Methodenartikel

Enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden

DOI:

10.3791/68208

⸱

30. Mai 2025

 ,  , 
1Department of Chemical, Biological, and Materials Engineering, University of South Florida

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von oberflächenexponierten Substraten der Hefe für enzymatische Modifikationsassays vor. Die Plattform wurde anhand der Analyse der Dephosphorylierungsaktivität der Tyrosinphosphatase SHP-2 gegen eines ihrer Substrate als repräsentativer enzymatischer Modifikationsassay demonstriert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Anzeige der Hefeoberfläche ist eine Genotyp-Phänotyp-Kopplungsstrategie, die ein Hochdurchsatz-Screening der Proteinfunktion ermöglicht. Traditionell wird die Darstellung der Hefeoberfläche auf die Evolution neuer Bindungsproteine angewendet, wobei die Durchflusszytometrie verwendet wird, um die Bindungsstärke zu beurteilen und zu sortieren. In jüngster Zeit besteht ein wachsendes Interesse an der Anwendung von Hefeoberflächendisplays für das Screening enzymatischer Modifikationen von Substratvarianten, wobei additive (z. B. Phosphorylierung) oder subtraktive (z. B. Proteolyse) Modifikationen einen Phänotyp liefern, der durch Durchflusszytometrie ablesbar ist. Solche Modifikationen werden regelmäßig durch intrazelluläre Kolokalisierung angewendet, aber die Fähigkeit, eine extrazelluläre enzymatische Modifikation der angezeigten Substrate zu erreichen, könnte viele weitere Reaktionen für die Untersuchung eröffnen. Hier beschreiben wir Techniken für das Design und die Anwendung von Screening-Assays für die extrazelluläre enzymatische Modifikation auf Kandidatensubstrate, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden, und die anschließende Bewertung mittels Durchflusszytometrie-Analyse. Wir stellen diese Protokolle im Zusammenhang mit Phosphatasen zur Dephosphorylierung von Hefesubstraten zur Verfügung, die phosphorylierte Tyrosinreste enthalten, und kommentieren, wie dieses angewandte Framework für die Entwicklung von Screening-Assays für andere Enzym-Substrat-Paare angepasst werden kann.

Einleitung

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Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Enzymen und ihren Zielen ist aufgrund seiner Notwendigkeit für die biologische Charakterisierung der Signalwege, die die zelluläre Homöostase und die Krankheitsentwicklung steuern, zu einem zunehmend interessanten Forschungsgebiet geworden 1,2. Enzyme sind für die Katalyse vieler Reaktionen verantwortlich, die biologisches Leben aufrechterhalten, und steuern notwendige Signalwege wie den Zellstoffwechsel 3,4, die Signalübertragung5 und sogar grundlegende Prozesse wie die Genomreparatur 6,7. Aufgrund ihrer Rolle in diesen Prozessen spielen ihre Wechselwirkungen auch eine Rolle bei der Entstehung vieler Krankheiten, da Abweichungen in ihrer Aktivität zu schweren Dysregulationen der Zellaktivität führen können, die eine Apoptose oder Vermehrung schädlicher Krebszellen verursachen2. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivität hat wichtige Anwendungen bei der Entwicklung neuer Therapeutika 8,9 gefunden, die Assays erfordern, die auf jede spezifische Enzym-Substrat-Wechselwirkungzugeschnitten sind 10. Mehrere enzymatische Assays haben sich als Standardprotokolle für die Bewertung und Charakterisierung dieser Wechselwirkungen etabliert. Assays, die zur Analyse enzymatischer Wechselwirkungen entwickelt wurden, werden in Detektionsassays eingeteilt, die die Bindung zur Aktivierung/Hemmungüberwachen 11, oder Assays, die die Substratmodifikation durch Enzymeüberwachen 12.

