Methodenartikel

Identifizierung von Mycobacterium-Spezies mittels DNA-Microarray-Chip-Methode

DOI:

10.3791/68234

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24. Juni 2025

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1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir eine DNA-Microarray-Chip-Methode zur Identifizierung von Mycobacterium-Spezies vor, die die diagnostische Genauigkeit und Effizienz verwandter Krankheiten für den klinischen Einsatz verbessern wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie wird eine DNA-Microarray-Chip-Methode vorgestellt, die für die genaue Identifizierung von Mycobacterium-Spezies entwickelt wurde. Durch die Nutzung der asymmetrischen PCR-Amplifikations- und Hybridisierungsprinzipien zielt diese Methode auf 17 häufige Mykobakterien ab, darunter solche aus dem Mycobacterium tuberculosis-Komplex und verschiedene nicht-tuberkulöse Mykobakterien. Es ist auf eine Vielzahl klinischer Proben wie Sputum, Eiter, bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit, Liquor cerebrospinalis und Punktionsflüssigkeit von Patienten mit Verdacht auf mykobakterielle Erkrankungen anwendbar. Der Assay beinhaltet die Amplifikation von Zielsequenzen im Mycobacterium-Genom durch asymmetrische PCR, gefolgt von einer Hybridisierung mit den Sonden auf dem Microarray-Chip. Die einzigartige Sondenanordnung (5x wiederholt in einem 12-reihigen x 10-Spalten-Microarray) und die Verwendung von Kontrollsonden erhöhen die Zuverlässigkeit. Klinische Studien mit 1.724 Proben zeigten eine hohe Leistungsfähigkeit. Die Methode erreichte eine klinische Spezifität, Sensitivität und Gesamtübereinstimmung von 100 % im Vergleich zu den Sequenzierungsergebnissen, mit Ausnahme von zwei seltenen nicht-tuberkulösen mykobakteriellen Proben, die außerhalb ihres Nachweisbereichs lagen. Diese DNA-Microarray-Chip-Methode bietet eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Diagnosetechniken, indem sie die Diagnosezeit verkürzt und einen umfassenderen Nachweis ermöglicht, wodurch sie ein großes Potenzial bei der Diagnose und Behandlung von mykobakteriellen Erkrankungen hat.

Einleitung

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Mycobacterium, eine Gattung von Bakterien, umfasst eine vielfältige Gruppe von Organismen mit erheblichen Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier. Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose (TB), ist seit langem eine globale Geißel für die Gesundheit. Trotz jahrzehntelanger Bemühungen in der Prävention und Behandlung ist Tuberkulose nach wie vor eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und für eine erschütternde Zahl von Todesfällen und Neuinfektionen pro Jahr weltweit verantwortlich 1,2. Auch nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) werden zunehmend als wichtige Krankheitserreger anerkannt, insbesondere in bestimmten Patientenpopulationen und Umweltumgebungen.

Die genaue Identifizierung von Mycobacterium-Spezies ist der Eckpfeiler eines wirksamen Krankheitsmanagements 3,4. Traditionelle Diagnosemethoden haben inhärente Grenzen. Kulturbasierte Techniken, auf die man sich in der Vergangenheit verlassen hat, sind notorisch zeitaufwändig. Der Prozess der Isolierung und Kultivierung von Mykobakterien kann Wochen bis Monate dauern, in denen es bei den Patienten zu einem Fortschreiten der Krankheit und einer möglichen Übertragung auf andere kommen kann. Darüber hinaus sind einige Mykobakterienarten extrem schwer zu kultivieren, was zu falsch-negativen Ergebnissen und einer verzögerten oder falschen Behandlung führt 5,6.

Die säurefeste Färbung, eine weitere häufig verwendete Methode, kann Mykobakterien anhand ihrer einzigartigen Zellwandeigenschaften identifizieren, die einer Entfärbung widerstehen. Es fehlt jedoch die Spezifität, um zwischen verschiedenen Mycobacterium-Spezies zu unterscheiden, und liefert nur einen breiten Hinweis auf das Vorhandensein von Mykobakterien7. Molekulare Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) haben sich als Alternativen herausgestellt, um einige dieser Nachteile zu überwinden. Die PCR kann mykobakterielle DNA schneller nachweisen als Kulturmethoden, was eine schnellere Diagnose ermöglicht. Herkömmliche PCR-Assays zielen jedoch in der Regel auf eine begrenzte Anzahl von Genen ab und bieten möglicherweise keine umfassende Speziesidentifizierung, insbesondere wenn es sich um eng verwandte Mycobacterium-Spezies handelt 5.

