Methodenartikel

Blaulicht-induzierbare semi-zufällige Mutagenese an spezifischer exogener DNA im Stamm Escherichia coli BL21

DOI:

10.3791/68283

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20. Juni 2025

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das skizzierte Protokoll beschreibt optimierte Methoden zur Erkennung exogener DNA, während Mutationen nur an diesen exogenen DNAs in Escherichia coli erzeugt werden.

Zusammenfassung

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Mutagenese-Technologien sind in der Variationszüchtung, der gerichteten Evolution und dem Protein-Engineering weit verbreitet. Die meisten Methoden können jedoch nur zufällige genomische DNA-Mutationen induzieren, die unkontrollierbar sind und zu Missbildungen oder sogar tödlichen Effekten führen. Durch die Fusion von drei Systemen: Cytosin-Basen-Editor (CBE), Blaulicht-induzierbare p-Mag/n-Mag-Elemente und gespaltene T7-RNA-Polymerase beinhaltet diese skizzierte Methode ein blaulicht-steuerbares, DNA-regionspezifisches, semi-zufälliges Mutagenese-System.

Dieses System kann Cytosin zu Thymin auf DNAs mutieren, beginnend mit dem T7-Promotor und endend mit dem T7-Terminator. Jedes exogene Gen, das dem T7-Promotor nachgeschaltet ist, kann potenziell mutiert sein. Auch diese Werkzeuge wurden in zwei Teilen konstruiert, um das System blaulichtsteuerbar zu machen. Der erste Teil wurde durch die Fusion von CBE mit n-Mag und dem N-terminalen T7-RNA-Polymerase-Gen erstellt. Der zweite Teil umfasste die Fusion von p-Mag mit der C-terminalen T7 RNA-Polymerase. Unter blauem Licht wurden diese beiden Teile so zusammengesetzt, dass sie als Mutationsgenerator auf DNAs zwischen dem T7-Promotor und dem T7-Terminator fungieren. Ohne blaues Licht wird p-Mag von n-Mag getrennt, wodurch das CBE von der Bearbeitung der DNA befreit wird.

Ziel dieses Protokolls ist es, regionenspezifische Zufallsmutationen in Escherichia coli mit Blaulichtkontrolle zu generieren und die mutierten Plasmide weiter zu validieren. Das System kann an ein In-vivo-Evolutionssystem angepasst werden, in dem die Funktion des interessierenden Gens ausgewählt und die gewünschten Mutationen für weitere Studien gesammelt werden können.

Einleitung

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Zufällige Mutationen und natürliche Selektion sind die Schlüsselkräfte der Evolution, die zu einer großen genetischen Variation zwischen den Arten geführt hat. Der Evolutionsprozess wurde als mächtiges Werkzeug genutzt, um Proteine mit optimierten oder neuartigen Funktionenzu entwickeln 1. Die natürlichen Mutationsraten durch DNA-Replikation wurden auf etwa eins zu 109 Basen pro Zellteilung bei mehreren Prokaryoten und Eukaryoten geschätzt2. Niedrige natürliche Mutationsraten machen es unpraktisch, eine große genetische Vielfalt in Laboratorien zu erzeugen. Die Studien konzentrierten sich auf die Entwicklung von Methoden, die die Mutationsraten erhöhen, um so viele Stellen wie möglich in einem bestimmten Gen innerhalb eines angemessenen Zeitraums abzudecken.