Eine wichtige Rolle von Enzymen ist die Regulierung des Zellverhaltens. Die Signaltransduktion, die intrazelluläre Reaktion einer Zelle auf einen extrazellulären Auslöser13, ist für das Überleben und die Funktionalität der Zellen verantwortlich. Zellproliferation, Differenzierung und viele andere funktionelle Prozesse beinhalten Signalwege mit enzymatischen Wechselwirkungen, die gesteuert werden14,15. Enzyme katalysieren posttranslationale Modifikationen, die häufig die massiven Signalnetzwerke modulieren, die für die korrekte Übertragung extrazellulärer Nachrichten verantwortlich sind16. Die Proteinphosphorylierung ist die häufigste posttranslationale Modifikation, die in der zellulären Signalübertragung und mehreren anderen zellulären Signalwegen allgegenwärtig ist. Folglich haben sich Proteinkinasen aufgrund ihrer entscheidenden regulatorischen Rolle als signifikanter Teil potenzieller therapeutischer Ziele herausgestellt17. Phosphatasen sind die natürlichen modulatorischen Moleküle für phosphatbasierte Zellsignalkomplexe18,19 und haben die Fähigkeit, Phosphatreste von ihren Zielproteinenzu entfernen 20. In den letzten zehn Jahren haben sich Phosphatasen zu einem wichtigen therapeutischen Ziel für die Behandlung von Krebs21 und entzündlichen Erkrankungen22 entwickelt, da sie an der Regulation nachgeschalteter Signalwege in mehreren Zelltypen beteiligt sind. Zusammen bieten Proteinkinasen und Phosphatasen eine breite Palette von Wechselwirkungen, die durch die Entwicklung spezifischer enzymatischer Assay-Protokolle untersucht werden können.

Das Display der Hefeoberfläche wurde als Werkzeug zur Charakterisierung und Bewertung der enzymatischen Aktivität verwendet23,24. Es bietet eine Hochdurchsatzplattform für das Screening posttranslationaler Modifikationsprozesse in Kombination mit endoplasmatischen Retikulum-Sequestrierungsstrategien25,26. Dies ermöglicht die Kolokalisierung und Beibehaltung von Kinase-Substrat-Paaren im endoplasmatischen Retikulum durch Bindung an KDEL-Rezeptoren27, wo die Phosphorylierung des Substrats aufgrund der Nähe zwischen Kinasen und ihren Zielen mit erhöhter Geschwindigkeit erfolgen kann. Die KDEL-Rezeptorbindung wird durch eine C-terminale FEHDEL-Retikulum-Retentionssequenz vermittelt, die nachweislich eine stärkere Retentionsfähigkeit aufweist als andere HDEL-Sequenzen25,28. Das phosphorylierte Substrat wird dann an der Hefeoberfläche verankert, wo es anschließend durch Durchflusszytometrieausgewertet werden kann 29. Derzeit gibt es keine verallgemeinerbaren Protokolle für die enzymatische Modifikation von Substraten, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden. Wir erweitern die Kapazitäten der Hefeoberflächendarstellung, indem wir die extrazellulär exprimierten phosphorylierten Substratvarianten nutzen und sie durch Dephosphorylierung durch ihre bekannte Phosphatase modifizieren. Die durchflusszytometrische Analyse bietet dann eine Plattform für die phänotypische Bewertung der oben genannten Substrate durch die Messung von Veränderungen des Phosphorylierungsmedians als Folge der Inkubation mit der bekannten Phosphatase. Dies bietet eine anpassungsfähige Methode zur posttranslationalen Modifikation von oberflächenexponierten Proteinen und gleichzeitig eine Methode zur enzymatischen Modifikationsanalyse von Wechselwirkungen bei der Verwendung der Hefeoberflächenanzeigeplattform.

Wir stellen Techniken zur Entwicklung und Anwendung eines enzymatischen Modifikationsassays vor, der die Einführung einer Kinase-Substrat-Interaktion in die Display-Plattform der Hefeoberfläche, die Co-Inkubation des exprimierten phosphorylierten Substrats mit einer rekombinanten Phosphatase und die anschließende Analyse der Dephosphorylierungsaktivität durch Durchflusszytometrie beschreibt. In diesem Bericht wird dies durch die Co-Lokalisierung der zytoplasmatischen Domäne von CD28 mit der Lymphozytenkinase (LCK) im endoplasmatischen Retikulum der Hefe erreicht, gefolgt von der Darstellung des phosphorylierten CD28 auf der Hefeoberfläche und der anschließenden Dephosphorylierung durch die domänenenthaltende Phosphatase-2 (SHP-2) der Src-Homologieregion 2. Ein pan-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (in dieser Studie 4G10), der phosphorylierte Tyrosinreste in einer Vielzahl von Peptidsequenzen nachweist, wird zur Quantifizierung des Phosphorylierungsgrades in Abhängigkeit von der Phosphatasebehandlung verwendet. Der detaillierte Prozess bietet einen verallgemeinerbaren Ansatz zur Untersuchung von Enzym-Substrat-Wechselwirkungen; Eine prospektive Methode zur Untersuchung von Enzymen und Substraten in gereinigter Form.

