Bidirektionale elektrische und optoelektronische Grenzflächen in gesunden und ischämischen ex vivo Rattenherzen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt fortschrittliche Materialherstellungs- und ex vivo-Methoden am Rattenherzen für optische und elektrische bidirektionale Bioschnittstellen, die eine präzise Herzstimulation, Aufzeichnung und Infarktmodellierung für die bioelektronische Forschung ermöglichen.

Zusammenfassung

Elektrophysiologische Studien sind entscheidend für die Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Materialien und kardialen Biogrenzflächen. Jüngste Fortschritte haben verschiedene neuartige Leiter- und Halbleitermaterialien für bidirektionale Schnittstellen mit Herzmodellen eingeführt, die eine Stimulation mit geringer Intensität neben Aufzeichnungen mit hohem raumzeitlichem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) ermöglichen. Das Ex-vivo-Modell des Nagetierherzens dient als effektive Plattform für die Validierung der Funktionalitäten neuer Materialien und Geräte, indem es In-vitro-Erkenntnisse mit translationalen Erkenntnissen verbindet und gleichzeitig ethische und administrative Bedenken minimiert. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und ex vivo-Perfusion von adulten Rattenherzen mit einem Langendorff-Gerät und etablieren eine präzise bidirektionale Stimulation und Aufzeichnung mit Hochleistungshalbleitern und -leitern, einschließlich nanoporösem Silizium, nanoporösem Kohlenstoff und flexiblen, netzartigen Mikroelektrodenarrays. Darüber hinaus stellen wir ein Myokardinfarktmodell vor, das durch Ischämie-Reperfusion (I/R)-Schädigung induziert wird, das durch Mehrkanalaufzeichnung und -kartierung sowie Infarktfärbung bewertet wird und kardioklinikrelevante Studien und potenzielle therapeutische Untersuchungen ermöglicht. Diese Methodik bietet wertvolle Einblicke in die Material-Bio-Grenzflächenforschung und die Entwicklung der kardialen Bioelektronik der nächsten Generation.

Einleitung

Das Gebiet der kardialen Bioelektronik schreitet rasant voran, angetrieben von der Notwendigkeit, Materialien und Geräte zu entwickeln, die eine präzise und effiziente bidirektionale Kommunikation mit dem Herzen ermöglichen 1,2,3,4. Elektrophysiologische Studien spielen dabei eine zentrale Rolle und liefern wichtige Einblicke in die Interaktion von Materialien mit kardialen Biogrenzflächen durch Modulation und Sensorik. Während In-vitro-Modelle, wie z. B. kultivierte HL-1-Zelllinien und primäre Kardiomyozyten von Nagetieren, eine kontrollierte Umgebung für erste Bewertungen bieten 5,6,7,8, gelingt es ihrer Einfachheit oft nicht, die komplexen, dynamischen Bedingungen eines lebenden Herzens zu replizieren. Diesen Modellen fehlt die 3D-Architektur des Herzens, die für eine koordinierte elektrische Leitung und mechanische Krafterzeugung entscheidend ist, und sie können keine rhythmischen Kontraktions-Relaxations-Zyklen oder Perfusionsdynamiken nachahmen, die für die Sauerstoff- und Nährstoffzufuhr entscheidend sind⁹. Umgekehrt liefern In-vivo-Modelle die physiologisch relevantesten Erkenntnisse, sind aber mit erheblichen ethischen, administrativen und technischen Herausforderungen verbunden, einschließlich des Bedarfs an umfangreicher Schulung, ausgeklügelten chirurgischen Aufbauten und der Einhaltung strenger regulatorischer Rahmenbedingungen¹⁰.

Um diese Lücke zu schließen, bieten Ex-vivo-Herzmodelle, wie das Langendorff-perfundierte adulte Rattenherz, eine überzeugende Alternative zur wissenschaftlichen Forschung^11,12. Diese Modelle kombinieren die physiologische Relevanz von in vivo Systemen mit der Kontrollierbarkeit und Zugänglichkeit von in vitro Aufbauten. Durch die Isolierung des Herzens und dessen Aufrechterhaltung in einem funktionsfähigen Zustand ermöglicht das Langendorff-Gerät den Forschern, hochgenaue Studien zur kardialen Elektrophysiologie unter genau kontrollierten Bedingungen durchzuführen. Das Fehlen systemischer Variablen wie neuronaler Eingaben und zirkulierender Hormone vereinfacht die Interpretation der Ergebnisse unter Beibehaltung wichtiger Aspekte der Herzphysiologie. Darüber hinaus mildern Ex-vivo-Modelle viele ethische Bedenken und reduzieren die Ressourcenbelastung, was sie zu einer vielseitigen und praktischen Plattform für die translationale Forschung macht¹³.

Zusätzlich zu seinem translationalen Potenzial setzt dieses Protokoll einen Maßstab für die Bewertung der Materialleistung. Durch die Einbeziehung repräsentativer Materialstrategien, wie z.B. optoelektronische Plattformen für die drahtlose Photostimulation und elektronische Systeme für die kabelgebundene Stimulation und Aufzeichnung, wird ein reproduzierbarer Rahmen für vergleichende Studien geschaffen. Diese Standardisierung erleichtert nicht nur Innovationen, sondern erhöht auch die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse über Forschungsgruppen hinweg. In der Vergangenheit haben sich viele Hochleistungs-Photoelektroden und -Elektroden als vielversprechend für bioelektrische Studien erwiesen, wie z. B. PEDOT: PSS¹⁴, MXene¹⁵, Iridiumoxide¹⁶, Platin¹⁷, Molybdän¹⁸, Silizium 19,20,21, Quantenpunkte 22,23,24 und organische Halbleiter ²⁵. Hier präsentiert dieses Protokoll repräsentative und hochmoderne Materialien, darunter nanoporöses Silizium²⁶, nanoporöses Kohlenstoff²⁷ und flexible netzartige Gold-Multielektroden-Arrays (MEAs)^28,29, die in das Protokoll integriert werden, um ihre Fähigkeiten in bidirektionalen kardialen Schnittstellen zu demonstrieren. Diese Materialien ermöglichen eine überschwellige Stimulation mit geringer Intensität, eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung und Aufzeichnungen mit hohem SNR-Vermögen und zeigen damit ihr Potenzial für die Weiterentwicklung der kardialen Bioelektronik. Darüber hinaus bietet die Einbeziehung eines durch I/R-Verletzungen induzierten Myokardinfarktmodells einen robusten Rahmen für krankheitsrelevante Studien und therapeutische Erkundungen.

In dieser Arbeit werden detaillierte Methoden zur Herstellung und Anwendung fortschrittlicher Materialien für die bleifreie Photostimulation und elektrische Stimulation und Sensorik mit ex vivo Rattenherzen vorgestellt (Abbildung 1A). Nanoporöse Siliziummembranen wurden durch Photolithographie-Strukturierung, reaktives Ionenätzen (RIE) und gepufferte Flusssäurefreisetzung (HF) von Silizium-auf-Isolator-Wafern (SOI) mit einer 5-μm-Bauelementschicht hergestellt, gefolgt von Färben und Übertragen auf weiche Polydimethylsiloxan (PDMS)-Membranen²⁶. Für die elektrische Stimulation und Aufzeichnung wurde nanoporöser Kohlenstoff durch Laserablation von salzinkubierten Zellulosesubstraten entwickelt, gefolgt von Wasserphasentransfer und Wärmelaminierung, was im Vergleich zu herkömmlichen Goldelektroden verbesserte Ladungsspeicher- und Injektionsfähigkeiten bietet²⁷. Darüber hinaus wurden flexible MEAs auf Polyimid-beschichteten Si-Wafern mittels Photolithographie, Elektronenstrahlmetallisierung, Ätzen, Verkapselung und Freisetzungsprozessen hergestellt, um eine ortsaufgelöste epikardiale Aufzeichnung und Kartierung zu ermöglichen^28,29.

