.2 zu reinigen. Besorgen Sie sich für jede einzelne Flüssigmedienprobe eine neue Spritze und wiederholen Sie Schritt 2.3.
  8. Nehmen Sie die gewünschte Probenmenge auf und geben Sie die Probe langsam über die Nanomembran in der Mitte der oberen Scheibe ab.
  9. Sobald die Probenfiltration abgeschlossen ist, führen Sie 3x Spülungen mit 1 ml Reinstwasser durch, um sicherzustellen, dass alle Partikel in der Probe ausreichend von allen Oberflächen auf die Membran in der Mitte der Filterscheibe gespült wurden.
  10. Lassen Sie das Vakuum eine weitere Minute lang eingeschaltet, um die 3x gespülte Probe vollständig zu trocknen, und schalten Sie dann das Vakuum aus.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.10. für jede Wiederholung, die von der interessierenden Probe durchgeführt werden soll.

3. Vorbereitung und Färbung von Fluoreszenzfarbstoffen

HINWEIS: Die Fluoreszenzfärbung mit Nilrot und/oder Trypanblau kann die interessierenden Raman-Spektroskopielaser beeinträchtigen.

  1. Färbung mit Nilrot (NR)
    1. Ziehen Sie PSA an.
    2. Reinigen Sie Handschuhe und Kapuze wie in den Schritten 1.1.2-1.1.5.
    3. Führen Sie die Probenfiltration wie in den Schritten 2.7-2.10 beschrieben durch.
    4. Spülen Sie zwei Glasbehälter mit Schraubverschluss 3x mit Reinstwasser.
    5. Bereiten Sie eine 0,1 mg/ml-Lösung von NR in Ultrapure 99% IPA in einem sauberen Glasbehälter vor.
    6. Zum Mischen vorsichtig 10x invertieren.
    7. Filtrieren Sie die NR-Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter in den zweiten Glasbehälter mit Schraubverschluss.
      HINWEIS: Der Filter, der zum Vorfiltern des NR verwendet wird, sollte einen kleineren Cutoff haben als der Filter, der zum Filtern der Proben verwendet wird.
    8. Legen Sie die zu färbende Filterscheibe auf die Stützfritte des Vakuumauffangkolbens.
    9. Pipettieren Sie 20 μl der 0,1 mg/ml NR-Lösung auf die Nanomembran in der Mitte der Filterscheibe.
      HINWEIS: Der Fleck sollte die poröse Oberfläche der Nanomembran vollständig bedecken. Wenn 20 μl nicht ausreichen, fügen Sie zusätzlichen Farbstoff hinzu, bis alle porösen Bereiche der Nanomembran angemessen mit Beize bedeckt sind.
    10. Inkubieren Sie den Fleck 5 Minuten lang.
    11. Den Fleck nach Abschluss der Inkubation vakuumfiltrieren.
    12. Spülen Sie 3x mit 1 ml Ultrapure 99% IPA, um überschüssige NR-Flecken zu entfernen.
      HINWEIS: Fahren Sie nach diesem Schritt mit dem Abschnitt Trypanblau-Färbung unten fort, wenn eine Gegenfärbung durchgeführt werden soll.
    13. Lassen Sie die Filterscheibe bei eingeschaltetem Vakuum 2 Minuten lang auf der Stützfritte stehen, um die Restflüssigkeit zu filtern und zu trocknen. Wenn die Filterscheibe nach 2 Minuten nicht trocken ist, stellen Sie sie mit einer sauberen Petrischale aus Glas für 2-5 Minuten in den 70 °C Ofen.
    14. Nach dem Trocknen führen Sie die Fluoreszenzmikroskopie wie in Schritt 2.6.4 beschrieben durch und fahren Sie mit Abschnitt 4 fort.
  2. Färben mit Trypanblau (TB)
    1. Ziehen Sie PSA an.
    2. Reinigen Sie Handschuhe und Kapuze wie in den Schritten 1.1.2-1.1.5 beschrieben.
    3. Schließen Sie die Probenfiltration aus den Schritten 2.7-2.10 ab oder beginnen Sie mit Schritt 3.2.4.
    4. Spülen Sie zwei Glasbehälter mit Schraubverschluss 3x mit Reinstwasser.
    5. Bereiten Sie 0,4 % TB-Fleck in einem Behälter vor.
      HINWEIS: Der Filter, der zum Vorfiltern des TB verwendet wird, sollte einen kleineren Grenzwert haben als der Filter, der zum Filtern der Proben verwendet wird.
    6. Zum Mischen vorsichtig 10x invertieren.
    7. Die TB-Fleckenlösung mit einem 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter in den zweiten Glasbehälter mit Schraubverschluss filtrieren.
      HINWEIS: Der Filter, der zum Vorfiltern des TB verwendet wird, sollte einen kleineren Grenzwert haben als der Filter, der zum Filtern der Proben verwendet wird.
    8. Legen Sie die zu färbende Filterscheibe auf die Stützfritte des Vakuumauffangkolbens.
    9. Pipettieren Sie 20 μl des 0,4 % TB-Farbstoffs auf die Nanomembran in der Mitte der Filterscheibe.
      HINWEIS: Der Fleck sollte die poröse Oberfläche der Nanomembran vollständig bedecken. Wenn 20 μl nicht ausreichen, fügen Sie tropfenweise zusätzlichen Fleck hinzu, bis alle porösen Bereiche der Nanomembran angemessen mit dem Fleck bedeckt sind.
    10. Inkubieren Sie den Fleck 5 Minuten lang.
    11. Den Fleck nach der Inkubation 5 Minuten lang vakuumfiltrieren.
    12. 3x mit 1 ml Volumen Reinstwasser spülen.
    13. Lassen Sie die Filterscheibe bei eingeschaltetem Vakuum 2 Minuten lang auf der Stützfritte stehen, um die Restflüssigkeit zu filtern und zu trocknen. Wenn die Filterscheibe nach 2 Minuten nicht trocken ist, stellen Sie sie mit einer sauberen Petrischale aus Glas für 2-5 Minuten in den 70 °C Ofen.
    14. Nach dem Trocknen führen Sie die Fluoreszenzmikroskopie wie in Schritt 2.6.4 beschrieben durch und fahren Sie mit Abschnitt 4 fort.