Die DNA-Microarray-Technologie hat die Bereiche Mikrobiologie und Diagnostik revolutioniert. Es bietet die Möglichkeit, mehrere genetische Ziele gleichzeitig zu analysieren, was einen umfassenderen und detaillierteren Überblick über die mikrobielle Population bietet 8,9. Jüngste Forschungen in diesem Bereich haben das Potenzial und die Bedeutung fortschrittlicher molekularer Techniken für die Identifizierung von Mycobacterium weiter beleuchtet. So zeigte eine Studie von Wang et al.10 die erhöhte Sensitivität und Spezifität eines modifizierten DNA-Microarray-Chips beim Nachweis seltener Mycobacterium-Spezies in einem klinischen Umfeld. Ihre Ergebnisse unterstrichen den Wert einer kontinuierlichen Optimierung der Microarray-Technologie. Eine weitere Studie von Wang und Kollegen11konzentrierte sich auf die Integration von DNA-Microarray-Daten mit klinischen Ergebnissen bei TB-Patienten. Die Ergebnisse gaben Aufschluss über den prognostischen Wert einer genauen Identifizierung von Mycobacterium-Spezies und das Potenzial für eine personalisierte Medizin.

Prüfprinzip
Dieses Kit verwendet die DNA-Microarray-Chip-Technologie in Kombination mit asymmetrischen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikations- und Hybridisierungsprinzipien für die Identifizierung von Mycobacterium-Spezies . Das Kit enthält einen Chip zur Identifizierung von Mycobacterium-Spezies und asymmetrische PCR-Amplifikationsreagenzien. Der Chip ist mit speziesspezifischen Sonden für den Nachweis und die Identifizierung von Mycobacterium-Spezies fixiert. Zu den Nachweiszielen gehören 17 klinisch häufige Spezies oder Gruppen, wie z. B. der Mycobacterium tuberculosis-Komplex , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae und Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum und Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai und Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi und Mycobacterium smegmatis.

Der Nachweis dieser 17 Mycobacterium-Spezies ist entscheidend für eine genaue klinische Diagnose und ein maßgeschneidertes Patientenmanagement. Der Mycobacterium tuberculosis-Komplex (MTBC) wird aufgrund seiner Rolle bei der Tuberkulose priorisiert und erfordert eine sofortige Isolierung und eine Multidrug-Therapie, um die Übertragung einzudämmen und die Arzneimittelresistenz zu bekämpfen. Spezies innerhalb des Mycobacterium avium-intracellulare-Komplexes (MAC), wie M. avium und M. intracellulare, betreffen überwiegend immungeschwächte Personen (z. B. HIV/AIDS) oder Personen mit chronischen Lungenerkrankungen, die eine verlängerte Makrolid-basierte Therapie erfordern. Schnell wachsende Mykobakterien (RGMs) wie M. abscessus und M. fortuitum sind berüchtigt für Antibiotikaresistenzen und verursachen oft schwere Haut-, Weichteil- oder Lungeninfektionen, die aggressive Kombinationen von Operationen und gezielten Antibiotika (z. B. Amikacin, Makrolide) erfordern. Umweltspezies wie M. gordonae oder M. smegmatis sind häufige Kontaminanten, können aber in bestimmten Kontexten opportunistische Infektionen verursachen, die eine sorgfältige klinische Korrelation erfordern, um unnötige Behandlungen zu vermeiden. Krankheitserreger wie M. marinum (assoziiert mit aquatischer Exposition) und M. ulcerans (Verursacher von Buruli-Geschwüren) haben unterschiedliche epidemiologische Nischen, die die Bewertung der Expositionsgeschichte leiten. Seltene, aber klinisch relevante Spezies (z. B . M. szulgai, M. malmoense) ahmen die Tuberkulose nach und erfordern artspezifische Therapien. Eine genaue Identifizierung ist von größter Bedeutung, da die Behandlungsdauer, die Auswahl des Medikaments (z. B. Rifampicin-Sensitivität bei M. kansasii vs. intrinsische Resistenz bei NTMs) und die Prognose drastisch variieren. Molekulare Diagnostik und antimikrobielle Empfindlichkeitstests sind unerlässlich, um die Ergebnisse zu optimieren, insbesondere bei immungeschwächten Bevölkerungsgruppen oder komplexen Infektionen.

