Methodenartikel

Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird

DOI:

10.3791/68204

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9. Mai 2025

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1SDS Optic S.A.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren einen validierten Sandwich-ELISA-Assay mit neuartigen monoklonalen Anti-HER2-Antikörpern. Dieser Assay ermöglicht die präzise Quantifizierung von zellgebundenem und freigesetztem HER2-Protein aus in vitro kultivierten Zellen und anderen Proben, einschließlich Blut und Geweben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) ist ein gut etablierter Krebsmarker. Es wurde zu einem sehr erfolgreichen diagnostischen und therapeutischen Ziel, insbesondere bei Brustkrebs und anderen HER2-exprimierenden Krebsarten. In der Klinik werden die immunhistochemischen Diagnosemethoden des Goldstandards mit den spezifischen Anti-HER2-Antikörpern eingesetzt, um das Expressionsniveau des membrangebundenen Rezeptors zu messen. Die lösliche extrazelluläre Domäne (ECD) von HER2, die von den überexprimierenden Zellen freigesetzt wird, zirkuliert im Blut und kann die Gewebeexpression des Rezeptors widerspiegeln. Es besteht ein Bedarf an genauen und validierten Assays, um die Konzentration des zirkulierenden HER2-Proteins mit den klinischen Manifestationen der Krankheit zu korrelieren.

Unser Team hat den neuartigen Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Quantifizierung der membrangebundenen und der aus Zellen freigesetzten ECD-Domäne von HER2 entwickelt und validiert. Der Assay verwendet zwei einzigartige monoklonale Antikörper, die spezifisch für HER2 sind und zuvor entwickelt wurden. Der Bestimmungsbereich umfasst eine HER2-Konzentration von 1,56 bis 100 ng/ml, die für in vitro kultivierte Krebszellen erwartet wird und eine Sensitivität auf einem Niveau von 0,5 ng/ml zeigt. Die zufriedenstellende Intra- und Inter-Assay-Präzision und Genauigkeit der Methode machen sie für die HER2-Quantifizierung in verschiedenen Arten von biologischen Proben, einschließlich Zellkulturmedium, Serum und solidem Tumorgewebe, anwendbar. Hier konzentrieren wir uns auf die umfassende Bestimmung der Rezeptor-assoziierten und von den in vitro kultivierten Krebszellen sezernierten Krebszellen. In der Arbeit wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Quantifizierung des HER2-Proteins vorgestellt, das für die Untersuchung einer Vielzahl von Zelllinien, Blut und Geweben eingesetzt werden kann.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Erfolg moderner Therapeutika hängt oft mit der Präzisionsmedizin zusammen, die auf der genauen Identifizierung therapiesensitiver Patienten beruht1. Zu diesen Therapien gehören die Anti-HER2-Medikamente, die auf den Rezeptor abzielen, der bei einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert wird, darunter Brust, Endometrium, Magen, Lunge und andere. Es gibt mehrere HER2-gerichtete Wirkstoffe mit bestätigtem Nutzen bei Patientinnen mit HER2-positiven Krebserkrankungen, einschließlich HER2-niedrigem Typ2. Die Bestätigung des HER2-positiven Status ist entscheidend für die Identifizierung der potenziell ansprechenden Patientinnen; Es bleibt jedoch eine Herausforderung, insbesondere in der HER2-Low-Gruppe.

Zu den Goldstandardmethoden im klinischen Umfeld, die routinemäßig für HER2-Tests verwendet werden, gehören die Immunhistochemie (IHC) Proteinexpression und die HER2-Genamplifikation durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Darüber hinaus wird der Oncotype DX Assay für die HER2-mRNA-Expression verwendet. Die für diese Methoden erforderliche Gewebebiopsie macht die Bestimmung der Eignung der Patienten für eine geeignete Behandlung und ihres potenziellen Ansprechens auf Therapien unsicher. Trotz der aktualisierten Richtlinien der American Society of Clinical Oncology (ASCO) und des College of American Pathologists (CAP) aus dem Jahr 2018, um die Variabilität zwischen den Testeinheiten zu reduzieren, bleibt die HER2-Konkordanz ein Gegenstand für Verbesserungen3.