In Labor-Evolutionsstudien wurden mehrere Systeme entwickelt, um höhere Mutationsraten zu erzielen 3,4,5,6,7,8,9,10. In-vitro-Evolutionssysteme nutzen fehleranfällige PCR, ortsgerichtete Sättigungsmutagenese oder computergestütztes Bibliotheksdesign, um Mutationen in Genen von Interesse einzuführen1. Die DNA-Bibliotheken werden in Wirtszellen umgewandelt, wo die Proteinprodukte gescreent oder ausgewählt werden. Die Mutagenese- und Selektionsschritte in der In-vitro-Evolution sind nicht gekoppelt, was die Effizienz und den Umfang der Populationen, die erzeugt werden können, einschränkt11. In vivo Evolutionssysteme haben diese Grenzen überwunden, indem sie Mutationssysteme in Zellen eingeführt und die Mutagenese und Selektionsschritte gekoppelt haben, um eine kontinuierliche Evolution zu ermöglichen. Frühere In-vivo-Mutagenesemethoden verwendeten chemische Mutagene 3,4 und Mutatorstämme 5,6. Diese Methoden leiden jedoch unter niedrigen Mutationsraten, mangelnder Kontrolle und engem oder ungleichmäßigem Mutationsspektrum12. Neuere Studien haben neuartige und verbesserte In-vivo-Evolutionssysteme entwickelt, die durch OrthoRep, ein orthogonales fehleranfälliges DNA-Replikationssystem, repräsentiertwerden 7,8; MutaT7, eine Fusion von Cytidin-Desaminase mit T7-RNA-Polymerase9; und EvolvR, eine Fusion von Nickase Cas9 mit der fehleranfälligen DNA-Polymerase10. Diese Methoden weisen unterschiedliche Wirtszellen, einen anderen Zielkontext und eine einfache Implementierung auf.

Die T7-RNA-Polymerase (T7 RNAP), eine Schlüsselkomponente des MutaT7-Systems, wurde auf dem Gebiet der synthetischen Biologie ausgiebig untersucht und weiterentwickelt. Fragmente von T7-RNAP wurden auf verschiedenen Ebenen zu unterschiedlichen Zeitpunkten co-exprimiert, um einen Ressourcenallokator13 zu bilden. Eine gespaltene T7-RNAP mit C-terminalen Fragmenten unterschiedlicher Promotorspezifität wurde gebaut, um ein UND-Logikgatter14 zu erzeugen. Die Fähigkeit von T7-RNAP-Fragmenten, sich zu einer funktionellen Polymerase zusammenzusetzen, hat zur Entwicklung von licht- und niedermolekularaktivierten Biosensoren geführt, bei denen die Dimerisierung von Interaktionspartnern, die mit jedem der N- und C-terminalen der T7-RNAP fusioniert sind, einen transkriptionellen Output erzeugt15. Die gespaltene T7-RNAP wurde auch mit n-Mag- und p-Mag-Domänen fusioniert, um eine lichtinduzierbare Genexpressionskontrolle in Escherichia coliaufzubauen 16. Bei Aktivierung von blauem Licht dimerisieren die Magnetdomänen und bringen zwei Domänen der gespaltenen T7-RNAP räumlich nahe zusammen, um die Polymerasefunktion auszuführen. Dieses System ermöglicht eine präzise raumzeitliche Kontrolle der Genexpression mit geringer basaler Expression und einem großen dynamischen Bereich.

In diesem Artikel wird ein Protokoll zum Aufbau eines semi-zufälligen Mutagenesesystems mit blauem Licht in vivo vorgestellt (Abbildung 1). Es basiert auf rAPOBEC1-Desaminase, die mit n-Mag-N-T7 RNAP fusioniert ist. Die Co-Expression von p-Mag-C-T7 RNAP aus demselben Plasmid ermöglicht die Blaulichtkontrolle der Polymerase und der Baseneditierungsaktivitäten. Das System kombiniert die Base-Editing-Kapazität von rAPOBEC1 mit lichtgesteuerter Split-T7-RNAP. Es wurde in E. coli unter Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Zielgen validiert, wobei seine Intensität durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ausgewählt wird. Im Vergleich zum ursprünglichen MutaT7-System führt unser blaulichtgesteuertes System semi-zufällige Mutationen im Zielgen ein, indem es das Lichtintervall moduliert. Anstatt das gesamte Cytosin im Zielgen in Uracilbasen umzuwandeln, erzeugt es ein größeres Mutationsprofil, indem es eine Teilmenge der Nukleotide durch Lichtkontrolle editiert. Das System kann leicht an ein in vivo Evolutionssystem angepasst werden, bei dem das GFP durch andere Gene von Interesse ersetzt werden kann und die Funktion nach Zellfitness oder Überleben ausgewählt werden kann.

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Protokoll

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Das folgende Protokoll beschreibt, wie ein exogeneses DNA-Mutagenese-Design mit dem CBE-Mag-T7-Polymerase-Mutagenese-System durchgeführt wird (Schritt 1). Sobald das exogene DNA-Plasmid konstruiert ist, werden Schritte zur Transformation der beiden Plasmide zur Expression der CBE-Mag-T7-Polymerase-Mutagenese im E. coli BL21-Stamm durch Zugabe von Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und anschließender Bestrahlung mit blauem Licht zur Initiierung der Mutagenese beschrieben (Schritte 2-9.2). Die Qualitätskontrollschritte zur Bewertung, wie viele Mutationen entweder auf GFP oder exogener DNA erzeugt wurden, wurden mittels Sanger-Sequenzierung durchgeführt (Schritte 9.3-11.2).