Zunächst werden die Zielsequenzen im Mycobacterium-Genom durch asymmetrische PCR amplifiziert. Dann werden die amplifizierten Produkte mit den Sonden auf dem Chip hybridisiert. Wenn das Ziel-Mycobacterium in der Probe vorhanden ist, binden die amplifizierten Produkte spezifisch an die entsprechenden Sonden auf dem Chip. Schließlich kann durch Scannen der Hybridisierungssignale auf dem Chip die Spezies von Mycobacterium in der Probe bestimmt werden.

Mittels Genchip-Microarraying-Technologie werden spezifische Sonden zum Nachweis der genannten Gene und verschiedene Kontrollsonden auf dem Substrat fixiert. Jede Detektionssonde und Kontrollsonde wird 5x wiederholt, wodurch ein Microarray mit 12 Zeilen x 10 Spalten entsteht. Die Sondenanordnung ist in Abbildung 1 dargestellt. Jeder Chip enthält vier identische Microarrays, und jeder Microarray kann eine Probe detektieren.

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Protokoll

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Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Quanzhou First Hospital, das der Fujian Medical University angegliedert ist, genehmigt (Zulassungsnummer 2024-K035). Vor der Entnahme der klinischen Proben wurde von allen Patienten eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Patienten wurden über den Zweck der Studie, die damit verbundenen Verfahren und ihr Recht auf jederzeitigen Rücktritt informiert, ohne dass ihre medizinische Versorgung beeinträchtigt wird.

1. Anforderungen an die Stichprobe

HINWEIS: Gehen Sie bei der Entnahme von Proben von Patienten mit klinischem Verdacht auf Tuberkulose und nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) für Tests mit diesem Kit folgendermaßen vor:

  1. Sammeln Sie Proben wie Auswurf, Eiter oder Sekrete, bronchoalveoläre Spülflüssigkeit, Punktionsflüssigkeit (einschließlich Liquor, Pleura- und Peritonealflüssigkeit, Perikardflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit und Galle) und Urin von den Patienten.
    1. Für Sputumproben:
      1. Weisen Sie den Patienten an, den Mund morgens mit sauberem Wasser auszuspülen und dann tiefen Auswurf in einen sterilen Probenbehälter zu husten, ihn zu verschließen und zum Testen einzusenden.
      2. Fügen Sie 1-2x das Volumen von 4% NaOH hinzu, schütteln Sie es und mischen Sie es gleichmäßig.
      3. Nach 15-20 min ein gleiches Volumen pH 6,8 Phosphatpuffer hinzufügen und gleichmäßig mischen.
      4. Bei Raumtemperatur 15 min bei 2.000 × g zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie 1 ml 0,9 % NaCl über eine Pipette hinzu und mischen Sie gründlich; Zur Erkennung verwenden.
    2. Für Eiter- oder Sekretproben:
      1. Spülen Sie die Oberfläche mit steriler normaler Kochsalzlösung ab. Sammeln Sie den Eiter oder das Sekret mit einem sterilen Tupfer, verschließen Sie ihn und senden Sie ihn zum Testen.
      2. Fügen Sie das 3-fache Volumen von 4% NaOH hinzu und schütteln Sie es gründlich, damit es gut vermischt ist.
      3. Lassen Sie es 20 min bei Raumtemperatur stehen (schütteln Sie es in dieser Zeit 2x manuell), zentrifugieren Sie es bei 2.000 × g bei Raumtemperatur für 15 min und entsorgen Sie dann den Überstand. Fügen Sie 1 ml 0,9 % NaCl über eine Pipette hinzu und mischen Sie es gleichmäßig; Zur Erkennung verwenden.
    3. Für bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit:
      1. Injizieren Sie 10-20 ml normale Kochsalzlösung durch ein geschütztes Röhrchen für bronchoalveoläre Lavage (PBAL).
      2. Sammeln Sie die Probe in einer sterilen Flasche durch Unterdrucksaugen und senden Sie sie zur Untersuchung.
    4. Für Liquor:
      1. Sammeln Sie mindestens 2 ml Probe mit aseptischer Technik.
      2. Bei 2.000 × g 15 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. 1 ml 0,9%ige Natriumchloridlösung über eine Pipette hinzufügen, gründlich mischen und zum Testen verwenden.
    5. Für Urinproben:
      HINWEIS: Es ist ratsam, die erste volle Menge Urin am Morgen oder den mittleren und späten Nachturin zu verwenden. Der Urin kann auch durch Katheterisierung entnommen werden.
      1. Entnehmen Sie die Probe in einem sterilen Behälter und lassen Sie die gesammelte Urinprobe 4-5 h stehen.
      2. Bei 2.000 × g 15 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. 1 ml 0,9%ige Natriumchloridlösung über eine Pipette hinzufügen, gründlich mischen und zum Testen verwenden.
  2. Lagerung von Proben
    HINWEIS: Proben auf festem Medium sollten nicht gefroren gelagert werden, da das Einfrieren nachfolgende Vorgänge beeinträchtigen kann.
    1. Proben, die im flüssigen Medium vorhanden sind, dürfen nicht länger als 5 Jahre bei -70 °C gelagert werden.
    2. Lagern Sie alle Proben nicht länger als 2 Monate bei 2-8 °C.
  3. Transport von Proben
    1. Achten Sie beim Transport der Testisolatproben darauf, einen geschlossenen Behälter zu verwenden, der die Anforderungen an die biologische Sicherheit unter den gesetzlich zulässigen Bedingungen erfüllt.