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Protokoll

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1. Zellwachstum von Hefe, die Plasmide beherbergt, und Induktion der Proteinexpression

  1. Bereiten Sie nach dem in Tabelle 1 beschriebenen Rezept die Medien vor, die für das Wachstum von nicht-plasmidhaltiger Hefe (YPD), plasmidhaltiger Hefezellwachstum (SD-CAA) und die Induktion der Proteinexpression (SRG-CAA) sowie SD-CAA-Platten erforderlich sind.
  2. Transformieren Sie Hefe-Display-Plasmid-DNA, die das Kinase-Substrat-Paar enthält, in EBY-100-Hefezellen durch die auf Lithiumkationen basierende Methode30,31, die üblicherweise für die Verwendung in Hefetransformationskits einer Vielzahl von Herstellern verwendet wird.
    HINWEIS: Die Elektroporation32 oder andere bevorzugte Hefeplasmid-Transformationstechniken können je nach Plasmidkonstrukt, das transformiert wird, verwendet werden.
  3. Bereiten Sie ein 14-ml-Kulturröhrchen mit 10 mL YPD-Medien vor. Beimpfen Sie EBY-100-Zellen und züchten Sie sie in einem Schüttelinkubator bei 30 °C und 300 U/min, bis die Kultur eine optische Dichte (OD600 nm) von 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 Zellen/ml) erreicht.
    HINWEIS: OD600 nm wird gemessen, indem 3 ml-Probenküvetten mit 1:10-Verdünnungen von Hefekulturen in ihrem jeweiligen Medium und 3-ml-Blankoküvetten mit dem für die Probenverdünnung verwendeten Medium hergestellt werden. Das OD600-nm-Programm auf dem Spektralphotometer wird verwendet, um zuerst die leere Küvette und dann jede Probenküvette zu messen, indem die entsprechende Verdünnung für jede Probe eingestellt wird. 1 OD600nm entspricht 1 × 107 Hefe/ml.
  4. Ernten Sie die Zellen, indem Sie die Kultur 3 Minuten lang bei 1.000 x g zentrifugieren und mit der 1. Waschlösung im Hefetransformationskit oder TE (10 mM Tris-HCl und 1,0 mM EDTA)31 waschen.
  5. Pelletieren Sie die Zellen erneut bei 1.000 x g für 3 Minuten und resuspendieren Sie in 1 ml des im Hefetransformationskit enthaltenen Transformationspuffers oder in sterilem Wasser. Die Zellen sollten in 50 μL Aliquots aliquotiert werden und können bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.
  6. Für die Plasmidtransformation wird ein Aliquot pro Plasmid hergestellt und auf Eis aufgetaut, dann werden 0,5-1,5 μg Plasmid-DNA, die das Hefe-Display-Konstrukt enthält, direkt in die Zellen gegeben. 0,5 ml der im Hefetransformationskit bereitgestellten Transformationslösung werden zugegeben, oder 0,5 ml eines sterilen 50%igen Polyethylenglykols und 0,1 M LiOAc-Lösung31. Kombinieren Sie die Mischung aus Zellen, Plasmid-DNA und Transformationslösung gründlich durch Pipettieren.
  7. Transformationsgemisch statisch für 30-60 min bei 30 °C inkubieren, Wirbelgemisch in Abständen von 15 min. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 × g für 3 min.
  8. Bereiten Sie ein 14-ml-Kulturröhrchen mit 4,5 mL SD-CAA-Medien vor. Resuspendieren Sie die Zellen, die das gewünschte Plasmid in 500 μl SD-CAA enthalten, und inokulieren Sie die vorbereiteten 4,5 mL.
  9. Achten Sie darauf, den Agar nicht zu durchstechen, verteilen Sie 50 μl der 5 ml der inokulierten Kultur auf eine SD-CAA-Platte und inkubieren Sie statisch bei 30 °C für 48 Stunden, um die Transformationseffizienz zu bestimmen.
  10. Inkubieren Sie die 5 ml SD-CAA-Zellkultur in einem Schüttelinkubator bei 30 °C und 300 U/min für mindestens 18 Stunden. Überwachen Sie die optische Dichte (OD600nm) nach 16 h und 20 h. Sobald die Probe auf eine ausreichende optische Dichte von nicht mehr als 6 angewachsen ist, wird die Kultur 3 Minuten lang bei 2.500 × g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Hefepellet zu stören.
  11. Resuspendieren Sie das Hefepellet in SRG-CAA auf einen End-ODvon 600 nm weniger als 1 (<1 × 107 Hefe/ml).
  12. Inkubieren Sie die Hefekultur in einem Schüttelbrutschrank bei 30 °C und 300 U/min für mindestens 8 h, jedoch nicht länger als 24 h.
    ANMERKUNG: Die Induktion der Proteinexpression in Hefezellen kann zwischen 20 und 37 °C variiert werden. 30 °C ist für die Synthese von Kinase/Substrat-Paarengeeignet 29,33, kann aber angepasst werden, wenn dies für die zu untersuchenden spezifischen Proteine als notwendig erachtet wird.
  13. Messen Sie OD600 nm , um die Zelldichte zu bestimmen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt werden, indem die Hefekulturen bei 4 °C gelagert werden.