1. Design exogener DNA und Aufbau des CBE-Mag-T7-Polymerase-Mutagenese-Systems

  1. Finden Sie die exogene DNA- oder cDNA-Sequenzierung mit Hilfe von Online-Tools (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene oder https://www.uniprot.org/).
    HINWEIS: Hier haben wir die GFP-Sequenz als exogene DNA für die Cytosin-Mutagenese verwendet.
  2. Ersetzen Sie die gfp-DNA mit der interessierenden DNA unter Verwendung eines geeigneten Klonierungskits.
    HINWEIS: Wir verwenden NheI, um die gfp-DNA im ursprünglichen Plasmid im DNA-Kolonie-Montagekit zu entfernen. Eine Alternative besteht darin, mit Unternehmen für die DNA-Synthese zusammenzuarbeiten. Siehe Ergänzende Datei 1 für die Plasmidsequenz.
  3. Synthetisieren Sie alle Gene zusammen mit dem CBE-Mag-T7-Polymerase-Mutagenese-System und bauen Sie sie in das pET-11a-Rückgrat mit Ampicillin-Resistenz ein.
    HINWEIS: Wir haben mit einem DNA-Syntheseunternehmen zusammengearbeitet, um dieses Plasmid zu entwickeln, und wir haben Glycerin-Stammbakterien erhalten, die unser Zielplasmid enthalten.

2. Aktivierung des Bakterienstamms

  1. Pipettieren Sie 10 μl der Glycerin-Stammbakterien auf den Rand einer LB-Agarplatte, die 100 μg/ml Ampicillin enthält. Streichen Sie die Bakterien von dieser Stelle aus mit einer sterilen Schlaufe über die Platte.
  2. Inkubieren Sie die Platte kopfüber bei 37 °C über Nacht in einem Bakterieninkubator.

3. Plasmid-Amplifikation

  1. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie aus der Platte und inokulieren Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 15 mL LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin.
  2. Stellen Sie die Kultur für 14-16 Stunden bei 37 °C und 180 U/min in einen Schüttelinkubator.

4. Extraktion von Plasmiden

  1. Nehmen Sie 5-15 mL der Bakterienkultur über Nacht und geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 18.894 × g für 1 min.
  2. Sammeln Sie das Bakterienpellet und entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand. Das Bakterienpellet wird in 500 μl Resuspensionspuffer durch Vortexen oder Pipettieren resuspendiert.
  3. Geben Sie 500 μl Lysepuffer in das Röhrchen, mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen 8-10x umdrehen, und lassen Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen, um die Zellen zu lysieren.
    HINWEIS: Bestätigen Sie die vollständige Lyse, indem Sie sicherstellen, dass kein sichtbares weißes Flockungsmaterial zurückbleibt.
  4. Geben Sie 200 μl Äquilibrierungspuffer in die Spin-Säule und geben Sie sie in ein Sammelröhrchen. Bei 18.894 × g für 2 min zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen. Setzen Sie die Säule wieder in das Auffangröhrchen ein.
  5. Geben Sie 500 μl Neutralisationspuffer zum Bakterienlysat, mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen 8-10x umdrehen, bis ein weißer Niederschlag erscheint, und lassen Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
  6. Bei 18.894 × g für 5 min zentrifugieren und den Überstand in eine Filtersäule überführen. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 18.894 × g , um die Lösung zu filtrieren.
  7. Geben Sie das 0,3-fache Volumen an Isopropanol in die gefilterte Lösung, mischen Sie durch Invertieren. Die Mischung in die äquilibrierte Spinsäule überführen.
  8. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 18.894 × g , verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in das Sammelröhrchen ein.
  9. Waschen Sie die Säule mit 750 μl Waschpuffer, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 18.894 × g und verwerfen Sie den Durchfluss.
  10. Zentrifugieren Sie die Säule erneut bei 18.894 × g für 1 min, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen.
  11. Setzen Sie die Schleudersäule in ein neues Zentrifugenröhrchen ein. Geben Sie 100-200 μl Elutionspuffer in die Mitte der Säulenmembran. Lassen Sie es 2-5 min bei Raumtemperatur ziehen und zentrifugieren Sie es bei 18.894 × g für 2 min. Lagern Sie die Plasmid-DNA bei -20 °C.