Über die Herstellung hinaus bietet das Protokoll ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung, Perfusion, Überwachung und Schnittstelle zu optischen und elektrischen Geräten für erwachsene Rattenherzen. Die Geräte wurden an isolierten Herzen getestet und zeigten repräsentative Ergebnisse bei der Stimulation und Aufzeichnung für die elektrophysiologische Bewertung. Dieses Protokoll stellt auch eine Methode zur Erstellung eines Myokardinfarktmodells durch I/R vor, das durch physiologische Aufzeichnungen, Färbungen und morphologische Bewertungen validiert wurde. Diese umfassende Methodik schafft einen reproduzierbaren Rahmen für die Bewertung von Materialien und Geräten in kardialen Biointerfaces. Abbildung 1B-D zeigt die Arbeitsabläufe der Materialherstellung für die Bewertung in diesem ex vivo Herzmodell. Abbildung 2A-C zeigt die erwarteten Ergebnisse in Bildern der hergestellten Geräte.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Chicago genehmigt (Protokollnummer 72378).

1. Herstellung nanoporöser Siliziummembranen (Abbildung 1B, Abbildung 2A, Abbildung 3)

1. Entwerfen Sie das Fotomaskenmuster in der AutoCAD-Software (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die Gerätegröße der Längenskala des biologischen Ziels entspricht. Verwenden Sie für das Rattenherz eine Gerätegröße von 2 - 10 mm. Fügen Sie dem Design kleine Lochanordnungen mit einem Durchmesser von 20 bis 100 μm hinzu, um die Freisetzung der Si-Bauelementschicht in gepuffertem HF zu erleichtern. Machen Sie die drei großen Löcher mit einem Durchmesser von 200 bis 1000 μm und bilden Sie einen chiralen Buchstaben L, um die richtige Seite der Membran zu identifizieren.
2. Reinigen Sie den SOI-Wafer mit Aceton und Isopropylalkohol (IPA) für jeweils 3 min im Ultraschallbad. Das Dörrbacken bei 200 °C für 20 min auf der Herdplatte durchführen.
3. Den dicken Positivlack AZ40XT-11D bei 3000 U/min 45 s lang schleudern und bei 115 °C 3 min backen. Achten Sie darauf, nicht zu viel Fotolack auf den Wafer zu gießen. Nach dem Spin Coating werden die Rückstände auf der Rückseite des Wafers mit Acetontupfern gereinigt.
   HINWEIS: AZ40XT-11D ist ein sehr viskoser positiver Fotolack.
4. Verwenden Sie den Heidelberg MLA150 Direct Writer, um das Fotolackmuster bei 375 nm und einer Dosis von 800 mJ/cm² zu belichten. Das Nachbacken bei 110 °C für 2 min durchführen.
5. Entwickeln Sie das Muster in AZ 300MIF developer für 2 Minuten. Spülen Sie den Wafer 60 s lang mit deionisiertem (DI) Wasser ab und trocknen Sie ihn anschließend mit N₂ Luft.
6. Ätzen Sie das freigelegte SOI mit einem SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm) RIE-Prozess für 12 min unter Verwendung von induktiv gekoppeltem Plasma bei 600 W und einer Radiofrequenz von 60 W in einem Fluoridätzer mit induktiv gekoppeltem Plasma mit einem Kammerdruck von 10 mT, was zu einer Ätzrate von etwa 660 nm/min führt.
7. Den Fotolack mit AZ NMP in einem 80 °C heißen Ultraschallbad für 10 min abisolieren und den Wafer in einem Ultraschallbad 3 min lang in Aceton reinigen, anschließend 3 min in IPA und mit komprimiertem Stickstoff trocknen.
8. Tauchen Sie die Probe bei Raumtemperatur in gepuffertes HF, um vergrabene Oxidschichten zu entfernen. Das Gerät löst in 4 - 8 h aus. Erhöhen Sie die Temperatur der Lösung (40 °C) leicht, um das Freisetzen zu erleichtern.
9. Übertragen Sie die gelösten Membranen vorsichtig mit 1 cm x 1 cm Filterpapier nacheinander in zwei separate DI-Wasserbäder, um eventuelle HF-Reste zu entfernen.
   HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Die Membran zur Lagerung bei 4 °C in einem IPA-Bad einweichen.
10. Übertragen Sie die Membran mit Hilfe von Filterpapier in eine Petrischale mit deionisiertem (DI) Wasser. Die Membran schwimmt aufgrund der Hydrophobie und der Oberflächenspannung auf der Wasseroberfläche.
    HINWEIS: Silikonmembranen können sich aufgrund des Marangoni-Effekts³⁰ rigoros von IPA zu Wasser bewegen.
11. Stellen Sie in einer separaten Petrischale die Fleckenätzlösung her, die ein Volumenverhältnis von 100:1 aus konzentriertem HF und konzentrierter Salpetersäure enthält (z. B. 10 mL HF und 0,1 mL HNO₃). Vor dem Ätzen gut mischen.
12. Die Membran mit Filterpapier in die Fleckenätzlösung geben und 30 s ätzen. Achten Sie auf die Seite der Si-Membran, indem Sie die Ausrichtung des Buchstabens L notieren, die durch die drei Hauptlöcher gebildet wird. Die Si-Membran sollte auf dem Ätzmittel schwimmen, wo nur eine Seite der Membran geätzt ist.
13. Übertragen Sie die Membran mit Filterpapier in zwei separate DI-Wasserschalen, um die Rückstände HF wegzuspülen.
    HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Die Membran zur Lagerung bei 4 °C in IPA überführen.
14. Stellen Sie ein unterstützendes Substrat mit dünnem PDMS her. Teil A (Basispolymer) und Teil B (Härter) im Gewichtsverhältnis 10:1 mischen und 30 min entgasen.
15. Spin Coat PMMA (495 A6) Opferschicht auf Objektträger bei 2.000 U/min für 45 s. Bei 180 °C 60 s backen.
16. Schleuderbeschichtung PDMS bei 4.500 U/min für 45 s auf dem PMMA-beschichteten Glas, was eine Dicke von 10 - 20 μm ergeben soll. Im 80 °C Backofen oder auf der heißen Platte 2 h aushärten.
    HINWEIS: Um mechanische Beschädigungen zu mildern, wurde PDMS als weiches Substrat für die Aufnahme der nanoporösen Siliziummembranen verwendet, das Schutz vor möglichen Schäden durch direkte Handhabung mit einer Pinzette bietet.
17. Übertragen Sie die geätzte Si-Membran von IPA auf PDMS. Verwenden Sie ein sauberes Tuch, um das überschüssige IPA zu entfernen, und die Si-Membran haftet fest an PDMS, nachdem das IPA verdampft ist. Achten Sie auf die Seite der Si-Membran, indem Sie die Ausrichtung des Buchstabens L identifizieren, die durch die drei Hauptlöcher gebildet wird. Das geätzte poröse Si sollte nach außen zeigen, und das ungeätzte Si sollte mit PDMS verbinden.
18. Schneide das PDMS mit einer Rasierklinge, die die Si-Membran enthält, umlaufend ab. Lassen Sie ausreichend Platz und achten Sie darauf, die Si-Membran nicht zu beschädigen.
19. Weichen Sie das Gerät in Aceton ein, bis das Si/PDMS freigegeben wird. Vermeiden Sie es, zu lange einzuweichen, da dies zu einer PDMS-Schwellung führen kann. Spülen Sie es mit DI-Wasser ab und trocknen Sie es mit N₂. Die O₂ -Plasmabehandlung bei 400 W für 10 min durchführen.

