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Methodenartikel

Evaluierung der rechtsventrikulären Funktion in experimentellen Modellen der pulmonalen arteriellen Hypertonie

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DOI:

10.3791/68248

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27. Juni 2025

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1Laboratory of Pulmonary Investigation, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Präsentation detaillierter Methoden zur Bewertung der Funktion des rechten Ventrikels wird die Qualität und Zuverlässigkeit der Forschung zur pulmonalen Hypertonie verbessern, einen robusten Rahmen für zukünftige Studien bieten und die Reproduzierbarkeit in verschiedenen Laboratorien verbessern.

Zusammenfassung

Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine chronische Erkrankung, die mit einem verminderten Überleben einhergeht, was sie zu einem wichtigen Forschungsgebiet macht. Experimentelle Modelle der PH haben unser Verständnis der Pathophysiologie erheblich verbessert und die Planung kleiner Beobachtungs- und klinischer Studien erleichtert. Es ist jedoch von entscheidender Bedeutung, standardisierte Methoden zu etablieren, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen experimentellen Studien und Forschungsgruppen zu gewährleisten. Die Standardisierung verbessert nicht nur die Reproduzierbarkeit, sondern fördert auch die Zusammenarbeit zwischen den Forschungsteams.

In diesem Video skizzieren wir die methodischen Schritte, die erforderlich sind, um die funktionalen Parameter der PH genau zu analysieren. Dazu gehören die echokardiographische Untersuchung, die invasive Punktion des rechten Ventrikels (RV) und die Berechnung des Fulton-Index. Im Bereich der Echokardiographie wird die Messung der pulmonalarteriellen Beschleunigungszeit und des pulmonalen Ejektionszeitverhältnisses sowie die Berechnung der RV-Ausgabe ausführlich vorgestellt. In Bezug auf invasive Messungen werden wesentliche Verfahren beschrieben, einschließlich Anästhesieprotokolle, optimale Tierpositionierung, Einrichtung der mechanischen Beatmung, präzise Öffnung der Brustwand, Visualisierung des RV und RV-Punktionstechniken.

Die Methodik der ventrikulären Dissektion (Fulton-Index) wird ausführlich erläutert, ebenso wie die Berechnung des Verhältnisses RV/linker Ventrikel plus Septum, korrigiert um das Körpergewicht des Tieres. Wir glauben, dass eine detaillierte Präsentation dieser Methoden die Qualität und Zuverlässigkeit der PH-Forschung verbessern wird, indem sie einen robusten Rahmen für zukünftige Studien bietet und die Reproduzierbarkeit in verschiedenen Labors verbessert.

Einleitung

Eine adäquate funktionelle Messung der Funktion des rechten Ventrikels (RV) bei Kleintieren ist seit der Zunahme von Studien mit Tiermodellen in den Atemwegs- und Herz-Kreislauf-Wissenschaften unerlässlich geworden. Es gibt mehrere Tiermodelle für pulmonale Hypertonie (PH), die Monocrotalin1, Hypoxie2 oder Sugen + Hypoxie3 verwenden. Sie haben sich gut bewährt, um neue pathophysiologische Signalwegezu entschlüsseln 1,4 und neue potenzielle pharmakologische5 und nicht-pharmakologische6 Behandlungen für PH zu untersuchen. Trotz des Erregers, der zum PH-Phänotyp führt, gibt es jedoch Bedenken hinsichtlich der funktionellen Messung der RV-Leistung, vor allem, weil die RV-Funktion in der Regel (1) das primäre Ergebnis ist, das in präklinischen Studien angenommen wurde7; (2) verschiedene Arten von Geräten stehen zur Verfügung, um eine Echokardiographie und eine invasive Punktion der RV-Kammer durchzuführen; (3) Fachwissen in der Anästhesie und einige Kenntnisse über die invasive mechanische Beatmung bei Kleintieren sind erforderlich, ebenso wie das Erkennen eines adäquaten Zeitfensters für die Beurteilung von RV.