5. Plasmidtransformation (E. coli BL21 chemisch kompetente Zellen)

  1. Nehmen Sie 50 μl aufgetaute, chemisch kompetente BL21-Zellen auf Eis. 2 μl Plasmid-DNA aus Schritt 4.11 zugeben und vorsichtig mischen. 30 min auf Eis inkubieren.
  2. Hitzeschock bei 42 °C für 45 s, dann sofort den Schlauch für 2 min wieder auf Eis stellen.
  3. Geben Sie 500 μl steriles LB-Medium in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie bei 37 °C und 180 U/min für 1 h, um eine Erholung zu ermöglichen.
  4. 5 Minuten lang bei 1.000 × g zentrifugieren, überschüssigen Überstand verwerfen, so dass ca. 100 μl übrig bleiben. Die Zellen resuspendieren und auf einen LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin aufpolieren. Über Nacht kopfüber bei 37 °C inkubieren.

6. Exprimieren des CBE-Mag-T7-Polymerase-Mutationsgenerators (inaktive Form)

  1. Führen Sie die Schritte 5.1-5.4 aus. Vor dem Verteilen der Zellen 1 mM IPTG gleichmäßig mit Ampicillin auf die Oberfläche des LB-Agars auftragen. Verwenden Sie deionisiertes Wasser als Kontrolle, um es mit IPTG-behandelten Gruppen zu vergleichen.
  2. Nachdem alle Völker gezüchtet sind, wählen Sie 10-20 Völker aus, um sie in 5 ml LB-Medium mit 1 mM IPTG in 100 ml Rundbodenglasröhrchen mit Phenolschraubverschluss und Gummiauskleidung bei 16 °C, 180 U/min für 8 Stunden zu kultivieren.
    HINWEIS: Alle Bienenvölker können für eine kurzfristige Lagerung bei 4 °C gelagert werden, bevor Sie mit Schritt 7 fortfahren.

7. Aktivieren Sie den Polymerase-Mutationsgenerator CBE-Mag-T7

  1. Sammeln Sie die Bakterien in 100 mL Rundboden-Glasröhrchen mit Phenol-Schraubverschluss und Gummiauskleidung und zentrifugieren Sie sie bei 18.894 × g für 2 Minuten.
  2. Ändern Sie das Medium auf LB-Medium ohne IPTG.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass sich der Polymerase-Mutationsgenerator CBE-Mag-T7 nicht selbst bearbeiten kann. Wir haben das lacI/O-System entwickelt, um die CBE-Mag-T7-Polymerase-Gencluster zu schützen.
  3. Bestrahlen Sie die Platte mit einem Blaulichtstrahler (470 nm, 4 mW/cm2) und kultivieren Sie sie für die vorgegebene Zeit bei 37 °C. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch, um die Mutationen zu verifizieren und zu prüfen, ob eine längere Exposition die Mutationshäufigkeit erhöht.
    HINWEIS: Hier stellen wir die Blaulichtbelichtung auf 0, 8, 16 und 24 Stunden ein.

8. Selektion von Mutationen für eine erhöhte Proteinfunktion und fortgesetzte Mutagenese

HINWEIS: Hier verwenden wir das gfp-Gen als exogene DNA für die Mutagenese und suchen nach Mutationen, die die Fluoreszenzintensität des GFP-Proteins erhöhen können.

  1. Nehmen Sie die Kolonien auf, beschriften Sie die Position auf einem Teller und impfen Sie die gesammelten Völker in 100 μl ddH2O.
  2. Übertragen Sie die 100 μl der Bakteriensuspension auf eine 96-Well-Platte und lesen Sie die GFP-Intensität bei Ex/Em = 488/510 nm ab.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 6.3 bis 9.2, bis einige offensichtliche Kolonien identifiziert werden können.

