Design von Festkörperfermentationssystemen für die polymerhydrolytische extrazelluläre Enzymproduktion durch filamentöse Pilze

Summary

Bei diesem Protokoll wird Weizenkleie in einem rotierenden Festkörperfermentationssystem verwendet, um die Enzymproduktion zu verbessern. Das Substrat, ergänzt mit Induktoren wie Chitin, unterstützt das Pilzwachstum unter kontrollierten Bedingungen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Enzymausbeute im Vergleich zur submersen Fermentation 4-6-mal höher ist, was die Anpassungsfähigkeit und Wirksamkeit der Methode für verschiedene biotechnologische Anwendungen zeigt.

Abstract

Die Festkörperfermentation (SSF) ist ein Biokonversionsverfahren, bei dem ein festes Substrat verwendet wird, das sich nicht in einem wässrigen Medium auflöst. Mikroorganismen wachsen auf der Oberfläche des Substrats und dringen in dessen feste Matrix ein, um essentielle Nährstoffe für ihre Entwicklung zu extrahieren. SSF zeichnet sich durch ein Minimum an freiem Wasser mit einem Feuchtigkeitsgehalt des Substrats von über 70 % aus und umfasst drei miteinander verbundene Phasen - gasförmig, flüssig und fest. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Weizenkleie, einem agroindustriellen Nebenprodukt, als Basissubstrat für die Enzymproduktion in einem Rotationssystem. Das Substrat wird mit einem Induktor wie Chitin, Chitosan, Stärke oder Cellulose ergänzt, um die Synthese hydrolytischer Proteine zu fördern. Das System ist sehr anpassungsfähig und ermöglicht die Verwendung verschiedener Pilzformen, einschließlich Myzel, Sporen oder Pellets. Bei der beschriebenen Methodik werden Induktor und Substrat im Verhältnis 1:100 (w/w) gemischt, durch Autoklavieren sterilisiert und mit sterilem Wasser auf den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt eingestellt. Dann wird das Pilzinokulum hinzugefügt, und das Rotationssystem arbeitet mit 10 U/min, um eine ausreichende Durchmischung und Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Das System wird 6-8 Tage lang unter optimalen Wachstumsbedingungen für mesophile oder thermophile/thermotolerante Pilze inkubiert, was seine Vielseitigkeit erhöht. Nach der Inkubation wird das Enzym je nach Art des Enzyms leicht unter Verwendung eines geeigneten Kältepuffers (z. B. Acetat, Citrat oder Phosphat) extrahiert. Der Extrakt wird durch Zentrifugation und Filtration geklärt, um einen zellfreien Überstand zu erhalten. Das Enzym kann dann je nach Bedarf weiter konzentriert oder gereinigt werden. Die Ergebnisse zeigten eine 4-6-fache Steigerung der Enzymaktivität im Vergleich zur submersen Fermentation (SmF), was die Wirksamkeit des Systems unterstreicht. Seine Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Substrate, Induktoren und Pilzarten macht es zu einem wertvollen Werkzeug für verschiedene biotechnologische Anwendungen.

Introduction

Die Festkörperfermentation (SSF) hat sich zu einer vielversprechenden und nachhaltigen Biokonversionstechnologie für die Herstellung hochwertiger Enzyme, bioaktiver Verbindungen und Sekundärmetaboliten entwickelt. Bei dieser Technik werden Mikroorganismen auf festen Substraten mit minimalem freiem Wasser gezüchtet, wodurch ihre natürliche Umgebung simuliert und eine effiziente Stoffwechselaktivität ermöglicht^{wird 1}. Das Hauptziel dieses Protokolls ist die Optimierung der Enzymproduktion durch ein rotierendes SSF-System, das eine verbesserte Substratausnutzung, Sauerstoffdiffusion und Prozessskalierbarkeit gewährleistet. Die Verwendung von Weizenkleie, einem reichlich vorhandenen agroindustriellen Nebenprodukt, als Basissubstrat trägt zur Verwertung landwirtschaftlicher Reststoffe bei und fördert zirkuläre Bioökonomiepraktiken².