HER2 ist ein Proto-Onkogen, das zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) gehört, deren Überexpression und Aktivierung in den pathologischen Zuständen zu einem aggressiven Ergebnis führen oder zu einer schlechten Prognose beitragen4. HER2 ist ein modulares Protein mit einer Größe von 185 kDa, das in der Zellmembran verankert ist und eine zytoplasmatische Tyrosinkinase und eine extrazelluläre Domäne (ECD) enthält. Das HER2-ECD kann aus den Zellen ausgeschieden werden, um als zellfreies Protein in die extrazelluläre Matrix5 freigesetzt zu werden, das weiter im Blut zirkuliert. Eine erhöhte HER2-Expression könnte sich in einem höheren Niveau der zirkulierenden ECD widerspiegeln, das einen wertvollen prädiktiven und prognostischen Marker 6,7, einen Surrogatmarker für das Ansprechen auf die Behandlung8 oder als ergänzende Methode zur IHC darstellt, um Patienten zu identifizieren, die für eine Anti-HER2-Behandlung in Frage kommen9. Die Herausforderung besteht jedoch weiterhin darin, die Korrelation zwischen der HER2-Expression des Tumors und dem systemischen Spiegel des Rezeptors im Blut herzustellen, die eine klinische Bedeutung haben könnte.

Die freigesetzte HER2-ECD kann mit Hilfe des Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)10 quantifiziert werden. Der Sandwich-ELISA ist ein Ansatz, bei dem zwei spezifische Antikörper verwendet werden, die unterschiedliche Epitope an dasselbe Zielantigen binden. Sie ermöglicht die genaue Messung von löslichen Proteinen in dem leicht zugänglichen blut- und flüssigkeitsbasierten biologischen Material (sogenannte Flüssigbiopsie). Trotz des Vorhandenseins von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassener Assays gibt es Kontroversen über den Nutzen der HER2-ECD-Diagnostik5 und den Grenzwert für einen erhöhten HER2-Spiegel im Blut. Weitere Forschung mit den validierten Methoden und einheitlich akzeptierten Schwellenwerten ist erforderlich, um die Anwendbarkeit der Assayszu bestätigen 11.

Die kritischen Komponenten eines jeden ELISA sind das Erfassen (immobilisiert auf der Platte und Definition der Assay-Spezifität und -Sensitivität) und der Nachweis von Antikörpern (die nach dem Auftragen der Proben hinzugefügt werden) (Abbildung 1). In diesem Bericht stellen wir das ELISA-Protokoll vor, das auf den kürzlich entwickelten neuen monoklonalen Anti-HER2-ECD-Antikörpern (mAb) basiert, die auf einer Affinitätssäule erzeugt, gereinigt und gründlich charakterisiert wurden, und stellen einzigartige Sequenzenvor 12. Der entwickelte ELISA, der diese kundenspezifischen Antikörper verwendet, zeigt seinen Nutzen für die genaue Quantifizierung des HER2-Proteins, das mit der Zellmembran assoziiert ist und in ein Kulturmedium abgegeben wird, um den Rezeptorstatus umfassend zu beurteilen. Der Assay kann in präklinischen Tests und zur Unterstützung der laufenden Forschung eingesetzt werden. Die Leistungsfähigkeit des Assays wurde weiter an biologischen Proben unterschiedlicher Herkunft, einschließlich Serum- und Gewebehomogenaten12, getestet, um das Potenzial für die Entwicklung von Forschung, Diagnostik und neuartigen Anti-HER2-Behandlungen in der Zukunft zu zeigen.

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Protokoll

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1. Kultivierung menschlicher Krebszellen

  1. Kultivieren Sie MDA-MB-231-, SK-BR-3- und SK-OV-3-Linien in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 4,5 g/l ᴅ-Glucose (DMEM-HG) enthält, ergänzt mit 2 mM ʟ-Glutamin und 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem FBS. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
  2. Wenn die Kultur ~80% Konfluenz erreicht, lösen Sie die Zellen durch Trypsinisierung ab und sammeln Sie sie in separaten konischen 15-ml-Röhrchen.
  3. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler und die Samenzellen für das Experiment in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 3 × 105 Zellen/pro Well in 1 ml Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
    HINWEIS: Säen Sie eine Vertiefung pro Zeitpunkt des Experiments. Sowohl Nachkulturmedium als auch Zelllysate werden in der weiteren Analyse verwendet.