2. Biotinylierung des 4G10-Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers

  1. Eine Durchstechflasche mit 2 mg PEG4-NHS-Biotin wird durch Zugabe von 680 μl sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 5 mM resuspendiert.
    HINWEIS: Die Resuspension von PEG4-NHS-Biotin sollte unmittelbar vor der Biotinylierungsreaktion frisch erfolgen. NHS hydrolysiert in wässriger Lösung. Die Verwendung von sterilem PBS und Fläschchen ist wichtig für die Vorbereitung von Reagenzien für die Langzeitlagerung und für die Verwendung in zellbasierten Assays, um mögliche Auswirkungen von Kontaminanten auf die Lebensfähigkeit der Reagenzien oder die durchgeführten empfindlichen Assays zu mildern.
  2. Basierend auf der 4G10-Antikörperkonzentration 100 μg Antikörper in ein steriles 1,7-ml-Fläschchen geben.
  3. 1 μl des vorbereiteten 5 mM PEG4-NHS-Biotin aus Schritt 2.1 in das Fläschchen mit den 100 μg 4G10-Antikörper geben, um ein molares Verhältnis von Biotin zu Antikörper von 7,5:1 zu erreichen. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig, um die Reaktion zu homogenisieren.
  4. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur mit konstanter Rotation mindestens 2 h lang inkubiert.
  5. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für 0,5-ml-Spin-Entsalzungssäulen, um den Puffer vom biotinylierten 4G10 (B-4G10) in PBS auszutauschen.
    HINWEIS: Entsalzungssäulen mit einem Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) von 7 kDa werden häufig für die Biotinylierung von Antikörpern verwendet, um die Entfernung von nicht umgesetztem Biotin und anderen kleinen Molekülen zu ermöglichen, während der größere Antikörper erhalten bleibt.
  6. Verdünnen Sie den B-4G10-Antikörper auf eine Endkonzentration von 1 μM in PBSA (PBS mit 1 g/l Rinderserumalbumin). Aliquotieren Sie den B-4G10-Antikörper in kleinere Volumina, um wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen zu verhindern.
    HINWEIS: Biotinylierte Antikörper können bis zu 3 Monate lang bei 4 °C für den täglichen Gebrauch gelagert werden, ohne dass die Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt wird. Die restlichen Aliquote, die nicht verwendet werden, werden maximal 2 Jahre lang bei -20 °C gelagert.