Gemäß den 3R präklinischer Studien (Replacement, Reduction und Refinement) ist die Reduktion darauf ausgerichtet, Methoden zu erweitern, die dazu beitragen, ein vergleichbares Informationsniveau zu erhalten, was die Reproduzierbarkeit erhöht8. So wird die Anzahl der Tiere in der Forschung vor allem durch Strategien wie geeignete Versuchsplanung, korrekte statistische Auswertung und den Austausch von Praxis und Wissen reduziert. In der vorliegenden methodischen Studie werden drei verschiedene Techniken nach PAH-Induktion vorgestellt (Abbildung 1). Die erste ist die nicht-invasive Messung der RV-Funktion durch transthorakale Echokardiographie. Die Bilder stammen aus langen und kurzen Ansichten der parasternalen Achse. Der Durchmesser des RV-Ausgangstrakts, die pulmonale Beschleunigungszeit (PAT) und die pulmonale Ejektionszeit (PET) werden mit Hilfe eines Pulswellendopplers bestimmt. Das PAT/PET-Verhältnis wird berechnet und als indirekter Index der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) verwendet9,10. Die zweite ist die invasive Punktion des Wohnmobils. In der Regel wird ein physiologisches Datenerfassungssystem verwendet, das kontinuierlich auf einem Computer aufzeichnet, auf dem eine maßgeschneiderte Software ausgeführt wird. Der invasive rechtsventrikuläre systolische Druck (RVSP) und der mittlere pulmonalarterielle Druck werden in verschiedenen Studien häufig als primäre Endpunkte herangezogen7. Der dritte ist der rechtsventrikuläre Hypertrophieindex, auch Fulton-Index11 genannt, der das Verhältnis des RV zum linken Ventrikel (LV) plus des interventrikulären Septums (S) (RV/LV + S) darstellt, korrigiert um das Körpergewicht des Tieres. Die Präsentation detaillierter Methoden zur Bewertung der RV-Funktion wird die Qualität und Zuverlässigkeit der PH-Forschung verbessern, einen robusten Rahmen für zukünftige Studien bieten und die Reproduzierbarkeit in verschiedenen Laboratorien verbessern.

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Abbildung 1: Flussdiagramm. Zusammenfassende Darstellung der in diesem Artikel beschriebenen Protokolle. Abkürzungen: ECHO = Echokardiographie; LV = linker Ventrikel; PAH = pulmonale arterielle Hypertonie; RV = rechter Ventrikel; RVH = rechtsventrikuläre Hypertrophie; RVSP = rechtsventrikulärer systolischer Druck; S = interventrikuläres Septum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren (CEUA) der Bundesuniversität Rio de Janeiro unter der Verfahrensnummer 043/22 genehmigt. Alle Verfahren entsprachen den Grundsätzen der Labortierhaltung und dem Leitfaden der US National Academy of Sciences für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Studie folgte den ARRIVE-Leitlinien11.

1. Vorbereitung der Tiere und Versuchsprotokoll

  1. Berechnen Sie die Anzahl der Tiere wie zuvor gemeldet12.
    ANMERKUNG: Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Unterschiede im RVSP zwischen CTRL und PAH eine Effektstärke von d = 3,95 erreichten, unter der Annahme eines Stichprobengrößenverhältnisses von 1 und einer statistischen Aussagekraft (1-β = 0,8), um signifikante Unterschiede (α = 0,05) zu identifizieren, waren in diesem Protokoll drei Tiere pro Gruppe erforderlich.
  2. Randomisieren Sie (sechs) männliche Wistar-Ratten (220 ± 10 g), die eine intraperitoneale (i.p.) Injektion von Monocrotalin (60 mg/kg; PAK-Gruppe, n = 3) oder Kochsalzlösung (1 ml/kg; STRG-Gruppe, n = 3).
  3. Messen Sie am 28. Tag die kardiovaskulären Parameter und euthanasieren Sie die Tiere durch Exsanguination durch eine Durchtrennung der Bauchaorta.