SSF hat gegenüber der Unterwasserfermentation (SmF) erhebliche Vorteile, darunter einen geringeren Energie- und Wasserverbrauch, eine höhere Produktkonzentration und die Kompatibilität mit einer Vielzahl von kostengünstigen landwirtschaftlichen Reststoffen wie Weizenkleie, Reishülsen und Zuckerrohr-Bagasse³. Im Gegensatz zu SmF, das große Mengen an Wasser und teuren Nährmedien benötigt, nutzen SSF-Systeme feste Matrices, die nicht nur als mikrobielle Wachstumsoberflächen dienen, sondern auch Nährstoffe liefern, die für die mikrobielle Aktivität unerlässlich sind. Darüber hinaus minimiert das begrenzte freie Wasser in SSF das Kontaminationsrisiko, was es zu einer robusteren Option für die Enzymproduktion in industriellen Umgebungen macht⁴. Zusätzlich zu seinen betrieblichen Vorteilen bietet SSF im Vergleich zur Unterwasserfermentation (SmF) erhebliche ökologische und wirtschaftliche Vorteile. Studien haben gezeigt, dass SSF den Wasserverbrauch um 50 % bis 70 % senkt und die Energiekosten um mehr als 30 % senkt, da keine großen Wassermengen vorhanden sind, die ein ständiges Rühren und Belüften erfordern. Darüber hinaus minimiert die Verwendung agroindustrieller Reststoffe als Substrate die Rohstoffkosten und fördert Praktiken der Kreislaufwirtschaft durch die Wiederverwendung landwirtschaftlicher Nebenprodukte ^2,4.

SSF wurde umfassend auf seine Effizienz und Skalierbarkeit validiert. So haben Studien beispielsweise eine 4- bis 6-fache Steigerung der Enzymaktivität mit SSF im Vergleich zu SmF berichtet, was die wirtschaftlichen und ökologischen Vorteile dieser Technik hervorhebt ^2,5. Darüber hinaus wird der nachgelagerte Prozess vereinfacht, da die Enzymextraktion in der Regel weniger Wasser und weniger Reinigungsschritte erfordert. Dies macht SSF besonders attraktiv für Branchen, die darauf abzielen, Betriebskosten und Umweltauswirkungen zu senken⁶.

Das in diesem Protokoll beschriebene rotierende SSF-System bietet mehrere Verbesserungen gegenüber herkömmlichen statischen SSF-Methoden. Während statische Systeme oft mit Herausforderungen wie ungleichmäßiger Substratbesiedlung und Sauerstoffbegrenzung konfrontiert sind, gewährleistet die rotierende Konfiguration eine gründliche Durchmischung und Belüftung und fördert so ein gleichmäßiges mikrobielles Wachstum ^7,8,9. Zum Beispiel wurde dieses System erfolgreich eingesetzt, um hydrolytische Enzyme wie Chitinasen, Amylasen und Proteasen unter Verwendung von Pilzspezies wie Aspergillus und Trichoderma² herzustellen.

Ein wesentliches Merkmal dieses SSF-Systems ist seine Anpassungsfähigkeit. Die Verwendung von Weizenkleie als Basissubstrat zeigt das Potenzial agroindustrieller Reststoffe für eine kostengünstige Biokonversion³. Darüber hinaus verbessert die Supplementierung des Substrats mit Induktoren wie Chitin, Chitosan und Stärke die Enzymsynthese weiter, indem spezifische Stoffwechselwege stimuliert^{werden 2,10}. Das System ist auch mit verschiedenen Pilzformen kompatibel, einschließlich Sporen, Myzel und Pellets, so dass der Benutzer den Prozess an seine spezifischen Anforderungen anpassen kann².

SSF bietet ein breites Anwendungspotenzial in verschiedenen Bereichen wie Lebensmittelbiotechnologie, Biokraftstoffproduktion und Umweltsanierung¹¹. Die Integration kostengünstiger Substrate, außergewöhnliche Enzymausbeuten und eine hohe Prozessflexibilität machen SSF zu einem unverzichtbaren Ansatz für biotechnologische Innovationen im industriellen Maßstab.

Protocol

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Untergrunds

HINWEIS: Verwenden Sie eine handelsübliche Weizenkleiemarke, um signifikante Schwankungen der Substrateigenschaften zu minimieren. Jede Charge Weizenkleie variiert aufgrund mehrerer Faktoren, was sie zu einem heterogenen Material macht, das schwer zu standardisieren ist, was zu Schwankungen im Gehalt an Bestandteilen führt. Wenn ein standardisiertes Material benötigt wird, wählen Sie eine alternative Matrix oder führen Sie eine chemische Analyse jeder Charge Weizenkleie durch, um sie an die Bedürfnisse anzupassen.

