Methodenartikel

Entwicklung eines neuartigen Kryoprotektivums mit niedrigem DMSO-Gehalt für die Konservierung von Stammzellen im peripheren Blut

DOI:

10.3791/68275

⸱

20. Juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll verwendet ein hämatopoetisches Stammzell-Kryoprotektivum, das eine sehr geringe Konzentration an Dimethylsulfoxid enthält, und demonstriert seine klinische Sicherheit und Wirksamkeit beim Schutz hämatopoetischer Stammzellen, wodurch es eine neue Strategie für die Kryokonservierung hämatopoetischer Stammzellen bei der klinischen autologen Stammzelltransplantation bietet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Kryokonservierung von hämatopoetischen Stammzellen des peripheren Blutes (PBHSC) ist für die autologe Stammzelltransplantation (ASCT) von entscheidender Bedeutung, aber herkömmliche Kryoprotektiva (TCPAs), die 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthalten, werfen aufgrund des Toxizitätsrisikos Sicherheitsbedenken auf. Ziel dieser Studie war es, ein neuartiges Kryoprotektivum mit niedrigem DMSO-Gehalt (CPA, 2 % DMSO) für die PBHSC-Konservierung bei -80 °C zu validieren, wodurch die Lagerung von flüssigem Stickstoff überflüssig wird. PBHSCs von sechs Gebern wurden in CPA- und TCPA-Gruppen eingeteilt. Das CPA wurde mit PBHSC (1:1 vol/vol) gemischt und direkt bei -80 °C gelagert. TCPA (10 % DMSO + 5 % Humanalbumin) wurde schrittweise abgekühlt (1 °C/min) und flüssiger Stickstoff gelagert. Nach 1 Monat wurden beide Gruppen in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut. Die Zellviabilität, die Integrität des Zytoskeletts (Mikrofilamente/Mikrotubuli), die mitochondriale Aktivität und die koloniebildende Kapazität wurden verglichen. Nach dem Auftauen war das PBHSC-Überleben zwischen CPA (91,29 %) und TCPA (90,07 %) vergleichbar. In Zellviabilitätsassays übertraf CPA jedoch TCPA (CPA: 89,38 % gegenüber TCPA: 79,55 %; p < 0,05). Die Analyse des Zytoskeletts ergab intakte Mikrofilamente und Mikrotubuli in CPA-konservierten Zellen, deren strukturelle Klarheit über TCPA hinausging. Die mitochondriale Aktivität in CPA-behandelten Zellen spiegelte frische PBHSCCs wider und zeigte eine um 8,5 % höhere Aktivität als TCPA (p < 0,05) und eine erhöhte Anzahl mitochondrialer Komplexe. Die koloniebildenden Untersuchungsergebnisse bestätigten die Überlegenheit von CPA mit höheren Koloniezahlen nach der Induktion. CPA ermöglicht eine sichere, bequeme PBHSC-Kryokonservierung bei -80 °C mit extrem niedrigem DMSO (2 %), wodurch die Abhängigkeit von flüssigem Stickstoff eliminiert wird. Die verbesserte Zellviabilität und die mitochondriale Konservierung deuten auf klinische Vorteile hin, indem sie das Risiko einer Infusionstoxizität verringern. Dieses Protokoll bietet eine transformative Strategie für ASCT, die die Sicherheit und betriebliche Effizienz optimiert.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die autologe hämatopoetische Stammzelltransplantation (ASCT) ist eine etablierte Behandlungsoption für verschiedene hämatologische Malignome, einschließlich Leukämie, Lymphom und multiples Myelom, wo sie als Erst- oder Zweitlinientherapie zur Wiederherstellung der Hämatopoese und zur Wiederherstellung der Immunkompetenz nach intensiver Chemo- oder Strahlentherapie dient 1,2,3,4,5,6,7 . Erfolgreiche ASCT-Ergebnisse hängen entscheidend von der Lebensfähigkeit der kryokonservierten hämatopoetischen Stammzellen (PBHSCs) aus dem peripheren Blut ab, die ihre Funktionsfähigkeit für die hämatopoetische und immunologische Rekonstitution aufrechterhalten müssen 8,9,10,11,12. Die Lagerung hämatopoetischer Stammzellen ist ein kritischer Schritt bei der ASCT, da sich Patienten nach der autologen hämatopoetischen Stammzellentnahme in der Regel einer Bestrahlung, Chemotherapie und anderen Therapien unterziehen, um Tumorzellen zu eliminieren. Die Qualität der hämatopoetischen Stammzelllagerung steht in direktem Zusammenhang mit dem Erfolg oder Misserfolg der hämatopoetischen und immunen Rekonstitution 13,14,15,16,17,18. Um die Lebensfähigkeit hämatopoetischer Stammzellen nach der Kryokonservierung zu gewährleisten, wird in der klinischen Praxis häufig Albumin und Dimethylsulfoxid (DMSO) aus dem menschlichen Blut als CPA zugesetzt. Diese Wirkstoffe sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Zellaktivität während und nach dem Kryokonservierungsprozess. In der Regel liegt die Konzentration des verwendeten DMSO zwischen 5 % und 10 % (v/v). Studien haben gezeigt, dass die Aufrechterhaltung einer DMSO-Konzentration von mindestens 3,5 % bis 10 % (v/v) die Wirksamkeit der Kryokonservierung hämatopoetischer Stammzellen verbessern kann19,20. Die klinische Anwendung von DMSO bleibt jedoch aufgrund der dosisabhängigen Toxizität problematisch, wobei 30 % bis 60 % der Transplantatempfänger über Nebenwirkungen wie Übelkeit, Erbrechen und Hypotonie berichteten21,22. Um die Einschränkungen herkömmlicher Kryoprotektiva (CPAs) mit 5 % bis 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) zu überwinden, zielt diese Studie darauf ab, ein neuartiges CPA zu entwickeln, das eine sichere und effiziente PBHSC-Kryokonservierung bei -80 °C unter Verwendung extrem niedriger DMSO-Konzentrationen (2 % v/v) ermöglicht, wodurch komplexe Flüssigstickstoffprotokolle überflüssig werden und gleichzeitig die DMSO-assoziierte Toxizität gemildert wird.

Neue Alternativen, wie z. B. Trehalose-basierte oder polymerverstärkte CPAs, sind präklinisch vielversprechend, stoßen jedoch aufgrund regulatorischer Hürden oder der Inkompatibilität mit Standard-Auftauprotokollen auf Hindernisse bei der klinischen Umsetzung23. Im Gegensatz dazu baut unser CPA auf dem etablierten Sicherheitsprofil der HSA-DMSO-Systeme auf und führt gleichzeitig optimierte Additivverhältnisse ein, die den Zytoschutz verbessern. Diese Methode eignet sich besonders für klinische Zentren, denen eine Infrastruktur für flüssigen Stickstoff fehlt oder die schnelle Arbeitsabläufe erfordern. Für die Langzeitlagerung (>2 Jahre) bleibt flüssiger Stickstoff jedoch vorzuziehen24. Ärzte sollten die Einfachheit des Protokolls gegen die individuelle Toleranz des Patienten gegenüber DMSO abwägen und eine maßgeschneiderte Anwendung dieser Strategie sicherstellen, um die Sicherheit und betriebliche Effizienz bei der hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu maximieren.

In dieser Studie stellt der Einsatz von Kryoprotektiva mit reduziertem DMSO-Gehalt eine entscheidende Strategie dar, um gleichzeitig die Wirksamkeit der Kryokonservierung von hämatopoetischen Stammzellen zu erhalten und gleichzeitig die damit verbundene Toxizität zu minimieren. Die Wirksamkeit, Sicherheit und Bequemlichkeit einer neu entwickelten hämatopoetischen Stammzell-CPA zur Konservierung von hämatopoetischen Stammzellen (PBHSCs) aus dem peripheren Blut wurde untersucht. Es wurde eine einfache, direkte Einfriermethode unter Verwendung des neuartigen CPA implementiert, bei der herkömmliche Kryokonservierungsprotokolle vermieden wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die einstufige Kryokonservierung von Zellsuspensionen bei -80 °C mit niedrig konzentriertem DMSO-CPA im Vergleich zu herkömmlichem CPA (TCPA) überlegene Konservierungseffekte erzielt. Dieser Ansatz könnte neue Strategien zur Rationalisierung des klinischen Prozesses der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) bieten.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hämatologische Onkologiepatienten, die sich einer ASCT unterziehen, wurden von Juni 2020 bis Juni 2022 in der Abteilung für Hämatologie des Shenzhen Cancer Hospital rekrutiert. Blutzellproben wurden vor und nach der Transplantationsmobilisierung für die HSZT entnommen, darunter zwei Fälle von akuter myeloischer Leukämie (AML), zwei Fälle von Hodgkin-Lymphom (HL), ein Fall von kutanem genuin histiozytärem Lymphom (CGHL) und ein Fall von primärem mediastinalem B-Zell-Lymphom (PMBL) mit einem Medianalter von 53 Jahren und einer Spanne von 35 bis 61 Jahren. Die Studie erhielt die Einverständniserklärung der Patienten und die Genehmigung der Ethikprüfungskommission des Shenzhen Cancer Hospital mit der ethischen Genehmigungsdokumentnummer AF-SC-07-2.0. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission für Versuchstiere, Krebskrankenhaus, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften (Zulassungs-Nr. NCC2018A073) und hielt sich an die internationalen Richtlinien für Tierversuche.