9. Stoppen Sie die Mutagenese und überprüfen Sie die Mutationen

  1. Nachdem Sie mehrere Stunden Blaulichtbestrahlung durchgeführt haben, bringen Sie alle Bakterien für weitere 15 Minuten an einen dunklen Ort bei 4 °C.
  2. Befolgen Sie die gleichen Schritte zur Plasmidextraktion wie in Schritt 4 beschrieben.
  3. Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die Sanger-Sequenzierung.
    HINWEIS: Hier verwenden wir ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT als Vorwärtsprimer und TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG als Rückwärtsprimer für die Sanger-Sequenzierung.

10. Datenanalyse und Berechnung der Mutationshäufigkeit

  1. Zeigen Sie die Mutation an, indem Sie die .ab1-Datei öffnen und die Peaks manuell überprüfen.
  2. Analysieren Sie die Mutationshäufigkeit mit Hilfe von Online-Tools (z. B. Mutation Surveyor Tool).
  3. Laden Sie die Sanger-Datendatei in das Online-Tool hoch und starten Sie die Analyse der Mutationsrate.

11. Zubereitung von bakterieller Glycerin-Stamm

  1. Eine einzelne Kolonie wird in ein Röhrchen mit 5 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin geimpft. Inkubieren Sie bei 37 °C, 180 U/min für 12-16 h.
  2. Mischen Sie die Bakterienkultur mit 50% Glycerin im Verhältnis 1:1. Aliquot in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Bei -80 °C lagern.

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Ergebnisse

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Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden dienen der Erzeugung von Mutationen an exogener DNA unter Verwendung eines gespaltenen CBE-Mag-T7-RNA-Polymerase-Mutationsgenerators. Gene für den Aufbau des CBE-Mag-T7-RNA-Polymerase-Mutationssystems und das Zielgen für die Mutagenese sind alle in das pET-11a-Plasmidrückgrat eingebaut. Die erfolgreiche Transformation und Blaulichtbestrahlung wurde ohne Schädigung der bakteriellen genomischen DNA durchgeführt, was sich in normalen und vergleichbaren Koloniezahlen auf LB-Agar...

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Diskussion

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Das Polymerase-gesteuerte Basen-Editing-Tool wurde erstmals 2021 von Cravens et al. unter Verwendung einer Proteinfusionsstrategieentwickelt 17. Mutationen an vier DNA-Nukleotiden wurden erfolgreich mit Raten von mehr als 10-4 Mutationen pro bp eingebaut. Da jedoch kontinuierlich Mutationen zwischen T7-Promotor und Terminator ohne zusätzliche Kontrolle durch die Forscher eingeführt wurden18, konnten "gute" Mutationen nicht vor de...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Konische 50-ml-ZentrifugenröhrchenFalkeCLS352070
AmpicillinThermo Scientific ChemikalienNr. J60977.14
Blaulicht-BestrahlungThorlabsLIU470A
DNA-Assemblierungs-Klonierungskit SCHNABELE5520S
DNA/Prmers-SyntheseBGI Genomik
EndoFree Plasmid Midi Bausatz CWBIOCW2106SPuffer P1: Resuspensionspuffer, Puffer P2: Lysepuffer, Puffer E3: Äquilibrierungspuffer, Puffer PS: Neutralisationspuffer, Puffer PW: Waschpuffer, Endo-Free Buffer EB: DNA-Aufreinigungspuffer, RNase A Endo-Remover FM: Puffer zur Entfernung von Endotoxinen, Spin Columns DM mit Sammelröhrchen
GlycerinFisher ChemicalG33-4
Inkubierter SchüttlerThermo ScientificSK2001CPKG
IPTG (Isopropylthio-β-Galactosid)Invitrogen15529019
Mikroplatten-ReaderThermo ScientificVarioskan LUX
Mikroskop LeicaDMI 4000B
Multiskan FCThermo Scientific Chemikalien
One Shot BL21(DE3) Chemisch kompetente E. coliInvitrogenC600003
PureLink Fast Midi-Plasmid-Aufreinigungskit mit niedrigem EndotoxingehaltInvitrogenNr. A36227
Pyrex  Robuste Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden, mit Phenol-Schraubverschluss und GummiauskleidungCorning  8422CLS8422100

Referenzen

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Blaulicht MutageneseCytosin Base EditorT7 Promotorsystemexogene DNA MutationProtein Engineeringgerichtete Evolutionregionspezifische MutageneseIn vivo Evolution
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