4. Partikelquantifizierung mittels Fluoreszenzmikroskopie

  1. Bildaufnahme mit optischer Mikroskopie
    1. Immobilisieren Sie die Filterscheibe mit einer Silikondichtung auf einem Objektträger oder verwenden Sie einen Ausrichtungsobjektträger, der speziell für die Verwendung von Filterscheiben mit einem Mikroskoptisch entwickelt wurde. Bewegen Sie die zu bebildernde Filterscheibe auf den Mikroskoptisch.
    2. Bilden Sie die Nanomembran mit Hellfeldbeleuchtung ab, so dass die maximal detektierten Zählungen ~ 90 % des maximalen Bereichs der Detektorkamera betragen.
      HINWEIS: Dieser 90%-Wert beträgt ~59.000 für einen 16-Bit-Detektor mit Weißwerten bei 65.535.
    3. Bilden Sie die Nanomembran mit Fluoreszenzbeleuchtung ab, sodass die maximale Pixelintensität bei etwa ~25 % des maximalen Bereichs der Detektorkamera liegt.
    4. Speichern Sie das Bild in einem 16-Bit-Composite-TIFF-Format.
  2. Partikelquantifizierung mittels Fluoreszenzmikroskopie
    1. Trennen Sie mit der Bildanalyseplattform den/die Fluoreszenzkanal(e) des in Version 4.1.4 erzeugten Composite-TIFF mit der Funktion "Split-Channels " vom Hellfeldkanal.
    2. Legen Sie einen Schwellenwert für die Pixelintensitäten mit der Funktion "Schwellenwert " auf einen Wert von 10.000 fest.
      HINWEIS: Wenn auf den Partikeln Bloom vorhanden ist, ist der Schwellenwert zu niedrig und sollte angehoben werden.
    3. Speichern Sie ein separates Bild im PNG-Format.
    4. Entfernen Sie das Bild, um Rauschpixel mit der Funktion "Flecken entfernen " zu entfernen.
    5. Trennlinie des Bildes mit der Funktion Wasserscheide .
      HINWEIS: Diese Funktion trennt benachbarte Partikel ähnlicher Größe, auf Kosten der Zerlegung großer zusammenhängender Partikel in kleinere Stücke. Da oft viel mehr kleine als große Partikel vorhanden sind, kann dies ein guter Kompromiss sein, aber auch unbeabsichtigte Auswirkungen haben, wie z. B. das Aufbrechen langer Fasern in Stränge kleiner Partikel. Überprüfen Sie die Bildergebnisse, bevor Sie Daten akzeptieren.
    6. Legen Sie den Maßstab der Schwellenwert-Fluoreszenzbilder fest, indem Sie die Breite einer Pore im Hellfeldbild messen. Verwenden Sie die gemessene Porenbreite, um die Skala in Pixel/μm einzustellen.
      HINWEIS: Bei rechteckigen Poren entspricht die kleinste Breite dem Produktetikett. Bei kreisförmigen Poren stimmt der Durchmesser mit dem Produktetikett überein, das die Porengröße (d. h. den Cut-off) der Nanomembran angibt.
    7. Wenden Sie die Funktion "Partikel zählen " der Bildanalyseplattform auf das Fluoreszenzbild mit Schwellenwert an, und werten Sie die Fläche, das Minimum und das Maximum aus.
    8. Verarbeiten Sie die Fluoreszenz- und Hellfeldbilder, um Komposite zu erstellen, die die Fluoreszenzdomänen visualisieren.
    9. Schwellenwert für das Fluoreszenzbild mit dem gleichen Wert wie in Schritt 4.2.2 festlegen.
    10. Führen Sie Kanäle mit der Bildanalyseplattform zusammen. Weisen Sie den Fluoreszenzkanal dem Rotkanal und das Hellfeldbild dem Graukanal zu.
    11. Speichern Sie die Komposition als PNG-Datei.

5. Raman-Spektroskopie

  1. Schalten Sie das Raman-Instrument und den zugehörigen Computer ein, sodass jedes Gerät gestartet werden kann.
  2. Öffnen Sie die Software auf dem Computer, der mit dem Raman-Instrument verbunden ist.
  3. Wenn die Software initialisiert ist, stellen Sie sicher, dass die aktuelle Systemaktivität und der Detektorstatus im unteren Menüband des Programmbildschirms Bereit anzeigen und die Farbe Grün haben.
  4. Wenn die Schaltfläche Autokalibrierung (AC) am unteren Rand des Bildschirms rot ist, führen Sie die gewünschte Autokalibrierung aus und warten Sie, bis sie abgeschlossen ist, bevor Sie fortfahren.
  5. Wenn nur ein Laser und ein Gitter verwendet werden:
    1. Klicken Sie auf dem Bildschirm "Automatische Kalibrierung" auf "Beenden " und wählen Sie dann den gewünschten Laser und das gewünschte Gitter aus den entsprechenden Dropdown-Listen unter "Gerät einrichten " auf der Registerkarte "Erfassung" aus.
    2. Kehren Sie zur roten AC-Taste am unteren Bildschirmrand zurück, klicken Sie auf Aktueller Laser/Gitter und lassen Sie die Kalibrierungsroutine ausführen.
  6. Wenn Sie alle Laser und Gitter verwenden, wählen Sie einfach Alle Laser und Gitterroste und lassen Sie das System laufen.
  7. Wenn Sie mehr als einen Laser und/oder Gitterrost verwenden, wählen Sie die benutzerdefinierten Laser/Gitter und wählen Sie alle gewünschten Einstellungen. Lassen Sie dann die Kalibrierung ausführen.
  8. Wählen Sie das LWD-Objektiv ( 20x Long Working Distance) auf dem Instrumentenrevolver und in der Software unter Instrumenteneinstellungen auf der Registerkarte Erfassung .
  9. Wenn dieses Objektiv nicht verfügbar ist, verwenden Sie ein alternatives Objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 5x oder 10x) mit einem Arbeitsabstand, der der Höhe der Filterscheibe entspricht.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit einem Objektiv mit geringerer Vergrößerung, um die anfängliche Navigation durch die Nanomembran der Filterscheibe zu erleichtern.
  10. Platzieren Sie die Filterscheibe so auf dem Mikroskoptisch, dass sie sich innerhalb des Strahlengangs befindet.
  11. Klicken Sie im oberen Menüband auf Videoerfassung , um die Visualisierungsoptik zu aktivieren.
  12. Verwenden Sie die groben und feinen Fokusräder am Instrument, um die Nanomembran der Filterscheibe in den Fokus zu bringen.
  13. Quadrieren Sie die Poren grob mit den Punktcursorlinien auf dem Computerbildschirm.
  14. Drehen Sie entweder die Filterscheibe vorsichtig auf dem Tisch, um diese quadratische Ausrichtung zu erreichen, oder verwenden Sie einen Ausrichtungsschieber, der speziell für die Verwendung in einem Mikroskoptisch entwickelt wurde.
  15. Stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassung" oben rechts sicher, dass der Beleuchtungsmodus "Dunkelfeld" ausgewählt ist, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  16. Um ein zusammengefügtes Bild zu erfassen, navigieren Sie im Menüband Datenregisterkarten zur Registerkarte Video.
  17. Navigieren Sie zum ersten gewünschten Sichtfeld, klicken Sie dann auf die Schaltfläche Mosaik oben rechts im Videofenster und fügen Sie es der Karte hinzu. Navigieren Sie mit dem Instrumenten-Joystick zur äußeren gegenüberliegenden Ecke des gewünschten Bereichs und fügen Sie sie der Karte hinzu.
  18. Führen Sie die Mosaikerfassung mit ViewSharp durch, um sicherzustellen, dass alle Bereiche im endgültigen Bild richtig scharf sind.
    HINWEIS: Objektive mit niedrigerer Vergrößerung benötigen weniger Zeit für die Aufnahme des Bildmosaiks, während Objektive mit höherer Vergrößerung länger benötigen.
  19. Nachdem das Bildmosaik erstellt wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf An ParticleFinder senden.
  20. Navigieren Sie im oberen rechten Menüband zur Registerkarte ParticleFinder , um mit den Schwellenwerteinstellungen zu interagieren.
  21. Um sicherzustellen, dass die richtigen Partikel ausgewählt sind, klicken Sie mit der linken Maustaste auf Bild auf der Registerkarte ParticleFinder-Daten , um die Kontrollkästchen Mitte, Partikel und Transparenz zu aktivieren. Legen Sie den Schieberegler für die Transparenz auf 50 % und die Pixelgröße von Mitte auf 2 Pixel fest.
    HINWEIS: Bei der Auswahl "Mitte " wird ein Punkt in der Mitte jedes Partikels platziert, und bei der Auswahl "Partikel" wird eine Überlagerung über jedem Bereich platziert, der als Partikel eingestuft wurde, mit einer Transparenz von 50 %. Mit diesen Einstellungen werden die einzelnen Partikel lokalisiert und die Kanten der einzelnen Partikel definiert.
  22. Bearbeiten Sie bei Bedarf die Parameter für die Partikelschwellenwerte und die Morphologie-/Größenauswahl auf der Registerkarte ParticleFinder auf der rechten Seite des Programms, um sicherzustellen, dass alle Partikel und ihre Größen-/Formparameter korrekt identifiziert werden. In der ergänzenden Tabelle S2 finden Sie ein Beispiel dafür, wie die morphologischen Parameter angewendet werden können.
    1. Wenn die automatische Partikelerkennung nicht ausreicht, wechseln Sie zur manuellen Partikelerkennung und passen Sie die Schwellenwerte schrittweise an, bis ein Großteil der richtigen Objekte als Partikel identifiziert wird.
    2. Wenn die Morphologie der erkannten Partikel weiter verfeinert werden muss, aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Morphologische Filter anwenden. Wählen Sie geeignete Parameter und deren Intensitäten in den resultierenden Dropdown-Menüs aus.
      HINWEIS: Die Reihenfolge, in der die Parameter ausgewählt werden, kann sich auf die Ausgabe auswirken.
  23. Wenn die Größe, Form oder andere morphologische Eigenschaften der Partikel kritische Faktoren sind, aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben "Partikel-Vorfilter anwenden" und wählen Sie dann die Parameter nach Bedarf aus und bearbeiten Sie sie.
  24. Nachdem die Partikel identifiziert wurden und die ausgewählten Formen/Kanten akzeptabel sind, navigieren Sie in der scrollbaren Vorschauliste der Partikelbilder im Abschnitt Ergebnisse . Wählen Sie die gewünschten Partikel aus, indem Sie auf das zugehörige Partikelbild klicken.
  25. Schalten Sie die Live-Ansicht mit der Videokamera-Taste oben auf dem Bildschirm ein.
  26. Wechseln Sie zum 50-fachen LWD-Objektiv , indem Sie auf die Vergrößerungszahl klicken und das entsprechende Objektiv im Dropdown-Menü auswählen, innerhalb der Anwendung im unteren Menüband.
  27. Bringen Sie den/die Partikel(n) bei Bedarf mit dem Feineinstellknopf wieder in den Fokus.
  28. Nehmen Sie Bilder einzelner Partikel auf, die mit Raman-Spektroskopie analysiert werden können, und speichern Sie die Bilder als separate Dateien mit entsprechenden Namen.
  29. Stellen Sie sicher, dass der gewünschte Bereich des Partikels, der mit der Raman-Spektroskopie analysiert werden soll, korrekt unter der Laserstrahlposition positioniert ist.
  30. Sobald der richtige Bereich des Partikels für die Analyse ausgewählt wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche STOP ALL am oberen Rand des Fensters, um die Visualisierungsoptik auszuschalten.
  31. Stellen Sie den Laser auf 532 nm ein, auf 1 % Leistung für ungefärbte Partikel und auf 785 nm oder 830 nm für fluoreszierend gefärbte Partikel.
  32. Stellen Sie die Erfassungszeit auf 10 s und die Akkumulationen auf 5 s ein.
  33. Wählen Sie die Registerkarte Spectra aus dem Menü der Daten-Tabs und drücken Sie dann die Wiedergabetaste, um die Echtzeitanzeige (RTD) zu starten.
    HINWEIS: Nutzen Sie die während der RTD erhaltenen Informationen, um die Einstellungen zu optimieren.
  34. Wenn Sie mit den Einstellungen und den Ergebnissen zufrieden sind, drücken Sie STOP ALL, um den RTD zu stoppen.
  35. Die endgültige Erfassung kann nun durch Drücken der kreisförmigen Taste "Spectrum Aquisition" neben der RTD-Taste eingesammelt werden.
  36. Speichern Sie die gesammelten Spektren als separate Dateien mit entsprechenden Namen.
  37. Wiederholen Sie die Schritte 5.28-5.36. für jedes interessierende Teilchen.
  38. Wenn Sie mit der Probe fertig sind, entfernen Sie die Filterscheibe und setzen Sie das Objektiv sowohl manuell am Oszilloskop als auch in der Software wieder auf das 20X LWD ein.
  39. Die Schritte 5.10 bis 5.37 für die neue(n) Probe(n) wiederholen.

