Methodenartikel

Neues Inselmodell für 3D-Untersuchungen von Endothel- und β-Zell-Interaktionen: Relevanz für das Screening zytoprotektorischer Substanzen

DOI:

10.3791/68220

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17. April 2026

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1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung stabiler Sphäroide der Maus-Pankreasinselchen sowie detaillierte Methoden zur 3D-Färbung, Reinigung und Montage, angepasst an deren geringe Größe.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Herstellung kleiner, stabiler Sphäroide, deren Kultur und 3D-Bildgebung zur Untersuchung der endothelialen und insulinproduzierenden β Cell-Interaktionen in einem 3D-Modell von Pankreasinseln. Die 150–200 μm großen Sphäroide, die den niedrigsten Bereich der Inselgrößen widerspiegeln, wurden aus einem ausgewählten Verhältnis hergestellt, das 1 intra-islet-Endothelzellen (MS-1-Zellen) zu 20 insulinsekretierenden Zellen (β-TC-6) kombinierte. Färben, Reinigen und Montageherausforderungen kleiner Sphäroide und deren Bekämpfung durch Anwendung von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und der CUBIC-Clearing-Technik werden detailliert dargelegt, ebenso wie Schlüsselpunkte für eine effiziente Analyse der 3D-Struktur mit verschiedenen Sonden. Daten zeigen, dass NTPDASE-Ectonukleotidase 3 im Sphäroidmodell nicht mit Insulin kolokalisiert ist, was auf unterschiedliche Reife- und Funktionsniveaus von β-TC6 hindeutet und dass das vollständige Verfahren auch auf isolierte Bauchspeicheldrüseninselchen angewandt werden kann, mit klarer Untersuchung der intra-inseligen Gefäße. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wirksamkeit des 3D-Bildgebungsprotokolls bei der Aufdeckung komplexer Pankreaszellorganisation und Interaktionen innerhalb des Inselmodells.

Einleitung

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Die Pankreasinseltransplantation wird oft durch eine sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) erschwert, die die intra-insellichen Endothelzellen (IEC) erheblich schädigt und sich auf die Durchfluss und Funktion des Transplantats auswirkt. Langfristig werden bei Patienten, 4 Jahre nach der Transplantation, beschrieben eine reduzierte Menge funktioneller Inselchen und der Verlust der Insulinunabhängigkeit1. Obwohl Maus- oder Rattenmodelle der Inseltransplantation entwickelt wurden, fehlen standardisierte Modelle zur Untersuchung pharmakologischer Ziele für die Präkonditionierung von Inselchen, die besonders im Zusammenhang mit zytokinbedingten Transplantatschäden durch IBMIR von Bedeutungsind. Tatsächlich eignet sich ein sphäroides Konstrukt besonders gut zur Identifikation neuer pharmakologischer Ziele und zur Bewertung zytoprotektiver Moleküle gegen zytokininduzierte Zelldysfunktionen. Darüber hinaus bietet es einen alternativen Ansatz, um die Verwendung von Tiermodellen von Typ-1-Diabetes und Inseltransplantation zu begrenzen.

Geeignete Färbungs-, Lichtungs- und Montagebedingungen für kleine Sphäroide einer Inselgröße zu finden, bleibt eine Herausforderung. In der Literatur beschreiben nur sehr wenige Studien den Umgang mit kleinen Sphäroiden und deren wesentlichen strukturellen Merkmalen. Die Schwierigkeit ergibt sich auch aus der Notwendigkeit, Gewebedurchdringung, Signalerhaltung und strukturelle Integrität auszubalancieren und gleichzeitig die empfindliche Natur dieser miniaturen 3D-Zellstrukturen zu bewahren. Außerdem haben herkömmliche Färbungsmethoden oft Schwierigkeiten, eine einheitliche Markierung von Sphäroiden zu erreichen. Dieses Problem wird durch die dichte zelluläre Organisation verschärft, die die Diffusion von Reagenzien behindern kann, da Antikörper und Farbstoffebegrenzt sind. Schließlich muss der Prozess der optischen Klärung, der entscheidend ist, um den Lichtstreuungshintergrund zu reduzieren und die Bildtiefe zu verbessern, sorgfältig optimiert werden, um eine Störung der Struktur des Sphäroids oder eine Veränderung biologischer Eigenschaftenzu vermeiden.

