Design von Festkörperfermentationssystemen für die polymerhydrolytische extrazelluläre Enzymproduktion durch filamentöse Pilze

Summary

Bei diesem Protokoll wird Weizenkleie in einem rotierenden Festkörperfermentationssystem verwendet, um die Enzymproduktion zu verbessern. Das Substrat, ergänzt mit Induktoren wie Chitin, unterstützt das Pilzwachstum unter kontrollierten Bedingungen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Enzymausbeute im Vergleich zur submersen Fermentation 4-6-mal höher ist, was die Anpassungsfähigkeit und Wirksamkeit der Methode für verschiedene biotechnologische Anwendungen zeigt.

Abstract

Die Festkörperfermentation (SSF) ist ein Biokonversionsverfahren, bei dem ein festes Substrat verwendet wird, das sich nicht in einem wässrigen Medium auflöst. Mikroorganismen wachsen auf der Oberfläche des Substrats und dringen in dessen feste Matrix ein, um essentielle Nährstoffe für ihre Entwicklung zu extrahieren. SSF zeichnet sich durch ein Minimum an freiem Wasser mit einem Feuchtigkeitsgehalt des Substrats von über 70 % aus und umfasst drei miteinander verbundene Phasen - gasförmig, flüssig und fest. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Weizenkleie, einem agroindustriellen Nebenprodukt, als Basissubstrat für die Enzymproduktion in einem Rotationssystem. Das Substrat wird mit einem Induktor wie Chitin, Chitosan, Stärke oder Cellulose ergänzt, um die Synthese hydrolytischer Proteine zu fördern. Das System ist sehr anpassungsfähig und ermöglicht die Verwendung verschiedener Pilzformen, einschließlich Myzel, Sporen oder Pellets. Bei der beschriebenen Methodik werden Induktor und Substrat im Verhältnis 1:100 (w/w) gemischt, durch Autoklavieren sterilisiert und mit sterilem Wasser auf den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt eingestellt. Dann wird das Pilzinokulum hinzugefügt, und das Rotationssystem arbeitet mit 10 U/min, um eine ausreichende Durchmischung und Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Das System wird 6-8 Tage lang unter optimalen Wachstumsbedingungen für mesophile oder thermophile/thermotolerante Pilze inkubiert, was seine Vielseitigkeit erhöht. Nach der Inkubation wird das Enzym je nach Art des Enzyms leicht unter Verwendung eines geeigneten Kältepuffers (z. B. Acetat, Citrat oder Phosphat) extrahiert. Der Extrakt wird durch Zentrifugation und Filtration geklärt, um einen zellfreien Überstand zu erhalten. Das Enzym kann dann je nach Bedarf weiter konzentriert oder gereinigt werden. Die Ergebnisse zeigten eine 4-6-fache Steigerung der Enzymaktivität im Vergleich zur submersen Fermentation (SmF), was die Wirksamkeit des Systems unterstreicht. Seine Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Substrate, Induktoren und Pilzarten macht es zu einem wertvollen Werkzeug für verschiedene biotechnologische Anwendungen.

Introduction

Die Festkörperfermentation (SSF) hat sich zu einer vielversprechenden und nachhaltigen Biokonversionstechnologie für die Herstellung hochwertiger Enzyme, bioaktiver Verbindungen und Sekundärmetaboliten entwickelt. Bei dieser Technik werden Mikroorganismen auf festen Substraten mit minimalem freiem Wasser gezüchtet, wodurch ihre natürliche Umgebung simuliert und eine effiziente Stoffwechselaktivität ermöglicht^{wird 1}. Das Hauptziel dieses Protokolls ist die Optimierung der Enzymproduktion durch ein rotierendes SSF-System, das eine verbesserte Substratausnutzung, Sauerstoffdiffusion und Prozessskalierbarkeit gewäh....

Protocol

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Untergrunds

HINWEIS: Verwenden Sie eine handelsübliche Weizenkleiemarke, um signifikante Schwankungen der Substrateigenschaften zu minimieren. Jede Charge Weizenkleie variiert aufgrund mehrerer Faktoren, was sie zu einem heterogenen Material macht, das schwer zu standardisieren ist, was zu Schwankungen im Gehalt an Bestandteilen führt. Wenn ein standardisiertes Material benötigt wird, wählen Sie eine alternative Matrix oder füh....

Results

Abbildung 1A zeigt die schematische Darstellung des in diesem System verwendeten Rotationsmischers, der ein Fassungsvermögen von sechs konischen Röhrchen von 50 mL hat. Abbildung 2B veranschaulicht die Veränderungen, die in der Weizenkleie während der Konditionierung vor dem Eintritt in den Festkörperfermentationsprozess auftreten. Wie zu sehen ist, wurden keine signifikanten strukturellen Veränderungen beobachtet.

Discussion

Diese Studie skizziert ein relevantes Protokoll zur Optimierung der Enzymproduktion durch Festkörperfermentationssysteme (SSF), die speziell für filamentöse Pilze entwickelt wurden. Im Folgenden werden kritische Aspekte der Methodik sowie ihre Bedeutung, Grenzen und Anwendungsmöglichkeiten diskutiert.

Der Erfolg des Protokolls hängt stark von wichtigen Schritten wie der Vorbereitung des Substrats und des Inokulums ab. Das richtige Waschen und Trocknen der Weiz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyerkolben	Sigma-Aldrich	CLS431684	Zur Kultivierung von Myzel in flüssigem Medium.
Konisches 50-ml-Röhrchen	Sigma-Aldrich	CLS430921	Zur Lagerung und Vorbereitung von Substraten und Inokulum.
Acetat-Puffer, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Für die Chitinase-Extraktion.
Centricon-Filter	Millipore	UFC905024	Zur weiteren Reinigung von Enzymen.
Kammer für Zählzellen	Sigma-Aldrich	Z359629	Wird verwendet, um Sporen unter einem Mikroskop zu zählen.
Filterpapier	Whatman	1001-110	Zur Filterung des Enzymextrakts.
Hygrometer	Todomicro	-	Zur Messung der relativen Luftfeuchtigkeit des Untergrundes.
Induktor (z. B. kommerzielles Chitin)	Sigma-Aldrich	Nr. C9752	Wird verwendet, um die Enzymproduktion während der Fermentation zu verbessern.
Phosphatpuffer, pH 6,9	Sigma-Aldrich	Nr. P5379	Für die Amylase-Extraktion.
Kartoffel-Dextrose-Agar	Sigma-Aldrich	Nr. P2182	Nährmedium für die Züchtung von Pilzmyzel.
Kartoffel-Dextrose-Brühe	Sigma-Aldrich	Nr. P6685	Flüssiges Kulturmedium für die Züchtung von Pilzmyzel.
Rotationsmischer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	Um das Substrat während der Gärung in Bewegung zu halten.
Bestandteile der Salzlösung (z. B. KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Mehrfach	Für die Herstellung einer sterilen Salzlösung siehe detailliertes Rezept im Protokoll.
Weizenkleie	Kommerzieller Markt	-	Substrat für die Feststofffermentation.