6. Spektrale Identifizierung

  1. Wenn eine gekaufte oder selbst erstellte Raman-Spektraldatenbank nicht verfügbar ist, navigieren Sie zur Open-Source-Spektroskopie-Bibliothek unter: https://www.openanalysis.org/openspecy/
    HINWEIS: OpenSpecy ist eine Open-Source-Datenbank für Raman- und IR-Spektroskopie, die 636 Spektren aus drei verschiedenen Bibliotheken mit 276 Polymeren und Materialien enthält, die für die Identifizierung von Umwelt-MP und Fasern geeignet sind21. Vor- und nachbearbeitete Spektraldaten sind für die Verwendung mit dieser Ressource gleichermaßen geeignet.
  2. Speichern Sie Raman-Spektren als einzelne .csv Dateien.
    1. Beschriften Sie Spalte A als Wellennummer, gefolgt von den Wellennummern der Spektren, und Spalte B sollte mit Intensität beschriftet werden, gefolgt von den Spitzenintensitätswerten pro Wellenzahl.
  3. Öffnen Sie die Spektren , indem Sie die .csv Datei per Drag & Drop in die Durchsuchen-Leiste oben links ziehen.
  4. Aktivieren Sie die Vorverarbeitung und Identifikation.
  5. Aktivieren Sie unter "Vorverarbeitung" die Option " Schwellenwert-Signalrauschen", "Min-Max-Normalisierung", "Glättung/Ableitung", "Wellenzahlen anpassen" und " Basislinienkorrektur".
    HINWEIS: Die spezifischen Einstellungen können in Abhängigkeit von den individuellen Eigenschaften der zu analysierenden Spektren angepasst werden.
  6. Wählen Sie unter Identifikation Raman als Spektrumtyp und Ableitung als Bibliothekstransformation aus.
    HINWEIS: Diese Bibliothek kann auch für die IR-Spektroskopie verwendet werden. Das Analysefenster zeigt ein weißes Spektrum, das hochgeladene Spektrum für die Analyse, und ein rotes Spektrum, die vermutete Identifizierungsübereinstimmung, an.
  7. Bei Spektren, die keine Übereinstimmung von r > 0,70 oder vernünftige Korrelationen der Peakform zurückgeben, verwenden Sie die Top 5 der vorgeschlagenen Ergebnisse, um mit der Suche nach potenziellen Übereinstimmungen zu beginnen.
  8. Stellen Sie sicher, dass die gemessenen Peakwerte innerhalb von ±10 Wellenzahlen eines entsprechenden Peaks in den ausgewählten Referenzspektren liegen, bevor Sie eine Übereinstimmung für diesen Peak bestätigen.
  9. Zeichnen Sie spektrale Korrelationen, ihre Korrelationswerte und die Datenbank auf, aus der die vermutete Übereinstimmung stammt.
  10. Laden Sie Dateien nach individuellen Bedürfnissen herunter.

7. Rasterelektronenmikroskopie

HINWEIS: Wenn die Filterscheibe vor der REM-Analyse nicht mit Metall beschichtet wird, fahren Sie mit Abschnitt 7.2 fort.