2. Herstellung flexibler Mikroelektrodenarrays (Abbildung 1C, Abbildung 2B, Abbildung 4)

1. Entwerfen Sie die Struktur flexibler MEAs in AutoCAD (Abbildung 4). Wir stellen zwei verschiedene Designs mit der gleichen Elektrodenprojektionsfläche, aber unterschiedlichen Substratstrukturen vor (Abbildung 2B, Abbildung 4).
2. Reinigen Sie das Silizium-Wafer-Substrat in Aceton und IPA für jeweils 3 min in einem Ultraschallbad.
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert keine zusätzliche Oberflächenbehandlung, um die Haftung zwischen Polyimid (PI) und Si-Wafer zu verbessern und die Freisetzung des Geräts zu erleichtern. Bei Bedarf kann eine Sauerstoffplasmabehandlung verwendet werden, um die Haftung zu verbessern.
3. Gießen Sie 4 ml der PI-Vorläuferlösung von Poly (pyromellitisches Dianhydrid-co-4,4′-oxydianilin) auf den Wafer. Schleudern Sie den Wafer bei 1.500 U/min für 45 s. Verwenden Sie NMP oder Aceton, um den Vorläufer auf der Rückseite des Wafers zu entfernen.
4. Bei 110 °C 3 Min., dann 3 Min. bei 180 °C vorbacken. Härten Sie den PI-beschichteten Wafer im Lackofen mit einem Profilmodus aus. Beginnen Sie bei Raumtemperatur, heizen Sie auf 250 °C mit der Rampengeschwindigkeit von 4 °C/min auf und halten Sie es 30 Minuten lang. Erhitzen Sie dann den Wafer auf 350 °C mit der Rampenrate von 2,5 °C/min, halten Sie ihn 60 Minuten lang bei 350 °C und kühlen Sie dann langsam auf RT ab. Das Ergebnis ist eine PI-Folie von ca. 5 μm Dicke.
5. Schleudern Sie den PI-beschichteten Wafer mit AZ nlof 2020 bei 2.000 U/min für 45 s. Die Waffel bei 110 °C 2 min backen. Verwenden Sie den Heidelberg MLA150 Direct Writer, um das Fotolackmuster bei 375 nm und einer Dosis von 200 mJ/cm² zu belichten.
6. Das Nachbacken bei 110 °C für 2 min durchführen. Entwickeln Sie das Muster 1 Minute lang in AZ 300MIF Developer. Spülen Sie den Wafer 60 s lang mit DI-Wasser ab und trocknen Sie ihn anschließend mit N₂ Luft.
7. 10 nm Titan und 200 nm Gold mit einem E-Beam-Verdampfer abscheiden. Den Fotolack mit AZ NMP in einem 80 °C-Bad für 3 h abisolieren und den Wafer in einem Ultraschallbad 3 Minuten lang in Aceton reinigen, anschließend 3 Minuten in IPA und mit komprimiertem Stickstoff trocknen.
8. Schleudern Sie den dicken Positivlack AZ40XT-11D bei 3.000 U/min für 45 s. Reinigen Sie den Fotolack auf der Rückseite des Wafers mit Aceton. Die Waffel bei 115 °C 3 min backen.
9. Verwenden Sie den Heidelberg MLA150 Direct Writer, um das Fotolackmuster bei 375 nm und einer Dosis von 800 mJ/cm² zu belichten. Das Nachbacken bei 110 °C für 2 min durchführen.
10. Entwickeln Sie das Muster in AZ 300MIF Developer für 3 Minuten. Spülen Sie den Wafer 60 s lang mit DI-Wasser ab und trocknen Sie ihn anschließend mit N₂ Luft.
11. Ätzen Sie das unbedeckte PI mit einem SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm) RIE-Prozess für 20 min mit induktiv gekoppeltem Plasma bei 600 W und einer Radiofrequenz von 60 W in einem induktiv gekoppelten Plasmafluoridätzer mit einem Kammerdruck von 10 mT.
12. Entfernen Sie den Fotolack mit AZ NMP in einem 80 °C-Bad für 10 Minuten und reinigen Sie den Wafer 3 Minuten lang mit milder Beschallung in Aceton, gefolgt von 3 Minuten in IPA und getrocknet mit komprimiertem Stickstoff.
    HINWEIS: Verwenden Sie Ultraschall mit geringer Leistung, um ein Ablösen des Geräts zu vermeiden. Vermeiden Sie Ultraschall, wenn der PI Anzeichen einer Ablösung zeigt.
13. Verarbeiten Sie den Wafer in einem Hexamethyldisilazan (HMDS)-Ofen, um eine HMDS-Behandlung durchzuführen. Schleudern Sie SU-8 2002 bei 2.000 U/min für 45 s. Daraus ergibt sich eine SU8-Dicke von ca. 2,5 μm.
14. Die Waffel bei 95 °C 20 min backen. Verwenden Sie den Heidelberg MLA150 Direct Writer, um das Fotolackmuster bei 375 nm und einer Dosis von 950 mJ/cm² zu belichten.
15. Entwickeln Sie das Muster in SU-8 Developer für 1 Min. Spülen Sie es mit IPA- und DI-Wasser ab und trocknen Sie es mit N₂ -Gas. Wenn während der IPA-Spülung weiße Flecken auf dem Wafer auftreten, weichen Sie den Wafer in SU8-Entwickler ein, bis die weißen Flecken verschwunden sind.
16. Über Nacht bei 160 °C fest backen. Verwenden Sie kürzere Backzeiten (~30 min) für akute Experimente. Nicht unter 150 °C und nicht über 200 °C backen. Ziehen Sie das flexible PI-gestützte flexible MEA vom Substrat ab.

3. Herstellung von nanoporösem Kohlenstoff (Abbildung 1D, Abbildung 2C, Abbildung 5)

1. Entwerfen Sie das Carbonfilmmuster in der Designsoftware (Abbildung 5).
   HINWEIS: Diese Methode enthält das Herstellungsprotokoll für zwei Arten von Elektroden: nanoporöse Stimulationselektrode auf Kohlenstoffbasis und Sensorelektrode.
2. Das Filterpapier wird 1 h lang in wässrigen Lösungen von Natriumborat (0,15 M, pH 9,4) imprägniert und anschließend über Nacht bei 60 °C getrocknet (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Whatman-Filterpapier der Güteklasse 1 diente in erster Linie als repräsentatives poröses Substrat auf Faserbasis. Natriumborat wird nach dem Imprägnier- und Trocknungsprozess in Zellulosefasern eingearbeitet. Salz wirkt als Katalysatoren, die die photochemische Karbonisierung unter Lasersynthese erleichtern²⁷.
3. Führen Sie die Lasersynthese mit einem CO₂ -Laser mit vorgefertigten Mustern durch (Abbildung 5A). Führen Sie die Strukturierung im Rastermodus mit optimierten Parametern durch: Leistung = 1,8 W; Geschwindigkeit = 1,6 cm/s; Punkte pro Zoll = 1000.
4. Bereiten Sie eine Folie aus Polyethylenterephthalat (PET) mit einer Dicke von 50 μm vor und reinigen Sie die Folie mit Aceton und Isopropylalkohol (IPA) für jeweils 3 min im Ultraschallbad.
5. 5 nm Titan und 100 nm Gold mit einem Elektronenstrahlverdampfer abscheiden. Wenden Sie das Wasserphasentransferverfahren an, um das MEA auf die PET-Folie (12,5 μm) zu übertragen.
   HINWEIS: Der Wasserphasentransfer wurde mit zwei aufeinanderfolgenden Verfahren durchgeführt: Wasserphasentrennung und Kapillartransfer.
6. Tauchen Sie Papiersubstrate allmählich in DI-Wasser, um sie während der Wasserphasentrennung zu delaminieren.
   HINWEIS: Die durch die Zellulosequellung induzierte Dehnungsenergie ermöglichte die Trennung der Kohlenstoffmembran vom Trägersubstrat in weniger als einer Sekunde, wodurch sie auf der Wasseroberfläche schwamm.
7. Verwenden Sie das Trägersubstrat, z. B. PET-Folie, für die Übertragung der Muster in Wassermedium während des Kapillartransfers. Tauchen Sie das Substrat in Wasser und bringen Sie es mit einem Ende der gewünschten Kohlenstoffmembran in Kontakt, um eine Kontaktlinie (die Übertragungsfront) zu bilden. Halten Sie dann das Substrat mit der Hand fest und bewegen Sie es mit geringer Geschwindigkeit in geneigter oder vertikaler Richtung.
   HINWEIS: Bei hydrophoben Stützsubstraten kann eine externe Krafteinwirkung oder eine O₂ -Plasmabehandlung angewendet werden, um die Bildung der Kontaktlinie zu unterstützen.
8. Nach dem Transfer ca. 20 μl Perfluorsulfonsäure (PFSA)-Polymerlösung (mit einer Konzentration von ~5% in einer Mischung aus niederen aliphatischen Alkoholen und Wasser) auf die Kohlenstoffmuster auftragen und bei Raumtemperatur (23 °C) und Druck (1 atm) zur Fixierung trocknen lassen.
9. Befestigen Sie die nanoporöse Stimulationselektrode auf Kohlenstoffbasis, indem Sie sie mit leitfähigem Silberkleber mit einem Cu-Draht verbinden. Verkapseln Sie die freiliegende Verbindungsstelle zwischen dem Cu-Draht und der Elektrode mit Silikonkleber, um Isolierung und Stabilität zu gewährleisten. Nach einer Aushärtung von 3 h bei Raumtemperatur ist die Stimulationselektrode einsatzbereit. Das Experiment kann hier pausiert werden.
10. Entwerfen Sie das Carbon- und MEA-Muster in AutoCAD (Abbildung 5B). Herstellung von 4 x 4 Mikroelektrodenarrays auf einer 25 μm PI-Schicht unter Verwendung des Standard-Photolithographieverfahrens, wie in Schritt 2 beschrieben.
    HINWEIS: Die PI-Folie kann durch PI-Vorläufer oder durch Laminieren kommerzieller PI-Folie auf Si-Wafer mit AZ2020-Fotolack hergestellt werden. Das Protokoll für die Photolithographie und Metallabscheidung ist das gleiche wie in Schritt 2.
11. Erstellen Sie eine monolithische Kohlenstoffmembran (2 cm x 2 cm) auf einem Papiersubstrat nach der Salzimprägnierung und dem Laserschreiben, wie in den Schritten 3.1-3.3. Übertragen Sie das Carbonmuster auf eine vorgefertigte PET-Trägerfolie mit einem Standard-Wasserphasentransferverfahren, wie in den Schritten 3.6-3.9.
12. Tragen Sie eine 10 Gew.-% Polyethylen-Co-Vinylacetat (EVA)-Lösung in Hexan auf das Kohlenstoffmuster auf und warten Sie, bis sie bei Raumtemperatur (23 °C) und Druck (1 atm) getrocknet ist. Entwerfen und laserschneiden Sie eine 10 μm dicke PET-Schablone (mit einer EVA-Beschichtung auf der Unterseite) mit 16 Löchern, die auf das MEA-Muster ausgerichtet sind und als Verkapselungsschicht dienen.
13. Richten Sie das MEA, die PET-Verkapselungsschicht und die Carbonmembran auf dem PET-Träger aus. Pressen Sie die Baugruppe mit einem handelsüblichen Heißlaminiergerät bei einer Verarbeitungstemperatur von 120 °C für den Transfer und die Verkapselung.
14. Kühlen Sie die nanoporöse, kohlenstofffähige Messelektrode auf Raumtemperatur ab, entfernen Sie die Rückstände und spülen Sie sie 3x mit Ethanol und Wasser ab, bevor Sie sie verwenden.