Das Anbringen kleiner Sphäroide für die 3D-Mikroskopie stellt eine weitere Herausforderung dar. Traditionelle Montagemedien bieten möglicherweise keine ausreichende Unterstützung für diese empfindlichen Strukturen, was während der Bildgebung zu deren Verformung oder Kollaps führen kann. Darüber hinaus muss die für eine optimale Bildgebungsqualität erforderliche Brechungsindexabgleichung präzise gesteuert werden, um eine genaue Visualisierung über die gesamte Tiefe des Sphäroids 6,7 sicherzustellen. Die Entwicklung von Protokollen, die auf kleine Sphäroide zugeschnitten sind, wird durch die Vielfalt der Zelltypen und experimentellen Bedingungen in sphäroidenKulturen zusätzlich erschwert. Schließlich ist der Bedarf an spezialisierten Ansätzen, um die Integrität mehrerer Zellpopulationen während der Färbungs- und Clearing-Prozesse zu erhalten, entscheidend für die Bewertung der Zellantworten.

Um die spezifischen Herausforderungen der Untersuchung des IBMIR-vermittelten Inselstresses zu adressieren, wurde ein 2000-Zell-Sphäroidmodell entwickelt, das Maus-IEC und Insulinsekretion β Zellen kombiniert, mit einem 1:20-Verhältnis von IEC zu β Zellen, ähnlich wie in einer Bauchspeicheldrüseninsel. Darüber hinaus haben frühere Experimente gezeigt, dass die Struktur die Lebensfähigkeit für 96 Stunden erhalten bleibt, was ein physiologisch relevantes 3D-Modell für die Beobachtung kurzer (Stundenbereich) oder längerer stressbedingter Zellantworten (Tage) sowie deren pharmakologischer Modulation liefert. Das sphäroide Modell besteht aus MS-1 murinen intra-insellichen Endothelzellen, Merkmalen der Mikrovaskulatur der Insel und konstitutivem Insulin, die β Zellen sekretieren, β-TC-68. Sie wurde so konzipiert, dass sie den kleinsten Dimensionsbereich der Pankreasinselchen (50–200 μm Durchmesser) und deren durchschnittlicheZellzahl 9 genau nachahmt.

Eine neuartige Ernte- und Färbemethodik, die speziell für die Handhabung kleiner Sphäroide (150–200 μm Durchmesser) optimiert ist, wird berichtet und ermöglicht eine optimale Durchdringung fluoreszierender Farbstoffe und Antikörper in der gesamten sphäroiden Struktur und mit minimalem Hintergrund. Das Protokoll beinhaltet ein Montageverfahren, bei dem Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMPA) sanft strukturelle Unterstützung für empfindliche Sphäroide geschaffen wird und gleichzeitig eine optimale Anpassung des Brechungsindex gewährleistet. LMPA ist eine modifizierte Form von Agarose mit reduzierter Gelierung (ca. 27 °C) und Schmelztemperatur (ca. 65 °C), die die Probenintegrität während der Einbettung erhält und eine optisch klare Matrix mit minimaler Autofluoreszenz 4,6 erzeugt. Schließlich wird die Clear Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC)10 Methode für die optische Clearing eingesetzt, um eine maximale Visualisierung der inneren Strukturen und die Erhaltung der Integrität empfindlicher Zell-Zell-Interaktionen zuermöglichen.