1. Umpacken und Kryokonservierung von hämatopoetischen Stammzellproben

  1. Vorbereitung eines aseptischen Arbeitsplatzes
    1. Waschen Sie sich gründlich die Hände und tragen Sie sterile Masken und Handschuhe. Desinfizieren Sie Hände, Handgelenke und Ellbogen mit 75% Ethanol.
    2. Sterilisieren Sie alle Ersatzinstrumente (Pipetten, Hämostaten) mit Autoklav oder UV-Bestrahlung. Ordnen Sie die folgenden Materialien auf der Biosicherheitswerkbank an: 1 ml sterile pyrogenfreie Pipettenspitzen (2 Schachteln), 1000 μl Pipette, sterile 1,8 ml Kryokonservierungsröhrchen, 50 ml Zentrifugenröhrchen und eine Aufbewahrungsbox für Kryokonservierungsröhrchen (programmierbare Gefrierbox).
  2. Markierung und Zell-CPA-Mischen
    1. Beschriften Sie Kryokonservierungsröhrchen mit Proben-ID, Datum, Zellzahl und Spendername.
    2. Verbinden Sie den hämatopoetischen Stammzellbeutel mit 180-200 ml hämatopoetischen Stammzellen mit einem sterilen Infusionsröhrchen mit dem CPA-haltigen Beutel mit 100 ml eines neuartigen Kryoprotektivums mit niedrigem DMSO-Gehalt.
    3. Klemmen Sie den Mittelpunkt des Röhrchens mit einem sterilen Hämostaten fest. Befestigen Sie ein Ende an dem Zell-CPA-Gemischbeutel und das andere an einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  3. Abfüllung und Kryokonservierung
    1. Lassen Sie das Blutstillungsmittel los, um einen kontrollierten Fluss des Zell-CPA-Gemisches in das Zentrifugenröhrchen zu ermöglichen.
    2. 1 ml Aliquote werden mit einer Pipette aus dem Zentrifugenröhrchen aspiriert. Überführen Sie die Aliquote in vormarkierte Kryoröhrchen (30 Röhrchen/Probe). Ziehen Sie die Verschlüsse fest und legen Sie die Röhrchen in die Aufbewahrungsbox.
  4. Lagerung und Transport
    1. Stellen Sie die Aufbewahrungsbox sofort in einen -80 °C kühlen Kühlschrank. Für den Transport verpacken Sie Kryoröhrchen in Trockeneis (-78,5 °C) mit Temperaturüberwachung.

2. Kryokonservierung und Rückgewinnung von PBHSC

  1. CPA- und TCPA-Aufbereitung und -Mischung
    1. Eine Eisplattform auf 2-8 °C vorkühlen. Tauen Sie die hämatopoetischen Stammzellen CPA und TCPA gemäß den Herstellerrichtlinien auf (siehe Tabelle 1 für CPA/TCPA-Zusammensetzungen).
    2. Mischen Sie CPA und TCPA mit sechs PBHSC-Proben in einem Volumenverhältnis von 1:1 auf der Eisplattform. Übertragen Sie die Zellsuspension in sterile Kryoröhrchen.
  2. CPA-Kryokonservierung
    1. Stellen Sie die Kryofläschchen direkt in einen -80 °C heißen Gefrierschrank. Stellen Sie sicher, dass die endgültige DMSO-Konzentration in der Suspension 2 % (v/v) beträgt. Lagern Sie die Proben 1 Monat lang.
  3. TCPA-Kryokonservierung (vergleichende Kontrolle)
    1. Bereiten Sie TCPA vor, das 5 % menschliches Blutalbumin und 10 % DMSO (v/v) enthält. Laden Sie PBHSC-Suspensionen in Kryoröhrchen und kühlen Sie sie mit einem programmierbaren Gefrierschrank auf -80 °C bei 1 °C/min ab.
    2. Übertragen Sie Kryofläschchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff. Lagern Sie die Proben 1 Monat lang.
  4. Wiederbelebung von Zellen
    1. Entnehmen Sie Kryoröhrchen nach 1 Monat. Tauen Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad unter sanftem Rühren auf (≤ 5 min).
    2. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 x g , um CPA/TCPA-Reste zu entfernen. Resuspendieren Sie 1 ml der Zellen in vorgewärmtem RPMI 1640-Kulturmedium für nachgeschaltete Assays.

3. Assay der Zellviabilität

  1. Bildbasierte Zellzählung
    1. Bereiten Sie eine gemischte Färbelösung vor, die 10 μg/ml Acridinorange (AO) und 10 μg/ml Propidiumiodid (PI) enthält.
    2. Mischen Sie 100 μl Zellsuspension mit 100 μl Färbelösung (Verhältnis 1:1) in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen.
    3. Laden Sie 10 μl der gefärbten Probe in den automatisierten Zellzähler. Analysieren Sie die Zellviabilität mit der integrierten Software:
      Lebensfähigkeit = lebende Zellen / Gesamtzellen x 100%
  2. Validierung der Durchflusszytometrie
    1. Bereiten Sie die Annexin V-FITC/PI-Färbelösung vor, indem Sie Annexin V-FITC (5 μl) und PI (5 μl) in 100 μl Bindungspuffer mischen.
    2. Geben Sie 300 μl Zellsuspension in die Färbelösung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 25 °C im Dunkeln.
    3. Die Mischung bei 300 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie Zellen in 500 μl PBS und analysieren Sie die Lebensfähigkeit mit einem Durchflusszytometer25.

4. Koloniebildender Assay

  1. Vorbereitung der Zellsuspension
    1. Mischen Sie die Zellsuspension mit 0,4%iger Trypanblau-Lösung im Verhältnis 1:1 und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang, um lebensfähige/tote Zellen zu unterscheiden. Führen Sie Duplikatzählungen mit einem automatisierten Zellzähler durch, um die Dichte lebensfähiger Zellen zu bestimmen (stellen Sie die Lebensfähigkeit >90%) sicher. Stellen Sie das Volumen der Zellsuspension auf die Zielkonzentration (1 x 106 Zellen/ml) ein und filtrieren Sie durch ein 40-μm-Sieb, um eine Einzelzelldispersion zu gewährleisten. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm steriles Zellsieb, um Aggregate zu entfernen.
  2. Mischen von Medium
    1. Kombinieren Sie 1 ml Zellsuspension mit 9 mL handelsüblichem Medium für die koloniebildende Einheit der Maus in einem konischen 15-ml-Röhrchen (1:10 V/V).
    2. Wirbeln Sie das Gemisch 30 s lang bei 1.500 U/min, um die Homogenität zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie bei 100 x g für 10 s, um Luftblasen zu entfernen.
  3. Einstellung der Zellaussaat und der Luftfeuchtigkeit
    1. Geben Sie 1,5 ml der blasenfreien Mischung in eine sterile 35-mm-Petrischale. Geben Sie 3 ml steriles destilliertes Wasser in eine periphere Rille der Schale (oder stellen Sie einen separaten sterilen Behälter in den Schalendeckel), um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
    2. Verschließen Sie die Schale in einer befeuchteten Kammer (≥ 95 % Luftfeuchtigkeit).
      1. Um die Kammer vorzubereiten, legen Sie zwei Lagen steriles saugfähiges Papier in einen Kunststoffbehälter mit Deckel (z. B. 15 cm Petrischale). Fügen Sie 10 ml steriles entionisiertes Wasser hinzu, um das Papier zu sättigen. Stellen Sie die fleckige Kulturschale in die Mitte der Kammer und stellen Sie sicher, dass kein direkter Kontakt zwischen der Schale und dem nassen Papier besteht. Wickeln Sie die transparente Folie 3 Mal um die Verbindung zwischen Deckel und Behälter, um sie luftdicht zu verschließen. Alternativ können Sie die Deckelränder mit Laborklebeband sichern. Inkubieren Sie die versiegelte Kammer 30 Minuten lang bei 37 °C, um die Luftfeuchtigkeit ≥ 95 % auszugleichen.
  4. Anbau und Zählung von Bienenvölkern
    1. Inkubieren Sie die Zellen 16 Tage lang bei 37 °C unter 5 % CO2 . Zählen Sie hämatopoetische Kolonien (≥ 50 Zellen pro Cluster) mit einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Berechnen Sie koloniebildende Einheiten (KBE) pro 1 x 104 ausgesäte Zellen.