2. Probenentnahme und -vorbereitung

  1. Sammeln Sie das Kulturmedium aus der 24-Stunden-Kultur aus einer Vertiefung jeder Zelllinie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
  2. Die entnommenen Proben werden bei 10 000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei -20 °C lagern, um den sezernierten ECD-HER2-Spiegel weiter zu bestimmen.
  3. Waschen Sie die restlichen Zellen auf der Platte mit 1 ml kaltem PBS, aspirieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie das PBS.
  4. Geben Sie 200 μl RIPA-Puffer (ergänzt mit 1 % Proteaseinhibitor) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 5 Minuten lang. Kratzen Sie die Zellen mit dem Zellschaber ab und mischen Sie durch mehrmaliges Pipettieren, um das Lysat zu homogenisieren.
  5. Sammeln Sie die lysierten Zellen in einem neuen Röhrchen und aspirieren Sie sie langsam mit einer Nadel in eine 2-ml-Spritze (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Wiederholen Sie den Aspirationsschritt 5-10 Mal, um die Zellen weiter aufzulösen.
  6. Die entnommenen Proben werden bei 10 000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen umgefüllt und bei -20 °C gelagert, um die zellgebundene Fraktion des HER2-Proteins weiter zu bestimmen.
  7. Wiederholen Sie die Entnahme von Kulturmedium und zellulärem Material und befolgen Sie die Vorbereitungsschritte für die verbleibenden Zeitpunkte - 48 h und 72 h Kultur.