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Protokoll

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Der Einsatz von menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe und allen experimentellen Protokollen wurde vom Ministerium für Hochschulbildung und Forschung der französischen Regierung (Generaldirektion für Forschung und Innovation, Bioethik-Einheit) genehmigt und unter der Nummer DC-2019-3439 registriert. Die informierte Zustimmung wurde von den gesetzlichen Vormündern aller Subjekte eingeholt.

1. Sphäroidpräparation

HINWEIS: Die Maus-IEC-Linie MS-1 und die Maus-β-Pankreaszelllinie β-TC6 wurden gleichzeitig kultiviert, um eine ausreichende Zellmenge für die sphäroide Kultur zu erhalten. MS-1 wurde in T75-Adhärentzell-Kolben im DMEM High Glucose-Medium mit 4,5 g/L Glukose kultiviert, mit 5 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin in einer feuchten Atmosphäre bei 37 °C. Die Passagen wurden bei Confluenz (2 Tage Kultur) nach Abscheidung mit Trypsin EDTA 1x und drei Waschen in Hank Balanced Lösung (HBSS) durchgeführt. β-TC6 wurden in T75 für schwierige adhärente Zellen im DMEM High Glucose Medium mit 4,5 g/L Glukose kultiviert, mit 15 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin in feuchter Atmosphäre bei 37 °C. Die Passagen wurden an der β-TC6-Konfluenz (10-tägige Kultur) nach Abscheidung durch Trypsin EDTA 1x und 3 Waschen in Hank Balanced Lösung (HBSS) durchgeführt.

  1. Bereite die Sphäroid-Kulturplatte vor
  2. Waschen Sie die Platte mit 500 μL Anti-Adhärenz-Spüllösung, die vom Hersteller bereitgestellt wird, um Zelladhäsion zu verhindern und die Sphäroidbildung zu fördern.
  3. Zentrifugiere die Platte bei 1.300 x g für 5 Minuten in einem schwingbaren Eimerrotor mit Plattenhaltern bei Raumtemperatur.
  4. Beobachten Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Mikrobrunnen verbleiben. Wenn ja, zentrifugiere ein zweites Mal mit 1.300 x g für 5 Minuten.
  5. Verzichte auf Anti-Haft-Spülung und wasche den Brunnen dreimal mit 1 ml warmem HBSS.
  6. Verwerfen Sie HBSS und ersetzen Sie durch 500 μL warmes sphäroides Medium: DMEM High Glucose mit 4,5 g/L Glukose, 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin.
  7. Halten Sie die Platte bei 37 °C in feuchter Atmosphäre, während Sie die sphäroide Suspension vorbereiten.
  8. Inkubieren Sie MS-1 und β-TC6 gleichzeitig mit Trypsinlösung und zählen Sie die lebenden Zellen jeder Linie.
    HINWEIS: Beim Aussäen werden die Sphäroide nach dem für Bauchspeicheldrüseninselchen typischen Verhältnis von 1 IEC zu 20 β Zellen gebildet. Verwenden Sie eine 24-Wellen-Spheroid-Kulturplatte, wobei jede Bohrung 300 Mikrowellen enthält, die ein Sphäroid mit 2000 Zellen aufnehmen könnten, was insgesamt 600.000 Zellen pro Bohrloch ergibt. In der vorliegenden Untersuchung zeigten Messungen identische sphäroide Volumen, die von den ausgewählten β-TC6- und MS1-Zelllinien nach der 48-Stunden-Sphäroidkultur eingenommen wurden.
  9. Mische die beiden Zelllinien zu einem Verhältnis von 1 zu 20 für 24 Brunnen und suspendiere sie dann in 24 mL sphäroides Medium.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine 10 mL oder 25 mL Pipette in der Saugflussbewegung, um die Federung zu homogenisieren.
  10. Pipette pro Bohrloch 1 ml und führe eine Saugflussbewegung aus, um die Zellsuspension gleichmäßig im Bohrloch zu verteilen.
  11. Zentrifugiere die Platte bei 130 x g für 5 Minuten in einem schwingbaren Schaufelrotor mit Plattenhaltern bei Raumtemperatur.
  12. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig auf die Mikrowellen verteilt sind.
    HINWEIS: Während dieses Zentrifugationsschritts verwenden Sie hohe Beschleunigungs- und Verzögerungsraten (70 %–90 % der Beschleunigungs- und Verzögerungsskalen), sonst verschieben sich die Zellklumpen zur Seite des Mikrowells.
  13. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5 %CO2.
  14. Überwachen Sie die Bildung und das Wachstum der Sphäroide mit einem Lichtmikroskop.
    HINWEIS: β-TC6 / MS-1 Sphäroide sollten nach 24 Stunden Kultur beginnen und nach 48 Stunden eine kugelförmige Form erreichen. Die Lebensfähigkeit kann mit Trypanblau nach einer spheroiden Zerstörung durch Trypsin in duplizierten Proben überwacht werden und wurde über 96 Stunden (80 %–90 %) aufrechterhalten.