4. Isolierung, Perfusion und Überwachung des Rattenherzens (Abbildung 6)

1. Bereiten Sie Ratten vor der Herzextraktion vor (Abbildung 6A). Dieses Protokoll verwendete männliche CD/SD-Ratten im Alter von 3 bis 4 Monaten, die aus Charles River gewonnen wurden.
2. Bereiten Sie die Tyrodelösung von N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) vor, indem Sie die Chemikalien gemäß Tabelle 1 auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit 2 M NaOH auf 7,2-7,4 ein. Präoxygenieren Sie, indem Sie Sauerstoffgas 0,5-1 h lang sprudeln lassen, und setzen Sie die Sauerstoffversorgung bis zum Ende der Experimente fort.
3. Legen Sie drei Röhrchen Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium) auf Eis. Bereiten Sie saubere chirurgische Instrumente vor (scharfe Schere, gebogene Schere, zwei Blutstiller, scharfe Pinzette, zwei kleine Pinzetten).
   HINWEIS: Eine Operation ist nicht zum Überleben gedacht, daher ist Sterilität nicht erforderlich.
4. Holen Sie erwachsene männliche CD/SD-Ratten mit einem Gewicht zwischen 400 und 500 g aus der Tierhaltung ab. 0,5 ml Heparin (1000 I.E./kg) intraperitoneal in den Unterbauch verabreichen. Verwende dicke Handschuhe, um die Ratte zum Schutz zu halten.
5. Fassen Sie die Ratte am oberen Rücken, so dass der Bauch freiliegt. Halten Sie die Ratte fest, aber ohne übermäßige Gewalt, um das Tier nicht zu verletzen. Injizieren Sie die Heparinlösung schnell und präzise. Warten Sie 20-30 Minuten. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Langendorff-Gerät vor.
   HINWEIS: Die Ratte kann im Voraus betäubt werden, um den richtigen Schritt zur Vorbereitung des chirurgischen Eingriffs zu gewährleisten.
6. Waschen Sie vor dem Nachfüllen der HEPES Tyrode-Lösung den Beutel für die intravenöse Therapie (IV) mit Wasser und trocknen Sie ihn vollständig ab, um die richtige Zusammensetzung zu gewährleisten. Füllen Sie den Beutel mit vorsauerstoffreicher HEPES-Tyrode-Lösung.
7. Schalten Sie den Thermostat und den Wasserkreislauf im Langendorff-Gerät bei 37 °C ein (Abbildung 6A). Bereiten Sie die Kanüle und die Naht vor und legen Sie die Petrischale für den Gewebeschnitt auf die Kühlpackung. Grundieren Sie die Kanüle vor dem Schneiden mit eiskaltem HBSS.
8. Bereiten Sie sich auf die Durchführung einer Rattenthorakotomie vor (Abbildung 6B). Betäuben Sie das Tier mit Isofluran in einer Glockenkonfiguration. Geben Sie 8 bis 10 ml Isofluran in ein 50-ml-Röhrchen, das mit einem Mullkissen gefüllt ist. Schließen Sie das Tier mit dem offenen Schlauch (mit Isofluran) in ein Gefäß ein.
9. Beobachten Sie den Fortschritt der Anästhesie, indem Sie den Zehenkneifreflex testen. Die Tiere werden unter Narkose gesetzt und verlieren innerhalb von 2-3 Minuten das Bewusstsein. Überwachen Sie den Zustand der Ratte sorgfältig und übertragen Sie sie sofort nach dem Bewusstverlust auf die Operationsplatte. Eine längere Narkose kann zum Tod der Ratte führen.
10. Bringen Sie das Tier auf die Operationsplatine. Legen Sie es auf den Rücken und legen Sie 5 ml Isofluran in ein 50-ml-Röhrchen, das mit einem Mullkissen gefüllt ist, über das Maul der Ratte. Bestätigen Sie die Vollnarkose, indem Sie eine der Pfoten einklemmen. Fahren Sie nur fort, wenn keine Antwort notiert wurde.
11. Befestigen Sie den Ober- und Unterarm mit Nadeln an der OP-Platte. Machen Sie einen Schnitt (~ 5 cm), um den Brustkorb der Ratte direkt unter der Brust zu öffnen. Schneiden Sie vorsichtig durch das Zwerchfell, um Herz und Lunge freizulegen.
12. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten durch, um den Brustkorb vollständig zu öffnen und einen vollständigen Zugang zu ermöglichen. Sichern Sie den Brustkorb am Brustbein mit einem Hämostaten. Halten Sie die Hohlvene mit einem Hämostatat unterhalb des Herzens fest. Entfernen Sie das Herz, indem Sie mit einer gebogenen, stumpfen Schere so nah wie möglich an der Unterseite des Brustkorbs unter dem Blutstillstand schneiden.
13. Übertragen Sie das Herz auf eiskaltes HBSS. Minimieren Sie die Dauer des Schritts, um eine längere Unterbrechung der Sauerstoffversorgung des kontrahierenden Herzens zu verhindern.
14. Bereiten Sie sich auf die Durchführung der Langendorff-Perfusion und -Überwachung vor. Füllen Sie die Kanüle und die Petrischale vollständig mit eiskaltem HBSS. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im System vorhanden sind.
15. Übertragen Sie das Herz zum Schneiden in die mit HBSS vorgefüllte Petrischale. Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer Schere Lungen und anderes Bindegewebe (Abbildung 6C).
    HINWEIS: Für das Sektionsverfahren wird eine stumpfe Dissektion empfohlen, um mögliche Schäden am Herzen zu vermeiden. Verwenden Sie zum Schneiden von benachbartem Gewebe zwei Scheren und reißen Sie das Gewebe vorsichtig auseinander.
16. Lokalisieren Sie die Aorta, indem Sie auf das Herz drücken und den Weg des Blutes beim Austritt verfolgen. Schneiden Sie unter die erste aufsteigende Arterie und kanülieren Sie die Aorta, wenn der Aortenbogen während der Extraktion erhalten bleibt (Abbildung 6D). Befestigen Sie die Aorta mit einem Doppelknoten an der Kanüle.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Kanüle zu tief einzuführen, um sicherzustellen, dass das Ventil geschlossen bleibt. Positionieren Sie die Naht nicht zu tief, da dies die Herzkranzgefäße verstopfen kann.
17. Grundieren Sie das Langendorff-Gerät mit einer mit Sauerstoff angereicherten Arbeitslösung. Öffnen Sie den Pufferfluss, und befestigen Sie die Kanüle an der Vorrichtung (Abbildung 6E). Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen gebildet werden. Das Herz beginnt sich bei diesem Schritt zusammenzuziehen.
    HINWEIS: Anfangs kann etwas Puffer aus den Ventrikeln spritzen, aber eine übermäßige Leckage ist nicht zu erwarten. Passen Sie die Naht nach Bedarf an, um ein Austreten des Puffers zu verhindern. In diesem Schritt wird kein Herzflimmern beobachtet, wenn die Operation und die Vorbereitung richtig durchgeführt werden.
18. Schneide die Vorhöfe ab. Lassen Sie die Luft aus dem Ballon ab, bevor Sie ihn in die linke Herzkammer einführen, und füllen Sie ihn dann mit der angeschlossenen Spritze mit Wasser.
19. Schließen Sie die BP-100-Sonden an die Perfusionsleitung und wassergefüllte Ballons an, um die Perfusion bzw. den linksventrikulären Druck (LVP) zu überwachen (Abbildung 6F).
    HINWEIS: Die BP-100-Sonden müssen vor der Verwendung kalibriert werden. Blasen in den Ballons müssen ausgestoßen werden, um eine präzise Druckmessung zu gewährleisten.
20. Überwachen Sie den Pufferdruck des HEPES Tyrode und den Ausgangswert von LVP. Stellen Sie sicher, dass der Pufferdruck im optimalen Bereich von 80-100 mmHg gehalten wird. Passen Sie den Ausgangs-LVP auf ca. 20 mmHg an, indem Sie das in den Ballon injizierte Wasservolumen ändern (Abbildung 6F).
21. EKG-Elektroden anschließen. Erden Sie die Kanüle und positionieren Sie die Elektrode je nach Vorliebe an den Seiten, oben oder am Scheitelpunkt (Abbildung 6F).
22. Verstärken Sie alle Signale (Perfusion, linksventrikulärer Druck und EKG) mit einem IA-400D-Verstärker und verbinden Sie ihn mit einem Computer über einen Digitizer mit der Clampex-Software (Abbildung 6F).