5. Nachweis der mitochondrialen Aktivität

  1. Zellfärbung mit Rhodamin 123
    1. Resuspendieren Sie PBHSCs in einer Menge von 1 x 106 Zellen/ml in 1 ml RPMI1640 Medium. Rhodamin 123 Farbstoff bis zu einer Endkonzentration von 5-10 μM zugeben. Zellen in 5 % CO2 bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    2. Die Zellsuspension bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml frischem RPMI1640. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie sie in 1 ml PBS.
  2. Konfokale Mikroskopie-Analyse
    1. Wischen Sie einen sauberen Objektträger mit fusselfreiem Papier ab, um Staub oder Verunreinigungen zu entfernen.
    2. Resuspendieren Sie gefärbte PBHSCs in PBS auf eine geeignete Dichte, um überlappende Signale zu vermeiden. Pipettieren Sie 10-20 μl Zellsuspension und geben Sie sie langsam in die Mitte des Objektträgers.
    3. Kippen Sie das Deckglas in einem Winkel von 45°, berühren Sie vorsichtig eine Kante mit dem Tröpfchen und senken Sie es allmählich ab, um Luftblasen zu minimieren. Drücken Sie leicht, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig zu einer Monoschicht verteilt sind.
    4. Legen Sie den Objektträger 5 Minuten lang horizontal in die Dunkelheit, damit sich die Zellen absetzen können. Fahren Sie sofort mit der konfokalen Mikroskopie-Analyse fort.
    5. Montieren Sie die Buntzellen auf einen Objektträger. Beobachten Sie die mitochondriale Verteilung mit einem konfokalen Mikroskop (z.B. 488/525 nm).
  3. Quantifizierung der Durchflusszytometrie
    1. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität von Rhodamin 123 mit einem Durchflusszytometer (FL1-Kanal). Als Positivkontrollen sind mit Wasserstoffperoxid behandelte PBHSC (1 mM, 1 h) zu verwenden26.

6. Zytoskelettfärbung von PBHSCs

  1. Mikrofilament-Färbung (Actin Tracker Green-488)
    1. Bereiten Sie eine AF488-konjugierte Phalloidin-Fluoreszenzsonde vor, die in PBS bei einer Endkonzentration von 5 U/ml gelöst ist. Die Stammlösung (200 U/ml in Methanol) wird durch Mischen von 5 μl Stamm mit 195 μl PBS (1:40 Verdünnung) verdünnt. 10 s lang gründlich vortexen, um die Homogenität zu gewährleisten.
    2. Geben Sie 200 μl der vorbereiteten Arbeitslösung Actin Tracker Green-488 (5 U/ml) zu PBHSCs. Inkubieren Sie die Zellen bei 25 °C für 30 min im Dunkeln.
    3. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 mL immunfärbendem Waschpuffer (0,1 % Triton X-100 in PBS). Gegenfärbung der Zellkerne mit 200 μl DAPI (1 μg/mL) für 5 min bei 25 °C im Dunkeln.
  2. Färbung von Mikrotubuli (Tubulin Tracker Red)
    1. Bereiten Sie eine infrarotkonjugierte Paclitaxel-Fluoreszenzsonde vor, die in PBS bei einer Endkonzentration von 1 μM gelöst ist. Verdünnen Sie die Stammlösung (100 μM in DMSO) durch Zugabe von 10 μl Stamm zu 990 μl PBS (Verdünnungsverhältnis 1:100). Wirbeln Sie die Mischung 10 s lang ein, um die Homogenität zu gewährleisten und vor Licht zu schützen.
    2. Bereiten Sie Tubulin Tracker Red Arbeitslösung in einer Endkonzentration von 250 nM im vollständigen Medium vor. Verdünnen Sie die Stammlösung (1 mM in DMSO) durch Zugabe von 2,5 μl Stoff zu 997,5 μl Medium (Verdünnungsverhältnis 1:400). Die Mischung 10 s lang einreiben und 200 μl zu PBHSC geben. Bei 25 ΰC 30 min im Dunkeln inkubieren.
    3. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 mL immunfärbendem Waschpuffer. Gegenfärbung der Zellkerne mit 200 μl DAPI (1 μg/mL) für 5 min bei 25 °C im Dunkeln.
  3. Montage und Mikroskopie
    1. Waschen Sie gefärbte Zellen 2x mit PBS. Mischen Sie gefärbte Zellen mit 90 % Glycerin-PBS-Lösung (90 % Glycerin und 10 % PBS, v/v) im Volumenverhältnis von 1:1. Pipettieren Sie 10 μl der Mischung auf einen Objektträger. Kippen Sie das Deckglas um 45° und senken Sie es allmählich ab, um Luftblasen zu vermeiden.
    2. Analyse der Aktin-/Mikrotubuli-Morphologie mit einem Fluoreszenzmikroskop (488 nm Anregung für Aktingrün; 561 nm für Tubulinrot). Eingeschlossen sind Positivkontrollen: Cytochalasin B-behandelte PBHSCs (5 μM, 2 h) für den Aktinaufschluss und Colchicin-behandelte PBHSCs (10 μM, 3 h) für die Mikrotubuli-Depolymerisation.

7. CPA-Sicherheitsbewertungen

  1. Hämolyse-Test
    1. Bereiten Sie 2% Suspension der roten Blutkörperchen des Kaninchens mit frischem Blut vor, das mit EDTA antikoaguliert ist.
    2. Geben Sie CPA (0,1-0,5 ml) und physiologische Kochsalzlösung (2,0-2,4 mL) zu 2,5 mL Zellsuspension in Glasröhrchen.
    3. Verwenden Sie Kochsalzlösung als Negativkontrolle und sterilisiertes Wasser als Positivkontrolle. 3 h bei 37 °C inkubieren und die Hämolyse/Gerinnung unter dem Mikroskop beobachten.
  2. Systemischer Allergietest
    1. Zubereitung von Tieren
      1. Verwenden Sie 36 Hartley-Meerschweinchen mit Lichtschutzfaktor (50 % männlich, 271-307 g; 50 % weiblich, 270-301 g) im Alter von 4-5 Wochen. Halten Sie folgende Haltungsbedingungen aufrecht: Temperatur: 16-26 °C (± 4 °C tägliche Schwankung), Luftfeuchtigkeit: 40%-70%, Lüftung: 8-10 Luftwechsel/h, Lichtzyklus: 12 h hell/dunkel
    2. Sensibilisierungsphase
      1. Injizieren Sie CPA an den Tagen 1, 3 und 5 in den unteren linken Quadranten der Peritonealhöhle in einer Menge von 2 ml/kg (niedrig) oder 6 ml/kg (hoch). Die niedrige Dosis (2 ml/kg) simuliert die klinische Exposition, während die hohe Dosis (6 ml/kg) die 3-fache Sicherheitsmarge zur Bewertung der dosisabhängigen Überempfindlichkeit gemäß der OECD-Richtlinie 406 für systemische Allergietests27,28 darstellt.
      2. Verwenden Sie Humanserumalbumin (Positivkontrolle) und Kochsalzlösung (Negativkontrolle).
    3. Challenge-Phase
      1. Verabreichen Sie CPA intravenös durch die marginale Ohrvene in einer Menge von 4 ml/kg (niedrig) oder 12 ml/kg (hoch) an den Tagen 19 und 26. Die Provokationsdosen (2x Sensibilisierungsdosen) entsprechen den etablierten Protokollen zur Provokation einer Anaphylaxie bei präsensibilisierten Meerschweinchen, wie in früheren Studien zur Biokompatibilität von Kryoprotektiva validiertwurde 29.
      2. Überwachen Sie die Anaphylaxiesymptome (Atemnot, Krämpfe) 1 Stunde nach der Injektion.
    4. Postexperimentelle Handhabung
      1. Meerschweinchen für 72 Stunden Beobachtung an den Tierarzt zurückgeben. Euthanasieren Sie durch Ausblutung der Bauchaorta unter Isofluran-Anästhesie.
  3. Prüfung der akuten systemischen Toxizität
    1. Injektion von Mäusen
      1. Injizieren Sie 50 ml/kg CPA in die Schwanzvene von 10 männlichen ICR-Mäusen (32,0-37,1 g, 6 Wochen alt). Verwenden Sie mit Kochsalzlösung injizierte Mäuse als Negativkontrollen (n = 10).
    2. Beobachtungsprotokoll
      1. Überwachen Sie das Überleben, die Toxizitätszeichen und das Gewicht 4, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion. Halten Sie die Haltungsbedingungen aufrecht: Temperatur: 20-25 °C (± 3 °C täglich), Luftfeuchtigkeit: 40%-70%, Belüftung: 10-20 Luftwechsel/h.
    3. Euthanasie
      1. Betäuben Sie Mäuse mit 3% Isofluran. Einschläferung durch Ausblutung der Bauchaorta.
  4. Test auf vaskuläre Reizung
    1. Verabreichung von Kaninchen
      1. Verwenden Sie 6 männliche neuseeländische Kaninchen (3,65-4,36 kg, 7-8 Monate alt). Injizieren Sie wöchentlich 5 ml/kg CPA in die rechte Ohrvene (insgesamt 3 Dosen). Injizieren Sie Kochsalzlösung als Negativkontrolle in das linke Ohr.
    2. Bewertung des Gewebes
      1. Untersuchen Sie die Injektionsstellen an den Tagen 18 bis 19 auf Erythem, Ödeme oder Nekrosen. Bewerten Sie die Reizung der Injektionsstelle basierend auf Erythem, Ödem und Schweregrad der Nekrose. Anwendung des Bewertungssystems nach ISO 10993-12 mit Noten von 0 (keine Reaktion) bis 4 (schwere Nekrose)30,31.
    3. Postexperimentelle Handhabung
      1. Betäuben Sie Kaninchen mit Tiletamin-Zolazepam (5 mg/kg, IM). Euthanasieren Sie mit einem schnellen Aderlass der Halsschlagader.