  1. Metallbeschichtung von Proben für das REM
    1. Montieren Sie die Filterscheibe mit Kohleband auf einen REM-Stummel aus Stahl.
    2. In einen Sputterer geben und die Kammer auf 50 mTorr abpumpen.
    3. Öffnen Sie das sputternde Ar (Argon)-Absperrventil.
    4. Spülen Sie das System, indem Sie Ar über ein Nadelventil auf einen Druck von 300 mTorr in die Kammer einführen, und evakuieren Sie die Kammer dann auf 50 mTorr. 3x wiederholen.
    5. Stellen Sie den Enddruck über das Nadelventil auf 100 mTorr ein.
    6. Unter Verwendung eines Au-Targets scheidet man Au durch Sputtern auf der Filterscheibe ab.
      HINWEIS: Andere Zielquellen (z. B. Pt, Ir, Si usw.) können alternativ anstelle von Au verwendet werden. Ein Strom von 20 mA erzeugt eine Abscheidung von 0,1 Angström/s bei 100 mTorr.
    7. Entlüften Sie das System und entfernen Sie die Filterscheibe. Lassen Sie die Filterscheibe am Edelstahlstummel haften.
  2. REM-Bilderfassung
    1. Befestigen Sie den Stummel mit einer Stellschraube an einem mehrstufigen Zeiss Auriga-Halter.
    2. Schalten Sie das SEM und die Computer ein, auf denen es ausgeführt wird, und lassen Sie jeden Computer starten.
    3. Öffnen Sie die Software, die an das SEM angehängt ist.
    4. Stellen Sie sicher, dass das System unter Vakuum steht (5e-6 Torr).
    5. Entlüften Sie die Ladeschleuse , indem Sie die Entlüftung am Hauptkörper der Ladeschleusenkammer drücken, und öffnen Sie die Ladeschleuse.
    6. Montieren Sie den mehrstufigen Halter an der teflonbeschichteten Einführlehre und befestigen Sie den Transferarm mit der beigefügten Schraubplatte.
    7. Schließen Sie die Ladeschleuse und pumpen Sie die Ladeschleuse herunter, indem Sie auf dem Hauptkörper der Ladeschleusenkammer auf Speichern drücken.
      HINWEIS: Der Abschluss erfolgt, wenn die grünen Lichter auf der Store-Taste nicht mehr blinken.
    8. Laden Sie die mehrstufige Halterung auf den Tisch in der Hauptbeobachtungskammer, indem Sie das Übergabetor öffnen.
    9. Drücken Sie auf Übertragen am Hauptkörper der Lastschleuse. Das Tor fällt herunter und legt die innere Kammer frei.
    10. Setzen Sie den Loadlock-Arm (in den mehrstufigen Halter eingeschraubt) ein und befestigen Sie den mehrstufigen Halter auf dem Tisch.
    11. Schrauben Sie den Loadlock-Transferarm ab und ziehen Sie den Arm vollständig ein, so dass er sich in der Loadlock befindet.
    12. Schließen Sie das Transfergate, indem Sie auf "Übertragen" drücken.
    13. Öffnen Sie das Absperrventil, indem Sie EHT in der unteren rechten Ecke der Software drücken.
    14. Stellen Sie den Arbeitsabstand in der Datenzone der Software auf 5 mm und die Beschleunigungsspannung auf 20 kV ein.
    15. Lokalisieren Sie die Filterscheibenmembran mit den Joysticks XY und Z.
    16. Heben Sie den Tisch mit dem Z-Joystick an, bis das Bild scharf wird.
    17. Korrigieren Sie den Astigmatismus , indem Sie die XY-Stigmatorknöpfe und das Fokusrad auf der Mittelkonsole einstellen.
    18. Bilde Probenpartikel in der gewünschten Vergrößerung, indem du das Vergrößerungsrad an der Mittelkonsole einstellst, und nimm Bilder mit einer Auflösung von 2.048 x 1.536 im 8- oder 16-Bit-TIFF-Format auf.
  3. EDX-Partikelanalyse
    1. Schalten Sie den ChamberScope CCD auf dem Desktop des SEM-Computers aus.
      HINWEIS: Wenn dieser Schritt nicht abgeschlossen ist, wird der EDX-Detektor mit dem Signal überfordert und es werden keine Daten aufgezeichnet.
    2. Kühlen Sie den EDX-Detektor , indem Sie die APEX EDX-Software auf dem EDX-Computer öffnen, indem Sie den Detektor in der oberen rechten Ecke des Menüs einschalten.
    3. Erfassen Sie ein REM-Bild mit niedriger Auflösung, das für das Mapping verwendet werden kann, indem Sie auf Bild aufnehmen klicken.
    4. Öffnen Sie das Menü Registerkarte "Zuordnung" oben auf dem Softwarebildschirm.
    5. Passen Sie unter Einstellungen die Auflösung (256 x 256) und die Pixelverweilzeit (0,16 μs) sowie die Bildnummer (32-64) an, um eine geschätzte Aufnahmezeit anzugeben, die ~5 Minuten lang sein sollte.
    6. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Menüs auf Karte erstellen .
    7. Wählen Sie Elementvorschau bestätigen , um die Elementsuche manuell anzupassen, oder verlassen Sie sich auf die automatisch identifizierten Peaks aus der Software.
    8. Generieren Sie nach Fertigstellung einen Bericht mit der AutoReport-Funktion im oberen rechten Bereich der Kartierungssoftware.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rohlinge und Hintergrundverunreinigungen verarbeiten
Ein akzeptables Blindergebnis ist ein Ergebnis, das entweder keine oder so wenige Partikel enthält, dass die Hintergrundkontamination (d. h. der Prozess) (falls vorhanden) die Ergebnisse des Experiments mit hoher Wahrscheinlichkeit verwirrt oder stört. Ein suboptimales Blindergebnis ist ein Ergebnis, das viele Partikel enthält, bei denen die interessierenden Partikel nur schwer von der Hintergrundkontamination zu unterscheiden sind.

Der akzeptable Grad der Prozesskontamination sollte bei oder so nahe wie möglich bei Null liegen, aber wenn Null nicht erreicht werden kann, ist die Konsistenz in der Anzahl der beobachteten Hintergrundpartikel entscheidend. Führen Sie mehrere leere Stichproben durch, um die Konsistenz der Ergebnisse zu bestimmen. Die Sorgfalt bei den Qualitätskontrollprotokollen (siehe Abschnitt 1), die Minderung der Kontamination und die richtigen Umgebungsbedingungen während der Verarbeitung sind von größter Bedeutung, um eine niedrige Hintergrundkontamination aufrechtzuerhalten. Die Ergebnisse und die Akzeptanz der Hintergrundkontamination können auch stark von der Abschaltung der verwendeten Nanomembranen und der allgemeinen Sauberkeit der Laborbedingungen abhängen. Es ist zu berücksichtigen, dass bei der Analyse kleinerer Partikel mit Membranen mit niedrigerem Cut-off-Gehalt (z. B. < 8 μm) die relative Häufigkeit der interessierenden Partikel und ähnlich großer Hintergrundverunreinigungen exponentiell zunimmt, was eine höhere Strenge bei der Qualitätskontrolle erforderlich macht22. Auch wenn ein Kontaminationsgrad nicht akzeptabel ist, solange die Bedingungen streng kontrolliert werden und ein hohes Maß an Konsistenz erreicht wird, können dennoch gute Analysen von Mikroplastik in der Umwelt oder Analysen von Interesse durchgeführt werden.

Filtration von Proben
Eine ideale Probenfiltration ist erforderlich, um eine originalgetreue multimodale Analyse zu erzeugen, wie das Beispiel für eine Datenkaskade in Abbildung 3 zeigt. Eine solche Probenfiltration führt zu gut dispergierten Partikeln über die Nanomembranoberfläche (z. B. mit etwa einem Drittel der Membranoberflächenabdeckung). Schlecht dispergierte Partikel, wie z. B. der Fall bei der Partikelaggregation (große Klumpen überlappender Partikel), verwirren sowohl manuelle als auch automatisierte Partikelzählmethoden, da überlappende Partikel nicht leicht und sicher unterschieden werden können. Solche Daten werden in der Regel von der Analyse ausgeschlossen, was zum Verlust wertvoller Informationen von Interesse führen kann. Gut dispergierte Partikel, wie in Abbildung 4A,B gezeigt, stellen sicher, dass spektroskopische oder Quantifizierungsanalysen nicht durch gestapelte oder überlappende Partikel unterschiedlicher Zusammensetzung erschwert werden, was zu Ergebnissen führen könnte, die schwieriger zu interpretieren, zu identifizieren und zu quantifizieren sind.

Färbung in Nilrot und Trypanblau
Repräsentative Bilder optimaler Fluoreszenzpartikelfärbevorgänge sind in Abbildung 3B auf einer SiN-Filterscheibe mit einem Cutoff-Gehalt von 20 μm dargestellt. Das Unterspülen des NR- oder TB-Flecks von der Nanomembranoberfläche kann zu falsch positiven Ergebnissen führen. Restpartikel, die aus Flecken bestehen, die aufgrund unzureichender Spülung auf der Membranoberfläche zurückgeblieben sind, können fälschlicherweise als fleckige Partikel interpretiert werden. Ein Zeichen dafür, dass eine unzureichende Spülung aufgetreten ist, ist, wenn Bereiche der Nanomembran ohne Partikel oder nachweisbare Restfilme/Rückstände aus der gefilterten Probe während der Beobachtung fluoreszieren, wie in Abbildung 5A gezeigt. Nach der Bildgebung kann, solange die Filterscheibe unter sauberen Bedingungen gehalten wurde, eine erneute Spülung durchgeführt werden, indem die einzelne Nanomembran-Filterscheibe wieder auf die Vakuumfiltrationsvorrichtung (ohne die Dichtungen) gelegt, das Vakuum eingeschaltet und ein weiteres Volumen ultrareines 99 % IPA (für NR) oder Reinstwasser (für TB) auf die Nanomembran der Filterscheibe filtriert wird. Notieren Sie das Gesamtvolumen des zusätzlich verwendeten Spülmediums. Um beste Ergebnisse zu erzielen, machen Sie Mikroskopiebilder der gesamten Nanomembranoberfläche, bevor Sie eine erneute Spülung durchführen, um mögliche Verunreinigungen zu berücksichtigen, die durch den erneuten Spülschritt auftreten können.