2. Sphäroidenernte und -färbung

  1. Die Sphäroide vorsichtig mit einer P1000-Pipette in ihrem Medium wieder aufhängen.
  2. Wirft die Sphäroide in kleine Mengen in einem 15-mL Falcon aus und zentrifugiert bei 130 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur
  3. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig, wobei Sie das Pellet mit den Kugeln vermeiden.
  4. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 2 ml HBSS vorsichtig, um eine Dissoziation der Sphäroide zu vermeiden, und zentrifugieren Sie bei 130 x g für 5 Minuten.
  5. Unter einer chemischen Haube entsorgen Sie das HBSS und suspendieren Sie die Sphäroide über Nacht in 1 ml 4%iger PFA-Lösung bei 4 °C zum Fixieren.
  6. Zentrifugiere das Rohr bei 130 x g für 5 Minuten, entsorge die 4%ige PFA-Lösung und wasche dreimal mit 2 ml 1x PBS (hergestellt in laborfähigem ultrareinem Wasser).
  7. Wieder in 2,5 ml HBSS suspendieren.
  8. Gib die sphäroide Suspension in eine 6-Well-Platte.
  9. Unter einer Fernglaslupe werden 20 bis 30 Kugeln mit einer P200-Pipette von Hand ausgewählt und in ein 1,5-ml-Rohr gelegt.
    HINWEIS: Jedes 1,5-ml-Rohr ist ein Färbungszustand mit 20 bis 30 Sphäroiden. Unterhalb von 20 geernteten Sphäroiden wird es schwierig, sie zu erkennen, wenn sie anschließend wieder suspendiert werden.
  10. Gleiche die Volumina der 1,5-mL-Röhren aus und zentrifugiere bei 800 x g für 5 Minuten.
    HINWEIS: Ab diesem Punkt werden alle Lösungs-Aspirationsschritte mit Hilfe einer Lupe durchgeführt. Es ist sehr schwierig, Sphäroide unter künstlichem Licht zu erkennen. Führen Sie tagsüber immer die folgenden Schritte aus, wobei die Röhren gegen das Tageslicht gehalten werden. Alle Lösungen sind mit einer P1000-Spitze mit einer P1000-Spitze am Ende aspiriert.
  11. Entfernen Sie so viel HBSS wie möglich, ohne die Sphäroide neu zu suspendieren.
  12. Suspendieren Sie die Sphäroide in 400 μL Abschrecklösung (0,5 M Glycin in 1x PBS (pH 7-7,4)), um zukünftige Hintergrundgeräusche durch verbleibende Aldehyde der PFA-Fixierung zu vermeiden. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden.
  13. Zentrifugiere bei 800 x g für 5 Minuten und pipette die Abschrecklösung ab.
  14. Resuspendieren in 400 μL Penetrationspuffer (0,2 % Triton X-100, 0,3 M Glycin, 20 % DMSO in 1x PBS). Dies wird dazu beitragen, das Eindringen von Antikörpern und nuklearen Sonden zu verbessern. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden.
    HINWEIS: Ab diesem Stadium setzen sich die Sphäroide von selbst ab und haften nicht mehr an der Röhrenwand. Zentrifugation ist nicht mehr notwendig, wenn die Mengen sanft aspiriert werden, ohne das Sphäroidpellet zu stören. Bei Bedarf zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 Minuten.
  15. Entsorge den Penetrationspuffer und inkubiere in 400 μL Blockierpuffer (0,2 % Triton X-100, 1 % BSA, 10 % DMSO, 5 % Ziegenserum in 1x PBS) über Nacht bei 37 °C.
  16. Entsorgen Sie den Blockpuffer und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C in 300 μL Primärantikörperlösung (0,2 % Tween 20, 1 % BSA, 5 % DMSO, 5 % Ziegenserum in 1x PBS).
    HINWEIS: Verwendete primäre Antikörper sind: Anti-CD31 (Endkonzentration von 2,2 μg/mL), Anti-Integrin β1 (1,43 μg/mL), Anti-Insulin (0,66 μg/mL) und Antimaus NTPDase311 (Verdünnung 1:1000) (siehe Materialtabelle). Kontroll-IgGs der jeweiligen identischen Isotypen sollten auf derselben Struktur validiert werden, um eine positive Markierung mittels Fluoreszenzmikroskopie sicherzustellen.
  17. Entsorge die primäre Antikörperlösung und wasche dreimal mit 400 μL Waschpuffer (0,2 % Tween 20, 1 % BSA in 1x PBS). Zwischen den Waschen 5 Minuten schütteln.
  18. Inkubieren Sie 300 μL der sekundären Antikörperlösung (DAPI (2 μg/mL), 0,2 % Tween 20, 1 % BSA, 5 % DMSO, 5 % Ziegenserum in 1x PBS) über Nacht bei 37 °C. Schützen Sie die Schläuche mit Alufolie.
    HINWEIS: DAPI sollte immer zu den Färbebedingungen hinzugefügt werden, da dies das Auffinden von Sphäroiden bei der Mikroskopie-Bildgebung erleichtert und hilft, die verschiedenen Fluorophore/Farbstoffe nicht zu bleichen. Alle sekundären Antikörper haben eine Endkonzentration von 2 μg/mL (siehe Materialtabelle).
  19. Entsorge die sekundäre Antikörperlösung und wasche dreimal mit 400 μL eines zweiten Waschpuffers: 0,2 % Tween 20, 1 % BSA in 1x PBS. Bewahre die letzte Wäsche auf und bewahre die Röhren bei 37 °C auf, bis sie am selben Tag montiert werden.