1. Waschen Sie die Weizenkleie dreimal mit sterilem destilliertem Wasser, um Rückstände von organischen Stoffen, Schmutz und Staub zu entfernen. Dadurch werden auch einfache Zucker entfernt, die die Gärung beeinträchtigen könnten.
2. Die gewaschene Kleie auf einem Alublech verteilen und im Backofen bei 60 °C 24 h trocknen.
3. Nach dem Trocknen die Weizenkleie in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen geben.

2. Vorbereitung des Inokulums

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt drei Methoden zur Inokulumvorbereitung: Sporensuspension, direkte Inokulation mit Myzelscheiben und zelluläre Suspension. Ermitteln Sie die anfängliche Inokulumkonzentration und quantifizieren Sie den Proteingehalt für genaue Ausbeuteberechnungen.

1. Herstellung der Sporensuspension
   1. Übertragen Sie eine mit Myzel getränkte Agarscheibe mit einem Durchmesser von 5 mm auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 5-7 Tage oder bis das Myzel das Medium gesättigt hat. Einige Pilze benötigen möglicherweise eine längere Inkubationszeit.
   2. Geben Sie 5 ml steriles destilliertes Wasser auf die Platte und lösen Sie die Sporen mechanisch mit einer sterilen Schlaufe.
   3. Bereiten Sie eine Verdünnung der Sporensuspension im Verhältnis 1:100 vor. Legen Sie 10 μL in die Mitte einer Neubauer-Kammer und zählen Sie die Sporen unter dem Mikroskop. Berechnen Sie die Sporenkonzentration (Sporen/ml) basierend auf dem Faktor der Kammer und der Verdünnung.
2. Kultivierung von Myzel in flüssigem Medium
   1. Eine mit Myzel gesättigte 5 mm Agarscheibe auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Agar-Platte geben und bei 28 °C bis zur Sättigung inkubieren.
   2. Bereiten Sie 25 ml Kartoffel-Dextrose-Brühe in einem sterilen 125-ml-Kolben und Autoklaven zu.
   3. Übertragen Sie eine 5 mm große Myzelscheibe von der gesättigten Platte in die sterile Brühe.
   4. Inkubieren Sie den Kolben auf einem Schüttler bei 125 U/min für 24-48 h, je nach Pilzstamm. Verlängern Sie die Inkubationszeit für langsam wachsende Pilze.
   5. Entnehmen Sie 2 mL für das Inokulum und 2 mL für die Bestimmung des Trockengewichts.
3. Direkte Inokulation von Myzelscheiben
   1. Legen Sie eine 5 mm dicke, mit Myzel getränkte Agarscheibe auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Agarplatte. Bei 28 °C bis zur Sättigung inkubieren.
   2. Verwenden Sie eine Myzelscheibe als Inokulum und eine andere, um das Trockengewicht zu bestimmen.

3. Vorbereitung des SSF-Systems

HINWEIS: Induktoren können natürlich oder kommerziell sein. Gereinigte kommerzielle Induktoren werden bevorzugt, um Verunreinigungen zu minimieren, die die Fermentationseffizienz beeinträchtigen könnten. Passen Sie die Wasserzugabe an, um eine relative Luftfeuchtigkeit von mindestens 90 % aufrechtzuerhalten.