3. Durchführung eines Sandwich-ELISA zur HER2-Bestimmung

  1. Bereiten Sie die Puffer vor.
    1. Überzugspuffer: 0,1 M NaHCO3-Lösung herstellen, indem 0,42 g NaHCO3 in 50 mL destilliertem Wasser gelöst und gründlich gemischt werden. Stellen Sie den pH-Wert mit 3 M NaOH auf 9,6 ein.
    2. Blockierungspuffer: Bereiten Sie 5 % fettfreie Milch (NFDM) in PBS vor, indem Sie 0,5 g Lotting-Milchpulver zu 10 ml PBS hinzufügen und gründlich mischen.
    3. Waschpuffer: Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST) vor, indem Sie 0,5 mL 0,05 % Tween-20 bis 1000 mL PBS hinzufügen und mischen (übermäßige Schaumbildung vermeiden).
  2. Biotinylat des nachweisbaren Antikörpers.
    1. Biotinylat 50-200 μg nachweisbarer Anti-HER2-Antikörper (Klon 70.21.73.67) unter Verwendung eines kommerziellen Biotin-Markierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Die Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit des Biotinylierungsprozesses basiert auf der Messung der endgültigen Proteinkonzentration des resultierenden Antikörpers und dem Chargenvergleich des Produkts.
  3. Bestreiche die Platte.
    1. Verdünnen Sie den Anti-HER2-Fängerantikörper (Klon 70.27.58) auf eine Konzentration von 1 μg/ml im Beschichtungspuffer. Um eine Platte zu beschichten, verwenden Sie 6,5 ml der einfangenden Antikörperlösung.
    2. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der in Schritt 3.3.1 hergestellten Auffangantikörperlösung in jede Vertiefung auf einer 96-Well-ELISA-Platte.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die äußersten Vertiefungen der Platte (z. B. A1, H12), um die durch den Kanteneffekt verursachte Variabilität zu reduzieren. Die äußersten Vertiefungen sollten mit destilliertem Wasser gefüllt werden, um stabile Reaktionsbedingungen zu gewährleisten.
    3. Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.
    4. Die Platte über Nacht (O/N) bei 4 °C inkubieren.
    5. Nach der O/N-Inkubation stellen Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 1 h auf einen horizontalen Mikroplattenschüttler (20-30 U/min mit einem Neigungswinkel von 4°-6°).
    6. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).
  4. Blockieren Sie die Platte .
    1. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl Blockierungspuffer (5 % NFDM in PBS) in jede beschichtete Vertiefung, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
    2. Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.
    3. Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    4. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).
  5. Bereiten Sie eine Kalibrierkurve und eine Positivkontrolle vor (Abbildung 2).
    1. Bereiten Sie die Arbeitsstandardlösung des HER2-Antigens vor, indem Sie 2 μl 1 mg/ml-Stammlösung zu einer 1998 μl PBS hinzufügen, um eine HER2-Konzentration von 0,001 mg/ml (1000 ng/ml) zu erhalten.
    2. Verdünnen Sie die Arbeitsstandardlösung (WSS), indem Sie 200 μl der Lösung zu 1800 μl PBS hinzufügen, um die Standardlösung 1 (STD 1) zu erhalten.
    3. Bereiten Sie die folgenden sechs Standards (STD 2-STD 7) durch serielle Verdünnung von STD 1 in PBS vor (Abbildung 2).
      1. STD 2: Fügen Sie 500 μl STD 1 bis 500 μl PBS hinzu und mischen Sie gründlich, um 50 ng/ml herzustellen.
      2. STD 3: 500 μl STD 2 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 25 ng/ml herzustellen.
      3. STD 4: 500 μl STD 3 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 12,5 ng/ml herzustellen.
      4. STD 5: 500 μl STD 4 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 6,25 ng/ml herzustellen.
      5. STD 6: 500 μl STD 5 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 3,125 ng/ml herzustellen.
      6. STD 7: 500 μl STD 6 bis 500 μl PBS zugeben und gründlich mischen, um 1,5625 ng/ml herzustellen.
      7. STD 8: Fügen Sie 500 μl PBS hinzu, um 0 ng/ml herzustellen.
    4. Positivkontrolle: Verdünnen Sie STD 1 durch Zugabe von 100 μl der STD 1-Lösung zu 900 μl PBS, um eine HER2-Lösung mit einer Proteinkonzentration von 10 ng/ml zu erhalten.
  6. Bereiten Sie Proben für Spike- und Wiederfindungsexperimente vor.
    1. Bereiten Sie die Matrixproben (PBS, Zelllysate und Kulturmedium) vor, die mit der bekannten HER2-Proteinkonzentration versetzt sind. Verdünnen Sie die Zelllysate im Verhältnis 1:2000 durch Zugabe von 2,5 μl des geeigneten Zelllysats zu 5 ml PBS, um eine Probenmatrix mit einem HER2-Spiegel unterhalb der LOD der Methode zu erhalten.
    2. Verwenden Sie WSS (1000 ng/ml) und STD1 (100 ng/ml), um Matrixproben zu spiken.
    3. Bereiten Sie für jede Matrix 6 Proben mit Konzentrationen von 0, 2, 5, 10, 30 und 50 ng/ml vor.
    4. Zur Herstellung von 0 ng/ml fügen Sie 400 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzu.
    5. Zur Herstellung von 2 ng/ml werden 8 μl STD1 zu 392 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzugefügt und gründlich gemischt.
    6. Zur Herstellung von 5 ng/ml werden 20 μl STD1 zu 380 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzugefügt und gründlich gemischt.
    7. Um 10 ng/ml herzustellen, fügen Sie 4 μl WSS zu 396 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzu und mischen Sie gründlich.
    8. Zur Herstellung von 30 ng/ml werden 12 μl WSS zu 388 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzugefügt und gründlich gemischt.
    9. Um 50 ng/ml herzustellen, fügen Sie 20 μl WSS zu 380 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzu und mischen Sie gründlich.
  7. Fügen Sie die Stichprobe, den Rohling und den Standard hinzu.
    1. Geben Sie mit einer Einkanalpipette 100 μl Standard-, Blind- (PBS) und getestete Proben (Zelllysate und Kulturmedium) in die entsprechenden Vertiefungen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, jede Probe in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.
    2. Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.
    3. Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    4. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).
  8. Erkennen Sie die Antikörperbindung.
    1. Verdünnen Sie den biotinylierten Nachweisantikörper (Klon 70.21.73.67) in PBS auf eine Arbeitskonzentration von 1 μg/ml. Verwenden Sie für eine Platte 6,5 ml Nachweis-Antikörper-Arbeitslösung.
    2. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der Nachweis-Antikörper-Arbeitslösung in jede Vertiefung.
    3. Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.
    4. Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    5. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).
  9. Fügen Sie das Avidin-HRP-Konjugat hinzu.
    1. Verdünnen Sie das kommerziell erhältliche Avidin-HRP-Konjugat 1:40.000, indem Sie 1 μl enzymatisches Konjugat zu 40 ml PBST hinzufügen.
    2. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl des verdünnten Konjugats in jede Vertiefung.
    3. Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.
    4. Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    5. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).
  10. Kolorimetrische Reaktion
    1. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl 3,3′,5,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat in jede Vertiefung.
    2. Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.
    3. Inkubieren Sie die Platte 1-5 min bei 37 °C lichtgeschützt und beobachten Sie die Farbentwicklung.
    4. Wenn die Farbe den erwarteten Wert erreicht, fügen Sie 100 μl Stopplösung hinzu, um die Reaktion zu beenden.
      HINWEIS: Der erwartete Gehalt entspricht einer intensiven blauen Färbung in Vertiefungen, die Proben mit einer hohen Konzentration des Analyten enthalten.
  11. Erfassen und analysieren Sie Daten.
    1. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
    2. Berechnen Sie anhand einer 4-parametrischen Kalibrierkurve die Probenkonzentration auf der Grundlage der Kurvengleichung.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des entwickelten Anti-HER2-Sandwich-ELISA-Workflows. Überblick über die wichtigsten Schritte des Sandwich-ELISA-Verfahrens. Dazu gehören die kritischen Schritte (mit einem roten Rahmen hervorgehoben) wie die Plattenbeschichtung mit dem einfangenden Anti-HER2-Antikörper 70.27.58, die Zugabe von Proben (Kurvenstandards, Blindproben, experimentelle Proben der Zelllysate oder des Kulturmediums) und die Bindung des detektierenden Anti-HER2-Antikörpers 70.21.73.67. Der Assay schließt mit der Signaldetektion und Datenanalyse ab, bei der das kolorimetrische Signal mit einem Mikroplatten-Reader quantifiziert wird, um die Konzentration des Zielantigens zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schema, das die Vorbereitung der Standardlösungen für die Kalibrierkurve darstellt. Serielle Verdünnungen des rekombinanten HER2-Proteins werden hergestellt, um eine Kalibrierkurve in einem Konzentrationsbereich von 1,56-100 ng/ml zu erzeugen (Fläschchen STD 1-STD 7). Zusätzlich ist die negative Kontrollprobe ohne das HER2-Protein enthalten (STD 8). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