2. Echokardiographie

  1. Einrichtung des Elektrokardiographie-Systems
    1. Überprüfen Sie, ob das Netzkabel ordnungsgemäß an das Gerät und die Steckdose angeschlossen ist. Drücken Sie die POWER-Taste auf dem Bedienfeld einige Sekunden lang, bis das System startet.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Wandler richtig angeschlossen ist.
    3. Wählen Sie PATIENT aus der Datenbank aus, um die Tier-ID zu registrieren und den Vorgang zu starten.
    4. Schalten Sie den Schallkopf aus, indem Sie die Gefriertaste (figure-protocol-1) auf dem Bedienfeld drücken, während Sie das Tier vorbereiten, um die Lebensdauer des Geräts zu erhalten.
  2. Elektrokardiographie-Verfahren
    1. Konfigurieren Sie das Anästhesiegerät mit 2,5 % Isofluran und 1 l/min Sauerstoffentladung.
    2. Legen Sie das Tier in die Kammer des Anästhesiegeräts. Sobald das Tier sediert ist, positionieren Sie das Tier in Rückenlage, befestigen Sie die oberen Pfoten mit Klebeband auf dem Operationstisch und befestigen Sie die Maske der Anästhesiegerätemaske an der Schnauze des Tieres. Um zu vermeiden, dass das Tier geweckt wird, stellen Sie sicher, dass Sie die Umschalttaste des Anästhesiegeräts von KAMMER auf MASKE ändern.
      1. Beurteilen Sie den Grad der Anästhesie durch die Bewertung des Pupillendurchmessers, der Position und der Reaktion auf Licht; Position der Nickmembran; und Bewegung als Reaktion auf die Stimulation des Schwanzes. Beginnen Sie die Experimente, wenn die Reaktionen auf einen Geräuschreiz (Handclap) sowie die Whisker-Stimulation und die Reaktion der Schwanzklemme fehlen13.
    3. Verwenden Sie einen Mullverband mit Waschmittel und Wasser, um das Fell auf der Brust des betäubten Tieres zu befeuchten. Rasieren Sie das Fell von der Brust des Tieres mit einer Rasierklinge, die an der Kelly-Pinzette befestigt ist. Tragen Sie eine großzügige Menge leitfähiges Gel auf die Brust des Tieres auf.
    4. Drücken Sie die 2D-Taste auf dem Bedienfeld.
    5. Platzieren Sie den Schallkopf zwischen dem dritten und fünften Interkostalraum, um die kurze Achse zu erfassen. Richten Sie den Schallkopf auf die linke Schulter des Tieres (90°-Winkel in Bezug auf das Brustbein) und nehmen Sie ein Querschnittsbild auf Höhe der Herzbasis auf, das eine Visualisierung des RV, der Aortenklappe, der Pulmonalklappe und des linken Vorhofs ermöglicht (Abbildung 2A).
    6. Drücken Sie die Freeze-Taste (figure-protocol-2) auf dem Bedienfeld , um das Bild einzufrieren, und drücken Sie die Speichern-Taste (figure-protocol-3) auf dem Bedienfeld , um das Bild zu speichern.
    7. Wenn der richtige Winkel gefunden wurde, bleiben Sie in dieser Position und drücken Sie die Pulswellentaste (PW) auf dem Bedienfeld , um den gepulsten spektralen Dopplermodus zu erhalten (Abbildung 2B).
    8. Bewegen Sie mit dem Trackball auf dem Bedienfeld den gelben Cursor (links oder rechts/oben oder unten) auf einem Bildschirm und positionieren Sie ihn über der Pulmonalklappe.
    9. Drücken Sie die fünf Tasten (5) auf dem Bedienfeld , um die Blutflusskurve durch die Pulmonalklappe zu erhalten.
      KRITISCHER SCHRITT: Um ein gutes Bild zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die Kurve intensiv weiß und die Akustik laut und klar ist.
    10. Positionieren Sie den Schallkopf zwischen dem dritten und fünften Interkostalraum, um die Längsachse zu erfassen. Richten Sie den Schallkopf auf die rechte Schulter des Tieres (45°-60°-Winkel in Bezug auf das Brustbein) und nehmen Sie ein Bild des Längsschnitts auf, das eine Visualisierung des linken Ventrikels, des rechten Ventrikels, des linken Vorhofs, der Mitralklappe und der Aortenklappe ermöglicht (Abbildung 2C).
    11. Drücken Sie die Freeze-Taste (figure-protocol-4) auf dem Bedienfeld , um das Bild einzufrieren, und drücken Sie die Speichern-Taste (figure-protocol-5) auf dem Bedienfeld , um das Bild zu speichern.
    12. Drücken Sie die Taste END EXAM auf dem Bedienfeld , um das Experiment zu beenden und die Bilder in der Patientendatenbank zu speichern.
  3. Datenanalyse
    1. Einrichtung des Elektrokardiographie-Systems:
      1. Überprüfen Sie, ob das Netzkabel ordnungsgemäß an das Gerät und die Steckdose angeschlossen ist. Drücken Sie die POWER-Taste einige Sekunden lang, bis das System startet.
      2. Wählen Sie auf einem Bildschirm SUCHEN und wählen Sie die entsprechende Tier-ID aus der Datenbank aus, um die Analyse zu starten.
      3. Drücken Sie die SONOVIEW-Taste auf dem Bedienfeld. Klicken Sie einmal innerhalb des Bildes auf einem Bildschirm, um die Analyse zu starten.
        HINWEIS: Das Bild wird durch eine gestrichelte Linie begrenzt. Diese Linie muss durchgehend sein, nachdem Sie geklickt haben, um die Analyse zu starten.
      4. Wählen Sie mit dem Trackball das Bild mit kurzer Achse im Pulswellen-Spektraldopplermodus in der rechten Ecke des Bildschirms aus.
      5. Drücken Sie die Taschenrechnertaste (figure-protocol-6) auf dem Bedienfeld und wählen Sie den Parameter Herzfrequenz (HF) auf einem Bildschirm aus. Positionieren Sie mit dem Trackball die Cursorlinie von Spitze zu Spitze von zwei Kurven. Wiederholen Sie dies dreimal, um den Durchschnittswert zu erhalten.
      6. Drücken Sie die Taschenrechnertaste (figure-protocol-7) auf dem Bedienfeld; wählen Sie auf dem Bildschirm den Parameter Pulmonalventil (PV) und danach den Parameter Pulmonalventil-Beschleunigungszeit (PV AccT/ET). Positionieren Sie die Cursorlinie mit dem Trackball vom Anfang bis zum Höhepunkt der Kurve. Positionieren Sie dann die Linie vom Anfang bis zum Ende derselben Kurve. Führen Sie diesen Vorgang dreimal aus, um den Durchschnittswert zu erhalten (Abbildung 3A).
      7. Speichern Sie die Daten, indem Sie auf der Systemsteuerung auf die Schaltfläche Speichern (figure-protocol-8) klicken.
      8. Wählen Sie mit dem Trackball das Bild mit der langen Achse in der rechten Ecke des Bildschirms aus.
      9. Drücken Sie die Taschenrechnertaste (figure-protocol-9) auf dem Bedienfeld, wählen Sie auf dem Bildschirm den Parameter rechtsventrikulärer Ausflusstrakt (RVOT) und danach den Parameter rechtsventrikulärer Ausflusstrakt (RVOT DIAM). Positionieren Sie den Cursor mit dem Trackball von einer Wand des Wohnmobils zur anderen Wand. Führen Sie diesen Vorgang dreimal aus, um den Durchschnittswert zu erhalten (Abbildung 3B).
      10. Speichern Sie die Bilder mit Daten, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern (figure-protocol-10) auf dem Bedienfeld klicken.
      11. Übertragen Sie die Bilder auf die externe Festplatte. Wählen Sie auf einem Bildschirm SUCHEN und die entsprechende Tier-ID aus der Datenbank. Wählen Sie auf einem Bildschirm EXPORTIEREN und wählen Sie die externe Festplatte aus.