3. Lösungsvorbereitung

  1. Herstellung der optischen Clearinglösung
    HINWEIS: Die optische Clearing-Lösung folgt demCUBIC-10-Verfahren und wurde wie von Gunasingh et al. 4 vorgeschlagen hergestellt. Die Komponentenverhältnisse werden in Prozentteilen des Endlösungsgewichts (w/w) angegeben, da Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)-Ethylendiamin zu viskos zum Pipetten ist und gewogen werden muss.
    1. In einer Glasflasche wiegen Sie 9 % (w/w) N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)-Ethylendiamin, 22% (w/w) Harnstoff, 44% (w/w) Saccharose, 0,1% (w/w) Triton X-100 und 24,9% (w/w) labortaugliches ultrareines Wasser.
      HINWEIS: Etwa 60 g Lösung sind erforderlich, um eine 24-Well-Platte zu reinigen.
    2. Fügen Sie eine magnetische Stange hinzu, die an den Flaschendurchmesser angepasst ist.
    3. Erhitze und rühre die Lösung auf 56 °C. Halten Sie eine mit Wasser gefüllte Kontrollglasflasche auf derselben Platte, um den Temperaturanstieg zu überwachen.
    4. Kontrollieren Sie die Rührgeschwindigkeit, um einen glatten flüssigen Wirbel zu erhalten, und rühren Sie die Lösung, bis alle Verbindungen vollständig gelöst sind. Die Lösung sollte vollständig flüssig und klar sein. Das kann bis zu 1 Stunde dauern.
    5. Halten Sie sie auf Raumtemperatur, geschützt vor Licht.
      HINWEIS: Die Reinigungslösung muss mindestens 24 Stunden vor der optischen Reinigung vorbereitet werden, damit die Lösung entgleiten kann und eventuelle Blasen entfernt werden. Um Blasen zu vermeiden, schütteln Sie die Lösung nie wieder. Niemals im Kühlhaus lagern.
  2. 2% LMPA-Lösungsvorbereitung
    1. Wage 0,5 g LMPA auf einer Präzisionswaage und lege es in eine 100-mL Erlenmeyer-Kolbe.
      VORSICHT: Nehmen Sie kein kleineres Erlenmeyer-Volumen, da bei Überlaufen ein Risiko von Verbrennungen besteht.
    2. Lösen Sie sich bei Raumtemperatur in 25 ml 1x PBS.
    3. Füllen Sie das Pulver gründlich in das 1x PBS ein, indem Sie die Erlenmeyer-Flasche vorsichtig umrühren.
      VORSICHT: Für den nächsten Schritt ist es unerlässlich, Schutzausrüstung zu tragen: Handschuhe und eine Maske für Augen und Gesicht, um vor Spritzern und Verbrennungen zu schützen.
    4. Erhitze die Erlenmeyer-Flasche in der Mikrowelle.
    5. Beobachte, wann die Lösung zu kochen beginnt (Blasen in der Flüssigkeit), und entferne sie unmittelbar, bevor sie überkocht.
    6. Rühren Sie das Erlenmeyer vorsichtig um, um das Pulver einzuarbeiten.
      VORSICHT: Rühren Sie nicht zu stark, da die Flüssigkeit überlaufen oder überkochen und spritzen kann.
    7. Erlenmeyer zurück in die Mikrowelle geben und wiederholen, bis der LMPA vollständig aufgelöst ist.
    8. Entferne das Erlenmeyer und gib vor dem Erstarren des LMPA schnell 1 ml 2%ige LMPA-Lösung in 1,5 mL Röhren ab. Lagern Sie bei Zimmertemperatur.
      HINWEIS: Der Prozess ist zeitaufwendig. Bereiten Sie die Lösung im Voraus vor und lagern Sie sie für die spätere Verwendung auf.