5. Entstehung eines Myokardinfarkts mittels IR-Verfahren (Abbildung 6G, Abbildung 7)

1. Füllen Sie die beheizte Kammer mit vorgewärmtem 37 °C HEPES Tyrode-Puffer. Tauchen Sie das Herz in den Puffer in der beheizten Kammer ein und stellen Sie den Absperrhahn so ein, dass der Pufferfluss gestoppt wird, wodurch eine globale Ischämie ausgelöst wird. Passen Sie die Dauer der Ischämie an die spezifischen Ziele des Experiments an.
2. Drehen Sie den Absperrhahn, um den Pufferfluss in das Herz nach 30 Minuten Ischämie wiederherzustellen und die Reperfusion einzuleiten. Lassen Sie das Herz 45 Minuten lang reperfusionieren, bevor Sie den Versuch zur Färbung zur Beurteilung der Infarktgröße beenden (Abbildung 6G).
   HINWEIS: Die Ischämie- oder Reperfusionszeit wird auf der Grundlage experimenteller Ziele bestimmt.
3. Überprüfen Sie die erfolgreiche Ischämiseinduktion, indem Sie eine Verringerung der Herzfrequenz und unregelmäßige EKG-Muster beobachten (Abbildung 7A). Es werden Herzrhythmusstörungen oder Kammerflimmern beobachtet.
4. Verabreichen Sie langsam 10 ml 4 °C HBSS durch die seitliche Öffnung des Absperrhahns, um das Herz zu stoppen. Entfernen Sie das Herz aus der Perfusionssäule, schneiden Sie das verbleibende Vorhofgewebe ab und legen Sie das Herz in eine Gewebeschnittmatrix.
5. Decken Sie die Matrix mit Klarsichtfolie ab und frieren Sie das Herz bei -80 °C für ca. 8 min ein oder bis es eine marshmallowartige Konsistenz erreicht. Nehmen Sie die Tissue-Slicing-Matrize aus dem Gefrierschrank und setzen Sie Rasierklingen ein, um das Herz in 2 mm dicke Stücke zu schneiden.
6. Entnehmen Sie die Gewebescheiben nacheinander aus der Schneidmatrix und lagern Sie sie bei -80 °C, bis sie für biochemische Experimente benötigt werden.
7. Führen Sie eine Infarktfärbung durch (Abbildung 7B). Inkubieren Sie die Herzscheiben in 10 ml 1 % w/v Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) bei 37 °C für 30 Minuten.
8. Übertragen Sie die Gewebescheibe auf 10% gepuffertes Formalin und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur fixieren. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, entfernen Sie das Herz aus dem Formalin und bilden Sie das Gewebe innerhalb von 24 Stunden ab. Minimieren Sie die Lichteinwirkung während dieses Schritts, um eine Verschlechterung des Flecks zu verhindern.
9. Fotografieren Sie die gefärbte Scheibe und verwenden Sie Software wie ImageJ, um die Infarktgröße zu schätzen.

6. Etablierung bidirektionaler optoelektrischer Grenzflächen zwischen Geräten und Herzgewebe (Abbildung 8, Abbildung 9)

1. Platzieren Sie die optoelektronische Silikonmembran an der gewünschten Stelle für die Stimulation. Die Siliziummembran heftet sich mit Kapillarkraft selbst an das Epikard (Abbildung 8A). Wenn die Befestigung schwierig ist, verwenden Sie Nassgewebekleber, um die Befestigung zu erleichtern.
   HINWEIS: Durch die Verringerung der Perfusionsrate kann die Wassermenge auf der Herzoberfläche reduziert werden, was die Bindung erleichtert. Sobald die Silikonmembran an der Herzoberfläche befestigt ist, haftet sie während der Operation in der Regel an der vorgegebenen Position.
2. Verbinden Sie die Elektroden mit den RHD-Systemen oder anderen elektrophysiologischen Plattformen zur Datenaufzeichnung. Die MEAs verfügen über 16-Kanal-I/O-Pads mit einem Rastermaß von 0,5 mm an einem Ende, die über einen ZIF-Stecker (Zero-Insertion-Force) mit einer Adapterplatine verbunden sind. Die Adapterplatine wird dann über einen Omnetics-Stecker mit dem Kopftisch verbunden.
3. Platzieren Sie die flexiblen MEAs auf den ventrikulären Oberflächen des isolierten Rattenherzens (Abbildung 8A). Platzieren Sie die MEAs innerhalb des Fensters, wenn Sie eine fensterförmige Silikonmembran verwenden (Abbildung 8B).
4. Programmieren Sie die 635-nm-Laserquelle mit der gewünschten Frequenz (z. B. 4 Hz) und dem Tastverhältnis (z. B. 0,4 %, 1 ms Impulsdauer) unter Verwendung von TTL-Signalen (Transistor-Transistor-Logik). Fokussieren Sie den Laserspot auf die Siliziummembran mit einer Spotgröße von etwa 1 mm. Tragen Sie eine schützende Laserschutzbrille. Beginnen Sie mit einer niedrigen Intensität für die Fokussierung.
5. Starten Sie das Aufnahme- und Stimulationsprotokoll. Erhöhen Sie die Laserintensität allmählich, bis eine ununterbrochene Überbrückungsstimulation beobachtet wird (Abbildung 8C).
   HINWEIS: In den Standards dieses Protokolls wird die Schwellenintensität definiert, die der Laser für 10 s ununterbrochenes Pacing ermöglicht.
6. Programmieren Sie das Laserprofil mit unterschiedlichen Pulsdauern, um ein Intensitäts- und Dauerprofil zu erhalten und die Leistung des Geräts zu vergleichen (Abbildung 8D). Das Setup ermöglicht die Mehrkanalaufzeichnung von EKG, TTL und LVP (Abbildung 8E).
7. Ändern Sie die Position der Siliziummembran oder des Lichtflecks und wiederholen Sie die Schritte 6.3-6.6, um zu untersuchen, wie sich verschiedene Stimulationsortierungen auf taktgesteuerte Wellenformen und die Herzleitung auswirken (Abbildung 9A).
8. Identifizieren Sie die getakteten QRS-Peaks von jedem Aufzeichnungsort, um die Isochronen- oder Aktivierungsverzögerungskarte zu erstellen. Identifizieren Sie den frühesten QRS-Peak, und legen Sie diese Position als Nullverzögerung fest, um die Aktivierungsverzögerungskarte darzustellen (Abbildung 9B-C).
   HINWEIS: Während die Aktivierungsverzögerungskarte im Sinusrhythmus (ohne Stimulation) als Referenz dienen kann, kann ihr Muster je nach Herzzustand und MEA-Platzierung erheblich variieren^18,30. Die Ergebnisse sind aussagekräftiger, wenn eine klare Stimulationsquelle, wie z. B. eine externe Stimulation, vorhanden ist.