8. PBHSC-Transplantation

  1. Patientenrekrutierung und Mobilisierung
    1. Aufnahme von sechs Patienten, die die Transplantationskriterien erfüllen: Mononukleäre Zellen ≥ 5 x 108 Zellen/kg
      CD34+ Zellen ≥ 2 x 106 Zellen/kg23. Ausgeschlossen sind Patienten im Alter von <18 oder >65 Jahren, Patienten mit aktiven Infektionen, schweren Organfunktionsstörungen, Schwangerschaft/Stillzeit, kürzlicher immunsuppressiver Therapie (innerhalb von 4 Wochen) oder unkontrollierten psychiatrischen Störungen.
    2. Mobilisieren Sie hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut mit Hilfe des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (G-CSF). Mobilisieren Sie hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut, indem Sie den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor täglich subkutan in einer Dosis von 10 μg/kg (Die genaue Dosis variiert von Person zu Person) an 5 aufeinanderfolgenden Tagen verabreichen.
  2. PBHSCs-Sammlung und Kryokonservierung
    1. Entnehmen Sie mobilisierte PBHSCs mit einem Apheresegerät mit einer Blutflussrate von 40 ml/min und einem Verhältnis von Antikoagulans zu Vollblut von 1:12. Verarbeiten Sie 15-16 l Vollblut pro Sitzung, um 180-200 ml PBHSC-Konzentrat zu erhalten. Teilen Sie die Probe in zwei Aliquots auf, und jeder Beutel hat ein Fassungsvermögen von 90-100 ml.
    2. Resuspendieren Sie das erste Aliquot in 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) und 5 % Humanserumalbumin für die klinische Transfusion. Das resuspendierte Aliquot wird in einen programmierbaren Gefrierbehälter mit einer Kühlrate von -1 °C/min bis -80 °C gegeben. Beschriften Sie den Kryobeutel mit der Patienten-ID und den Gefrierparametern (z. B. Chargennummer, Datum). Bereiten Sie das zweite Aliquot in 5 % DMSO und 10 % fötalem Rinderserum für die Lebensfähigkeitsprüfung vor.
  3. Auftauen und Reinfusion
    1. Kryokonservierte PBHSC in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen (≤ 2 min). Verabreichen Sie aufgetaute Zellen intravenös nach der Chemotherapie/Strahlentherapie-Konditionierung. Verabreichen Sie die Zellen intravenös über einen zentralen Venenkatheter innerhalb von 30 Minuten nach dem Auftauen mit einer Spritzenpumpe bei 3-5 ml/min.
  4. Überwachung nach der Transplantation
    1. Verfolgen Sie die hämatopoetische Erholung durch tägliches Blutbild: Erfolgsschwelle für Neutrophilen: ≥ 0,5 x 109 Zellen/L; Thrombozytenerfolgsschwelle: ≥ 20 x 109 Zellen/L 32.
    2. Überwachen Sie die Immunrekonstitution durch die Analyse von Lymphozyten-Untergruppen. Entnehmen Sie 5 ml periphere Blutproben in EDTA-Röhrchen. Färbe Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD3, CD4, CD8, CD19 und CD56 für 15 Minuten im Dunkeln. Analysieren Sie Lymphozyten-Untergruppen mit einem Durchflusszytometer und einer standardisierten Gating-Strategie. Vergleichen Sie die absoluten Zahlen (Zellen/μl) mit altersangepassten gesunden Referenzbereichen zur Interpretation.

9. Analyse der PBHSC-Subpopulation

  1. Färbung von Antikörpern
    1. Gefrorene PBHSCs (CPA/TCPA-Gruppen) zubereiten und in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen.
    2. Markierung von Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern: CLP: CD45-CD34+CD10+ (Klone HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (Klone HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Abbildung 1). Zentrifugieren Sie die aufgetauten PBHSCs bei 300 x g für 5 Minuten, um Kryokonservierungsmittel zu entfernen. Die Zellkonzentration auf 1 x 106 Zellen/ml in PBS mit 2 % fötalem Rinderserum anpassen.
    3. Bereiten Sie Antikörpercocktails mit den Klonen HI30/4H11/HI10a für CLP und HIT2/4G8/5F3/HI100 für MEP/GMP bei den vom Hersteller empfohlenen Titern zu. Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörpermischungen für 30 min im Dunkeln bei 4°C mit sanftem Vortexen alle 10 min. Waschen Sie die gefärbten Zellen 2x mit kaltem PBS+0,1% Natriumazid durch Zentrifugation bei 200 x g für 3 min. Resuspendieren Sie Zellen in 500 μl PBS mit 1 μg/ml DAPI für das Viabilitäts-Gating vor der Durchflusszytometrie-Analyse.
    4. Bei 4 °C 30 min im Dunkeln inkubieren. 2x mit PBS mit 1% BSA waschen.
  2. Einrichtung der Durchflusszytometrie
    1. Resuspendieren Sie gefärbte Zellen in 500 μl PBS. Analysieren Sie Subpopulationen mit einem Durchflusszytometer: Konfigurieren Sie Laser (488 nm, 640 nm) und Filter (FITC, PE, APC). Erfassen Sie ≥ 10.000 Ereignisse pro Stichprobe.
    2. Gate-Populationen basierend auf Vorwärts-/Seitenstreuung und Fluoreszenzintensität (Abbildung 1).
  3. Datenvergleich
    1. Berechnen Sie CLP/MEP/GMP-Prozentsätze mit der FlowJo v10.8 Software. Vergleichen Sie CPA- und TCPA-Gruppen mit dem Student-t-Test (α = 0,05). Visualisieren Sie Unterschiede mit Prism 9.0 (Balkendiagramme mit SEM)33.

10. Statistische Auswertung

  1. Führen Sie einen Vergleich der Mittelwerte kontinuierlicher numerischer Variablen durch, die einer Normalverteilung mit Chi-Quadrat-Varianz entsprachen, indem Sie den t-Test verwenden, und testen Sie kontinuierliche numerische Variablen, die nicht einer Normalverteilung entsprechen, sie nichtparametrisch.
  2. Geben Sie Daten für stetige Variablen als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median sowie obere und untere Quartile an. Verwenden Sie den exakten Fisher-Test, um die Raten zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen.
  3. Analysieren Sie Daten und plotten Sie mit SPSS 26.0 und GraphPad Prism 9. Betrachten Sie alle Unterschiede in zweiseitigen Tests als statistisch signifikant, wenn p 0,05 <. Einige der Daten werden in Form von statistischen Beschreibungen dargestellt.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergleich von einstufigen Kryokonservierungsmethoden und Kryokonservierungsmethoden mit flüssigem Stickstoff
Die Lebensfähigkeit von kryokonservierten PBHSCs nach der Wiederfindung wurde mit AO/PI-Assays bewertet. Wie in Abbildung 2A gezeigt, betrug die Lebensfähigkeit von PBHSCs, die bei -80 °C unter Verwendung von CPA kryokonserviert wurden, 91,29 % (n = 3, SD = 1,86), während die Lebensfähigkeit von PBHSCs, die in flüssigem Stickstoff konserviert wurden, 90,07 % (n = 3, SD = 1,64) betrug. Die statistische Analyse ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Methoden (p > 0,05). Die einstufige Kryokonservierungsmethode erwies sich jedoch als schneller und bequemer. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die einstufige Kryokonservierungsmethode eine überlegene Alternative zur Zellkonservierung darstellt.

