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Methodenartikel

Einsatz von Ganzzell-Biosensoren zur Messung von ionischem Quecksilber in Wasserproben

641 Ansichten

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DOI:

10.3791/68257

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3. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel werden Protokolle für die Verwendung von zwei Ganzzell-Biosensoren (Mer-Blue und Mer-RFP) zum Nachweis von ionischem Quecksilber vorgestellt. Durch die Bereitstellung detaillierter Verfahren für ihren Betrieb und ihre Ergebnisanalyse zielt die Studie darauf ab, eine breitere Einführung und Weiterentwicklung dieser Technologien zur Überwachung spezifischer Schadstoffe zu erleichtern.

Zusammenfassung

Ganzzell-Biosensoren (WCBs) sind instrumentelle Plattformen für die Entdeckung und Charakterisierung regulatorischer Elemente und die Weiterentwicklung des Bioengineerings. Sie sind auch vielversprechend für die Umwelt- und Lebensmittelüberwachung. Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um ihre Empfindlichkeit und Portabilität zu verbessern, ist die Standardisierung ihrer Handhabung und Datenanalyse noch relativ unterentwickelt. Dieser Artikel enthält einen umfassenden Leitfaden für die Verwendung von zwei kürzlich entwickelten WCBs, Mer-Blue und Mer-RFP, die nachweislich in der Lage sind, ionisches Quecksilber in Konzentrationen unterhalb der Trinkwassergrenzwerte der Weltgesundheitsorganisation zu erkennen. Die hierin beschriebenen Protokolle umfassen die Vorbereitung mikrobieller Kulturen, die Kalibrierung des Sensors, die Datenerfassung und die Analyse. Für den fluorometrischen Mer-RFP-Biosensor wird ein neuartiges Biosynthese-Allokationstheorem verwendet, um das Zeitintervall für zuverlässige und genaue Dosis-Wirkungs-Messungen zu identifizieren. Für den kolorimetrischen Mer-Blue-Biosensor ermöglicht ein kostengünstiges Kamera-Setup strenge Messungen in Umgebungen, in denen teure Spektralphotometer und Fluorimeter fehlen, und erleichtert so die dezentrale Überwachung der Verschmutzung. Es werden die Verfahren zur Untersuchung von Süßwasserproben beschrieben und die Grenzen dieser Biosensoren in Bezug auf die Probentypen diskutiert. Durch den Austausch dieser Handhabungs- und Analysetechniken ermutigen wir breitere Forschungsgruppen, diese biologischen Geräte für die Entwicklung effektiver Lösungen zur Umweltüberwachung einzusetzen und zu verbessern. Letztendlich zielt diese Forschung darauf ab, die breite Einführung von Biosensortechnologien in der umweltwissenschaftlichen Gemeinschaft zu erleichtern und zu einer effektiveren und effizienteren Überwachung der Spurenelementverschmutzung in verschiedenen Ökosystemen beizutragen.

Einleitung

Angesichts der wachsenden Besorgnis über die Umweltverschmutzung und die Sicherheit der Wasser- und Lebensmittelversorgung haben sich Biosensoren zu einer attraktiven, erschwinglichen Alternative zu herkömmlichen Methoden der analytischen Chemie entwickelt. Schwermetalle sind hochgiftige Schadstoffe, die durch menschliche Aktivitäten immer häufiger vorkommen 1,2,3,4. Herkömmliche Nachweismethoden5 sind jedoch oft kostspielig und unzugänglich.

Quecksilberempfindliche WCBs nutzen die bemerkenswerte Spezifität und Sensitivität des MerR-Transkriptionsfaktors 6,7,8. In seiner nativen Funktion reguliert MerR die Expression von Effektorproteinen, deren entgiftende Wirkung Quecksilberresistenz verleiht9. Die Fähigkeit von MerR, die Genexpression in einer quecksilberabhängigen Weise zu regulieren, wurde für die Regulation von Reporterproteinen in Quecksilbernachweissystemen umfunktioniert 10,11,12,13,14,15,16. Trotz vielversprechender Forschung müssen diese WCBs noch für die Überwachung in der realen Welt eingesetzt werden. Faktoren wie biologische Fragilität, spezielle Handhabungsanforderungen und das Fehlen standardisierter Protokolle und zertifizierter Referenzmaterialien haben die praktische Anwendung behindert 17,18,19,20.