7. Einrichtung bidirektionaler elektrischer Schnittstellen zwischen Geräten und Herzgewebe (Abbildung 10)

1. Schließen Sie die Stimulationselektroden (0,5 cm x 0,5 cm) in einer Zwei-Elektroden-Konfiguration an und platzieren Sie die Arbeitselektrode an der linken ventrikulären Wand, während sich die Gegenelektrode an der rechten ventrikulären Wand befindet.
2. Liefern Sie Rechteckstrom-Wellenformen (z. B. 1 mA, 1 ms Impulsdauer) durch einen Potentiostaten bis zur erfolgreichen Stimulation (Abbildung 10A-B). Führen Sie Tests durch, um Diagramme des Stimulationsstroms im Vergleich zur Impulsdauer und der Stimulationsspannung im Vergleich zur Impulsdauer zu erhalten, um die Wirksamkeit der Materialstimulation zu bewerten (Abbildung 10C-D).
3. Führen Sie elektrische Aufnahmen mit einem 4 x 4-Mikroelektrodenarray (2 mm Abstand zwischen den Elektroden) und mit einer RHD-USB-Schnittstellenkarte und einem RHD-Aufnahmekopf mit 16-Kanal-Eingang durch. Nehmen Sie die Signale mit 10 kS/s in der Bandbreite von 0,1-100 Hz auf.
4. Messen Sie das Rauschen jeder Aufzeichnungselektrode (Abbildung 10E). Berechnen Sie das SNR mit der folgenden Gleichung (Abbildung 10F):
   oder
   Dabei ist Signal die Signalamplitude und_std-Rauschen die Standardabweichung des Rauschpegels. Während der Aufnahme ist der 60-Hz-Notch-Filter ausgeschaltet, um die Rohergebnisse wiederzugeben.
5. Führen Sie zusätzliche Analysen durch und zeichnen Sie isochrone Karten der elektrischen Ausbreitung mit Python.
6. Bestimmen Sie einen Zeitstempel der Spitzenablenkung (getakteter QRS-Komplex) für jede Kontraktion und berechnen Sie den Durchschnitt für mehrere Signale. Verwenden Sie die Gaußsche Interpolation für das Kartenrendering, um die Lesbarkeit zu verbessern.

Ergebnisse

Die Stimulationselektrophysiologie einer Vielzahl von optoelektronischen und elektronischen Materialien kann mit dem ex vivo-Herzsystem , das einen bequemen und kontrollierten Aufbau ermöglicht, effizient validiert werden (Abbildung 1A). Materialien mit hoher Ladungsinjektion wie poröses Silizium und poröser Kohlenstoff erleichtern die bioelektrische Modulation mit geringer optischer Intensität und Niederspannungsstimulation und gewährleisten so Sicherheit und einen ladungsausgeglichenen kapazitiven Betrieb.

Nanoporöses Silizium weist im Vergleich zu herkömmlichen Siliziumstrukturen, wie z. B. p-n- oder p-i-n-Übergängen, eine signifikant höhere Photostromerzeugung auf, was auf seinen Porositäts-aktivierten Heteroübergang²⁰, seine verbesserte Ladungsspeicherkapazität, seine reduzierte Impedanz und seine verbesserte optische Absorption zurückzuführen ist. Diese überwiegend kapazitiven Photoströme ermöglichen eine biosichere, ladungsbalancierte Stimulation³¹ (Abbildung 12A-B), wodurch eine optische Stimulation von ex vivo Rattenherzen bei 240 bpm mit einer Lichtintensität von 0,51 mW/mm² und einer Pulsdauer von 1 ms (Abbildung 8C) oder von nur 0,167 mW/mm² mit einer Pulsdauer von 10 ms (Abbildung 11B) erreicht wird -- Werte, die mit optogenetischen Methoden vergleichbar oder niedriger sind und weit unter den Lasersicherheitsschwellen^{liegen 31. 32}. Urheberrecht Unterhalb dieser Intensitäten kann es zu einem teilweisen oder gar Nichteinfangen von Lichtimpulsen kommen. Im Gegensatz dazu benötigen andere Materialien, wie z. B. p-i-n-Siliziummembranen oder golddekorierte p-i-n-Siliziummembranen, deutlich höhere optische Intensitäten, um eine Stimulation auszulösen (Abbildung 11B). Die kontinuierliche Stimulation mit nanoporösem Silizium erhöht die mechanische Kontraktion, was durch eine erhöhte LVP angezeigt wird (Abbildung 8E). Darüber hinaus demonstriert das Gerät in seiner monolithischen Form eine räumlich aufgelöste Photostrominjektion unter lokalisierten Lichtimpulsen, was Multisite- und potentielle Random-Access-Stimulationsstudien ermöglicht²⁶.

In bidirektionalen, fensterförmigen Siliziummembranstudien (Abbildung 3D, Abbildung 8B) erzeugt die Multisite-Stimulation unterschiedliche Multielektroden-Aufzeichnungsprofile und Herzleitungsmuster, die die Originalität der Wellenausbreitung von jedem Stimulationspunkt aus validieren (Abbildung 9). Diese Funktion unterstreicht die Fähigkeit des Systems, komplexe kardiale Leitungsbahnen mit hoher Präzision zu analysieren und abnormale Herzerkrankungen wie Myokardinfarkt zu diagnostizieren.

Die hergestellten MEAs sind ca. 10 μm dick und enthalten makroporöse Strukturen oder Serpentin-Verbindungen, um die Biegesteifigkeit zu minimieren und die Flexibilität oder Dehnbarkeit zu verbessern (Abbildung 4)^33,34. Die Arrays bestehen aus 16 unabhängigen Aufzeichnungsstellen, die in einer 4 x 4-Konfiguration angeordnet sind und eine Fläche von 6 mm x 6 mm abdecken. Diese Arrays ermöglichen die direkte Aufzeichnung epikardialer Signale an mehreren Stellen auf der Herzoberfläche. Eine repräsentative 16-Kanal-Aufzeichnung ist in Abbildung 13 dargestellt. Isochronenkarten, die aus den Aufzeichnungen erstellt werden, visualisieren die elektrische Leitung über die Herzoberfläche, mit oder ohne lokalisierte Stimulation. Lokalisierte Stimulation induziert oft Verzögerungen in der Leitung, die den intrinsischen Sinusrhythmus und die Leitungsbahnen des ex vivo-Herzens außer Kraft setzen (Abbildung 9B).