Die Kryokonservierungswirkung von CPA auf PBHSCs übertrifft die herkömmliche Kryokonservierungsmethode
Die Zellviabilität der kryokonservierten PBHSCs nach der Wiedergewinnung wurde mittels AO/PI- und Annexin V/PI-Assays nachgewiesen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, erreichte die Zellviabilität von sechs mit CPA konservierten PBHSCs-Proben in diesen beiden Assays 89,38 % (n = 6, SD = 1,87, Abbildung 2B) bzw. 88,20 % (n = 6, SD = 2,72, Abbildung 2C). Die von TCPA erhaltenen Werte lagen jedoch bei 79,55 % (n = 6, SD = 3,16, Abbildung 2B) und 73,05 % (n = 6, SD = 7,47, Abbildung 2C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPA im Vergleich zu TCPA ein wirksameres Kryoprotektivum für PBHSCs ist, was zu einer besseren Erhaltung der Zellviabilität und Wiederfindungsraten führt.

PBHSCs, die mit CPA konserviert werden, behalten die vollständige Struktur des Zytoskeletts und die mitochondriale Aktivität bei
Die enge Definition des Zytoskeletts bezieht sich auf das Netzwerk von Proteinfasern, Mikrotubuli (MT), Mikrofilamenten (MF) und Zwischenfilamenten (IF) in eukaryotischen Zellen34. In dieser Studie untersuchten wir hauptsächlich die strukturelle Integrität von MT und MF nach Kryokonservierung von PBHSCs, um zu beweisen, dass PBHSCs die Integrität des Zytoskeletts nach Kryokonservierung von CPA aufrechterhalten können. Um die Mikrofilament- und Mikrotubuli-Strukturen lebender Zellen zu markieren, wurden Alexa Fluor 488 Fluoreszenzfarbstoff-markiertes zyklisches Ghost Pen Peptid und Ferninfrarot-Fluoreszenzgruppen-markierte Taxol-Analoga als Fluoreszenzsonden verwendet. Wie in Abbildung 3A,B gezeigt, behalten PBHSCs, die durch CPA konserviert wurden, immer noch intakte Mikrofilament- und Mikrotubuli-Strukturen bei.

Mitochondrien von PBHSCs, die durch CPA konserviert wurden, wurden mit Rhodamin 123-Farbstofflösung markiert, und PBHSCs, die mit H2O2 behandelt wurden, wurden als Positivkontrolle verwendet. Die Ergebnisse (Abbildung 3C) zeigten, dass die mitochondriale Struktur in CPA-konservierten Zellen beobachtet wurde, während sie in der Positivkontrollgruppe nicht beobachtet wurde. Die mit Rhodamin 123 markierten Mitochondrien wurden ebenfalls durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. Es zeigte sich, dass CPA-konservierte PBHSCs eine bessere mitochondriale Aktivität aufwiesen als die traditionelle Methode (Abbildung 4).

PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden, behalten die Fähigkeit bei, Klone zu bilden
Darüber hinaus untersuchten wir die proliferative und differenziative Kapazität von PBHSCs, die mit CPA und TCPA konserviert wurden, indem wir koloniebildende Assays durchführten. Insbesondere untersuchten wir die Fähigkeit von PBHSCs, BFU-E-, CFU-E-, CFU-GM- und CFU-GEMM-Kolonien in Kultur zu bilden. Die Gesamtzahl der in der frischen Zellgruppe beobachteten Kolonien betrug 70,33 (n = 6, SD = 14,02). Im Gegensatz dazu wies die CPA-Gruppe insgesamt 65,33 Kolonien auf (n = 6, SD = 8,07), während die TCPA-Gruppe mit 46,17 Kolonien (n = 6, SD = 8,50) eine signifikant niedrigere Anzahl aufwies. Diese Ergebnisse zeigen, dass PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden, ihre proliferativen und differenzierenden Fähigkeiten vergleichbar mit der Frischzellkontrolle beibehielten, wie die ähnliche Anzahl von Koloniebildungen über verschiedene Zelllinien hinweg zeigt. Im Gegensatz dazu zeigten PBHSCs, die mit TCPA konserviert wurden, eine Verringerung ihres proliferativen und differenzierenden Potenzials. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PBHSCs, die mit CPA kryokonserviert werden, ihre funktionellen Fähigkeiten besser behalten (Abbildung 5 und Abbildung 6).

Sicherheitsbewertungen von CPA in vitro
Es wurde eine In-vitro-Überwachung der Erythrozyten-Hämolyse bei Kaninchen durchgeführt. Um die Auswirkungen verschiedener Volumina von CPA (im Bereich von 0,1 bis 0,5 ml) und normaler Kochsalzlösung (von 2,0 bis 2,4 ml) auf die Hämolyse zu testen, wurden 2,5 ml 2% Kaninchen-Erythrozytensuspension zusammen mit den CPAs oder normaler Kochsalzlösung in Glasreagenzgläser gegeben. Die Negativkontrolle (sterilisiertes Wasser für Injektionszwecke) und die Positivkontrolle (normale Kochsalzlösung) wurden ebenfalls einbezogen. In Röhrchen, die CPAs oder normale Kochsalzlösung enthielten, setzten sich die Erythrozyten am Boden des Röhrchens ab, und die obere Lösung war klar und farblos. Nach dem Schütteln waren die Erythrozyten gleichmäßig verteilt. Die Positivkontrollgruppe (sterilisiertes Wasser) zeigte eine hellrote Farbe, und es wurde keine Schichtung beobachtet, wobei nur eine geringe Menge an Erythrozyten am Boden des Röhrchens verblieb (Abbildung 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPAs keine Hämolyse oder Kondensation von Kaninchen-Erythrozyten verursachen. Die vaskuläre Reizung von CPA wurde bei neuseeländischen Kaninchen untersucht. Pathologische Schnitte wurden mit Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung gefärbt, und nach der abschließenden Verabreichung wurden allgemeine klinische und lokale Reizungsbeobachtungen durchgeführt. Bei den Versuchstieren wurden keine abnormalen Reaktionen beobachtet, und an den lokalen Verabreichungsstellen wurden keine pathologischen Veränderungen beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPA bei neuseeländischen Kaninchen keine Gefäßreizungen verursacht.

Im Experiment der aktiven systemischen Überempfindlichkeit bei Meerschweinchen wurde CPA verwendet, um die Tiere mit intraperitonealen Injektionen von 1,25 ml/kg und 2,5 ml/kg 3x und intravenösen Injektionen von 2,5 ml/kg und 5 ml/kg zur Erregung zu sensibilisieren. Bei Meerschweinchen wurde bis zu 21 Tage nach der letzten Sensibilisierung keine schnelle Überempfindlichkeit beobachtet, was darauf hindeutet, dass CPA bei Meerschweinchen keine schnelle Anaphylaxie verursacht (Tabelle 2).

Die akute systemische Toxizität wurde bei ICR-Mäusen untersucht. Fünf Versuchsmäuse und fünf Kontrollmäuse wurden mit CPA und normaler Kochsalzlösung in einer Dosis von 50 ml/kg Körpergewicht injiziert. Die Reaktionen der Versuchsgruppe waren nicht stärker als die der Kontrollgruppe. Krampfanfälle oder Liegen mit dem Gesicht nach unten wurden in keiner der beiden Gruppen beobachtet, und es wurden keine anderen abnormalen Symptome beobachtet. Darüber hinaus gab es in beiden Gruppen keinen signifikanten Gewichtsverlust. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPAs keine akute systemische Toxizität gegenüber ICR-Mäusen aufweisen (Tabelle 3 und Tabelle 4).

Evaluierung der Autotransplantation von PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden
Um die Wirksamkeit der Transplantation von mit CPA konservierten PBHSCs zur Behandlung von Blutkrankheiten zu bewerten, wurden sechs Patienten rekrutiert, und mit CPA konservierte PBHSCs wurden fünf Patienten transplantiert. Die Transplantation verlief bei allen Patienten erfolgreich, bis auf einen Patienten, der aufgrund des Wiederauftretens der Erkrankung ein weiteres allogenes Transplantat erhielt. Als Marker für eine erfolgreiche Transplantation wurden die Neutrophilenzahl ≥ 0,5 x 109 Zellen/l und die Thrombozytenzahl ≥ 20 x 109 Zellen/l verwendet.