Es wurde ein WCB-System zur Detektion von ionischem Quecksilber entwickelt, bei dem MerR an zwei verschiedene Reporterproteine gekoppelt ist. Mer-Blue exprimiert ein chromogenes Protein und dient als kolorimetrischer Biosensor, der eine visuelle oder kamerabasierte Detektion ermöglicht. Mer-RFP, ein fluoreszierender Biosensor, ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung der Signalakkumulation. Durch die sorgfältige Kontrolle des Zeitpunkts der Probenexposition während der Wachstumsphase wurde in beiden Systemen eine robuste Reproduzierbarkeit erreicht15.

In diesem Artikel werden detaillierte Protokolle für den Betrieb von Mer-Blue und Mer-RFP sowie eine umfassende Analyse ihrer Signalausgänge vorgestellt. Für Mer-RFP basiert die Analyse auf einem kürzlich eingeführten Theorem der Proteinbiosyntheseallokation21. Für Mer-Blue kann die kolorimetrische Analyse mit einer Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ digitalisiert werden. Um konsistente Bildaufnahmeeinstellungen zu gewährleisten, wird ein kostengünstiges DIY-Kamera-Setup namens PelletCam vorgestellt. In beiden Fällen wird automatisierte Software zur Verfügung gestellt, um den Betrieb zu erleichtern. Durch die gemeinsame Nutzung zugänglicher und standardisierter experimenteller Methoden und Datenanalysetechniken wird eine breitere Einführung von WCBs für die Entwicklung zuverlässiger und kostengünstiger biosensorbasierter Überwachungslösungen gefördert.

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Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von ionischen Quecksilberlösungen

  1. Eine kleine Menge HgBr2-Pulver (typischerweise zwischen 0,1 und 0,2 g) mit geeigneten Schutzhandschuhen und einer Maske abwiegen, um ein Einatmen und eine Exposition der Haut zu verhindern.
  2. Berechnen Sie die Wassermenge, die zur Gewinnung einer 4 mM-Lösung benötigt wird, indem die gemessene Masse des festen Pulvers in ddH2O nach folgender Formel aufgelöst wird:
    figure-protocol-1
    HINWEIS: Das erwartete Volumen liegt nahe bei 100 ml; Es kann eine vereinfachte Formel verwendet werden:
    figure-protocol-2
    1. Alternativ können Sie bei der Verwendung von HgCl2 die folgende Formel anwenden:
      figure-protocol-3
  3. Lagern Sie die Stammlösung in einem hermetisch verschlossenen Behälter in einer gekühlten Umgebung (4 °C), um eine Verdunstung zu verhindern.
  4. Bereiten Sie vor jedem Titrationsassay serielle Verdünnungen vor, beginnend mit 1 ml 2 mM Hg2+ und verdünnen Sie auf 40 nM, wie in Tabelle 1 gezeigt.
    HINWEIS: Die Konzentration von ionischem Quecksilber kann sich während der Lagerung ändern, wahrscheinlich aufgrund der spontanen Reduktion und Verdunstung von elementarem Quecksilber (Hg°). Obwohl die Kühlung und die Verwendung hochwertiger, hermetischer Behälter diese Effekte verringern können, sollten Sie Lösungen vermeiden, die länger als 6 Wochen gelagert werden - insbesondere bei Konzentrationen von 250 nM Hg2+ oder niedriger.

2. Vorbereitung des M9-Mediums

  1. Reagenzpulver werden in getrennten Kolben mit Reinstwasser gelöst, um die folgenden Stammlösungen herzustellen: M9 5×, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, 20 % (w/v) Glukose und 20 % (w/v) Casaminosäuren.
  2. Mischen Sie in einer 500-ml- oder 1-l-Glasflasche 50 mL M9 5×, 2,5 mL 20% (w/v) Casaminosäuren und fügen Sie Reinstwasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 246,475 mL zu erreichen.
  3. Das Gemisch und die oben genannten Stammlösungen bei 121 °C für 20 min autoklavieren.
  4. Lassen Sie alle Lösungen vollständig abkühlen, um eine Ausfällung von CaCl2 zu vermeiden.
  5. Zur abgekühlten Mischung hinzufügen: 25 μl 1 M CaCl2, 500 μl 1 M MgSO4 und 3 ml 20 % (w/v) Glukose.
    HINWEIS: Daraus ergibt sich ein reichhaltig supplementiertes M9-Medium mit den folgenden Endkonzentrationen: 0,24 % (w/v) Glukose, 0,2 % (w/v) Casaminosäuren, 2 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na2HPO4, 1 g/L NH4Cl.