3. Dephosphorylierung von Substraten, die auf der Oberfläche der Hefezellen exprimiert werden

  1. Bereiten Sie die 2x Arbeitspufferlösung vor, wie zuvor in der Literaturbeschrieben 34.
    HINWEIS: 2x wird empfohlen, um die Messung der benötigten Inhaltsstoffe zu erleichtern.
  2. Bereiten Sie den Arbeitspuffer für die Proben in einem 1,7-ml-Fläschchen vor, indem Sie die in Schritt 3.1 hergestellte 2x-Pufferlösung 1:2 in deionisiertem Wasser verdünnen.
    HINWEIS: Das Gesamtreaktionsvolumen für jede Probe beträgt 20 μl, und jede Probe benötigt zwischen 10 μl und 18 μl Arbeitspuffer. Bereiten Sie genügend Arbeitspuffer für alle Proben oder Kontrollen vor.
  3. Gemäß der in Tabelle 2 beschriebenen empfohlenen Probenvorbereitung beschriften Sie 1,7-ml-Fläschchen mit dem entsprechenden Kontroll- oder Probennamen.
  4. Auf der Grundlage des in Schritt 1.9 gemessenen OD600 nm ist das Kulturvolumen zu berechnen, das erforderlich ist, um für jede Probe zwei Millionen (2 × 106) Hefezellen aus der entsprechenden Hefekultur zu gewinnen.
  5. Geben Sie das im vorherigen Schritt berechnete Volumen der Hefekultur für jede Probe in das 1,7-ml-Fläschchen.
  6. Zentrifugieren Sie das Fläschchen 1 Minute lang bei 4.500 × g. Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette entfernen und als biologisch gefährlichen Abfall entsorgen.
  7. Die pelletierten Zellen werden in 1 ml PBSA resuspendiert und Schritt 3.6 wiederholt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, so viel Überstand wie möglich zu entfernen, ohne die pelletierten Zellen zu stören.
  8. Berechnen Sie auf der Grundlage seiner Stammkonzentration das Volumen des rekombinanten humanen SHP-2, das erforderlich ist, um eine Endkonzentration von 1.000 nM in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl zu erreichen.
    HINWEIS: Rekombinantes SHP-2 sollte in kleinen Volumina aliquotiert werden, so dass kein Protein, das in jedem Assay verwendet wird, mehr als zwei Gefrier-Auftau-Zyklen durchlaufen hat. Alle SHP-2-Reste eines Aliquots, nachdem alle Proben für einen Assay vorbereitet wurden, sollten verworfen werden.
    Die Stammkonzentrationen rekombinanter Enzyme können je nach Chargennummer variieren. Rekombinantes SHP-2 wird üblicherweise in einer Stammkonzentration von 0,2-0,4 mg/ml formuliert. Bei einer Stammkonzentration von 0,324 mg/mL SHP-2 entspricht dies einer Stammkonzentration von 4,696 μM (SHP-2 hat ein Molekulargewicht von 69 kDa). 4,26 μl des SHP-2-Stammes in einer 20-μl-Reaktion führen zu einer endgültigen Reaktionskonzentration von 1.000 nM SHP-2.
  9. 7,7 mg DTT in 10 mL deionisiertes Wasser geben, das in einem konischen 15-ml-Wasser hergestellt wurde, um eine 5 mM DTT-Lösung herzustellen. Wenn das Wiegen von Milligramm aufgrund von Geräteeinschränkungen schwierig ist, fügen Sie 0,77 g DVB-T zu 10 ml deionisiertem Wasser hinzu und führen Sie dann eine 100-fache Verdünnung durch, um die für den Assay verwendete 5-mM-DVB-T-Lösung herzustellen.
    HINWEIS: Die DVB-T-Lösung kann in Stammlösungen mit höherer Konzentration hergestellt werden, um auf 5 mM verdünnt zu werden, wenn es mit den verfügbaren Geräten nicht möglich ist, Mengen im Milligramm-Maßstab zu messen. Die DTT-Lösung muss frisch vor der Resuspension der Zellen in einem Arbeitspuffer hergestellt werden, da sie zur Hydrolyse neigt und bei Verdünnung in Wasser über lange Zeiträume instabil ist.
  10. Die pelletierten Zellen werden in dem in Schritt 3.2 hergestellten Arbeitspuffer resuspendiert, so dass das endgültige Reaktionsvolumen in jeder Probe oder Kontrolle 20 μl beträgt.
    HINWEIS: Die Menge des zugegebenen Arbeitspuffers sollte auf der Grundlage der Menge an DTT (2 μl) und SHP-2 (berechnet in Schritt 3.8) berechnet werden, die in jeder Probe enthalten ist.
  11. 2 μl der in Schritt 3.9 hergestellten 5 mM DTT-Lösung werden zu jeder Probe oder Kontrolle für eine endgültige Reaktionskonzentration von 0,5 mM DTT gegeben.
  12. Das in Schritt 3.8 berechnete SHP-2-Volumen wird zu jeder Probe hinzugefügt, um ein Endvolumen von 20 μl zu erhalten, und mit einer Mikropipette vorsichtig gemischt.
  13. Wickeln Sie die Deckel der Probenfläschchen in Parafilm ein, um ein Auslaufen oder Kreuzkontamination zu verhindern.
  14. Die Proben werden bei 37 °C für 2 h auf einem Rotor bei konstanter Drehzahl inkubiert.
  15. Entnehmen Sie die Proben aus dem Rotor und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jeder Probe 1 ml PBSA hinzufügen.
  16. Wiederholen Sie Schritt 3.6.