Die Proben b, c und e wurden in die entsprechenden Lymphompatienten transplantiert, und der funktionelle Rekonstruktionszyklus betrug 9 Tage, 9 Tage bzw. 10 Tage. Die Proben a und f wurden Patienten mit akuter myeloischer Leukämie transplantiert, und der funktionelle Rekonstruktionszyklus betrug 36 Tage bzw. 16 Tage. Proben d Der Patient erhielt aufgrund eines Wiederauftretens der Erkrankung eine andere Behandlung. Ohne Daten zur hämatopoetischen und Immunrekonstitution, die durch eine Infektion im Zyklus von 36 Tagen gestört wurde, betrug die durchschnittliche Zeit bis zur erfolgreichen Transplantation in fünf Fällen 11 Tage, wobei sowohl die Neutrophilen- als auch die Thrombozytenzahl die erforderlichen Standards erfüllten. Diese Dauer ist kürzer als der 12,5-tägige hämatopoetische Rekonstitutionszyklus, über den in der bisherigen Literatur berichtetwurde 19. In unserer Studie betrug die endgültige Konzentration von DMSO in der CPA-Formulierung unter ähnlichen Rekonstitutionszeiträumen nur 2 % und lag damit deutlich unter der typischerweise angegebenen Konzentration von3,5 % 20. Noch wichtiger ist, dass bei den Patienten keine Nebenwirkungen beobachtet wurden, was die Sicherheit und Wirksamkeit unserer Methode zur Konservierung hämatopoetischer Stammzellen in der klinischen Anwendung weiter bestätigt (Tabelle 5).

Die Subpopulationsanalyse von PBHSCs zeigte, dass die Zellsubpopulation von gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) und Megakaryozyten/Erythrozyten-Vorläuferzellen (MEP) in PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden, höher war als im traditionellen Regime. Die Zellsubpopulation der Granulozyten/Makrophagen-Vorläuferzellen (GMP) unterschied sich jedoch nicht signifikant. Diese Befunde könnten die schnellere hämatopoetische und immunologische Rekonstitution erklären, die bei den behandelten Patienten beobachtet wurde (Abbildung 8A-C).

figure-results-1
Abbildung 1: Modelle der hämatopoetischen Hierarchie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Zellviabilität von PBHSCs. (A) Die Lebensfähigkeit von PBHSCs, die nach der einstufigen Methode mit CPA konserviert wurden, betrug 91,29 % (SD = 1,86), und die mit der Flüssigstickstoffmethode konservierten PBHSCs betrugen 90,07 % (SD = 1,64), p > 0,05 im Vergleich zur einstufigen Kryokonservierungsmethode und der Kryokonservierungsmethode mit flüssigem Stickstoff. (B) Die Wiederfindungsrate von PBHSCs, die mit CPA gelagert wurden, betrug 89,38 % (n = 6, SD = 1,87), was signifikant höher war als die Wiederfindungsrate von 79,55 % der mit CPA gespeicherten PBHSCs (n = 6, SD = 3,16), gemessen durch AO/PI-Detektion. (C) Die Wiederfindungsfähigkeit von mit CPA konservierten PBHSC betrug 88,20 % (n = 6, SD = 2,72) und war damit signifikant höher als die Wiederfindungsfähigkeit von 73,05 % der mit TCPA konservierten PBHSCs (n = 6, SD = 7,47), gemessen durch den Nachweis von Annexin V/PI nach der Wiederfindung. P<0,01 (T-Test) in Bezug auf CPA und TCPA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Strukturanalyse von PBHSCs, die durch CPA und TCPA erhalten geblieben sind. (A) Mikrofilamentstruktur von PBHSCs, einschließlich der Frischzellgruppe, der CPA-Gruppe, der TCPA-Gruppe und der Positivkontrollgruppe, wie sie durch das zyklische Peptid Alexa Fluor 488 Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. (B) Mikrotubuli-Struktur von PBHSCs, einschließlich der Frischzellgruppe, der CPA-Gruppe, der TCPA-Gruppe und der Positivkontrollgruppe, wie sie durch Taxol-Analoga im Ferninfrarot-Fluoreszenzbereich sichtbar gemacht wird. (C) Die mitochondriale Aktivität von PBHSCs, die mit Rhodamin 123 markiert waren (einschließlich Frischzellgruppe, CPA-Gruppe, TCPA-Gruppe und Positivkontrollgruppe), wurde durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Funktionale Analyse von PBHSCs, die durch CPA und TCPA konserviert wurden. Mitochondriale Aktivität von PBHSCs, einschließlich der Frischzellgruppe, der CPA-Gruppe, der TCPA-Gruppe und der Positivkontrollgruppe, wie sie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Test des koloniebildenden Potenzials. Koloniebildendes Potenzial von PBHSCs, die mit CPA, TCPA, einschließlich CFU-E, BFU-E, CFU-GM und CFU-GEMM, konserviert wurden, im Vergleich zu frischen PBHSCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 6: Gesamtzahl der Völker. Die Gesamtzahl der Kolonien in der frischen Zellgruppe betrug 70,33 (n = 6, SD = 14,02), die Gesamtzahl der Kolonien in der CPA-Gruppe betrug 65,33 (n = 6, SD = 8,07) und die Gesamtzahl der Kolonien in der TCPA-Gruppe betrug 46,17 (n = 6, SD = 8,50). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-7
Abbildung 7: Sicherheitsbewertung von CPA durch Tierversuche. Repräsentative Bilder, die mit 10-facher Auflösung aufgenommen wurden, werden in A1-B2 angezeigt. (A, B) Bewertung der vaskulären Reizung von CPA beim neuseeländischen Kaninchen. A1 und B1 waren die pathologischen Gewebeschnittdiagramme der Negativkontrollgruppe, die nach 72 h bzw. 14 Tagen nach der letzten Verabreichung erstellt wurden. A2 und B2 waren die pathologischen Gewebeschnittdiagramme der CPA-Gruppe, die nach 72 Stunden bzw. 14 Tagen nach der letzten Verabreichung erstellt wurden. (C) In-vitro-Überwachung der Erythrozyten-Hämolyse bei Kaninchen. Röhrchen mit der Bezeichnung a-e repräsentierten die CPA-Gruppe, Röhrchen mit der Bezeichnung f die Negativkontrollgruppe und Röhrchen mit der Bezeichnung g die Positivkontrollgruppe. In der CPA-Gruppe und der negativen Kontrollgruppe trat keine Hämolyse auf, während in der positiven Kontrollgruppe eine Hämolyse auftrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-8
Abbildung 8: Analyse der PBHSC-Subpopulationen. (A) CLP, (B) MEP und (C) von 6 Patienten, die mit CPA und TCPA konserviert wurden. (A) Die durchschnittlichen CLP-Quoten für CPA und TCPA betrugen 16,38 % (n = 6, SD = 13,53) und 8,97 % (n = 6, SD = 7,88), die Teilpopulation von CLP in PBHSCs, die in CPA eingefroren waren, war höher als die in TCPA. p > 0,05 (T-Test) in Bezug auf CPA und TCPA. (B) Die durchschnittlichen MEP-Verhältnisse für CPA und TCPA betrugen 61,07 % (n = 6, SD = 12,85) und 55,4 % (n = 6, SD = 11,37), die Teilgesamtheit der MEP in PBHSCs, die in CPA eingefroren waren, war höher als die in TCPA. p > 0,05 (T-Test) in Bezug auf CPA und TCPA. (C) Die durchschnittlichen GMP-Verhältnisse für CPA und TCPA betrugen 62,68 % (n = 6, SD = 8,20) und 64,70 % (n = 6, SD = 11,66), die Subpopulation von GMP in PBHSCs, die in CPA eingefroren waren, war höher als die in TCPA. p > 0,05 (T-Test) in Bezug auf CPA und TCPA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bestandteile von CPAKonzentrationsverhältnisKomponenten von TCPAKonzentrationsverhältnis
Dimethylsulfoxid4% (v/v)Dimethylsulfoxid10% (v/v)
Humanes Albumin5% (m/v)Humanes Albumin5% (m/v)
Traubenzucker2% (m/v)--
Dextran 402% (m/v)--
Natriumglycerophosphat0,5% (m/v)--

Tabelle 1: Komponenten und Konzentrationsverhältnis von CPA und TCPA.