3. Aktivieren des Biosensors Mer-Blue / Mer-RFP

  1. Verwenden Sie Escherichia coli DH5α-Zellen, die mit dem pUC-Mer-RFP- oder pUC-Mer-Blue-Plasmid transformiert wurden (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie eine LB-Agar-Petrischale mit 100 μg/ml Ampicillin vor.
  3. Keimzellen aus einem kryokonservierten Glycerinstamm mit der Streaking-Methode auf die LB-Agarplatte.
  4. Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  5. Nehmen Sie am nächsten Tag eine einzelne Kolonie aus der LB-Agar-Platte, um eine 10-ml-Kultur mit M9-Medium zu beimpfen (Abbildung 1A).
  6. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C unter ständigem Schütteln bei 220 U/min über Nacht (~16 h) (Abbildung 1B).

4. Titrationsexperiment mit Mer-RFP

  1. Messen Sie die optische Dichte der Bakterienkultur über Nacht bei 600 nm (OD600).
  2. Berechnen Sie das Volumen der Übernachtkultur, das erforderlich ist, um einen OD600 von 0,05 bei einem Gesamtvolumen von 10 ml frischem M9-Medium zu erreichen, indem Sie die folgende Formel verwenden:
    figure-protocol-4
    wobei C1 der OD600 der Übernachtkultur und V1 das Volumen ist, das aus ihr entnommen werden soll.
  3. Zentrifugieren SieV 1 mL des Vorinokulums bei 3500 × g für 5 min. Entsorgen Sie das alte M9-Medium und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 10 ml frischem M9-Medium (Abbildung 1C).
  4. Geben Sie 195 μl der resuspendierten Kultur in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte. Stellen Sie sicher, dass jede Mikrokultur in dreifacher Ausfertigung vorbereitet wird, um genaue Messungen zu ermöglichen.
  5. Geben Sie 5 μl ionische Quecksilberlösungen von 40 nM bis 40 μM, wie in Schritt 1 beschrieben, in jede Vertiefung, um Endkonzentrationen zwischen 1 nM und 1 μM zu erreichen (Abbildung 1D).
  6. Setzen Sie die Mikroplatte in einen Multimode-Mikroplatten-Reader mit Temperaturregelung ein, der auf die folgenden Parameter eingestellt ist (Abbildung 1E) - Temperatur: 37 °C, Schütteln: Ständiges Schütteln bei 60 U/min, Zeitintervall: Alle 15 Minuten für 16 Stunden abgelesen, Messung der optischen Dichte: Ablesung bei 600 nm, Fluoreszenzmessung: Anregung bei 570 nm und Emission bei 615 nm.
  7. Sammeln Sie nach Abschluss der 16-stündigen Inkubationszeit die Daten vom Mikroplatten-Reader (Abbildung 1F).