Raman-Spektroskopie
Die Raman-Spektroskopie, die an unbeschichtetem SiN durchgeführt wird, kann in Abhängigkeit von der Laserwellenlänge einen markanten Peak erzeugen, und dieser Peak kann Signale mit geringer Häufigkeit etwa innerhalb des Wellenzahlbereichs23 von 520 cm-1 maskieren. Wenn die interessierenden Raman-Spektren ausreichend vom Silizium- oder Siliziumnitrid-Hintergrund-Peak getrennt sind, sollte die Verwendung von unbeschichteten SiN-Filterscheiben zu angemessenen Raman-Spektroskopie-Ergebnissen führen. In diesem Bericht wurden in den Pipelines B und C Au-SiN-Filterscheiben verwendet. Die Goldbeschichtung aus Au-SiN maskiert den inhärenten Si-Peak, so dass Spektren mit geringer Häufigkeit zuverlässiger in der Nähe oder bei Wellenzahlen von 520 cm-1 erfasst werden können. Darüber hinaus kann Au-SiN mit der IR-Spektroskopie verwendet werden, wenn Raman nicht verfügbar ist. Beginnen Sie immer mit der niedrigsten Leistungseinstellung (d. h. Laserintensität) am Gerät und erhöhen Sie sie dann allmählich, da einige interessante Partikel, wie z. B. oxidierte Partikel, zerbrechlich sein und durch den Laser beschädigt oder zerstört werden können.

Bei der Analyse ausgewählter Partikel mit Raman-Spektroskopie ist die Bestimmung der Zuverlässigkeit eines zurückgegebenen Spektrums von entscheidender Bedeutung. Einige Partikel können automatisch fluoreszieren, und diese Fluoreszenz fügt der Spektralmessung Rauschen hinzu, das die Interpretation des Partikelsignals maskieren oder erschweren kann. Dieses Rauschen wird die Form eines hochintensiven Bandes annehmen, das einen breiten Bereich von Wellenzahlen umfasst und die zugrunde liegenden Daten miteinander verbindet. Richtige Spektren, die in Abbildung 3C und Abbildung 4C,D dargestellt sind, haben bereits vor der Baseline-Korrektur klar definierte Peaks über kürzere Spannen von Wellenzahlen. Wenn keine Peaks auftreten, die mindestens dreimal größer sind als alle umgebenden Signale, dann ist es wahrscheinlich, dass es sich bei den gesammelten Spektren entweder um Hintergrundrauschen handelt oder dass andere Geräteeinstellungen erforderlich sind, um das betreffende Teilchen zu analysieren. Stellen Sie sicher, dass für jede Probe die richtige Laserwellenlänge ausgewählt ist. Laser mit niedrigerer Wellenlänge, wie z. B. ein 532-nm-Laser, können das durch Fluoreszenz erzeugte Signal nicht ausreichend verarbeiten. Ein Laser mit höherer Wellenlänge, wie z. B. ein 782-nm- oder 830-nm-Laser, kann genügend Fluoreszenz ausreichend ignorieren, um ein Spektrum zurückzugeben. Je nach Art der Probe eignen sich unterschiedliche Laser für unterschiedliche Partikeltypen und können, wenn möglich, während der Datenerfassung auf einer einzigen Filterscheibe ausgetauscht werden.

Um die Zusammensetzung der Partikel zu bestimmen, werden die gesammelten Spektren mit denen in einer Referenzspektrendatenbank verglichen. Die zuverlässige Identifizierung eines bestimmten Teilchenspektrums führt zu einem Pearson-Koeffizienten (r) von mehr als 70 % (r > 0,70). Suboptimale Raman-Daten sind in Abbildung 5B dargestellt, wobei < 0,70 beträgt. Die Ergebnisse der MP-Identifizierung sind nützlich, um potenzielle Quellen für MP-Verschmutzung zu bestimmen. Zur Darstellung der Ergebnisse der Partikelidentifikation können ein Bild und Spektren des analysierten Partikels gezeigt werden, wie in Abbildung 3C und Abbildung 4C dargestellt.

Rasterelektronenmikroskopie
Sowohl SiN- als auch Au-SiN-Filterscheiben sind sofort nach der Partikelabscheidung durch Filtration mit dem REM kompatibel. Wenn die SiN-Filterscheiben vor dem REM und nach dem Partikeleinfang nicht mit Au oder Pt beschichtet werden, können einige Partikel durch den Ionisationsstrahl des REM leichter "aufgeladen" werden, was dazu führen kann, dass das Partikel entweder glüht oder in Bildern sehr hell erscheint. Diese Helligkeit/dieses Leuchten kann aufgrund des schlechten Kontrasts zu Problemen bei der Visualisierung führen, z. B. bei der Maskierung der Morphologie des Partikels. Um dies zu verringern, führen Sie vor dem REM optische/Fluoreszenzmikroskopie und Raman-Spektroskopie durch, um schwer zu analysierende oder kleine Partikel von Interesse für eine spätere REM/EDX-Analyse zu markieren, beschichten Sie dann die Nanomembran mit Au oder Pt, wie in Protokollabschnitt 7 beschrieben, und führen Sie REM/EDX durch.

Die Beschichtung von SiN oder Au-SiN mit Au oder Pt nach dem Partikeleinfangen und vor der REM-Analyse hilft, diesen Aufladeeffekt während der Bildgebung zu verhindern, da die Partikel nun unter der entsorgten Metallschicht nicht mehr anfällig für Ionisation sind. Diese Beschichtung verbessert den Kontrast und die Auflösung, so dass ein besseres morphologisches Verständnis eines bestimmten Partikels erzielt werden kann, wie in Abbildung 3D (Faser vs. Fragment) oder Oberflächenmorphologien, wie z. B. Vertiefungen und Risse auf oxidierten Partikeln, zu sehen ist. Metallbeschichtungspartikel vor der REM-Analyse verhindern dauerhaft, dass sie mit Spektroskopie oder Fluoreszenzbildgebung weiter analysiert werden können, so dass nur noch REM/EDX-Analysen möglich sind. Die Beschichtung der Partikel und die Durchführung von REM/EDX sollten daher die letzten Schritte in jedem Prozess sein, wenn dies beabsichtigt ist.

EDX-Messungen können sowohl vor als auch nach der Metallbeschichtung an eingefangenen Partikeln durchgeführt werden. EDX kann die spezifische elementare Zusammensetzung eines bestimmten Partikels oder Bereichs aufdecken, die gut zu allen Partikeln passt, die kleiner als die Größengrenze für die Nachweisgrenze für die Raman-Analyse sind, oder zu Elementzusammensetzungen, die mit bestimmten Raman-Laserwellenlängen wie Metall, Legierungen, wassergesättigten Partikeln und Partikeln schwer zu analysieren sein können, wie z. B. Metall, Legierungen, wassergesättigte Partikel und Partikel, die stark fluoreszieren, wenn sie den/den zur Verwendung zur Verfügung stehenden(n) Raman-Laserstrahl(en) ausgesetzt werden. In dieser Studie wurden die Partikel mit einer 6 nm dicken Schicht Au beschichtet. Die REM-Bildgebung wurde zwischen 200x und 3.000x Vergrößerung mit einer Strahlleistung von 20 kV und einer Brennweite von 5 mm durchgeführt. Die entsprechenden REM-Bilder der ausgewählten Partikel sind in Abbildung 3D dargestellt.