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Abbildung 2: Parasternales Fenster der transthorakalen Echokardiographie. Schematische Darstellung der Position des Schallkopfs für die Aufnahme von Schnittbildern und ein repräsentatives Bild der kurzen Achse im (A) 2D-Modus und (B) im Pulswellen-Spektral-Doppler-Modus sowie der (C) langen Achse. Abkürzungen: Ao = Aorta; AV = Aortenklappe; STRG = Steuerung; LA = linkes Atrium; LV = linker Ventrikel; MV = Mitralklappe; PAH = pulmonale arterielle Hypertonie; RA = rechter Vorhof; RV = rechter Ventrikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Transthorakale Echokardiographie-Datenanalyse. (A) Repräsentatives Bild der Position der gestrichelten Linie zur Berechnung des PAT/PET-Verhältnisses und (B) Repräsentatives Bild der Position des Konnektors zur Analyse des Ausflussdurchmessers des rechten Ventrikels. Abkürzungen: HR = Herzfrequenz; PAT = Beschleunigungszeit der Lungenarterie; PET = pulmonale Auswurfzeit; PV AccT = Beschleunigungszeit des Pulmonalventils; PV ET = Auswurfzeit des Pulmonalventils; PV AccT/ET = Verhältnis von Beschleunigungszeit des Pulmonalventils zu Auswurfzeit des Pulmonalventils; RVOT Diam = Durchmesser des rechtsventrikulären Ausflusstrakts; RVOT-Fläche = Fläche des rechtsventrikulären Ausflusstrakts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Rechtsventrikulärer systolischer Druck