4. Montage und optische Freigabe

  1. Die Plattenzentrifuge wird auf 40 °C vorgeheizt, wobei ein langer Zyklus zur Vorbereitung der Probenplatte durchgeführt wird.
    HINWEIS: LMPA wird bei 30 °C geliert. Lass die Zentrifuge nicht unter 40 °C laufen. Wenn die Zentrifuge es zulässt, erhöhen Sie sie auf 50 °C.
  2. Flüssige Aliquoten von 2 % LMPA in einem Wasserbad oder Röhrenheizung bei 70 °C für 5 bis 10 Minuten.
  3. Senke und halte die Temperatur der 2 % LMPA bei 55 °C.
  4. Setzen Sie die Bildaufnahmeplatte vorsichtig auf den Plattenheizer, vorgeheizt auf 50 °C.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, das empfindliche Polymer, das als Basis für die Brunnen dient, nicht zu brechen oder zu kratzen.
  5. Achte darauf, dass die Platte heiß ist, bevor du die 2%ige LMPA hinzufügst. Es darf in diesem Stadium nicht zusammenpassen.
  6. Pipettieren Sie 200 μL mit 2 % LMPA in jedes Bohrloch. Decken Sie den gesamten Untergrund des Supports ab, um eine erste flüssige Basis zu erhalten, die eine flüssigere Verteilung der Sphäroide ermöglicht.
  7. Entsorge den Waschpuffer aus den Röhren, suspendiere die Sphäroide in 300 μL mit 2 % LMPA und pipettiere sie direkt in ihren Brunnen. Führen Sie immer eine sanfte Resuspension durch, um Blasen zu vermeiden.
  8. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um die Fluorophore zu schützen.
  9. Wiegen Sie den Teller schnell ohne Alufolie und legen Sie ihn zurück in den Tellerwärmer.
  10. Bereiten Sie eine 24-Brunnen-Platte vor und fügen Sie Wasser hinzu, um das Gleichgewicht auszugleichen.
  11. Entfernen Sie die Platte mit der Alufolie schnell aus dem Plattenwärmer, um die Fluorophore zu schützen, die mit den sekundären Antikörpern gekoppelt sind. Behalten Sie sie in der Hand und legen Sie sie nicht auf eine kalte Oberfläche.
  12. Entfernen Sie die Alufolie und legen Sie sie in die Zentrifuge der Platte.
  13. Zentrifugiere bei 1000 x g für 15 Minuten bei 40 °C. Überprüfen Sie die Temperatur des Rotors, die Raumtemperatur haben sollte.
  14. Während der Zentrifugation bereiten Sie eine Eisschale vor: Flachen Sie das Eis so, dass die Platte auf eine ebene Oberfläche gelegt werden kann.
  15. Nimm den Teller heraus und stelle ihn auf das Eis, wobei das Tablett oder der Teller mit Alufolie bedeckt wird. Lass den Teller 10 Minuten auf Eis stehen.
  16. Nimm die Platte vom Eis und lasse sie 20 Minuten im Aluminium, damit sie bei Raumtemperatur stabilisiert wird.