Repräsentative EDX-Ergebnisse sind in Abbildung 3F dargestellt. Elemente, die mit einem Gewichtsprozentsatz von weniger als 1 % detektiert werden, können je nach Empfindlichkeit des Instruments als Spuren oder unzuverlässig angesehen werden. Daher haben wir einen Schwellenwert von 1 % festgelegt. Wenn ausgewählte Partikel für die EDX-Analyse beschichtet wurden, ist eine nachweisbare Menge der Beschichtung im Elementdatenbericht vorhanden. Bei Verwendung von unbeschichteten SiN-Filterscheiben werden Si- und N-Signale beobachtet, wie in Abbildung 3F gezeigt. Die meisten synthetischen Polymerpartikel enthalten leider auch die Elemente C, H und O, da die meisten nicht-synthetischen Partikel aus biologischen Quellen ebenfalls aus den gleichen Elementen bestehen, aber nicht-synthetische Partikel können auch Elemente wie S enthalten, wie im Fall von Proteinen. Diese Ähnlichkeit in der Zusammensetzung ist der Grund, warum die Gegenfärbemethode mit Nilrot und Trypanblau für die Unterscheidung zwischen synthetischen und nicht-synthetischen Partikeln nützlich ist, aber kein erschöpfendes Identifizierungswerkzeug ist, da Nilrot in bestimmten Fällen auch in der Lage ist, nicht-synthetische Partikel zu färben. Zusätzliche Analyseparameter wie die oben vorgeschlagenen sollten in Verbindung mit allen Färbeverfahren verwendet werden, um die Ergebnisse zu bestätigen. Darüber hinaus kann EDX ein nützliches Werkzeug sein, um möglicherweise Partikel zu identifizieren, die außerhalb der Nachweisgrenze für die Raman-Spektroskopie liegen (d. h. Nanoplastik mit einer Größe von < 1 μm).

figure-results-1
Abbildung 1: SNAP-Pipelines. (A) Schematische Darstellung von SNAP-Pipelines, bei denen dieselben Partikel auf derselben Nanomembran mit einer Reihe verschiedener Analysetechniken charakterisiert werden. Pipeline A) zeigt , dass 1) aufgefangene Partikel von Interesse aus Trinkwasserproben mittels Vakuumfiltration 2) mit Nilrot und Trypanblau gefärbt werden, um synthetische bzw. nicht-synthetische Polymerpartikel zu unterscheiden, gefolgt von 3) Partikelidentifizierung mittels Raman-Spektroskopie und 4) REM/EDX zur Charakterisierung der Partikelmorphologie und Elementidentifizierung. Pipeline B) demonstriert 1) den Partikeleinfang auf Au-SiN, gefolgt von 2) Raman-Spektroskopie. Rohrleitung C) demonstriert 1) Partikeleinfang auf Au-SiN, gefolgt von REM/EDX. (B) Schematische Darstellung der Filterscheibe und der Silikondichtung in der Filtrationsanordnung in der Vakuumvorrichtung, die die sequentielle Filtration durch eine 20 μm MPSN, dann 8,0 μm MSSN-Nanomembran darstellt, die durch Silikondichtungen getrennt ist. Abkürzungen: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; REM = Rasterelektronenmikroskopie; EDX = energiedispersive Röntgenspektroskopie; MPSN = mikroporöses Siliziumnitrid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Entnahmequellen für Trinkwasserproben. Eine von der Monroe County Water Authority veröffentlichte regionale Karte, auf der die Orte dargestellt sind, an denen jede der vier Trinkwasserproben in der Region Greater Rochester, NY, entnommen wurde. Die Proben stammten aus verschiedenen Oberflächenwasserquellen: Lake Ontario (blau), Hemlock Lake (grün), Hemlock Lake und Lake Ontario (gelb) und Canandaigua Lake (violett). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Zusammenfassung der Analysen aus der SNAP-Pipeline A, die an Partikeln durchgeführt wurden, die aus Trinkwasserproben abgeschieden wurden. (A) Graustufenbild von eingefangenen Partikeln aus einer repräsentativen Trinkwasserprobe auf einem 20 μm Cutoff-SiN. (B) Falschfarbenes Überlagerungsbild von gegengefärbten Partikeln zur Darstellung von Nilrot (falschfarbige rote Partikel) und Trypanblau (falschfarbige blaue Partikel). (C) Referenzspektren (rot) und gesammelte (weiße) Raman-Spektren, die ein mit Nilrot gefärbtes Partikel als Polyethylen mit einem Pearson-r-Wert von 0,97 identifizieren, mit repräsentativem Bild des analysierten Partikels. (D) Elektronenmikroskopische Aufnahme von zwei verschiedenen Partikeltypen, die die Analyse der Partikelmorphologie einer Faser (obere Platte) und eines Fragments (untere Platte) zeigt, die beide die Trypanblau-Färbung aufnehmen. (E) Quantifizierung von Nilrot-gefärbten Partikeln, die nacheinander sowohl auf 20 μm als auch auf 8 μm Cut-off-Nanomembranen eingefangen wurden. (F) Zusammengefasste EDX-Elementaranalyse eines zufällig ausgewählten Fragments und analytische Details der Ergebnisse mit repräsentativem REM-Bild des analysierten Partikels. Abkürzungen: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; REM = Rasterelektronenmikroskopie; EDX = energiedispersive Röntgenspektroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Zusammenfassung der Analysen aus der SNAP-Pipeline B, die an Partikeln durchgeführt wurden, die aus Trinkwasserproben aufgefangen wurden. Raman-Spektralanalyse von drei randomisierten Partikeln aus vier Trinkwasserproben von Haushalten, die auf 20 μm MPSN- und 8,0 μm MSSN Au-SiN-Filterscheiben erfasst wurden. Repräsentative Dunkelfeldbilder der gesamten aktiven Membranfläche für 20 μm bzw. 8 μm Au-SiN sind in A und B dargestellt. Partikel erscheinen in diesem Bildgebungsmodus gelb, während der Hintergrund dunkel bleibt, was eine einfache automatische Partikelzählung ermöglicht. Repräsentative Raman-Spektren von synthetischen und nicht-synthetischen Partikeln auf (C) 20 μm und (D) 8,0 μm Au-SiN. Die Gesamtpartikelzahlen für (E) 20 μm und (F) 8,0 μm Au-SiN werden nach Größenbereichen sortiert, die von der automatisierten Partikelsuchsoftware bestimmt werden. Abkürzungen: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; REM = Rasterelektronenmikroskopie; EDX = energiedispersive Röntgenspektroskopie; MPSN = mikroporöses Siliziumnitrid; MSSN = Mikrospalt Siliziumnitrid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Ergebnisse der suboptimalen Fluoreszenzbildgebung und Raman-Spektroskopie. (A) Ein suboptimales Fluoreszenzbild von gefärbten Partikeln (linkes Bild), bei dem die Membran den Nilrot-Fleck zurückhielt, wahrscheinlich durch Unterspülen. Zwei Partikel, eine mit Trypanblau gefärbte Faser und ein mit Nilrot gefärbtes Fragment (rechtes Bild), wurden für die Raman-Spektroskopie ausgewählt. (B) Ergebnisse der suboptimalen Raman-Spektroskopie, bei denen der Pearson-Koeffizient (r) weniger als 70 % (r < 0,70) beträgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle S1: Eigenschaften von Silizium-Nanomembranen in Filterscheiben. In dieser Tabelle sind die Eigenschaften der Membranen innerhalb der SiN-Filterscheiben dargestellt, einschließlich der minimalen Porengröße, der prozentualen Porosität, der Dicke der Membranen mit und ohne Au-Beschichtung, der aktiven Fläche der Membran und der Gasdurchlässigkeit durch die Membran bei positivem Druck, der mit einem eingestellten konstanten Druck ausgeübt wird. Cut-off (d. h. Porengröße), Porosität, Dicke und Membranfläche, bestimmt durch Messung von Merkmalen auf REM-Bildern. Die Daten zur Gasdurchlässigkeit werden als mittlere ± Standardabweichung (n = 10) für den bei 103,42 kPa angelegten Überdruck N 2 angegeben. Abkürzungen: Au = Gold; Six Ny = Nicht-stöchiometrisches Siliziumnitrid. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S2: ParticleFinder-Partikelzahlen und Parameter. Von jeder Probe wurden Bildmosaike des gesamten Membranbereichs entnommen, und jedes Bildmosaik wurde analysiert, um die Gesamtpartikelzahl zu erfassen. In dieser Tabelle sind die Parameter aufgeführt, die verwendet werden, und in welcher Reihenfolge die Gesamtpartikelzahl für jedes Probenbild und die Partikelzahl bei bestimmten Größenfraktionen bestimmt wird. Die Parameter variieren von Probe zu Probe und hängen von Art, Menge und Form der Partikel sowie dem spezifischen Reflexionsvermögen jeder Membran während der Bildgebung ab. Die Daten aus dieser Tabelle sind in Abbildung 4 visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Eindämmung der Verschmutzung durch Mikroplastik ist ein zunehmend besorgniserregendes Thema. Und der erste Schritt der Eindämmung besteht darin, das Vorhandensein von Kontaminationen zu identifizieren. Eine optimierte Methode zur Erfassung und sofortigen Analyse ist entscheidend, um den Ermittlern Zeit zu sparen und sensible Probenmetriken zu erhalten. Dieser Bericht beschreibt flexible Arbeitsabläufe, die auf Variationen unserer entwickelten SNAP-Methoden für die Analyse solcher MP in flüssigen Proben basieren, wobei ein einziges Substrat für alle durchgeführten Analysen verwendet wird. Die Probe muss so vakuumfiltriert werden, dass die Partikel aufgefangen und auf einer Silizium-Nanomembran isoliert werden, die in einer Filterscheibe untergebracht ist. Eine ausreichende Minderung der Hintergrundkontamination ist entscheidend für aussagekräftige Ergebnisse. Alle kontaminierenden Partikel auf der Dosierspritze oder dem Glasvakuumtrichter während der Filtration können die Probe kontaminieren und gleichzeitig aufgefangen werden, daher ist die sorgfältige Befolgung der Qualitätskontrollprotokolle nach Abschnitt 1 für genaue Ergebnisse von entscheidender Bedeutung. Es wird empfohlen, nur mit Medien zu kontrollieren, um die Prüfer über Hintergrundkontaminationen zu informieren, die für einzelne Prozesse und Laborbedingungen spezifisch sind. Das hierin beschriebene Protokoll beruht auf der Vakuumfiltration einer flüssigen Probe sowie auf dem Auffangen und Isolieren von Partikeln aus der Probe auf zwei verschiedenen abgeschnittenen SiN-Filterscheiben. Bei allen Rohrleitungen muss die Partikelabscheidung und -isolierung anderen Methoden vorausgehen, aber alle anderen Identifizierungsmethoden können in der Reihenfolge durchgeführt werden, die für den Prüfer am besten geeignet ist.