4. Zellmarkierung und durchflusszytometrische Analyse von dephosphorylierten Substraten

  1. Proben aus Schritt 3.16 werden in einer 20-μl-Mischung der entsprechenden Primärreagenzien resuspendiert, wie in Tabelle 2 beschrieben. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Alle verwendeten Reagenzkonzentrationen wurden so berechnet, dass sie in Bezug auf die Anzahl der Proteine, die auf der Oberfläche von Hefezellen exprimiert werden, über dem Niveau liegen. Die Berechnung geht von der Expression von 10.000 Proteinen/Zelle aus allen 2 x 106 Hefen in einer Probe35 aus, während dies routinemäßig nur ~50% von ihnen der Fall ist. Tabelle 3 zeigt das überschüssige Markierungsreagenzienverhältnis für jedes der in Tabelle 2 ausgedrückten Reagenzien, berechnet wie folgt:
    figure-protocol-1
  2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.500 × g für 1 min und entsorgen Sie den Überstand als biologisch gefährlichen Abfall.
  3. Waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie sie in 1 ml PBSA resuspendieren. Wiederholen Sie Schritt 4.2.
  4. Die Proben werden in einer 20-μl-Mischung der entsprechenden Sekundärreagenzien resuspendiert, wie in Tabelle 2 beschrieben. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang unter Lichteinfall.
  5. Wiederholen Sie Schritt 4.2.
  6. Wiederholen Sie Schritt 4.3.
  7. Die gewaschenen Proben werden in 300-500 μl PBSA resuspendiert und in 5 mL Polystyrolröhrchen überführt, um sie sofort mit einem geeigneten Durchflusszytometer zu analysieren.
    HINWEIS: Wenn Proben transportiert werden müssen, bewahren Sie sie auf nassem Eis auf. Es wird nicht empfohlen, aber die Proben können bei 4 °C für maximal 2 h als Nasspellets gelagert werden.
  8. Nachdem Sie den erforderlichen Start und die Vorbereitung des Zytometers für ein neues Experiment durchgeführt haben, klicken Sie im Menü Datei auf die Schaltfläche Neues Experiment, benennen Sie das Experiment und klicken Sie auf Speichern, um sicherzustellen, dass die erfassten Daten im gewünschten Dateipfad gespeichert werden.
  9. Wählen Sie das Punktdiagramm-Symbol in der oberen Symbolleiste aus, um zwei oder mehr Punktdiagramme für jedes auszuführende Muster zu erstellen. Wählen Sie für eines der Punktdiagramme den Namen der X-Achse aus, um den FSC-A-Kanal anzuzeigen, und den Namen der Y-Achse, um den SSC-A-Kanal anzuzeigen. Dieses Diagramm zeigt die Side Scatter - Area im Vergleich zur Forward Scatter - Area und wird verwendet, um Hefezellen für die weitere Analyse zu gaten.
  10. Wählen Sie in einem anderen Punktdiagramm den Namen der X-Achse aus, um den Kanal anzuzeigen, in dem das sekundäre Reagenz, das auf den primären Anti-Epitop-Tag-Antikörper abzielt, fluoresziert. Wählen Sie den Namen der Y-Achse aus, um den Kanal anzuzeigen, in dem das Sekundärreagenz von Streptavidin fluoresziert. Dieses Diagramm zeigt nur die Ereignisse, die von der Seite nach vorne als Hefezellen gesteuert werden, und wird verwendet, um die Tyrosinphosphorylierung auf der Y-Achse und die Expression der Substratoberfläche auf der X-Achse anzuzeigen.
    HINWEIS: In diesem Beispiel fluoresziert das Sekundärreagenz, das auf den primären Anti-Epitop-Tag-Antikörper abzielt, im FITC-Kanal (AF-488), und das Sekundärreagenz von Streptavidin fluoresziert im AF-647-Kanal. Die verwendeten Kanäle können je nach den primären und sekundären Reagenzien, die während der Markierung verwendet werden, variieren.