  17. Pipettieren Sie pro Bohrloch 1 bis 1,5 ml der Reinigungslösung, decken Sie sie mit Alufolie ab und lassen Sie sie mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt, klar machen.
    HINWEIS: Lagern Sie den Teller niemals bei 4 °C. Das LMPA kann sich zusammenziehen, sich vom Boden des Brunnens lösen und in der Clearing-Lösung schwimmen. Bild innerhalb einer Woche nach der Räumung.

5. Bildverarbeitung

  1. Verwenden Sie ein konfokales rotierendes Scheibenmikroskop, wählen Sie (mindestens) das 30-fache Objektiv.
  2. Behalten Sie die Clearing-Lösungen, da sie die Brechungsindexe homogenisieren und die 3D-Bildgebung erleichtern.
  3. Finden Sie die Sphäroide, indem Sie den DAPI-Kanal auswählen, um das Bleichen der anderen Fluorophore zu vermeiden.
  4. Erfassen Sie Bilder mit der Z-Stack-Funktion. Wählen Sie oben und unten des Sphäroids aus und setzen Sie die optischen Schnitte 10 μm auseinander.
    HINWEIS: Bildaufnahme und Bildanalyse wurden auf der Bildplattform des CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra durchgeführt.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Wirksamkeit der Kennzeichnung und der optischen Freigabe zu bewerten, wurden mehrere Modelle demselben Protokoll unterzogen und anschließend festgelegt (Abbildung 1). Sphäroide mit dem Verhältnis von 1 IEC zu 20 β-Zellen und 1 IEC zu 50 β-Zellen wurden nach der oben beschriebenen Methode kultiviert. Bemerkenswert ist, dass das Verhältnis von 1 IEC zu 20 β Zellen dem einer menschlichen Pankreasinsel nahekommt. Die Verwendung von Trypanblau zur Färbung ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein sphäroides Modell, das MS-1 murine IEC und murine β Zellen β-TC6 integriert, wurde entwickelt und ahmt die dreidimensionale Struktur von Pankreasinseln nach. Dieses Modell eignet sich für die Analyse stressbedingter IEC-Dysfunktion über 72 Stunden und deren Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit und Funktion der β-Zellen, mit Bezug auf die Forschung zur Inseltransplantation. Wichtig ist, dass die aus Mauszellen bestehende Sphäroid homogen war und eine relevante intra-inselliche Endothe...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren sind Pascal Kessler von der PICSTRA-Bildgebungsplattform dankbar für fachkundige Unterstützung bei der Spinn-Disk-Mikroskopie und der Extraktion der rohen Etikettierungsdaten aus dem Z-Stack. Die Autoren möchten das freundliche Geschenk gereinigter menschlicher Inselchen von Dr. W. Bietiger, Dr. A. Langlois und Dr. K. Bouzakri vom European Center for the Study of Diabetes (CEED, Straßburg, Frankreich) würdigen