5. Datenanalyse für Mer-RFP-Ergebnisse

  1. Verwenden Sie eine bevorzugte Tabellenkalkulationssoftware oder Datenverwaltungstools, um die Rohwerte von OD600 im Zeitverlauf für alle einzelnen Kulturen zu visualisieren (Abbildung 1G). Es ist sicherzustellen, dass das Ende der Verzögerungsphase und der Beginn der stationären Phase bei allen Replikaten innerhalb jeder Quecksilberkonzentrationsbedingung ungefähr zur gleichen Zeit auftreten. Schließen Sie alle Kulturen aus, die um mehr als 1 h vom durchschnittlichen Zeitplan abweichen.
  2. Berechnen Sie den durchschnittlichen OD600 für jeden Zeitpunkt über alle Replikate innerhalb jeder Quecksilberkonzentrationsbedingung. Für jede dreifache Kulturbedingung stehen eine einzelne, gemittelte OD600-Wachstumskurve und drei Fluoreszenzintensitätsausgaben zu unterschiedlichen Zeitpunkten zur Verfügung.
  3. Plotten Sie den gemittelten OD600 vs. Zeit für die Kultur ohne Quecksilber. Identifizieren und wählen Sie visuell das Zeitintervall aus, in dem die Wachstumsrate positiv ist (siehe Abbildung 2). Schließen Sie die verbleibenden Datenpunkte aus allen Kulturen aus.
  4. Berechnen Sie für jede Kultur die spezifische Wachstumsrate zu jedem Zeitpunkt, indem Sie die Änderung von OD600 gegenüber dem vorherigen Zeitpunkt ermitteln und diese Änderung durch den OD600-Wert zu diesem Zeitpunkt dividieren, indem Sie die folgende Formel verwenden:
    figure-protocol-5
  5. Berechnen Sie auf ähnliche Weise die spezifische Fluoreszenzproduktionsrate für jede Kultur, indem Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität seit dem vorherigen Zeitpunkt ermitteln und diese Änderung durch den OD600-Wert zu diesem Zeitpunkt dividieren, indem Sie die folgende Formel verwenden:
    figure-protocol-6
  6. Für jede Kultur ist die spezifische Wachstumsrate gegen die Fluoreszenzproduktionsrate aufzutragen (siehe Abbildung 3). Identifizieren Sie einen linearen Bereich innerhalb der späten Zeitpunkte. Frühe Zeitpunkte werden ausgeschlossen, bis eine lineare Regression mit dem höchsten R2 auf der Grundlage eines Minimums von 12 Punkten (ca. 3 h) erreicht wird.
    HINWEIS: Die Steigung dieser linearen Regression stellt den Expressionsanteil dar, d. h. den Anteil der gesamten Proteinsynthese, der dem Reporterprotein21 zugeordnet ist.
  7. Extrahieren Sie für alle Kulturen lineare Trends aus ungefähr demselben Zeitintervall, und notieren Sie den Steigungswert für jede Bedingung.
    HINWEIS: Um den höchstmöglichenR2-Wert in allen Kulturen mit demselben Zeitintervall zu erreichen, sind möglicherweise mehrere Versuche erforderlich. Für die automatisierte Analyse steht unter https://github.com/frank-britto/Mer_RFP folgendes Jupyter Notebook (Google Colab Framework) zur Verfügung. Dieses Notebook dient als Vorlage für die Optimierung der Extraktion linearer Trends und die weitere Erstellung von Dosis-Wirkungs-Profilen.
  8. Nehmen Sie die durchschnittliche Steigung über die Replikate für jede Quecksilberkonzentration.
  9. Stellen Sie die gemittelten Steigungswerte gegen die Quecksilberkonzentration dar (siehe Abbildung 4A). Passen Sie eine Hügelfunktion an die Daten an:
    figure-protocol-7
    Dabei gilt: fRFP ist die Expressionsfraktion für rot fluoreszierendes Protein, H steht für die maximal mögliche Expression für den Schaltkreis, [Hg2+] ist die ionische Quecksilberkonzentration, kHg bezieht sich auf die Affinität für ionisches Quecksilber, n ist der Hill-Koeffizient, der die Kooperativität der Reaktion auf Hg2+ ausdrückt.

6. Titrationsexperiment mit Mer-Blue Biosensor

  1. Zentrifugieren Sie eine über Nacht erhaltene, dichte Kultur, die Sie wie in Schritt 3 beschrieben bei 3.500 × g für 10 min erhalten haben.
  2. Entsorgen Sie das verbrauchte M9-Medium und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in frischem M9-Medium auf einen OD600 von 1,0. Stellen Sie sicher, dass mindestens 5 ml Kultur bei dieser Dichte erhalten werden (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Wenn kein Spektralphotometer verfügbar ist, nähern Sie sich den Anfangsbedingungen, indem Sie das Bakterienpellet in einem Volumen frisches M9-Medium resuspendieren, das dem Doppelten des ursprünglichen Volumens der dichten Kultur entspricht.
  3. 9,5 ml M9-Medium und 10 μl einer 100 mg/ml-Ampicillin-Stammlösung in sterilisierte Glaskulturröhrchen geben (Abbildung 1H).
  4. Das supplementierte M9-Medium wird mit 500 μl der in Schritt 6.2 hergestellten Biosensorkultur (OD600 = 1,0) beimpft.
  5. 10 μl der vorbereiteten ionischen Quecksilberlösungen (siehe Schritt 1) zugeben, um Endkonzentrationen von 0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 125 nM und 250 nM zu erreichen.
  6. Inkubieren Sie die Kulturen 16 Stunden lang bei 37 °C und schütteln Sie sie kräftig bei 220 U/min (Abbildung 1I).