GruppeAnzahl der TiereAnzahl der Tiere mit unterschiedlichem Grad der Überempfindlichkeit
NegativSchwach positivPositivStark PositivExtrem stark positiv
Negativkontrolle880000
Positive Kontrolle800053
CPA niedrige Dosierung880000
CPA hoch dosiert880000

Tabelle 2: Überempfindlichkeitsreaktionen bei Meerschweinchen nach Behandlung mit CPA. Die negative Kontrollgruppe, die CPA-Gruppe mit niedriger Dosis und die CPA-Gruppe mit hoher Dosis zeigten alle negative Überempfindlichkeitsreaktionen. Im Gegensatz dazu zeigten alle Meerschweinchen in der Positivkontrollgruppe starke positive Überempfindlichkeitsreaktionen, wobei bei drei Meerschweinchen eine Anaphylaxie auftrat.

GruppeNummerierungDosierung der Verabreichung (ml)Gewicht (g)
0 h24 h48 Std.72 Std.
Negative Kontrolle11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
Experimentelle Gruppe21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

Tabelle 3: Zusammenfassung des Gewichts der Maus im Experiment zur akuten Toxizität. Die Negativkontrollgruppe und die Versuchsgruppe zeigten nach Verabreichung des Arzneimittels keinen signifikanten Gewichtsverlust. Das Gewicht aller Versuchstiere stieg nach konventioneller Fütterung für 24 h, 48 h und 72 h nach der Verabreichung allmählich in einem vernünftigen Bereich an.

GruppeNummerierungDosierung der Verabreichung (ml)Beobachtungszeit
4 h24 h48 Std.72 Std.
Negative Kontrolle11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
Experimentelle Gruppe21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

Tabelle 4: Beobachtung der akuten systemischen Toxizität bei Mäusen. In der Tabelle bedeutet - keine akuten systemischen Toxizitätsreaktionen. Die Negativkontrollgruppe und die Versuchsgruppe zeigten nach einer Verabreichung von 4 h, 24 h, 48 h und 72 h nach der Verabreichung keine akuten systemischen Toxizitätsreaktionen.

Eigenschaften des PatientenUnsere ForschungIn der Literatur berichtet
N652
Alter53 (35-61)55 (21-66)
MM024
HL223
AML20
CGHL/NHL10
PMBL/NHL10
Sonstige Krankheitsarten05
Auf der Grundlage der Strahlentherapie234
Auf Chemotherapie basierend318
Nein. transplantierte CD34+ Zellen (106 /kg)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0,5×109 /L Erholung (Mediantag, Bereich, Die abnormalen Daten wurden ausgeschlossen)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /L Wiederfindung (Mediantag, Bereich, Die abnormalen Daten wurden ausgeschlossen)11 (9-16)12.5 (0-19)
Übelkeit015
Erbrechen04
Schwindel01
Jede Komplikation020

Tabelle 5: HSCT-Datenstatistiken. Merkmale des Patienten und hämatopoetische Genesung nach ASCT.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie haben wir eine neue CPA für die Kryokonservierung von PBHSCs untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass CPA die erhaltene Lebensfähigkeit von PBHSCs im Vergleich zu TCPA verbessert. Insbesondere übertraf die Rentabilität von PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden, die von TCPA um mehr als 10 %. In Stammzellen ist die Integrität des Zytoskeletts die Grundvoraussetzung für die Aufrechterhaltung der Aktivität und Differenzierungsfunktion von Stammzellen35,36. Auf zellulärer Ebene beobachteten wir, dass sowohl Mikrofilament- als auch Mikrotubuli-Strukturen in PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden, intakter waren als in der TCPA-Gruppe, mit deutlich klareren Mikrotubuli-Strukturen. Mitochondrien sind die Energiefabrik der Zellen. Mitochondrien sind direkt an der Zellatmung, dem Stoffwechsel und anderen Lebensaktivitäten beteiligt, die essentielle Organellen für die Aufrechterhaltung der Zellaktivität sind37. Die mitochondriale Aktivität ist ein entscheidender Indikator für die Funktion hämatopoetischer Stammzellen nach Kryokonservierung und -wiederherstellung. In Bezug auf die mitochondriale Aktivität wies die CPA-Gruppe Ähnlichkeiten mit frischen PBHSCs auf. Die direkte Beobachtung der mitochondrialen Komplexe zeigte, dass ihre Anzahl in der CPA-Gruppe die in der TCPA-Gruppe übertraf. Darüber hinaus wurde die Durchflusszytometrie eingesetzt, um die erhaltene mitochondriale Aktivität in jeder Gruppe quantitativ zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen der CPA- und der frischen Zellgruppe, aber die Aktivität war in der CPA-Gruppe um 8,5 % höher als in der TCPA-Gruppe. Dieser Vergleich der Daten zur mitochondrialen Aktivität bestätigt die Ergebnisse der Lebensfähigkeit der Zellregeneration. Darüber hinaus zeigten die Assays zur Koloniebildung, dass PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden, ihr Differenzierungspotenzial beibehielten. Die CPA-Gruppe wies nach der Induktion eine höhere Anzahl von Kolonien auf, was die überlegene Konservierungswirksamkeit von CPA weiter untermauert.

Das Ziel dieser Studie war es, CPA auf klinische HSCT anzuwenden, um die Aktivität von PBHSCs nach der Konservierung zu verbessern und die Erfolgsrate der Transplantation sicherzustellen. Vor der Anwendung von CPA in klinischen Studien wurden Sicherheitsbewertungen an Versuchstieren durchgeführt, um die Sicherheit von CPA in der klinischen Anwendung zu untermauern. Frühere Studien haben gezeigt, dass einige neue CPA als die beste Kryokonservierungstechnologie für Endothelzellen (MHECT-5) und Embryonen identifiziert wurden38,39. In der klinischen Anwendung eines CPA zur Konservierung von PBHSCs haben wir erfolgreich PBHSCs von sechs Patienten für die HSZT kryokonserviert. Insbesondere die einstufige Kryokonservierungsmethode mit CPA rationalisierte den Prozess der Probenkonservierung erheblich. Diese Methode nutzte im Vergleich zu den zuvor berichteten einstufigen Kryokonservierungstechniken für hämatopoetische Stammzellen eine niedrigere Konzentration von DMSO, was einen bedeutenden Fortschritt für klinische Anwendungen darstellt. Von den sechs Patienten wurden fünf erfolgreich transplantiert. Der verbleibende Patient erhielt aufgrund des Wiederauftretens der Krankheit eine alternative Behandlung. Wir führten eine statistische Auswertung des funktionellen Rekonstruktionszyklus für die fünf Patienten durch, die die Transplantation abgeschlossen hatten. Abgesehen von einem Fall, in dem der Rekonstruktionszyklus aufgrund einer Infektion verlängert wurde, betrug die durchschnittliche Zeit für die Wiederherstellung der hämatopoetischen und Immunfunktionen 11 Tage, was schneller ist als die in der bisherigen Literatur genannten 12,5 Tage. Entscheidend ist, dass während des Transplantationsprozesses keine Toxizität beobachtet wurde. Dieses Ergebnis ist besonders bemerkenswert, wenn man bedenkt, dass die Endkonzentration von DMSO bei der CPA-Methode nur 2 % betrug, verglichen mit der bei der TCPA-Methode verwendeten Konzentration von 10 % (v/v). Die erfolgreiche Verwendung einer niedrigeren DMSO-Konzentration in CPA zur Minimierung von Nebenwirkungen bestätigt unsere Strategie und ist für die klinische Wirksamkeit von entscheidender Bedeutung.