  1. Vorbereitung des rechtsventrikulären systolischen Drucks
    1. Beatmungsgerät: Stellen Sie am Beatmungsgerät die folgenden Parameter ein: Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs (FiO 2 ), 21 %; Atemzugvolumen, 8 ml/kg; Atemfrequenz, 70 Schläge pro Minute; und positiver endexspiratorischer Druck (PEEP), 3 cmH2O.
    2. Monitor und Signalgeber: Verbinden Sie das für die Punktion verwendete 19 G Kopfvenen-Set mit einem Monitor, damit der Druck sichtbar gemacht werden kann.
    3. Verfahren zur Nullstellung des Druckwandlers des mehrkanaligen physiologischen Rekorders:
      1. Schließen Sie den Druckmessumformer an das entsprechende hämodynamische Kabel und den Kanal des Multiparameter-Monitors an.
      2. Richten Sie sowohl den Druckaufnehmer als auch die Endspitze der Kopfhautvene auf einer ähnlichen Höhe des Thorax des Tieres aus.
      3. Drücken Sie die Nulltaste im Multiparameter-Bildschirm. Bewegen Sie die Kopfhautvene, die mit dem Druckmesskopf verbunden ist, nach oben und unten und prüfen Sie, ob die Werte ansteigen bzw. fallen.
        KRITISCHER SCHRITT: Das Kopfhautvenenset muss mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt werden, um eine ordnungsgemäße Signalübertragung zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen in der Leitung, um Signalstörungen zu vermeiden.
    4. Kalibrierverfahren für den Druckmesskopf des physiologischen Mehrkanal-Rekorders: Prüfen Sie mit einem externen und analogen Blutdruckmessgerät, ob der im Druckmesskopf ausgeübte Druck dem auf dem Bildschirm des Multipameter-Monitors beobachteten Druck entspricht. Wenn nicht, passen Sie die Kanalverstärkung an.
    5. Stellen Sie für einen Computer mit einem offenen dedizierten Erfassungssystem die Software wie folgt ein:
      1. Öffnen Sie das Programm, und klicken Sie auf dem Bildschirm auf DataAcquisitionSystem . Dadurch öffnet sich das Fenster, in dem das Drucksignal überwacht werden kann.
      2. Klicken Sie in diesem Fenster auf den weißen Pfeil auf einem Bildschirm in der oberen linken Ecke.
      3. Es erscheint ein Pop-up-Fenster, in dem Sie zur Konfiguration aufgefordert werden. Klicken Sie auf OK.
      4. Wechseln Sie im neuen Fenster zu Physischer Kanal, und klicken Sie auf Durchsuchen.
      5. Wählen Sie mit der STRG-Taste auf einer Tastatur alle Kanäle außer "ai7" aus, und klicken Sie auf "OK".
      6. Unter Physischer Kanal finden Sie weitere Informationen unter Konfiguration des Eingangsterminals auf Standard festgelegt. Verwenden Sie die seitlichen Pfeile, um es in RSE zu ändern, und klicken Sie dann auf OK.
      7. Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die Signalerfassung überprüft und die Basislinie kalibriert werden kann. Drücken Sie auf Konfiguration laden, wählen Sie die entsprechende Konfigurationsdatei aus, und drücken Sie dann auf der rechten Seite des Fensters Signale laden .
      8. Warten Sie 5-10 s, bis das Signal auf dem Bildschirm erscheint. Sobald es sichtbar ist, klicken Sie auf Signal 0, wählen Sie Signal 6 und klicken Sie dann auf Nullbasislinie.
      9. Navigieren Sie zum Dateiverzeichnis, und wählen Sie den Speicherort aus, an dem die Daten während des Experiments gespeichert werden sollen. Klicken Sie in der unteren rechten Ecke auf Aktueller Ordner .
      10. Nachdem alle Parameter in der Software eingestellt sind, klicken Sie auf OK. Kehren Sie zum Hauptfenster des Programms zurück und klicken Sie auf Erwerben. Das Programm beginnt mit der Signalerfassung.
      11. Wählen Sie in der unteren rechten Ecke das Signal entsprechend der Konfiguration aus (Signal 6).
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Signal auf dem Computermonitor mit dem Signal auf dem Schallkopfmonitor übereinstimmt und schwankt, wenn der Kopfhautvenensatz bewegt wird. Wenn nicht, beheben Sie die Signalübertragung, bevor Sie fortfahren.
  2. Rechtsventrikuläres systolisches Druckverfahren
    1. Nach der Echokardiographie ist eine i.p. Kombination aus 87,5 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin zu verabreichen, um das Tier zu betäuben.
    2. Sobald das Tier sediert ist, verabreichen Sie 400 μl Lidocain subkutan (s.c.) in die Trachealregion.
  3. Tracheostomy
    1. Sobald das Tier sediert ist, bringen Sie es in Rückenlage und befestigen Sie die oberen Pfoten mit Klebeband auf dem Operationstisch an einer Wärmequelle, um die Körpertemperatur zu halten (z. B. auf einem beheizten Operationstisch).
    2. Reinigen Sie den Halsbereich mit 70% Alkohol. Verwenden Sie dann einen Mullverband mit Waschmittel und Wasser, um das Fell am Hals des betäubten Tieres zu befeuchten. Rasieren Sie das Fell vom Hals des Tieres mit einer Rasierklinge, die an der Kelly-Pinzette befestigt ist.
    3. Machen Sie einen Schnitt in die Haut mit einer Gewebezange mit Zähnen und Schere.
    4. Legen Sie die Luftröhre frei, indem Sie die Unterkieferdrüse zurückziehen und die umgebenden Muskeln mit einer Gewebezange mit Zähnen und einer gebogenen Kelly-Pinzette stumpf präparieren.
    5. Führen Sie vorsichtig eine Nahtlinie mit einer gebogenen Kelly-Pinzette unter die Luftröhre.
    6. Heben Sie die Luftröhre mit den losen Enden der Nahtlinie vorsichtig an, um sie besser sichtbar zu machen, und machen Sie mit einer Skalpellklinge einen kleinen Schnitt zwischen zwei Knorpelringen. Seien Sie vorsichtig mit den Knorpelringen, um ein Durchtrennen des Kehlkopfes zu vermeiden.
    7. Führen Sie die Trachealkanüle vorsichtig mit der abgeschrägten Spitze nach unten ein und drehen Sie sie nach der korrekten Positionierung nach oben, wobei Sie etwa fünf Ringe, aber nicht tiefer vorrücken.
      HINWEIS: Wenn die Tracheostomiekanüle Schleim enthält, muss dieser mit einer Spritze ausgeatmet werden, bevor er an das Beatmungsgerät angeschlossen wird.
    8. Befestigen Sie die Kanüle mit der Nahtlinie und stellen Sie sicher, dass sie an Ort und Stelle bleibt.
    9. 2 mg/kg Pancuroniumbromid verabreichen, um das Muskeltier zu lähmen.
      HINWEIS: Pancuroniumbromid kann intravenös über einen Schwanzvenenkatheter oder intraperitoneal injiziert werden.
    10. Schließen Sie das Tier an das Beatmungsgerät an, das im volumengesteuerten Beatmungsmodus getestet und konfiguriert wurde.
    11. Nachdem das Tier tracheotomiert und an das Beatmungsgerät angeschlossen ist, legen Sie das Herz frei.
  4. Katheterisierung
    1. Reinigen Sie den Brustbereich mit 70% Alkohol. Verwenden Sie dann einen Mullverband mit Waschmittel und Wasser, um das Fell auf der Brust des betäubten Tieres zu befeuchten. Rasieren Sie das Fell von der Brust des Tieres mit einer Rasierklinge, die an der Kelly-Pinzette befestigt ist.
    2. Um die Brusthöhle zu öffnen, machen Sie einen Einschnitt in die Haut von der Basis des Xiphoid-Processus aus, der etwa 0,5 cm unterhalb der Tracheostomiestelle stoppt.
    3. Schneiden Sie die inneren und äußeren Interkostalmuskeln durch, um die Rippen und das Brustbein freizulegen.
    4. Legen Sie das Herz frei, indem Sie das Brustbein mit einer Schere durchtrennen, und verwenden Sie eine Kelly-Pinzette, um jede Seite der Brusthöhle zu halten, um einen besseren Zugang zum Wohnmobil zu ermöglichen.
      HINWEIS: Schneiden Sie immer entlang des Brustbeins, um übermäßige Blutungen zu minimieren, die die Sicht beeinträchtigen könnten.
    5. Das Herz ist vom Perikard bedeckt. Entfernen Sie diese dünne Membran mit einer Pinzette, so dass die Herzkammern differenziert werden können.
    6. Nachdem das Tier trachealisiert und an das Beatmungsgerät angeschlossen wurde und das Herz freigelegt ist, fahren Sie mit der rechtsventrikulären Punktion fort.
    7. Stellen Sie sicher, dass der Computer eingeschaltet ist, LabView geöffnet ist und die Baseline für die Signalerfassung konfiguriert ist, bevor Sie das RVSP bewerten. Lokalisieren Sie das RV und verwenden Sie den interventrikulären Ast der Koronararterien als Referenz. Dieser Ast ist sichtbar und zeigt die Position des interventrikulären Septums an, das den rechten und den linken Ventrikel trennt.
    8. Überprüfen Sie in der Software, ob die Signalerfassung gestartet wurde. Klicken Sie auf einem Bildschirm auf die Schaltfläche Speichern und geben Sie die ID des Tieres ein.
    9. Mit dem mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllten 19 G Kopfhautvenen-Set etwas oberhalb des Referenzpunkts punktieren und darauf achten, dass die Nadel nicht zu tief eingeführt wird.
      KRITISCHER SCHRITT: Ein übermäßiges Einführen der Nadel könnte den linken Ventrikel durchstechen und einen Druck erzeugen, der nichts mit der Lungenarterie zu tun hat.
    10. Überprüfen Sie die Genauigkeit der Punktion anhand der erhaltenen Druckwerte: RVSP bei Kontrolltieren, 10-20 mmHg; RVSP bei Tieren mit pulmonaler arterieller Hypertonie bis zu 60 mmHg; Der erfasste Druck >80 mmHg deutet darauf hin, dass die Kanüle wahrscheinlich den linken Ventrikel erreicht hat (Abbildung 4B).
    11. Zeichnen Sie mindestens 10 stabile Druckwellenspitzen auf, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
    12. Am Ende der Signalerfassung ist dem Tier Heparin zur Blutentnahme durch Punktion des linken Ventrikels oder der Bauchvene mit einer heparinisierten Spritze zu verabreichen.
      HINWEIS: Heparin kann intravenös durch einen Schwanzvenenkatheter oder direkt in den linken Ventrikel injiziert werden.
    13. Nach der Blutentnahme wird das Tier durch Ausblutung eingeschläfert, indem die Bauchvene durchtrennt wird, und fahren Sie mit der Organentnahme zur weiteren Analyse fort.
    14. Speichern Sie das Signal in dem Dateiverzeichnis, das zu Beginn des Experiments ausgewählt wurde. Übertragen Sie die Bilder auf die externe Festplatte, indem Sie die Dateien im Computerordner auswählen und die .bin Dateien auf eine externe Festplatte kopieren und einfügen.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Überprüfen Sie den Routinecode, der in MATLAB verwendet wird, um das Wandlersignal für RVSP zu analysieren (Ergänzende Datei 1). Es wurde auf der Grundlage der Bedürfnisse dieses Forschungsprojekts entwickelt.