7. Datenerfassung und -analyse für Mer-Blue Ergebnisse

  1. Übertragen Sie etwa 1,3 ml jeder Kultur in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen (Abbildung 1J).
  2. Zentrifugieren Sie die Mikroröhrchen 3 Minuten lang mit Höchstgeschwindigkeit, um feste Pellets zu erhalten. Entsorgen Sie den Überstand.
  3. (Fakultativ) Um größere Pellets zu erhalten, wiederholen Sie das Zentrifugieren und Entfernen des Überstands bis zu sechsmal.
  4. Fotografieren Sie den Boden jedes Mikroröhrchens und konzentrieren Sie sich dabei auf das Pellet (Abbildung 1K). Verwenden Sie einen Mikroröhrchenhalter und ein Stativ oder eine PelletCam (siehe Schritt 8), um eine konsistente und reproduzierbare Ausrichtung, Beleuchtung und Farbeinstellungen für alle Bilder zu gewährleisten (siehe Abbildung 5).
  5. Bestimmen Sie die Farbintensitätswerte der einzelnen Pellet-Bilder über die Kanäle Rot, Grün und Blau (RGB).
    1. Wenn Sie ImageJ verwenden: Laden Sie das Bild und navigieren Sie zu Bild > Geben Sie > RGB-Stapel ein , um einen Stapel mit drei Scheiben (Rot-, Grün- und Blaukanal) zu erstellen. Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug, um einen Bereich of Interest (ROI) um den Pelletbereich zu zeichnen. Navigieren Sie zu Analysieren > Messen , um die mittleren Intensitätswerte für den ausgewählten Bereich in jedem Kanal zu erhalten.
    2. Bei Verwendung von PelletCam: Öffnen Sie die .csv Datei mit den durchschnittlichen Farbintensitätswerten für einen repräsentativen Neun-Pixel-Bereich des Pelletbildes.
  6. Berechnen Sie die Reaktion des Biosensors für jede Probe, indem Sie den euklidischen Abstand im RGB-Raum relativ zu einem weißen Referenz-Pelletbild (nicht transformierte E. coli) berechnen, wie zuvorbeschrieben 22, unter Verwendung der Gleichung:
    figure-protocol-8
    Hier stellen R-Probe, G-Probe und B-Probe die durchschnittlichen Farbintensitäten von jedem RGB-Kanal im ausgewählten Bereich des Pelletbildes aus der Probe des Biosensors dar, während Rref, Gref und Bref die entsprechenden Werte für ein Referenzpellet von nicht transformierten E. coli bezeichnen.
  7. Plotten Sie die berechneten euklidischen Abstände gegen die entsprechenden ionischen Quecksilberkonzentrationen (siehe Abbildung 6). Passen Sie eine Hill-Funktion an die Daten an (siehe Abbildung 4B) an, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
    figure-protocol-9
    Dabei ist E der euklidische Abstand, H steht für die maximal mögliche Färbung des Schaltkreises, [Hg2+] ist die ionische Quecksilberkonzentration, kHg bezieht sich auf die Affinität zu ionischem Quecksilber und n ist der Hill-Koeffizient, der die Kooperativität der Reaktion auf Hg2+ ausdrückt.