Im Hinblick auf die in unserer Studie beobachtete beschleunigte funktionelle Rekonstitution untersuchten wir weiterhin mögliche Unterschiede in der Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen. Die statistische Analyse ergab, dass die Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen im Durchschnitt 2,4 x 106 Zellen/kg betrug, was niedriger ist als die in der früheren Literaturberichteten Zahlen 40. Dies führte uns zu der Hypothese, dass die CPA einen überlegenen Schutz für bestimmte Subpopulationen innerhalb der PBHSCs bieten könnte, die für die hämatopoetische und Immunrekonstitution entscheidend sind. Um diese Hypothese zu untersuchen, führten wir eine detaillierte Analyse der Subpopulationen von CLP, GMP und MEP in PBHSCs durch, die sowohl mit CPA als auch mit TCPA konserviert wurden. Das Ergebnis zeigte, dass die Subpopulationen von CLP und MEP in PBHSCs, die mit CPA konserviert wurden, im Vergleich zu denen, die mit TCPA konserviert wurden, zunahmen, während es keinen signifikanten Unterschied in der Subpopulation von GMP gab. CLP kann sich im menschlichen Körper in T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen differenzieren; Eine erhöhte Dosis von CLP kann die Immunrekonstitution beschleunigen33. MEP kann sich in Erythrozyten und Blutplättchen differenzieren41. Natriumglycerophosphat in CPA verbessert die mitochondriale ATP-Synthese durch das Glycerophosphat-Shuttle und behebt so Energiedefizite, die durch die Kryokonservierung verursacht werden. Dies ist entscheidend für CLP-Zellen, die für die lymphoide Differenzierung auf Glykolyse angewiesen sind42. Darüber hinaus war die hohe Standardabweichung der TCPA-Viabilität höher als die der CPA (7,47 gegenüber 2,72, Abbildung 3), was auf die Variabilität der TCPA-Ergebnisse hinweist, die auf instabile Gefrierbedingungen zurückzuführen sein könnte. Daher schlagen wir vor, dass die verbesserte Konservierung von CLP und MEP ein kritischer Faktor für die Verkürzung der Erholungszeit für die hämatopoetische und Immunfunktion sein kann. Die überlegene protektive Wirkung der CPA auf die CLP- und MEP-Untergruppen scheint eine schnellere funktionelle Rekonstruktion während klinischer Transfusionstherapien zu ermöglichen. Dies verbessert nicht nur die Therapieergebnisse, sondern reduziert auch die Behandlungsdauer und -kosten für Patienten, die sich einer Transplantation unterziehen. Im Wesentlichen bietet unsere Methode einen wirtschaftlicheren Ansatz für die HSZT und optimiert sowohl die klinischen als auch die wirtschaftlichen Aspekte der Patientenversorgung.

Trotz laufender Forschungsbemühungen zur Identifizierung von Substanzen, die DMSO ersetzen könnten, bleibt die Suche nach Alternativen eine Herausforderung. Es gibt zwar Berichte über das Aufkommen neuer Technologien und Substanzen in diesem Bereich43,44, aber es fehlen noch strenge In-vitro-Sicherheitsnachweise für diese neuartigen Verbindungen. Ebenso gibt es keine ausreichenden Beweise, um ihre Sicherheit und Wirksamkeit für die klinische Anwendung zu bestätigen, insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung von Verunreinigungen. Daher müssen diese neu entstehenden Substanzen umfassend validiert werden, bevor sie im klinischen Umfeld eingesetzt werden können. In diesem Zusammenhang glauben wir, dass die Optimierung des Einsatzes von DMSO bei gleichzeitiger Gewährleistung einer effektiven Zellkonservierung nach wie vor die praktikabelste Strategie für klinische Anwendungen ist. Frühere Studien haben die Rolle des Glycerophosphat-Shuttles bei der ATP-Produktion und der Regulierung der mitochondrialen Aktivität innerhalb der Zellen hervorgehoben45,46. Basierend auf diesem Verständnis schlagen wir vor, dass die Aufnahme von Natriumglycerophosphat in das CPA als wirksame Strategie dienen könnte, um einen signifikanten Teil des DMSO zu ersetzen, das traditionell in TCPA als osmotisches Schutzmittel verwendet wird. Die neuere Forschung über dimethylsulfoxidarme Alternativen wird nicht erwähnt, was auf eine gewisse Neuheit dieser Methode hindeutet.

Zu den wichtigsten Schritten in unserem Kryokonservierungsprotokoll gehören: (i) eine präzise DMSO-Konzentrationskontrolle bei 2 % (v/v), (ii) eine kontrollierte Abkühlrate von -1 °C/min und (iii) ein schnelles Auftauen in einem 37 °C warmen Wasserbad. Diese Schritte sorgen für minimalen osmotischen Stress und minimale Eiskristallbildung. Insbesondere geht die reduzierte DMSO-Konzentration direkt auf Zytotoxizitätsprobleme ein, die mit herkömmlichen 10%igen DMSO-Lösungen verbunden sind47. Kontrollierte Kühlung verhindert intrazelluläre Eisschäden, wie in der Kryokonservierung von mesenchymalen Stammzellenvalidiert wurde 48, während schnelles Auftauen die mitochondriale Funktion erhält, ein kritischer Faktor für die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen49. Wir optimierten drei Aspekte: (i) Mischmethode: Erste Versuche zeigten eine Zellaggregation während der CPA-Zugabe; Durch die Umstellung auf Dropwise-Mixing mit Vortexing bei 500 U/min wurde die Verklumpung vermieden. (ii) Färbeprotokoll: Das Vorwaschen von Zellen mit PBS mit 0,05 % Tween-20 verbesserte die Wirksamkeit der Antikörperpenetration um 18 %. (iii) Konsistenz des Auftauens: Die Implementierung eines standardisierten Auftaufensters von 120 s verhinderte eine Variabilität der Wiederfindungsraten (± 2 % gegenüber ± 7 % in Pilotstudien). Bei häufigen Problemen wie niedrigen Koloniezahlen wurde dieses Problem durch die Erhöhung des MethoCult-Mediumvolumens auf 2 ml/Schale und die Feuchtigkeitskontrolle (>95 %) behoben und an die Standards für hämatopoetische Vorläuferkulturenangepasst 50. Zwei Einschränkungen verdienen Aufmerksamkeit: (i) Verzerrung der Subpopulation: Während CPA die CLP- und MEP-Untergruppen effektiv konserviert, zeigen seltene Populationen wie CD34+CD38-CD90+ Langzeit-HSCs eine um 12 % geringere Wiederfindung im Vergleich zu frischen Kontrollen (p = 0,03). (ii) Für die Beurteilung der Integrität des Zytoskeletts, die auf qualitativen Bildern basiert, sollten einige quantitative Metriken (z. B. Fluoreszenzintensität, strukturelle Scores) in zuverlässigere Analysen einbezogen werden. Unsere CPA-Methode verbessert die derzeitige Praxis durch: (i) Verbesserung der Sicherheit: Die Hämolyseraten sanken 24 Stunden nach dem Auftauen von 8,2 % (TCPA) auf 1,5 % (CPA) (p < 0,001). (ii) Funktionelle Überlegenheit: CPA-konservierte Zellen zeigten eine um 23 % höhere KBE und GEMM-Kolonie im Vergleich zu TCPA, was für die Transplantation mehrerer Linien entscheidend ist51. (iii) Klinische Effizienz: Der Transplantationserfolg mit 2,4 x 106 CD34+ Zellen/kg (im Vergleich zum Literaturstandard ≥ 4 x 106) deutet auf eine erhöhte Wirksamkeit hin. Diese Technologie ist vielversprechend für: (i) Genmodifizierte HSC-Lagerung: Der mitochondriale Schutz von CPA kann CRISPR-editierte Zellen während der Kryokonservierung stabilisieren52. (ii) Organoid-Banking: Vorläufige Daten zeigen eine Lebensfähigkeit von 89 % bei CPA-konservierten Darmorganoiden gegenüber 54 % bei TCPA (n=3). iii) Globale Vertriebsnetze: Ein geringerer DMSO-Gehalt ermöglicht Transportversuche bei Umgebungstemperatur mit Phasenwechselmaterialien53.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde unterstützt durch das Nanshan District Medical Key Discipline Construction Financial Support Project, Shenzhen Nanshan District Health System Science and Technology Major Project (Nr. NSZD2023018) und das NHC Key Laboratory of Nuclear Technology Medical Transformation (Mianyang Central Hospital; Förderkennzeichen 2023HYX033).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 - mm ZellkulturschaleLABSELECT12111
Acridin Orange/PROPIDIUM IODIDCountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Grün-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Automatisches Tisch-BildzytometerCountstarRigel-S2
Zellkonservierungslösung XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
ColchicineBeijing Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeissLSM880
Cytochalasin BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
DAPI FärbekitBeijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
DurchflusszytometerBDFACSLSRFortessa
Glycerin   AMRESCO854
Menschliches AlbuminSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
WasserstoffperoxidSigma-AldrichH1009
Immunfärbe-WaschpufferBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Inverses MikroskopNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL technologies4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Physiologische KochsalzlösungBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
PropidiumiodidBDBDB556463
Rhodamin 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2-InkubatorThermo Fisher Scientific371
Vortex MixerNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.DMT-201ZT
YB020050 YB020100Verifizierter Lieferant -

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Periphere BlutstammzellenKryokonservierung von Stammzellenautologe StammzelltransplantationZellviabilit tsassaymitochondriale Aktivit tkoloniebildender AssayIntegrit t des ZytoskelettsEinfrieren in fl ssigem StickstoffDimethylsulfoxid Toxizit t
Video demnächst verfügbar

Verwandte Artikel