1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen: 5 g trockene Weizenkleie; 0,2 g des Induktors (z. B. kommerzielles Chitin); 5,5 ml Wasser (je nach Wasseraufnahmekapazität des Induktors anpassen); 5 ml einer sterilen Salzlösung mit 16 g/l monobasischem Kaliumphosphat, 4 g/l Natriumsulfat, 2 g/l Kaliumchlorid, 1 g/l Calciumchlorid, 400 mg/l Zinkchlorid, 60 mg/l Borsäure, 40 mg/l Natriummolybdat, 150 mg/l Magnesiumchlorid, 100 mg/l Eisenchlorid und 400 mg/l Kupfersulfat.
2. Messen Sie die relative Luftfeuchtigkeit mit einem elektrodenbasierten Hygrometer und stellen Sie eine Luftfeuchtigkeit von mindestens 90 % sicher. Führen Sie die Elektrodensonde in unterschiedlichen Tiefen direkt in den Reaktor ein, um eine repräsentative Messung der Feuchtigkeitsverteilung zu erhalten.
   1. Befolgen Sie die Schritte, um die Luftfeuchtigkeit einzustellen, wenn sie unter 90 % liegt:
      1. Fügen Sie nach und nach steriles destilliertes Wasser in Schritten von 1 ml pro 10 g Substrat hinzu. Nach jeder Zugabe gründlich mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Feuchtigkeit zu gewährleisten.
      2. Lassen Sie das Substrat 10-15 Minuten lang äquilibrieren. Messen Sie die Luftfeuchtigkeit erneut.
      3. Wiederholen Sie die obigen Schritte, bis die Zielluftfeuchtigkeit von 90 % erreicht ist. Vermeiden Sie eine Überbenetzung des Substrats während des gesamten Prozesses.
   2. Befolgen Sie die Schritte, um die Luftfeuchtigkeit einzustellen, wenn sie über 90 % liegt:
      1. Verteilen Sie das Substrat dünn in einer sterilen Umgebung. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit, indem Sie (1) das Substrat einer laminaren Luftströmung aussetzen oder (2) es für 10-15 Minuten in eine Trockenkammer bei 30 °C legen.
      2. Alternativ können Sie das Substrat vorsichtig mischen, um eine gleichmäßige Feuchtigkeitsverteilung zu fördern. Beurteilen Sie nach der Behandlung die Luftfeuchtigkeit neu.
      3. Wiederholen Sie den Trocknungs- oder Mischschritt nach Bedarf, bis die Luftfeuchtigkeit 90 % erreicht. Fahren Sie mit der Gärung erst fort, wenn die gewünschte Feuchtigkeit erreicht ist.
3. Autoklavieren Sie das Rohr 15 Minuten lang bei 15 psi.
4. Beimpfen Sie das Substrat nach dem Abkühlen mit einem der folgenden Mittel: 1 ml Sporensuspension (1 x 10^6-1 x 10⁷ Sporen/ml), 2 ml zelluläre Suspension oder eine 5 mm Myzelscheibe.

4. Verfahren der Feststofffermentation (SSF)

HINWEIS: Für kinetische Studien oder Parameterauswertungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten sind für jeden Zeitpunkt separate Röhrchen vorzubereiten, um die Repräsentativität zu gewährleisten.

1. Vermeiden Sie das Verklumpen des Substrats, indem Sie die Schläuche 5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in 1-Minuten-Zyklen vortexen.
2. Legen Sie die Röhrchen in einen Rotationsmischer mit einer horizontalen Achse. Stellen Sie sicher, dass sich das Substrat frei in den Rohren bewegt. Stellen Sie den Mischer auf 10 U/min ein.
3. Inkubieren Sie den Mischer in einem Inkubator bei der optimalen Wachstumstemperatur des Mikroorganismus. Halten Sie die angegebene Temperatur für eine optimale enzymatische Aktivität aufrecht, wenn wärmeempfindliche Induktoren verwendet werden.

5. Extraktion von Enzymen

HINWEIS: Die Grundlagen der Extraktion basieren auf der Löslichkeit und der pH-maximalen Aktivität des extrazellulären Enzyms. Da SSF das Medium Wasser meidet, ist das extrazelluläre Enzym an dem Wasser beteiligt, das die feste Matrix umgibt, was bedeutet, dass die Konzentration höher ist als bei SmF. In diesem Zusammenhang hängt die Auswahl des besten Extraktionspuffers von der Kenntnis der gewünschten Aktivität ab. Die Optimierung der Extraktionen hängt von der endgültigen Enzymkonzentration und der Art des verwendeten Extraktionspuffers ab.