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Sandwich-ELISA-Validierung
Der neu entwickelte Assay erfordert ein Validierungsverfahren. Zu den wichtigen Validierungsparametern gehören Linearität, Präzision und Nachweisgrenzen, d. h. die untere Nachweisgrenze (LLOD) und die obere Nachweisgrenze. In der vorherigen Arbeit haben wir eine gründliche Methodenvalidierung durchgeführt. Die ELISA-Linearität wurde getestet, indem die simulierten Proben auf niedrige (2, 5, 10 ng/ml), mittlere bis hohe (30 ng/ml) und signifikant (50 ng/ml) Konzentrationen de...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zu den kritischen Komponenten bei der Konstruktion eines Sandwich-ELISA gehören Fangantikörper, die auf der Platte immobilisiert sind und zur Spezifität und Sensitivität des Assays beitragen. In dem vorgestellten Assay haben wir als Fängerantikörper das neuartige monoklonale Protein (HER2/70.27.58) verwendet, das im eigenen Haus erzeugt und charakterisiert wurde. Der Antikörper hatte eine einzigartige Sequenz der CDR (Komplementaritäts-bestimmende Region) und wies basierend auf der Affin...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.L., A.A., A.M., M.S. erklären die finanzielle Unterstützung durch SDS Optic S.A.; A.A., A.M., M.S. erklären den Aktienbesitz von SDS Optic S.A.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie wurde durch Mittel des Nationalen Zentrums für Forschung und Entwicklung STRATEGMEDII/269364/5/NCBR/2015 und des EU-KMU-Instruments Horizont 2020 Nr. 783818 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biotin Markierungskit-NH2AbnovaKA0003
Blotting Grade, Milchpulver, fettarmRothT145.1
Zellzählobjektträger für TC10/TC20 Zellzähler, ZweikammerBio-Rad145-0011
ZellkulturplattenBiologix07-6012
ZellschaberBiologix70-1250
ZentrifugeOhaus30130868
Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank - Telstar Bio II Advance 6TelstarN/A
96-Well-Platten mit klarem FlachbodenThermo Fisher442404
Culture Safe CO2 Inkubatoren - Touch 190SLeecN/A
Dimethylsulfoxid Sigma AldrichD2650
DMEM - hoher GlukosegehaltSigma AldrichD0822
ELISA Plate ReaderBioTek800TSUVI
FBS Standard, fötales RinderserumPAN BiotechP30-19375
Zwangsumlauftrockner für LaborsBINDER9090-0018
HRP-AvidinThermo Fisher43-4423
Humanes Her2 / ErbB2 Protein, Fc Tag, PremiumGrade AcroBIOSYSTEMSHER2-H5253
Immunowash Microplate WasherBio-Rad170-7009
L-Glutaminesolution Sigma AldrichG7513
mAb a-HER2 (Klon 70.21.73.67)SDS OpticBIO-ABH-2
mAb a-HER2 (Klon 70.27.58)SDS OpticBIO-ABH-1
MDA-MB-231 ZelllinieATCCHTB-26
NaHCO3POCH810530115
NaOHPOCHBA0981118
Protease-Inhibitor-CocktailSigma AldrichP8340
RIPA-PufferSigma AldrichR0278
ROTI Fair PBSRoth1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] ZelllinieATCCHTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] ZelllinieATCCHTB-77
Stopplösung 1xAbcamab210900
TC20 Automatisierter ZellzählerBio-rad1450102 TMB-Substrat
1xAbcamab210902
Tween-20Sigma AldrichP9416
VortexOhaus30392117
Wave Motion ShakerOhaus30391968