2. Vorbereitung des Experiments

  1. Aufbereitung von Hackschnitzelwaschlösungen
    HINWEIS: Bereiten Sie die Spänewaschlösung I und die Spänewaschlösung II entsprechend der Anzahl der Späne vor. Das Volumen sollte so bemessen sein, dass die Späne beim Waschen vollständig untergetaucht werden können. Gleichmäßig mischen und auf Raumtemperatur (10-30 °C) ausgleichen. Die Endkonzentration von SSC beträgt 2x und die Endkonzentration von SDS beträgt 0,2%.
    1. Zur Herstellung der Chipwaschlösung I werden 20x SSC, destilliertes Wasser (oder gereinigtes Wasser) und 10 % SDS im Verhältnis 10:88:2 nacheinander gemischt, um die Chipswaschlösung I herzustellen. Wenn Sie beispielsweise ein Gesamtvolumen von 600 mL zubereiten, messen Sie zuerst 60 mL 20x SSC und 528 mL destilliertes Wasser (oder gereinigtes Wasser) ab und geben Sie diese in ein 1 L Becherglas und mischen Sie sie gleichmäßig mit einem Rührstab. Fügen Sie dann 12 ml 10% SDS hinzu und mischen Sie es erneut gleichmäßig.
    2. Zur Herstellung von Chipwaschlösung II: Die Endkonzentration von SSC beträgt 0,2x. Mischen Sie 20x SSC und destilliertes Wasser (oder gereinigtes Wasser) im Verhältnis 1:99, um die Chip Washing Solution II zu erhalten. Messen Sie am Beispiel der Zubereitung eines Gesamtvolumens von 600 mL 6 mL 20x SSC und 594 mL destilliertes Wasser (oder gereinigtes Wasser) ab und geben Sie sie in ein 1 L Becherglas und mischen Sie gleichmäßig.
      HINWEIS: Wenn die 10%ige SDS-Lösung weiße Flockungsausfällungen entwickelt, erhitzen Sie sie auf 50 °C, mischen Sie sie gründlich und bereiten Sie dann den Microarray-Waschpuffer vor. Wenn Waschpuffer I weiße Flockungsmittelausfällungen entwickelt, erhitzen Sie ihn auf 50°C, mischen Sie ihn gründlich und gleichen Sie ihn vor Gebrauch auf Raumtemperatur aus.
  2. Bereiten Sie 350 ml Eis-Wasser-Mischung vor.
  3. Halten Sie destilliertes Wasser (oder gereinigtes Wasser) bereit.