  1. Öffnen Sie das Programm, klicken Sie auf dem MATLAB-Bildschirm auf die Schaltfläche Nach Einfügen suchen (figure-protocol-13) und wählen Sie die Datei auf der internen Festplatte des Computers aus, die den entsprechenden Code enthält.
  2. Beobachten Sie in der linken Ecke des MATLAB-Bildschirms die Liste der Dateien, die die Codes für jeden Kanal enthalten, der vom Wandler erkannt wird.
  3. Wählen Sie den Code für die Kanalkonfiguration aus, der zu Beginn des Experiments ausgewählt wurde, um das Signal zu erkennen (Kanal 6).
  4. Drücken Sie die Run-Taste (figure-protocol-14) und wählen Sie die .bin Datei auf der externen Festplatte aus, die analysiert werden soll.
    KRITISCHER SCHRITT: Ändern Sie in der unteren rechten Ecke den Archivtyp von Alle MATLAB-Dateien in Alle Dateien, da sonst die .bin Dateien nicht angezeigt werden.
  5. Wählen Sie den besten Bereich der Kurve aus, indem Sie einmal am Anfang und einmal am Ende klicken. Der beste Bereich ist der mit den homogensten Kurven, wobei Spitzen und Täler visuell gleich sind (Abbildung 4A).
  6. Wählen Sie 10 s der Kurve aus, indem Sie einmal auf den Anfang (0 s) und einmal auf das Ende (10 s) klicken (Abbildung 4A).
    HINWEIS: Die X-Achse stellt die Zeit in Sekunden und die Y-Achse den Druck in mmHg dar.
  7. Passen Sie die Grundlinie an, indem Sie den niedrigsten Talwert im Befehlsfenster subtrahieren und die EINGABETASTE auf der Tastatur drücken. Die Software generiert alle Daten automatisch (Abbildung 4A).
  8. Beachten Sie die Daten, die in zwei Spalten dargestellt werden. Der erste ist der Zeitpunkt des Peaks und der zweite ist der Wert des Peaks (Druck).
    HINWEIS: Die aus der Punktion erhaltenen Kurven stellen den systolischen (Spitzen-) und diastolischen (Tal-) Druck des RV dar. Die MATLAB-Analyse zeigt beide Werte an.
  9. Kopieren Sie die Daten des systolischen Drucks, fügen Sie sie in eine .txt Datei ein und löschen Sie die Werte, die sich auf die Zeit beziehen.
  10. Ändern Sie alle Punkte in der .txt Datei in Kommas, um den Durchschnitt zu erhalten.
  11. Wählen Sie 10 Spitzendruckwerte aus und mitteln Sie diese.