8. Bau einer PelletCam

  1. Laden Sie die Dateien herunter, um ein geschlossenes Mikrocontroller-System für die Farbmessung in Bakterienpellets von der Website (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI) zu bauen.
    HINWEIS: Grundkenntnisse in den Bereichen Laserschneiden, 3D-Druck, ESP32 und Arduino sind hilfreich. Eine Einführung in ESP32-CAM finden Sie unter (https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true). Es wird empfohlen, die ESP32-CAM zusammen mit dem MB Adapter zu erwerben, um die Programmierung zu erleichtern. Für Nutzer, die mit dem ESP32 nicht vertraut sind, empfiehlt es sich, zunächst dem Tutorial https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/ folgen.
  2. Verwenden Sie die LasercutterBox.ai Feile, um einen 3 mm Multiplex mit einem Laserschneider zu schneiden und zu gravieren.
  3. Bauen Sie die Teile aus der Datei ESP32SET.stl-Datei mit einem 3D-Drucker. Diese .stl-Datei kann von fast allen 3D-Drucker-Softwares direkt importiert werden; Beispiel: Bambu Studio (https://bambulab.com/en/download/studio).
  4. Installieren Sie das ESP32 (ESP32-CAM-MB 2640 WiFi Bluetooth-Kameramodul), indem Sie die .cpp und .h - und .ino-Dateien in einem einzigen Ordner ablegen. Öffnen Sie anschließend die .ino-Datei mit der Arduino IDE-Software und klicken Sie auf >Hochladen. Nach dem Hochladen startet der ESP32 automatisch.
  5. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Benutzer in der Lage sein, eine Verbindung zu dem WLAN-Zugangspunkt mit dem Namen >PELLET und dem Passwort >PELLETCAM herzustellen, wie in der .ino-Datei des ESP32 angegeben. Die IP-Adresse der PelletCam wird im seriellen Monitor der Arduino IDE angezeigt. Öffnen Sie einen Webbrowser und navigieren Sie zur Adresse: http://192.168.4.1.
    HINWEIS: Auf diese Weise können Sie das Bild anzeigen oder ein neues Bild aufnehmen (>CAPTURE PHOTO), das Bild drehen (>ROTATE) oder die Leuchtdichte des LED-Streifens einstellen (>LEDS).
  6. Schließen Sie den ESP32 Arduino an den LED-Streifen (NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED mit integrierten Treibern) und ein 5-V-USB-Kabel gemäß dem Schema in der Datei InstallationManual.pptx an.
  7. Kleben Sie den ESP32 und den LED-Streifen mit einer Klebepistole auf die 3D-gedruckten Halterungen.
  8. Führen Sie ein Mikroröhrchen mit farbigem Boden (oder ein Bakterienpellet) in die 3D-gedruckte Vorderseite der PelletCam ein. Positionieren Sie die ESP32-LED-Halterung ca. 5 cm weiter und machen Sie ein Foto über die Webseite. Wenn ein scharfes und richtig ausgeleuchtetes Bild erhalten wird, dann kleben Sie die ESP32-LED-Halterung auf den Boden der Holzkiste. Ist dies nicht der Fall, stellen Sie den Abstand zwischen Front und ESP32-LED-Träger ein und wiederholen Sie den Vorgang, bis ein zufriedenstellender Abstand erreicht ist.
  9. Bauen Sie die Box mit Kreppband zusammen und kleben Sie alle Teile mit Holzleim zusammen.
  10. Schließen Sie die PelletCam über das USB-Kabel an ein USB-Netzteil an, das mindestens 1 A liefern kann.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Python 3.9 oder eine höhere Version installiert ist.
  11. Öffnen Sie eine Eingabeaufforderung oder ein Terminalfenster. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das die pellet.py Datei enthält. Führen Sie das Skript mit dem Befehl >python pellet.py aus.
  12. Wenn das pellet.py Skript nicht ausgeführt werden kann, kann dies an fehlenden Python-Bibliotheken liegen. Installieren Sie die erforderlichen Bibliotheken mit dem Befehl >pip install pillow tkinter pathlib statistics. Weitere Informationen zum Einrichten Ihres eigenen Systems finden Sie im Dokument PelletCam Example.docx.

9. Messung von Wasserproben aus der Umwelt

  1. Sammeln Sie Proben aus Umweltquellen wie Flüssen oder Teichen und lagern Sie sie in luftdichten Behältern bei niedrigen Temperaturen, um die Verdunstung zu minimieren. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion.
  2. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 3.500 × g , um Sand und organische Ablagerungen zu sedimentieren und die wässrige Fraktion zu isolieren.
  3. Sterilisieren Sie die geklärte Probe mit einem 0,22 μm Spritzenfilter.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Hitzesterilisation, da Quecksilber flüchtig ist und während des Prozesses verdampfen kann.
  4. (Fakultativ) Bereiten Sie ein separates angesäuertes Aliquot vor, indem Sie 5 % HCl für die unabhängige Messung mit Standardtechniken der analytischen Chemie hinzufügen. Verwenden Sie nur die nicht angesäuerte Probe für Biosensor-Assays.
  5. Mischen Sie 5 mL der sterilfiltrierten Umgebungsprobe mit 4,5 mL 2× M9 Medium, was zu einer Verdünnung der Probe im Verhältnis 1:2 führt.
  6. Das verdünnte Proben-Medium-Gemisch wird mit 0,5 ml einer Übernachtkultur beimpft (die wie in Schritt 5.4 beschrieben hergestellt wurde). Diese Inokulation entspricht einer 20-fachen Verdünnung der Kultur, was einen OD600 von 0,05 ergibt, um den Assay zu starten.
    1. Wenn Sie Mer-RFPTransfer verwenden, geben Sie 200 μl des Proben-Medium-Gemisches in eine Mikrotiterplattenvertiefung und starten Sie die Messungen mit einem Mikroplatten-Reader, wie in Schritt 3.6 beschrieben.
    2. Bei Verwendung von Mer-Blue: Das 10-ml-Proben-Medium-Gemisch bei 37 °C für 16 h unter kräftigem Schütteln bei 220 U/min inkubieren, wie in Schritt 5.6 beschrieben.