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
µ-plate 24 bohrloch, schwarze ID 14 mm IBIDI82426
AggreWell 800 (24 Brunnen)StemCell34815
Anti-Adhärenz-Spüllösung StemCell7010
Anti-CD31-Antikörper [P2B1]abcamab24590Abschlussverstärker 2.2 & Mikro; g/mL
Anti-Integrin & Beta; 1 Antikörper, Klon MB1.2MerckMAB1997 Endkonzentration 1,43 & Mikro; g/mL
Zellkulturkolbe, T-75, Oberfläche, Oberfläche : Zell+, FilterkappeSarstedt83.3911.302β-TC6-Kultur
Zellkulturkolben, T-75, Oberfläche: Standard, 2-Position-SchraubverschlussSarstedt83.3911.02MS-1-Kultur
DAPI-DihydrochloridThermofisher,D1306Abschließende Schwerpunkt 2&Mikro; g/mL
Dimethylsulfoxid SigmaD8418-250ML
DMEM, hohe Glukose, GlutaMAX&Trade; Ergänzung, PyruvatThermofischer wissenschaftlich31966047
Dulaglutid
DulaglutidLillyTrulicity 1,5 mg Pen
Fetales RinderserumBiowestS1810-500
GlycinSigmaG7126-1KG
Ziegen-Anti-Meerschweinchen-IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21435Abschließende Schwerpunkt 2&Mikro; g/mL
Ziegen-Maus-IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor™ 488Thermofischer  A-11029Abschließende Schwerpunkt 2&Mikro; g/mL
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor™ 633ThermofischerA-21071Abschließende Schwerpunkt 2&Mikro; g/mL
Ziegenanti-Ratten-IgG (H+L) kreuzadsorbierte sekundäre Antikörper, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21434Abschließende Schwerpunkt 2&Mikro; g/mL
ZiegenserumSigmaS26-100ML
HBSS ohne Kalzium & magnesium  & PhenolrotCorning21-022-CV
Insulin (C27C9) Kaninchen-MAbZellsignalübertragung3014SEndkonzentration 0,66 & Mikro; g/mL
Isolierte menschliche Bauchspeicheldrüseninsel  Centre Europé en d'Etude du Diabete (CeeD)Ein freundliches Geschenk von Dr. Karim Bouzakri. Klinische Qualität, isoliert gemäß den Richtlinien.
Niedrige Geling-Temperatur AgaroseMerckA9414-10G
MS-1-ZellenATCCCRL-2279
Paraformaldehydlösung, 4 % in PBS 1xFischer Scientific15670799
PBS 10xEuromedexET330-AEinmal verdünnt in ultrareinem Wasser in Laborqualität
Penicillin-StreptomycinPAN BiotechP06-07100
Polyklonales Meerschweinchen-Antimaus NTPDase3 Antikörper mN3-1CI4; mN3-2C(I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpVerdünnung 1:1000
Quadrol/N,N,N&prim;,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) Ethylendiamin Sigma122262-1L
Drehscheibe Olympus IXplore SPIN Olympus Wissenschaftliche Lösungen
Sukkrase für die MolekularbiologieSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Bioqualitäts-LaborqualitätEuromedex2000-A
Trypsin/EDTA (10x)PAN BiotechP10-025100
Tween-20Euromedex//
HarnstoffSigmaU-5128
β-TC6-ZellenATCCCRL-11506

Referenzen

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