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Abbildung 4: Analyse des rechtsventrikulären systolischen Drucks. (A) Repräsentative Bilder der Schritte zur Auswahl von Bereichen der Kurve während der Analyse. (B) Das Beispiel einer Kurve zeigt einen Peak von etwa 80 mmHg, was darauf hindeutet, dass die Punktion tief genug war, um den linken Ventrikel zu erreichen. Nach sanftem Zurückziehen erreichte es die rechte Herzkammer. Es ist möglich, dies in der Kurve zu sehen, die im ersten Schritt erscheint. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Rechtsventrikulärer Hypertrophie-Index

  1. Verfahren
    1. Messen Sie zu Beginn des Versuchsprotokolls das Körpergewicht des Tieres.
    2. Nach der Messung des RVSP wird das Tier durch Ausblutung eingeschläfert und die Organe aus der Brusthöhle en bloc entfernt, um das Herz des eingeschläferten Tieres zu trennen.
    3. Präparieren Sie die Gefäße an der Basis des Herzens (Aorta, Lungenarterie, Hohlvene und Lungenvenen).
      KRITISCHER SCHRITT: Achten Sie darauf, dass Sie die rechte und linke Ohrmuschel nicht präparieren.
    4. Trocknen Sie das Herz mit Gaze und notieren Sie das Gewicht des trockenen ganzen Herzens, gemessen auf der Präzisionswaage.
    5. Sezieren Sie den linken und rechten Vorhof und verwerfen Sie sie.
    6. Trennen Sie das Wohnmobil von dem LV, das dem S zugeordnet ist.
    7. Trocknen Sie jedes Bauteil, präparieren Sie es mit Gaze und notieren Sie das Gewicht des RV und LV + S separat gemessen auf der Präzisionswaage.
  2. Datenanalyse
    1. Berechnen Sie den rechtsventrikulären Hypertrophieindex als Fulton-Index, der die Beurteilung der RV-Hypertrophie ermöglicht, indem das Gewicht der RV-freien Wand mit dem Gewicht der LV + S-Wände verglichen wird, korrigiert durch das Körpergewicht:
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      HINWEIS: Fulton-Index bei Kontrolltieren bis zu 0,4 mg; Fulton-Index bei Tieren mit PAH, >0,4 mg.