Für diese Studie wurden zwei Fluoreszenzmikroskope verwendet, um die Wiederholbarkeit der Ergebnisse über alle Instrumente hinweg zu demonstrieren. Die Instruktionsschritte beschreiben speziell die Verwendung einer Olympus BX61 für die Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der überwiegenden Verwendung und wurde gemäß den Anweisungen des Geräts unter Verwendung von Hellfeld für die Graustufenbildgebung, TRITC-Kanal (z. B. ~543 nm; Em. ~593 nm) für die Bildgebung von NR-gefärbten Partikeln und Cy5-Kanal (z. B. ~649 nm; Em. ~667 nm) für die Bildgebung von TB-gefärbten Partikeln. Um die Ergebnisse der Färbung darzustellen, empfehlen wir, eine Überlagerung der Kanalbilder zu konstruieren (für die Bildverarbeitung verwenden wir FIJI/ImageJ, im Folgenden als Bildanalyseplattform bezeichnet), mit einer Auflösung von 2.048 x 2.040 Pixeln und einer Tiefe von 16 Bit. Ganze Nanomembranbilder können wie in Abbildung 4A, B oder als ausgewählte interessante Regionen, wie in Abbildung 3A, B gezeigt, dargestellt werden.

Nilrot wird häufig zum Färben von synthetischen Polymer-MP verwendet, kann aber aufgrund seiner lipophilen und hydrophoben Natur nicht-synthetische Polymere aus biologischen Quellen färben, was möglicherweise zu falsch positiven Ergebnissen führt, die die MP-Quantifizierungsergebnisse verfälschen 24,25,26. Ein Trypanblau-Gegenfärbeschritt, wie in Protokollabschnitt 3 beschrieben, wird empfohlen, um die Unterscheidung von falsch-positiven Ereignissen zu unterstützen, ist jedoch keine erschöpfende Lösung und sollte mit zusätzlichen Analysemetriken kombiniert werden, um die Ergebnisse zu bestätigen. Die Nilrot-Fluoreszenz von Partikeln ist ein Problem bei der Raman-Spektroskopie-Analyse, da sie das Hintergrundsignal erheblich erhöhen kann. In dieser Studie haben wir jedoch Polymere vor der Raman-Spektroskopie mit einem 830-nm-Laser mit Nilrot und Trypanblau gegengefärbt, und es wurde nur wenig Rauschen beobachtet, wie in Abbildung 3 gezeigt.

Einige Wellenlängen von Lasern, die für die Raman-Spektroskopie geeignet sind, sind nicht in der Lage, die Fluoreszenz von gefärbten Partikeln zu ignorieren, wie z. B. ein 532-nm-Laser, und können daher erhebliche Schwierigkeiten bei der korrekten Schätzung der Zusammensetzung des interessierenden Partikels verursachen. Die Metallbeschichtung der Partikel nach der Aufnahme ist nützlich, um den Kontrast während der REM-Bildgebung zu verbessern, ist aber mit einer nachfolgenden spektroskopischen oder Fluoreszenzanalyse nicht kompatibel. Notieren Sie sich vor dem Versuchsaufbau alle gewünschten Messungen, um sicherzustellen, dass der Prozessablauf und die Beschichtungsarten richtig berücksichtigt werden. Die Au-SiN-Filterscheiben können für alle genannten Analysen verwendet werden, bei denen die Transmissionsmikroskopie für den Arbeitsablauf nicht entscheidend ist oder wenn Raman- oder IR-Spektroskopie verwendet wird.

Die hier gezeigten Methoden sowie die Nanomembranen, die zum Einfangen und Isolieren von Partikeln verwendet werden, können an die individuellen Bedürfnisse der Forscher angepasst werden. Die Nanomembranen eignen sich für eine Reihe von spektroskopischen Analysen, und der Untersucher kann das zu filtrierende Medium gegen ein anderes Probenmedium von Interesse austauschen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf verdautes tierisches Gewebe27, injizierbare Arzneimittel und Ölproben. Für diese Studie wurden zwei Raman-Spektroskopie-Instrumente verwendet, und in den Unterrichtsschritten wird die Verwendung eines Horiba XploRA Plus Raman-Instruments, das alle in Abbildung 4 gezeigten Daten sammelte und verarbeitete, detailliert beschrieben. Es ist auch wichtig, die Größenbeschränkung der Detektion für jedes Raman-Mikroskop zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass die interessierenden Partikel mit der Punktgröße der Laser des Instruments angemessen analysiert werden können. Um die Ergebnisse der Partikelidentifizierung mit Raman anzuzeigen, können die Referenz- und Probenspektren sowie ein Bild des analysierten Partikels wie in Abbildung 3C und Abbildung 4C dargestellt werden.

Protokollabschnitt 6 enthält Anweisungen zur Identifizierung von Teilchen mithilfe einer Open-Source-Spektralbibliothek. Der planarisierte Einfang von Partikeln auf einer gleichmäßig flachen Membran sowie die regelmäßige Anordnung der Poren der Membran ermöglichen eine vorhersagbare, automatisierte Bildgebung. Sowohl die Dicken von 400 nm oder 1.000 nm des SiN als auch ihre Siliziumnitrid-Zusammensetzung verleihen ihnen eine hervorragende optische Transparenz, können aber auch in einigen spektroskopischen Instrumentenparametern einen intensiven Silizium-Peak aufweisen. Bei der Verwendung von blankem, nicht metallbeschichtetem SiN bei der Raman-Analyse ist Vorsicht geboten. Der Si-Peak kann als Kalibrierungssignal fungieren, aber die Intensität des Peaks kann auch die Signale von Spektren niedrigerer Intensität im selben Wellenzahlbereich wie das Si-Signal maskieren. Solche Si-Peaks wurden in dieser Studie bei Verwendung des 830-nm-Lasers nicht beobachtet.