  11. Setzen Sie jedes Probenröhrchen in den Röhrchenhalter des Zytometers ein und wählen Sie Ausführen für das Zytometer, um mit dem Laden der Probe und der Datenerfassung zu beginnen. Passen Sie die anzuzeigenden Ereignisse, die aufzuzeichnenden Ereignisse, die aufzuzeichnende Zeit und die Abtastdurchflussrate nach Bedarf an.
  12. Definieren Sie ein Tor, das die gesunden Hefezellen im Diagramm SSC-A vs. FSC-A umgibt, das in Schritt 4.9 erstellt wurde. Abbildung 1 veranschaulicht eine beschreibende Darstellung der anzuwendenden Gating-Strategie.
    HINWEIS: Auf dem SSC-A- und FSC-A-Diagramm sind 100.000 anzuzeigende Ereignisse und 50.000 aufzuzeichnende Ereignisse innerhalb des definierten Hefegatters eine gute Richtlinie, um ausreichende Daten für die weitere Analyse zu visualisieren und zu sammeln. Strengere Gating-Strategien zur Selektion von Singulett-Hefe können auf der Grundlage eines Diagramms von Forward Scatter-Height versus Forward Scatter-Area angewendet werden, wie kürzlich berichtetwurde 36. Die in Abbildung 1 gezeigte Gating-Strategie entspricht einem weniger stringenten Ansatz, der Singulett- und etwas Dublett-Hefe durch Scatter-Gating umfasst.
  13. Aufzeichnung der Fluoreszenz aller Kontrollproben mit einem Durchflusszytometrie-Analysator. Zuerst werden routinemäßig Kontrollproben entnommen, um eine Gating-Strategie zu definieren, wie unten in Schritt 4.14 beschrieben.
  14. Definieren Sie eine Gating-Strategie für Ihre in Schritt 4.10 erstellte Parzelle vor der Analyse der behandelten Proben. Abbildung 1 veranschaulicht eine beschreibende Darstellung der anzuwendenden Gating-Strategie.
  15. Aufzeichnung der Fluoreszenz von dephosphorylierten Proben mit dem Durchflusszytometer und der in den Schritten 4.12 und 4.14 definierten Gating-Strategie.
  16. Analysieren Sie Durchflusszytometriedaten, die mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware erfasst wurden.
  17. Bewertung der Dephosphorylierung durch Messung und Vergleich des Medians der Y-Achse von Zellen, die Proteine auf ihrer Oberfläche exprimieren, und der Phosphorylierung zu Studienbeginn, die von nicht anzeigenden Zellen zwischen Proben und Kontrollen bereitgestellt wird. Berechnen Sie die prozentuale mediane Phosphorylierungsdifferenz wie folgt:
    figure-protocol-2

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die durchflusszytometrische Analyse eines einzelnen Replikats unseres Modellsystems, das 2 Stunden lang ohne (Abbildung 1A) und mit (Abbildung 1B) 1.000 nM SHP-2 inkubiert wurde, zeigt eine mediane Phosphorylierungsdifferenz von 63,6 %, die definiert ist als das Verhältnis des Medians der Y-Achse (Phosphorylierung) von allen an der Oberfläche angezeigten Ereignissen abzüglich des Phosphorylierungssignals zu Studienbeginn, definiert als der Median der Y-Achse der...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die Analyse enzymatischer Wechselwirkungen unter Verwendung der extrazellulären Darstellung von Proteinen auf der Hefeoberfläche. Die Einbeziehung der Sequestrierung des endoplasmatischen Retikulums in das verwendete Oberflächen-Display-Plasmid ermöglicht es, spezifische Wechselwirkungen zwischen Enzymen und posttranslational modifizierten Substraten extrazellulär zu analysieren, da intrazelluläre Wechselwirkungen so gestaltet werden können, dass sie...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award an L.A.S. (CBET - 2339172) und Startup-Fonds der University of South Florida unterstützt.