Nanostrukturierte Kohlenstoffmaterialien stellen aufgrund ihrer hohen Ladungsspeicherkapazität und niedrigen Impedanz eine effektive Lösung dar, um die Leistung bioelektronischer Bauelemente zu verbessern (Abbildung 14). Unser salzgestütztes Lasertransferverfahren ermöglicht die einfache Strukturierung und den sofortigen Transfer von nanoporösen Kohlenstoffbauelementen auf flexible Substrate oder herkömmliche Au-Elektroden zur Verbesserung der Leistung der Bioelektronik. Die Impedanzcharakterisierung bestätigte ferner, dass die Kohlenstoffbeschichtung die Impedanz der Au-Elektrode erheblich um etwa 2 Größenordnungen reduzierte, von 7244,4 Ω auf 63,1 Ω bei einer Frequenz von 100 Hz, die für EKG-Signale relevant ist (Abbildung 14A-B). Die Helmholtz-Kapazität der Au-Elektrode stieg nach der Kohlenstoffbeschichtung signifikant an, von 0,025 mF/cm² auf 1,98 mF/cm² (Abbildung 14C). Die Erhöhung der Kapazität mit dieser Mikrokondensator-Beschichtungsstrategie kann die Polarisationsspannung im Vergleich zur herkömmlichen Au-Elektrode effektiv senken (Abbildung 14D).

Dieses Protokoll etabliert eine nanoporöse kohlenstoffbasierte Plattform für effektive Bioschnittstellen zur elektrischen Modulation oder Sensorik von Herzsystemen (Abbildung 10). Zur Bewertung der Leistungsfähigkeit von nanoporöser Kohlenstoffelektronik für die Herzstimulation wurde die Au- oder Au-C-Elektrode an der linksventrikulären (LV) Wand für die Ladungsinjektion bei biphasischen Rechteckstrom-Wellenformen³⁵ platziert (Abbildung 10A). Bei 4-Hz-Stimulation (1 mA) erreichten sowohl die Au- als auch die Au-C-Elektroden eine effektive Overdrive-Stimulation (Abbildung 10B). In der Au-C-Gruppe wurde jedoch eine deutlich höhere EKG-Amplitude beobachtet, die auf die Kontraktionsstärke hinweist. Beide Elektroden zeigten eine exponentielle Abnahme des Schwellenstroms für die Stimulation mit Pulsdauer. Stimulationsschwellen, die die niedrigsten Spannungen für eine effektive Frequenzmodulation angeben, wurden ebenfalls über verschiedene Pulsbreiten gemessen (Abbildung 10C-D). Die Festigkeits-Dauer-Kurve wurde mit der folgenden Gleichung modelliert:

wobei I(t) sich auf den Stimulusstrom bei der Impulsdauer (t) bezieht, I_Rheobase der Schwellenstrom bei einer unendlich langen Impulsdauer (Rheobase) und τ die Membranzeitkonstante³⁶ ist. Bei der Berechnung wird die minimale Gebühr, die für eine erfolgreiche Stimulation bei chronaxie erforderlich ist, als verwendet. Q_min. Die Werte wurden mit 0,79 bzw. 0,71 μC für Au- bzw. Au-C-Elektroden bestimmt (Abbildung 10C). Bei einem Stimulationsstrom von 4 mA/cm² wurden Schwellenspannungen für eine effektive Stimulation bei 1,32 V bzw. 0,90 V für Au- bzw. Au-C-Elektroden beobachtet (Abbildung 10D). Die Verringerung der Schwellenspannung um 30,3 % deutet auf eine potenzielle Abnahme des oxidativen Stresses während einer längeren Stimulation^{hin 31} und ermöglicht so sicherere bioelektronische Anwendungen mit minimaler Gewebeschädigung. Zusätzlich wurde eine kohlenstofftransplantierte 16-Kanal-Au-Elektrode für eine verbesserte epikardiale EKG-Signaldetektion entwickelt (Abbildung 10E-F). Der nanostrukturierte Kohlenstofftransfer verbesserte das Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu herkömmlichen Au-Elektroden um das 8,0-fache und demonstrierte damit die Wirksamkeit von nanoporösen kohlenstoffbasierten Beschichtungen für die High-Fidelity-Bioelektronik.