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subbiah, V., Kurzrock, R. Debunking the delusion that precision oncology is an illusion. Oncologist. 22 (8), 881-882 (2017).
  2. Swain, S. M., Shastry, M., Hamilton, E. Targeting HER2positive breast cancer: advances and future directions. Nat Rev Drug Discov. 22 (2), 101-126 (2023).
  3. McLemore, L. E., et al. HER2 testing in breast cancers: comparison of assays and interpretation using ASCO/CAP 2013 and 2018 guidelines. Breast Cancer Res Treat. 187 (1), 95-104 (2021).
  4. Iqbal, N., Iqbal, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in cancers: overexpression and therapeutic implications. Mol Biol Int. 2014, 852748(2014).
  5. Tsé, C., Gauchez, A. S., Jacot, W., Lamy, P. J. HER2 shedding and serum HER2 extracellular domain: biology and clinical utility in breast cancer. Cancer Treat Rev. 38 (2), 133-142 (2012).
  6. Reix, N., et al. A prospective study to assess the clinical utility of serum HER2 extracellular domain in breast cancer with HER2 overexpression. Breast Cancer Res Treat. 160 (2), 249-259 (2016).
  7. Di Gioia, D., et al. Serum HER2 supports HER2testing in tissue at the time of primary diagnosis of breast cancer. Clin Chim Acta. 430, 86-91 (2014).
  8. Carney, W. P., et al. Monitoring the circulating levels of the HER2/neu oncoprotein in breast cancer. Clin Breast Cancer. 5 (2), 105-116 (2004).
  9. Azar, F. P., Fatemeh, H. S. Value of serum human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)/neu testing in breast cancer patients to maximize detection of HER2/neupositive patients and susceptibility to trastuzumab. Clin Biochem. 44 (13), (2011).
  10. Pandey, I., Misra, V., Pandey, A., Verma, A. Expression of HER2/neu in gastric adenocarcinoma and its correlation with serum HER2/neu level and Ecadherin expression. Indian J Pathol Microbiol. 65 (1), 35-41 (2022).
  11. Agnon, V., et al. ELISA assay employing epitopespecific monoclonal antibodies to quantify circulating HER2 with potential application in monitoring cancer patients undergoing therapy with trastuzumab. Sci Rep. 10 (1), 3016(2020).
  12. Antos, A., et al. The unique monoclonal antibodies and immunochemical assay for comprehensive determination of the cellbound and soluble HER2 in different biological samples. Sci Rep. 14 (1), 3978(2024).
  13. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Front Neurol. 6, 179(2015).
  14. Perrier, A., Gligorov, J., Lefèvre, G., Boissan, M. The extracellular domain of HER2 in serum as a biomarker of breast cancer. Lab Invest. 98 (6), 696-707 (2018).
  15. Van Gorkom, T., van Arkel, G. H. J., Voet, W., Thijsen, S. F. T., Kremer, K. Consequences of the edge effect in a commercial enzymelinked immunosorbent assay for the diagnosis of Lyme neuroborreliosis. J Clin Microbiol. 59 (8), e0328020(2021).
  16. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatographymass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures. J Vis Exp. 159, e61031(2020).
  17. Giordani, E., et al. Monitoring changing patterns in HER2 addiction by liquid biopsy in advanced breast cancer patients. J Exp Clin Cancer Res. 43 (1), 182(2024).
  18. Wu, Y., et al. Imaging and monitoring HER2 expression in breast cancer during trastuzumab therapy with a peptide probe 99mTcHYNICH10F. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 47 (11), 2613-2623 (2020).
  19. NinioMany, L., et al. miR125a induces HER2 expression and sensitivity to trastuzumab in triplenegative breast cancer lines. Front Oncol. 10, 191(2020).

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