3. Vorbereitung der Instrumente und Materialien

  1. Instrumentenauswahl und -einrichtung
    1. Identifizieren und bereiten Sie den Microarray-Chip-Scanner vor und stellen Sie sicher, dass er kalibriert und einsatzbereit ist.
    2. Richten Sie das Nukleinsäure-Extraktionsinstrument ein, überprüfen Sie seine Funktionen und laden Sie die erforderlichen Reagenzien.
    3. Platzieren Sie die Hybridisierungsbox für Gen-Microarray-Chip-Hybridisierungsboxen an der richtigen Stelle und bestätigen Sie den ordnungsgemäßen Betriebszustand.
  2. Vorbereitung von Pipettierwerkzeugen
    1. Sammeln Sie Mikropipetten mit Spezifikationen von 0,1-10 μl, 2-20 μl und 20-200 μl zusammen mit den entsprechenden sauberen und sterilen Pipettenspitzen. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipetten genau kalibriert sind und die Spitzen richtig sitzen.
  3. Anordnung der Zusatzausrüstung
    1. Bereiten Sie ein Wasserbad mit konstanter Temperatur vor und stellen Sie es auf die gewünschte Temperatur (50 °C) ein.
    2. Positionieren Sie die Mikrozentrifuge, die 1,5 mL Zentrifugenröhrchen zentrifugieren kann, und überprüfen Sie die Gleichgewichts- und Geschwindigkeitseinstellungen.
    3. Organisieren Sie saubere und sterile Zentrifugenröhrchen (200 μl und 1,5 ml) und optional saubere und sterile Acht-Well-Streifen (200 μl) auf den Racks der Zentrifugenröhrchen.
  4. Bereitschaft der Probenhandhabungsausrüstung
    1. Stellen Sie einen Schüttler mit konstanter Temperatur an einem geeigneten Ort auf und stellen Sie die entsprechenden Schüttelparameter ein.
    2. Stellen Sie zwei Behälter zum Waschen von Chips bereit und stellen Sie sicher, dass sie sauber und trocken sind.
    3. Ordnen Sie Objektträgergestelle und eine Zentrifuge an und halten Sie einen Behälter zum Zentrifugieren und Trocknen der Späne bereit.
  5. Vorbereitung des PCR-Verstärkers
    1. Schalten Sie den PCR-Verstärker ein und programmieren Sie ihn gemäß dem experimentellen Protokoll, um sicherzustellen, dass er für die Durchführung von Amplifikationsreaktionen bereit ist.

4. Nukleinsäure-Extraktion

HINWEIS: Führen Sie den Vorgang im Bereich der Probenvorbereitung durch und gehen Sie folgendermaßen vor:

  1. Präparat
    1. Geben Sie 80 μl Nukleinsäure-Extraktionslösung in das Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen und fügen Sie 1 ml 0,9 % NaCl hinzu.
  2. Entnahme von Isolatproben
    1. Um die Probenentnahme zu starten, untersuchen Sie die Quelle der Proben, unabhängig davon, ob sie aus einem festen oder einem flüssigen Medium stammen.
    2. Um Proben von festem Medium zu entnehmen, verwenden Sie eine sterile Impfschlaufe, um eine sichtbare Kolonie aus dem entsprechenden festen Medium zu entnehmen. Wenn die Bakterien so gewachsen sind, dass sie das gesamte Medium bedecken, dann pflücken Sie eine entsprechende Menge Bakterienrasen. Legen Sie es vorsichtig in das Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen, das die Nukleinsäure-Extraktionslösung enthält, und achten Sie darauf, dass das feste Medium so wenig wie möglich aufgenommen wird.
    3. Bei Proben mit flüssigem Medium sind 10-20 μl der Bakteriensuspension mit einer Trübung gleich oder mehr als 1 McFarland-Standard zu aspirieren. Injizieren Sie es in das Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen, das die Nukleinsäure-Extraktionslösung enthält.
      HINWEIS: Nach der Probenentnahme, unabhängig davon, ob es sich um ein festes oder flüssiges Medium handelt, sind die Proben bereit für die anschließende Nukleinsäureextraktion.
  3. Nukleinsäure-Extraktion
    1. Nachdem Sie die vorbehandelten Proben oder isolierten Proben aus Schritt 1.1 oben hinzugefügt haben, verwenden Sie das Nukleinsäure-Schnellextraktionsinstrument, um Nukleinsäuren zu extrahieren. Die extrahierten Nukleinsäuren zur vorübergehenden Lagerung bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Als Indikator für die Extraktionseffizienz kann der automatische Extraktor Proben mit einer viralen Nukleinsäurelast von mehr als 100 Kopien/ml extrahieren. Die Zwischenspeicherzeit sollte 2 Monate nicht überschreiten.