1. Nach der gewünschten Fermentationszeit wird das Substrat in 20 ml vorgekühltem Puffer resuspendiert. Beispiele hierfür sind: 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,6, für die Chitinase-Extraktion; 0,02 M Phosphatpuffer, pH 6,9, für die Amylase-Extraktion.
2. Wirbeln Sie die Röhren in Zyklen: 1 min bei maximaler Geschwindigkeit, danach 1 min auf Eis. 10 Mal wiederholen.
3. Die Suspension mit Papierfiltern filtrieren und den Überstand durch Pressen mechanisch herausziehen.
4. Der Überstand wird durch Zentrifugieren bei 3000 x g für 15 min bei 4 °C geklärt.
5. Verwenden Sie den Rohextrakt direkt oder reinigen Sie das Enzym über Säulenchromatographie oder Zentrifugalfilter weiter. Kinetische Studien werden auch empfohlen, um die Michaelis-Konstante (Km) und die maximale Rate der enzymatischen Transformation (Vmax) zu ^bestimmen12.

6. Optimierungsprozess

HINWEIS: Optimieren Sie dieses Protokoll, indem Sie die Qualität und Konzentration der Induktoren sowie die Art und Konzentration des Inokulums bewerten und anpassen.

1. Bestimmen Sie die ideale Fermentationszeit und verfeinern Sie die Extraktionsschritte, um die Effizienz zu verbessern.
2. Kontrollieren und optimieren Sie die Umgebungsbedingungen, einschließlich Temperatur, pH-Wert und Belüftung.
3. Testen Sie verschiedene Puffer und Extraktionsbedingungen, um die Enzymausbeute und -stabilität zu verbessern.
4. Führen Sie statistische Analysen durch, wie z. B. die Reaktionsoberflächenmethodik, um die einflussreichsten Variablen zu identifizieren und eine optimale Enzymproduktion zu erreichen.

Results

Abbildung 1A zeigt die schematische Darstellung des in diesem System verwendeten Rotationsmischers, der ein Fassungsvermögen von sechs konischen Röhrchen von 50 mL hat. Abbildung 2B veranschaulicht die Veränderungen, die in der Weizenkleie während der Konditionierung vor dem Eintritt in den Festkörperfermentationsprozess auftreten. Wie zu sehen ist, wurden keine signifikanten strukturellen Veränderungen beobachtet.

Discussion

Diese Studie skizziert ein relevantes Protokoll zur Optimierung der Enzymproduktion durch Festkörperfermentationssysteme (SSF), die speziell für filamentöse Pilze entwickelt wurden. Im Folgenden werden kritische Aspekte der Methodik sowie ihre Bedeutung, Grenzen und Anwendungsmöglichkeiten diskutiert.

Der Erfolg des Protokolls hängt stark von wichtigen Schritten wie der Vorbereitung des Substrats und des Inokulums ab. Das richtige Waschen und Trocknen der Weiz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyerkolben	Sigma-Aldrich	CLS431684	Zur Kultivierung von Myzel in flüssigem Medium.
Konisches 50-ml-Röhrchen	Sigma-Aldrich	CLS430921	Zur Lagerung und Vorbereitung von Substraten und Inokulum.
Acetat-Puffer, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Für die Chitinase-Extraktion.
Centricon-Filter	Millipore	UFC905024	Zur weiteren Reinigung von Enzymen.
Kammer für Zählzellen	Sigma-Aldrich	Z359629	Wird verwendet, um Sporen unter einem Mikroskop zu zählen.
Filterpapier	Whatman	1001-110	Zur Filterung des Enzymextrakts.
Hygrometer	Todomicro	-	Zur Messung der relativen Luftfeuchtigkeit des Untergrundes.
Induktor (z. B. kommerzielles Chitin)	Sigma-Aldrich	Nr. C9752	Wird verwendet, um die Enzymproduktion während der Fermentation zu verbessern.
Phosphatpuffer, pH 6,9	Sigma-Aldrich	Nr. P5379	Für die Amylase-Extraktion.
Kartoffel-Dextrose-Agar	Sigma-Aldrich	Nr. P2182	Nährmedium für die Züchtung von Pilzmyzel.
Kartoffel-Dextrose-Brühe	Sigma-Aldrich	Nr. P6685	Flüssiges Kulturmedium für die Züchtung von Pilzmyzel.
Rotationsmischer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	Um das Substrat während der Gärung in Bewegung zu halten.
Bestandteile der Salzlösung (z. B. KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Mehrfach	Für die Herstellung einer sterilen Salzlösung siehe detailliertes Rezept im Protokoll.
Weizenkleie	Kommerzieller Markt	-	Substrat für die Feststofffermentation.