In Abbildung 2A ist das microtube-open-translucent icon von Servier https://smart.servier.com/ unter CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/ lizenziert. Zu den Modifikationen gehören die Zugabe von Puffer und einer Hefezelle (links) sowie die Zugabe von Antikörpern (Mitte-rechts).

Das Reagenzglas, der Inkubator und das Durchflusszytometer in Abbildung 2A wurden über www.bioicons.com unter freiem Zugang zur Verfügung gestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 L Medienflaschen Corning06-414-1D
1,7/2,0 mL MikroröhrchenAxygenMCT-175-C
10 & Mikro; L SureOne PipettenspitzenFisher Scientific02-707-438
1000 µ L SureOne PipettenspitzenFisher Scientific02-707-408
12 mL Polystyrol-RundbodenröhrchenGreiner07-000-212
3 mL KunststoffküvettenMARKE759076D
300 & micro; L SureOne PipettenspitzenFisher Scientific02-707-411
5 mL Serologische PipettenFisher Scientific13-678-11D
Saures Kasein (Casaminosäuren)Fisher ScientificBP-1424-500
Analysenwaage Mettler Toledo30243397
Bakteriologische Petrischale CorningFalcon 351008
BiosicherheitswerkbänkeLabconcoLogic Class II, Type A2  302310102
BiospektrometerEppendorfKinetic 6136000010
Rinderserum AlbuminFisher BioreagenzienBP1600-100
ZitronensäureFisher ScientificA940-500
CytoFLEX Durchflusszytometrie Analysator Beckam CoulterCytoflex C09745CytExpert Software
DextroseFisher ScientificD16-1
DithiothreitolFisher BioreagenzienBP172-5
Esel Anti-Ziegen FITCInvitrogenA16000
EDTAAlfa AesarH56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-BiotinThermo ScientificA39259
Frozen-EZ Hefetransformation II Kit Zymo ResearchT2001
GalaktoseFisher ScientificBP656-500
Allzweck-KühlschrankMarvel ScientificMS24RAS4RW
Ziege Anti-Myc-Tag-Antikörper BethylA190-104A
Mikroröhren-Zentrifuge Eppendorf5425 R 5406000313
Mini Niedertemperatur-KühlbrutatorFisher Scientific15-015-2632
Maus Anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10BioXcellBE0194
Parafilm MBemisM PM999
Phosphatgepufferte KochsalzlösungFisher BioreagenzienBP399-500
Pipetten-Controller Eppendorfeasypet 3 4430000018
RaffinoseThermo ScientificJ21060-36
Rekombinantes humanes aktives SHP-2 ProteinR& D Systems1894-SH
Kühlzentrifuge Eppendorf5910 R
Saccharomyces cerevisiae Hefe Oberflächendisplay Stamm EBY 100ATCCMYA-4941
Shaker IncubatorEppendorfM1335-0002 New Brunswick Innova 42 
Einkanal-Pipetten-Set Eppendorf05-403-151
NatriumchloridFisher ScientificS671-500
Natriumcitrat-DihydratFisher ScientificS279-500
Natriumphosphat zweibasisches HeptahydratFisher ScientificS373-500
Natriumphosphat monobasisches MonohydratFisher ScientificS468-500
Streptavidin Alexa Fluor 647InvitrogenS32357
Top Loading BalanceMettler Toledo
Tris hydrochlorideEMD Millipore648317-100GM
Tube Revolver RotatorFisher Scientific11-676-341
Wägepapier Fisher Scientific09-898-12B
Hefe-Stickstoff-BasisBD Difco291940
Zeba Spin-Entsalzungskolonnen Thermo Scientific89883

Referenzen

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Yeast Surface DisplayFlow CytometryEnzymatic ModificationProtein DephosphorylationSubstrate ScreeningPhosphorylation AnalysisSHP 2 PhosphataseExtracellular Enzyme AssayHigh Throughput ScreeningGating Strategy

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