5. PCR-Amplifikation

  1. Vorbereitung des PCR-Reaktionssystems
    1. Bereiten Sie im Bereich der Reagenzienlagerung und -aufbereitung 200-μL-Zentrifugenröhrchen oder Acht-Well-Streifen entsprechend der Anzahl der zu testenden Proben vor und markieren Sie die Probennummern im Voraus. Nehmen Sie die PCR-Amplifikationsreagenzien aus dem Kit, lassen Sie sie auf natürliche Weise auftauen und schmelzen, schütteln Sie sie vorsichtig und mischen Sie sie gleichmäßig und zentrifugieren Sie dann schnell, damit sich die Reagenzien am Boden der Röhrchen sammeln.
    2. Entsprechend der Anzahl der Proben aliquotieren Sie die PCR-Amplifikationsreagenzien in 200-μl-Zentrifugenröhrchen oder Acht-Well-Streifen mit einem Volumen von 18 μl pro Röhrchen. Verschließen Sie die Röhrchenkappen fest und überführen Sie sie dann in den Bereich für die Vorbereitung des Amplifikationsreaktionsgemisches und den Amplifikationsbereich.
    3. Geben Sie 2 μl Matrizen-DNA (die DNA der zu testenden Probe (d. h. den Überstand im Nukleinsäure-Extraktionsröhrchen), Positivkontrollprodukte oder Negativkontrollprodukte) in den Probenvorbereitungsbereich. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen jedes PCR-Reaktionssystems 20 μl erreicht.
      HINWEIS: Verwenden Sie während der Amplifikation jedes Mal Positivkontrollprodukte und Negativkontrollprodukte. Das Positivkontrollprodukt kann zur Qualitätskontrolle in den PCR-Amplifikations- und Hybridisierungsprozessen verwendet werden, und das Negativkontrollprodukt kann zur Überwachung der Umgebung und des Betriebsprozesses verwendet werden.
  2. Verstärkung
    1. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen oder Acht-Well-Streifen mit den Reagenzien in das PCR-Amplifikationsgerät. Stellen Sie sicher, dass das Gerät auf die erforderliche Temperatur vorgewärmt ist. Durchführung der PCR-Amplifikationsreaktion gemäß dem folgenden Temperaturzyklusprogramm: Erstdenaturierung bei 94 °C für 600 s (1 Zyklus); 35 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Glühen bei 60 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 40 s; eine abschließende Ausdehnung bei 72 °C für 420 s (1 Zyklus); Auf unbestimmte Zeit bei 4 °C halten (1 Zyklus).

6. Chip-Hybridisierung

HINWEIS: Bevor die PCR-Amplifikationsreaktion endet, führen Sie die folgenden Vorgänge aus:

  1. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades mit konstanter Temperatur auf 50 °C ein und heizen Sie es vor.
  2. Vorbereitung der Chips
    1. Geben Sie 200 μl destilliertes Wasser (oder gereinigtes Wasser, wie in Abbildung 2A gezeigt) auf den Boden der Gen-Microarray-Chip-Hybridisierungsbox. Platzieren Sie die Halterung zwischen den beiden Positionierungssäulen im Inneren des Kastens.
    2. Platzieren Sie den Chip vorsichtig mit der Vorderseite nach oben auf der Halterung und decken Sie den Chip mit dem Deckglas ab, wobei die vier Naben nach unten zeigen (wie in Abbildung 2B gezeigt).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Deckglas in der richtigen Platzierungsrichtung platziert ist, sodass sein Ende mit dem Etikett am Ende des Chips ausgerichtet ist.
  3. Vorbereitung, Denaturierung und Kühlung des Hybridisierungsreaktionsgemisches
    1. Bereiten Sie 200-μl-Zentrifugenröhrchen oder Acht-Well-Streifen entsprechend der Anzahl der Proben vor und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.
    2. Nehmen Sie den Hybridisierungspuffer aus dem Kit und erhitzen Sie ihn auf 50 °C, bis er vollständig geschmolzen ist. Nach gründlichem Mischen schnell in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren. Aliquotieren Sie 9 μl des Hybridisierungspuffers in jedes vorbereitete 200-μl-Zentrifugenröhrchen oder Acht-Well-Streifen. Geben Sie dann 6 μl des entsprechenden PCR-Produkts in jedes Röhrchen, was zu einem Gesamtvolumen von 15 μl pro Hybridisierungsreaktionsgemisch führt.
    3. Das Hybridisierungsreaktionsgemisch (einschließlich des Hybridisierungspuffers und des PCR-Produkts) auf 95 °C erhitzen (in einem PCR-Gerät oder einem Wasserbad) und 5 Minuten lang denaturieren. Das Hybridisierungsreaktionsgemisch, das im vorherigen Schritt der Denaturierungsbehandlung unterzogen wurde, wird entnommen und sofort 3 Minuten lang in ein Eis-Wasser-Gemisch getaucht.
  4. Hybridisierungsreaktion
    1. Nehmen Sie das Hybridisierungsreaktionsgemisch aus dem Eisbad, pipettieren Sie es 2x mit einer Mikropipette auf und ab, um es gleichmäßig zu mischen. Nachdem der weiße Flockungsniederschlag (falls vorhanden) verschwunden ist, geben Sie 13,5 μl des Hybridisierungsreaktionsgemisches durch das Ladeloch des Deckglases (wie in Abbildung 2C gezeigt), decken Sie die Hybridisierungsbox schnell ab und verschließen Sie sie (wie in Abbildung 2D gezeigt). Notieren Sie sich die Chipnummer, die Position des Microarrays und die entsprechende Probennummer.
      HINWEIS: Jedem Microarray kann nur eine Probe hinzugefügt werden.
    2. Stellen Sie die verschlossenen Hybridisierungsboxen sofort waagerecht in das auf 50 °C vorgewärmte Wasserbad mit konstanter Temperatur. Starten Sie den Timer auf 120 Minuten, nachdem alle Hybridisierungsboxen eingesetzt wurden.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen während des Ladevorgangs. Bei allen Schritten vom Beginn der Beladung bis zur Trocknung der Chips ist zu vermeiden, dass die Flüssigkeit auf den Chip-Microarrays über längere Zeit direkt der Luft ausgesetzt wird, um zu verhindern, dass der Chiphintergrund durch Trocknung zu hoch wird und die Ergebnisinterpretation beeinträchtigt.
  5. Waschen und Trocknen von Spänen
    1. Nachdem die Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist, nehmen Sie die Hybridisierungsboxen horizontal heraus, zerlegen Sie sie und nehmen Sie die Chips zum Waschen heraus. Legen Sie die Chips sofort auf den Schieber in den Behälter (z. B. ein Becherglas), der mit Chipswaschlösung I gefüllt ist, die auf Raumtemperatur (10-30 °C) ausgeglichen wurde. Waschen Sie sie bei einer Drehzahl von 80-100 U/min auf einem Schüttler mit konstanter Temperatur für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
    2. Waschen Sie die Chips mit Chip Washing Solution II äquilibriert auf Raumtemperatur bei einer Drehzahl von 80-100 U/min auf einem Schüttler mit konstanter Temperatur für 3 min bei Raumtemperatur.
    3. Die Chips in eine Zentrifuge geben und bei 100 × g bei Raumtemperatur 5 Minuten zentrifugieren. Scannen Sie sie nach dem Trocknen.
      HINWEIS: Lassen Sie die Chips nicht kollidieren oder aneinander reiben.

7. Chip-Scanning und Ergebnisinterpretation

HINWEIS: Verwenden Sie den Microarray-Chip-Scanner und die entsprechende Software, um Signale zu lesen und Ergebnisse zu interpretieren. In Tabelle 1 finden Sie auch abnormale Ergebnisse und Fehlerbehebung. Befolgen Sie diese Schritte, um zu arbeiten (siehe Benutzerhandbücher des Scanners und der Software).