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Ergebnisse

Beide Biosensoren zeigen keine nachweisbare Basisexpression ihrer jeweiligen Reporterproteine unter quecksilberfreien Bedingungen. Mer-Blue-Kulturen zeigen in der Regel zwischen 6 und 8 Stunden nach der Inokulation bei HgBr2-Konzentrationen von 25 nM und mehr eine sichtbare Färbung mit bloßem Auge. Bei ordnungsgemäßer Durchführung liefern Titrationsexperimente, die entweder Mer-RFP oder Mer-Blue verwenden, Reaktionen, die einer Hill-Funktion mit einem Hill-Koeffizienten nahe 1 entsprechen, was auf ein nicht-ko...

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Diskussion

Die hier verwendeten Biosensor-Schaltkreise sind identisch und unterscheiden sich nur im Reporterprotein. Beide sind vollständig auf Plasmiden mit hoher Kopienzahl kodiert, was ihren Einsatz in Escherichia coli-Zellen verschiedener Stämme ermöglicht. Während es in E. coli B-Stammzellen funktionsfähig war, wurde in K-12-Stämmen, insbesondere DH5α und chemisch kompetenten E. coli-Zellen , ein stärkeres farbiges Signal von Mer-Blue beobachtet15.

...

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Danksagungen

Diese Forschung wird dank der Unterstützung des Programa Nacional de Investigación Científica y Estudios Avanzados PROCIENCIA im Rahmen des Programms EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada", Fördervertrag PE501086520-2024-PROCIENCIA, präsentiert. Die Entwicklung der Quecksilber-Biosensoren wurde von VLIR-UOS über den Fördercode PE2020SIN292B122 der Südinitiative finanziert. M.D. dankt VLIRUOS, DGD und dem Rat der flämischen Universitäten für angewandte Wissenschaft und Kunst für das XREI-Stipendium im Rahmen des Global Minds-Projekts BE2017GMHVLHC106.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3 mm dickes MultiplexholzViele Verteiler
5 V USB-KabelViele Verteiler
96-Well Transparentes Polystyrol mit flachem Boden TC-behandelte MikrotiterplattenCorning3599
AgarpulverHiMediaGRM026
AmpicillinGold Biotechnology, Inc.A-301-100
CaCl2Millipore208290
CasaminosäurenCalbiochem2040OP
D-(+)-GlucoseCentral Drug House (P) Ltd.506250
ESP32-CAM-MB 2640 Bluetooth WiFi Kameramodul USB auf serielle Schnittstelle Entwicklungsplatine Automatischer Download (Typ C)Viele Distributoren
GlaskulturröhrchenCorning9825
HgBr2, Quecksilber(II)-bromidMerck200085
HgCl2, Quecksilber(II)-chloridMerck21465
Luria Bouillon (Miller)Sigma-AldrichL3522
M9 MindestsalzeSigma-AldrichM6030
MgSO4HiMediaGRM684
NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED mit integrierten TreibernAdafruit1426
Plasmid: pUC-Mer-BlueUnsereGruppen-VollständigeSequenz in https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Plasmid verfügbar: pUC-Mer-RFP UnsereGruppe-VollständigeSequenz erhältlich in https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Spritzenvorsatzfilter, hydrophil, Porengröße 0,22 MikrometerMilliporeSLGV004SLFür die Sterilisation von Umweltproben.

Referenzen

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