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Ergebnisse

Für die statistischen Analysen wurde jede Variable mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalität und Varianz getestet. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Der ungepaarte t-Test wurde verwendet, um die Partikelkonzentrationen in der Kontrollgruppe (CTRL) und der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) (p<0,05) zu vergleichen.

Echokardiographische Veränderungen im Tiermodell der PAH
Abbildung 4 zeigt, dass d...

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Diskussion

PAH ist eine fortschreitende Erkrankung, die durch einen übermäßigen Gefäßumbau gekennzeichnet ist, der eine Erhöhung des pulmonalen Gefäßwiderstands fördert, was zu einer erhöhten RV-Nachlast führt14. Dementsprechend stellt der RVSP eine funktionale Variable dar, die direkt mit dem Schweregrad von PAH15 korreliert. Im Laufe der Zeit ist die adaptive Reaktion des RV eine kompensatorische konzentrische Hypertrophie (gemessen am Fulton-Index)...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Herrn André Benedito da Silva für die Unterstützung bei den Experimenten, Frau Verônica Cristina dos Santos Lima für die Tierpflege und Frau Lorna O'Brien für die Überarbeitung der englischen Grammatik. Diese Studie wurde von der Rio de Janeiro State Research Foundation unterstützt (FAPERJ E-26/202.766/2018, E-26/010.001488/2019).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
Alkohol 70%MontenegroALC70-001
Leitfähiges GelMercorCG-002
Kochsalzlösung (NaCl 0,9%)BioPharmaSAL-009
Instruments
19 G Kopfhautvenen-SetDescarpackSVS-19G
Gebogene Kelly-PinzetteABC instrumentos cirurgicosCKF-003
Kelly-PinzetteABC instrumentos cirurgicosKF-004
Nadeln (18, 22 und 26 G)DescarpackNDL-MIX
PetrischaleGlassLabPD-150
RasierklingeABC instrumentos cirurgicosRB-005
SkalpellABC instrumentos cirurgicosSC-006
SchereABC instrumentos cirurgicosSCIS-007
NahtleitungABC instrumentos cirurgicosSUT-008
Spritzen (1, 3 und 5 mL)DescarpackSYR-135
TracheostomiekanüleMedTechTC-010
PinzetteABC instrumentos cirurgicosTWZ-011
Drugs
Dextroketaminhydrochlorid 5%Cristá liaDXT-00587,5 mg/kg intraperitoneales
Isofluran 1 ml/ml 240 mLCrist&aakut; liaISO-2402,5%ige Inhalationslösung
Lidocainhydrochlorid 1%Cristá liaLID-001400 µ L subkutan lokal
MonocrotalinSigma-AldrichC240160 mg/kg intraperitoneales
Pancuroniumbromid 2 mg/mlCrist&aakut; liaPAN-0022 mg/kg intravenös
Natriumheparin 5000 I.E./mlCrist&aakute; liaHEP-5000verdünnt 1:4 in 1 mL
Xylazinhydrochlorid 2%SyntecXYL-00212,5 mg/kg intraperitoneal
Equipment
GraphPad Prism 9GraphPad Software, IncGP9
Vernetzter Multiparameter-Veterinärmonitor LifeWindow 9xDigicare TiergesundheitLW9x
LabView-SoftwareNational Instruments, Corp.LV-2019
MATLAB R2019a (Version) SoftwareThe MathWorks, Inc.MATLAB-2019
Monitor und SignalgeberMedTechMST-015
PräzisionswaageSartoriusPS-020
R540 Mäuse & Rattentier AnästhesiegerätRWD Life Schience Co., LTDR540-ANA
ScaleOhausSCL-025
Servo-i mechanisches Beatmungsgerät Getinge ABSERVO-IFiO2 = 21%; Tidalvolumen = 8 ml/kg, Atemfrequenz = 70 bpm und PEEP = 3 cmH2O
SonoView-SoftwareSONOTEC Ultraschallsensorik Halle GmbHSV-2020
UGEO HM70A System Samsung Eletrô nica da Amazô nia LTDAHM70A
G*Power 3.1.9.7Universität Dü sseldorf, Deutschlandgpower

Referenzen

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