  1. Schalten Sie den Scanner und die entsprechende Software ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Lasersteuerung , um ihn 10 Minuten lang vorheizen zu lassen.
  2. Geben Sie verschiedene Arten von Informationen zu den Proben ein, z. B. die Probennummer.
  3. Nachdem der Scanner mit dem Vorheizen fertig ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Auswerfen und platzieren Sie den Chip gleichmäßig auf dem kleinen Halterungsstück. Schieben Sie den Chip vorsichtig und horizontal in die Öffnung des Scannerfachs und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden .
  4. Geben Sie die Chipnummer ein, klicken Sie, um den Nachweisbereich auszuwählen (Microarray 1-4), und klicken Sie dann auf Probe auswählen , um die entsprechenden Proben für jeden Microarray auszuwählen. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Erkennung starten , um den Chip-Scan durchzuführen. Die Scanergebnisse werden auf dem Bildschirm angezeigt und automatisch gespeichert.
  5. Wiederholen Sie nach dem Scannen eines Chips die Schritte 7.3 und 7.4, um den nächsten Chip zu scannen. Gehen Sie wie folgt vor, bis alle Chips gescannt wurden.
  6. Verwenden Sie die Seite Datenabfrage , um Datenabfrage- und Druckvorgänge durchzuführen.
  7. Nachdem Sie alle Vorgänge abgeschlossen haben, schalten Sie zuerst den Laser aus, beenden Sie dann die Software und schalten Sie schließlich den Scanner aus.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Positive Ergebnisse
Für die Sonden der Gattung Mycobacterium (interne Kontrolle, IC) und Mycobacterium tuberculosis werden ihre positiven Ergebniswerte mit der Methode der Receiver Operating Characteristics (ROC) bestimmt. Für die Sonden, die zum Nachweis der anderen 16 NTM verwendet werden, werden ihre positiven Ergebniswerte durch die Perzentilmethode bestimmt.

Experimentelle Qualitätskontrolle
Das Nachweisergebnis des Positivkontroll...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die in dieser Arbeit vorgestellte DNA-Microarray-Chip-Methode kann Nukleinsäuren in klinischen Proben (einschließlich Sputum, Eiter, bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit und Punktionsflüssigkeit) von Patienten mit Verdacht auf Tuberkulose und nicht-tuberkulöse Mykobakteriose direkt nachweisen und die Zeit bis zur bestätigten Diagnose erheblich verkürzen. Die in dieser Studie vorgestellte DNA-Microarray-Chip-Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt bei der Ide...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das Fujian Provincial Natural Science Foundation Project (2024J011521) und das Quanzhou Science and Technology Plan Project (2024NY006) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % Natriumchlorid-Injektion (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Amplifikationsapparatur für angewandte BiosystemeThermo Fisher ScientificVeriti 96-Well-Thermocycler
CapitalBio LuxScan10K/BCapitalBioLuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24 CapitalBioSlideWasher 24 
  Zentrifuge Eppendorf5424RMaX.speed 15000 min-1
Hybridisierungs-Puffer
HybSet Gen-Microarray-Chip und -Abdeckung
Kit zur Identifizierung von Mycobacterium-SpeziesCapitalBio301030
Negativkontrollen, Positivkontrollen
Nukleinsäure-ExtraktorTIANLONGGeneRotex 96
Reagenz für PCR-Amplifikation
pH 6,8 PhosphatpufferShangHai yuanye BiotechnologieNr. R20029-10
Pipettieren und SpitzenThermo Scientific0,1 - 10 μm L, 2 - 20 μ L und 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA Nukleinsäure-Extraktions- oder AufreinigungskitTIANLONGqEx-DNA/RNA
SDSCapitalBio441060
Natriumhydroxid (NaOH)XILONGS  WissenschaftlichArtikel-Nr.: XK13-011-00027
SSCCapitalBio441050
thermostatisches WasserbadSURUIHH-W600

Referenzen

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Asymmetrische PCRHybridisierungsprinzipienMycobacterium tuberculosis Komplexnichttuberkul se Mykobakterienklinische Probenmolekulare DiagnostikSondenhybridisierung

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