Die ultradünne Beschaffenheit des hier verwendeten SiN (400 nm oder 1.000 nm dick) und Au-SiN (520 nm oder 1.120 nm dick) verlieh ihnen ihre hervorragenden filtrierenden, optischen und spektroskopischen Eigenschaften. Diese Membranen müssen jedoch vor physischen Beschädigungen geschützt werden, z. B. durch übermäßigen Differenzdruck (z. B. ≥-206 kPa), direkte Berührung mit einer Pinzette oder einem Finger oder durch unsachgemäße Platzierung der Dichtung. Die Filterscheibe, in der die Membranen untergebracht sind, schützt diese und ermöglicht eine einfache Handhabung bei normalem Gebrauch. Berühren Sie bei der Manipulation der Filterscheiben nur den schwarzen Außenring und niemals den aktiven Membranbereich. Obwohl hier nicht quantitativ berichtet, verringert das Sammeln von eingefangenen Partikeln auf einer kleinen Menge an Membranoberfläche (3 x 3 mm für 20 μm bzw. 3 x 0,7 x 3 mm für 8,0 μm Cut-off-Membranen) möglicherweise die Gesamtzeit für die Probenanalyse, indem die Zeit reduziert wird, die zum Auffinden und Analysieren von Partikeln von Interesse benötigt wird. Dieser "Konzentrationsfaktor" ist es wert, in Zukunft erforscht zu werden, und könnte Forschern einen einzigartigen Vorteil von SiN-Filterscheiben bieten. In Kombination mit ihren höheren oberflächennormalisierten Flussraten im Vergleich zu anderen weit verbreiteten Membranen für die MP-Charakterisierung15 können automatisierte Partikelbildgebungsroutinen, die nur einen relativ kleineren Bereich von gleichmäßig flachem und fokussiertem SiN abbilden müssen, die Gesamtanalysezeiten weiter reduzieren. Die Vorteile des hypothetischen Konzentrationsfaktors müssen jedoch noch empirisch nachgewiesen werden, indem die Gesamtverarbeitungszeiten (von der Filtration bis zur Bildanalyse) auf konventionellen und SiN-Filterscheiben verglichen werden.

Wir haben den Nutzen der SNAP-Variationen heuristisch an lokalen Leitungswasserproben demonstriert. Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf die Abscheidung von MP aus Trinkwasserquellen in der Umgebung von Rochester, NY. Die Probenentnahme verlief folgendermaßen: Bei jeder Probenentnahme wurde mindestens ein Liter Wasser durch den Wasserhahn geleitet, bevor die Entnahme begann. Neue, versiegelte Polypropylen-Flaschen wurden zum laufenden Wasserhahn gebracht und direkt vor der Entnahme geöffnet. Die Flaschen wurden vor der Sammlung nicht mit Trinkwasser gespült. Jede Probe bestand aus zwei 500-ml-Flaschen, die direkt hintereinander entnommen wurden. Jede Wasserprobe stammte aus dem Rohrsystem eines bestimmten Haushalts, und das Rohrmaterial war während der gesamten Probenahme nicht konsistent. Variablen wie die Menge des jüngsten Wasserverbrauchs, der Zeitpunkt der Sammlung, das Alter der Rohre und das Alter des Hauses, aus dem die Probe stammte, konnten in dieser Studie nicht kontrolliert werden. Dabei handelte es sich nicht um ein validiertes Probenentnahmeprotokoll. Jeder Prüfer sollte seine eigenen Erhebungsverfahren entwickeln und validieren. Im Interesse der vollständigen Offenlegung der Verfahren ist jedoch die obige Beschreibung enthalten. Die Filterscheiben ermöglichen die wiederholte Analyse auf demselben Substrat für eine Reihe von Analysemethoden. Es sind keine Unterproben oder mehrere Proben außerhalb von Standard-Versuchsreplikaten erforderlich. Der Wegfall von Subsampling und mehreren Proben erhöht das Vertrauen in die Erfassung von Informationen über Ziele mit geringer Abundanz. Neben der Ermöglichung multimodaler Analysemethoden bieten die SiN-Filterscheiben einen deutlichen Vorteil gegenüber anderen analogen Filtrationsmedien aufgrund der zeitsparenden Qualität einer schnelleren Filtrationsrate pro Flächeneinheit15.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JR und JM sind Gründer und Aktionäre von SiMPore Inc. JR ist Miterfinder einer Patentanmeldung, die die Verwendung von Siliziumnitrid-Filtern ermöglicht, wie sie in dieser Studie dargestellt sind.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peng Miao von Horiba Scientific hat diese Veröffentlichung großzügig mit dem Einsatz und der Expertise ihres XploRA Plus Raman-Spektroskopiesystems unterstützt. Die elektronenmikroskopische Bildgebung wurde im Integrated Nanosystems Center (URnano) an der University of Rochester durchgeführt. Die Mikrofabrikation wurde am Semiconductor and Micro-systems Fabrication Laboratory (SMFL) am Rochester Institute of Technology durchgeführt.

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde teilweise vom National Institute of Environmental Health Sciences unter der Preisnummer unterstützt. R44ES031036 an SiMPore und vom Lake Ontario MicroPlastics Center (LOMP) im Rahmen des National Institute of Environmental Health Sciences Award No. P01 ES035526 und dem National Science Foundation Award No. OCE-2418255 an die University of Rochester. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung einer Förderorganisation wieder.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 L GlasbecherPyrex1000-1L
1 L IsolierflascheMillipore SigmaZ290459-1EA
Laborkittel aus 100 % BaumwolleLandauLA-3172
100 mL GlasfiltrationstrichterAdvantec311000https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99%iger IsopropylalkoholFisher ScientificA416-20
APEX EDSEDAXEDX-Software zur Durchführung von EDX-Analysen an aufgefangenen Partikeln.
Denton Prep SputtersystemDenton VacuumDESK II : 293618089Goldbeschichtungssystem
FIJI, BildanalyseplattformImageJV 1.54FFIJI (FIJI ist nur ImageJ) - eine Distribution von ImageJ 
Glasflasche mit SchraubverschlussCorning 1395-250
KimwipesKimtech06-666-11C
LabSpec6Horiba ScientificHoriba Raman Software mit ParticleFinder und ViewSharp
Laminar-Flow-HaubeAir ScienceVLF-72A
Mikroskop Olympus  / NikonBX61 / Ti2eJedes Mikroskop mit geeigneter Fluoreszenz kann für die optische Mikroskopie verwendet werden. 
MPSN SiN FilterSiMPore Inc.FD25-8.0-Au; FD25-8.0-NC
FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Monoject 60 mL SpritzenCoviden8881560265
Nil Rotes PulverTCIN0659
Nitril HandschuheAnsell Microflex19-167-17
OpenSpecyopenanalysis.orgOpen Source, Spektralbibliothek
OfenVWR1310Gravity Convektion Utility Oven
P20 PipetteBrandtech705872
PipettenspitzePremium VialsGS 151140R
Pourous Support FritteAdvantec311000Teil des Bundles
Raman InstrumentHoribaXplora PLUS
GummistopfenAdvantec311000Teil des Bundles
REM InstrumentZiessAurigaAuriga Serie, Modulare Traversen-Arbeitsstation
SilikondichtungenSiMPoreGASKET-25-RKlarguss-PDMS-Dichtungen, 0,8 mm stark
SilikonwalzeSanyue ( ASIN: B07XDTNPS3)Silikonwalze -  8 x 5 x 2 Zoll
SmartSEMZeissV8SEM-Software zur Bedienung der Zeiss Auriga
SprühflascheUlineS-7273
Spritzenfilter Thermo ScientificCH2225-PES0,22 & Mikro; M Luer-Lock-Spritzenvorsatzfilter, 25 mm 
SpritzenpumpeNew Era Pump Systems, Inc.NE-1000Optional, aber empfohlen
Trypanblau - 0,4%Millipore SigmaT8154-20ML
PinzetteSiMPoreK6TWZR
VakuumpumpeWelch847-676-8800
VakuumschlauchGraingerZUSA-HT-4037

References

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