Die erfolgreiche Induktion von I/R-Infarktmodellen wurde entweder vor Ort während des Experiments oder postexperimentell durch physiologisches Signalmonitoring bzw. TTC-Färbung validiert. Nach dem Schneiden und Färben weist das infarzierte Herz eine weiß gefärbte Region auf, die eine Myokardschädigung darstellt und der Infarktgröße entspricht (Abbildung 7B). Im Gegensatz dazu fehlen einem gesunden Herzen nach dem Färben weiße Regionen. Während der Echtzeitüberwachung zeigt ein erfolgreiches Ischämie-Modell eine deutlich reduzierte Herzfrequenz an, die sich in LVP- und EKG-Messwerten zeigt. Darüber hinaus zeigt die MEA-Kartierung des ischämischen Herzens eine verminderte elektrische Leitungsgeschwindigkeit über das Epikard, was zu einer erhöhten Verzögerungszeit führt³⁷ (Abbildung 7A).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls und des Fertigungsablaufs. (A) Schematische Darstellung des ex vivo Rattenherzaufbaus und der Geräteschnittstelle. (B) Herstellungsprozess einer porösen Siliziummembran (Schritt 1). Die Herstellung der porösen Si-Membran beginnt mit einem SOI-Wafer, bei dem eine Fotolackschicht mittels Fotolithographie strukturiert wird, um hexagonale Merkmale zu definieren. RIE entfernt selektiv freiliegendes Silizium, gefolgt von einem Lift-off-Prozess in gepuffertem HF, um Si-Membranen freizusetzen. Die Membran wird in einer HF-basierten Lösung gebeizt, wodurch eine nanoporöse Si-Struktur erzeugt wird. Die resultierende poröse Si-Membran wird vorsichtig abgelöst und zur mechanischen Unterstützung auf ein PDMS-Substrat übertragen. Schließlich modifiziert die Plasmabehandlung die Oberflächeneigenschaften für verstärkte Photoströme. (C) Herstellungsprozess von flexiblen makroporösen Mehrelektrodenarrays (Schritt 2). Die Herstellung flexibler MEAs beginnt mit der PI-Beschichtung auf einem Siliziumwafer, der als flexible Substratschicht dient. Die Photostrukturierung wird mit AZ 2020 Fotolack durchgeführt, um Elektrodenbereiche zu definieren. Die Metallabscheidung (Au/Ti) erfolgt mittels Elektronenstrahlverdampfung, um leitfähige Spuren zu erzeugen, gefolgt von einem weiteren Photostrukturierungsschritt mit AZ 40XT-11D, um ausgewählte Bereiche vor RIE zu schützen und makroporöses Substrat zu bilden. Eine SU-8-Photostrukturierung und ein Hard-Bake-Schritt fügen die Verkapselung hinzu, bevor der abschließende Lift-off-Prozess das flexible MEA vom Si-Wafer freisetzt. (D) Arbeitsablauf der Strukturierung und des Transfers von Kohlenstoffmembranen (Schritt 3), einschließlich der Faserverarbeitung durch Salzimprägnierung, der Mikrofabrikation durch Lasersynthese und des wasserunterstützten Mustertransfers vom Papiersubstrat auf andere Träger. Abbildung 1D wurde von²⁷ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Optische und REM-Bilder der hergestellten Bauelemente. (A) Querschnitts-REM (oben) und optisches mikroskopisches Bild (unten) von nanoporösem Si. (B) Optische Bilder von makroporösen Mehrelektrodenarrays mit hohlen (oben) und serpentinen (unten) Designs. (C) Optisch mikroskopisches Schnittbild (oben) und Foto (unten) von karbonisierten Substraten. Abbildung 2A wurde von²⁶ geändert. Abbildung 2C wurde von²⁷ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: CAD-Entwürfe des Si-Membrangeräts. Die Abbildung zeigt die Parameter für (A) kleine, (B) mittlere, (C) große und (D) offene fensterförmige Siliziummembranbauelemente. Einheit: mm. Diese Zahl wurde von²⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: CAD-Konstruktion der makroporösen MEAs. (A) Die Konstruktionszeichnungen und Anmerkungen für die hohlförmige MEA. (B) Die Konstruktionszeichnungen und Anmerkungen für die serpentinförmige MEA. Einheit: mm. Abbildung 4A wurde von²⁶ geändert. Abbildung 4B wurde von²⁸ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Schemata und Designs der kohlenstoffbasierten Elektrodenarrays für die Herzschnittstelle. (A) Design für die Schnittstellen der Stimulationselektrode (Schritt 3). Bei einer typischen Stimulation wurden Stimulationselektroden in einer Zwei-Elektroden-Konfiguration angeschlossen. Die Arbeitselektrode (serpentines nanoporöses Kohlenstoffmuster) wurde an der linken ventrikulären Wand platziert, während die Gegenelektrode an der rechten ventrikulären Wand platziert und mit der Erde verbunden wurde. Rechteckstrom-Wellenformen wurden über einen Potentiostaten abgegeben. (B) Die 16-Kanal-MEAs für die Maskierung und den Transfer von Kohlenstoffelektroden (Schritt 3). Schicht 1 zeigt das Au-Muster eines 16-Kanal-MEA auf einem PI-Substrat. Schicht 2 zeigt die PET-Verkapselungsfolie. Diese Zahl wurde von²⁷ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Schematische und fotografische Darstellung des ex vivo Aufbaus und des experimentellen Ablaufs. (A) Apparate und Werkzeuge, die für die Ex-vivo-Einrichtung verwendet werden, einschließlich konische Kolbenbehälter, chirurgische Instrumente, Perfusionssysteme und Temperaturkontrollsysteme (Schritt 4). (B) Extraktionsprozess des Rattenherzs: Betäuben Sie das Tier mit Isofluran; Befestigt die Arme der Ratte; Öffnen Sie den Brustkorb der Ratte; Ernte das Rattenherz. (C) Entnahme von umgebendem Fettgewebe aus dem entnommenen Herzen, um es für den Versuchsaufbau vorzubereiten. (D) Befestigung des extrahierten Herzens an das ex vivo-Perfusionssystem. (E) Perfusionsaufbau, der das Herz zeigt, das mit dem System verbunden ist, um physiologische Bedingungen zu simulieren. (F) Einrichtung der Herz-EKG-Aufzeichnung. (G) Ischämie-Reperfusionsprozesse (I/R) werden durch den Aufbau demonstriert (Schritt 5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Vergleich zwischen gesundem isoliertem Herz und I/R-Herz. (A) LVP-, EKG- und EKG-Ausbreitungsverzögerungen wurden von scheingesunden Herzen und Ischämie-/Reperfusionsherzen (I/R) aufgezeichnet. (B) Repräsentative Fotos von mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) gefärbten Schnitten von gesundem Herz und I/R-Herz. Die weiße Fläche zeigt die Größe des Infarktbereichs an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Bidirektionale optoelektronische Stimulation und elektrische Aufzeichnung eines ex vivo Rattenherzens unter Verwendung einer porösen Siliziummembran und flexibler MEAs. (A) Das Foto zeigt die Befestigung der Silikonmembran und die Platzierung von serpentinförmigen MEAs neben der Silikonmembran auf dem Herzen. (B) Foto, das die Befestigung einer offenen fensterförmigen Silikonmembran und hohlförmiger MEAs zeigt, die in das Si-Fenster eingebaut sind. (C) Optische Stimulation am ex vivo-Rattenherz mit Nicht-Capture, teilweiser Stimulation und vollständiger Stimulation bei drei verschiedenen Intensitäten bei 240 bpm und einer Pulsdauer von 1 ms. (D) Diagramm der Intensität über die Dauer zur Bewertung der Stimulationsschwelle des Geräts. (E) Optische Stimulationsprofile unter 0,24 mW/mm² Intensität und 10 ms Impulsdauer. Abbildung 8B-D wurde von²⁶ modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Multisite-Pacing und Mapping in bidirektionalen Schnittstellen. (A) Positionen von Tempo- und Aufnahmeorten. (B) Die Isochronenkarte zeigt die Verzögerung der Aktivierung des elektrischen Signals nach Photostimulation an acht verschiedenen Stellen auf einem monolithischen Si-Bauelement mit offenem Fenster. (C) Die beispielhafte Kontrolle und die schrittweisen 16-Kanal-EKG-Kurven an verschiedenen Stimulationsstellen. Durch die Stimulation verschiedener Stellen induzierte die räumliche Aktivierung zeitliche Verzögerungen in der QRS-Evolution, die an Geweben an verschiedenen Aufzeichnungsstellen nachgewiesen wurden. Diese können als Aktivierungsverzögerungskarte dargestellt werden, die die Untersuchung von Leitungsbahnen auf der Herzoberfläche ermöglicht. Diese Zahl wurde von²⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10. Nanoporöse Bioelektronik auf Kohlenstoffbasis für die Herzstimulation und -aufzeichnung. (A) Optisches Bild einer mit einer porösen Kohlenstoffmembran transplantierten Au (Au-C)-Elektrode für die Herzstimulation. Das eingefügte Bild zeigt die vergrößerte Ansicht eines serpentinstrukturierten Mikrokondensators auf der Au-Elektrode. (B) EKG-Reaktion des isolierten Rattenherzens auf biphasische Rechteckstrom-Wellenformstimulation bei einer Frequenz von 4 Hz. Bei gleicher Stromdichte von 4,0 mA/^cm2 zeigte das Herz unter Stimulation durch Au- oder Au-C-Elektroden unterschiedliche EKG-Reaktionen. (C) Die Dauer-Stärke-Kurven von Au- und Au-C-Stimulationselektroden und ihre Kurvenanpassung liegen bei einer Stimulationsfrequenz von 4 Hz vor. (D) Die Schwellenspannung, die an die Elektroden angelegt wird, um eine effektive Stimulation bei unterschiedlichen Dauern für Au- und Au-C-Elektroden zu erzielen. (E) Basislinienkurven von EKG-Signalen, die mit der Au-Elektrode und den Au-C-Elektroden aufgezeichnet wurden. (F) Das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) wird aus den aufgezeichneten EKG-Kurven berechnet. Die eingefügten Abbildungen zeigen die optischen Bilder des Au und des Au-C-Elektrodenarrays, die für die EKG-Aufzeichnung verwendet wurden (Elektrodengröße: 1 mm; Schritt 7.5). Diese Zahl wurde von²⁷ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Vergleich von Photoströmen für verschiedene Si-Bauelemente und Bewertung der Stimulationsschwelle. (A) Vergleich der Photostromgrößen über vier Si-basierte Bauelemente. Blaue Kurven stellen die gemittelten Photoströme von N = 8 unabhängigen Geräten dar, und die überlagerten grauen Kurven veranschaulichen die Messungen einzelner Geräte. Das nebenstehende Balkendiagramm zeigt die Spitzenwerte des Photostroms (in blau) und die integrierten Ladungsinjektionen (in orange). Balkendiagramme werden als Mittelwert ± s.d. ausgedrückt. Maßstabsbalken, 10 ms. (B) Die Ex-vivo-Herzstimulation wurde mit den drei verschiedenen Geräten durchgeführt. Die Stimulation wurde mit einer Frequenz von 240 b.p.m. und einer Pulsbreite von 10 ms durchgeführt. Diese Zahl wurde von²⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Charakterisierung der Ladungsbilanz durch Integration der injizierten und zurückgeführten Ladung. (A) Darstellung des Lade- und Entladeprozesses in der charakteristischen Photostromkurve. (B) Berechnung der Gesamtladungen, die mit der Ladungsinjektion und der Ladungsrückgabe verbunden sind. Die Ergebnisse zeigten insgesamt eine gute Ladungsbalance unter verschiedenen Stimulationsdauern. Diese Zahl wurde von²⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 13: Die repräsentativen elektrischen Signale, die von jeder Elektrode in der 16-Kanal-MEA gesammelt werden. Die elektrischen Signale in 16 Kanälen (Ch) zeigen die Elektrokardiogramm (EKG)-Informationen des ex vivo schlagenden Herzens. Die Zahl wurde von²⁸ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 14. Elektrochemische Eigenschaften von nanoporöser Bioelektronik auf Kohlenstoffbasis. (A) Die elektrochemische Grenzfläche zwischen erregbaren Geweben und strukturierten Kohlenstoffgrenzflächen. (B) Impedanz- und Phasenspektren von Au- und Au-C-Elektroden mit angepassten Kurven entsprechend der in A dargestellten Schaltung. (C) CV-Messung von Au- und C-Mustern mit derselben Geometrie mit einem Spannungsbereich von -0,2 bis 0,4 V im Vergleich zu einer Standard-Ag/AgCl-Elektrode. (D) Spannungsänderungen der Au- und Au-C-Elektrode während eines biphasischen galvanostatischen Stimulationszyklus. Diese Zahl wurde von²⁷ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Verbindung	Empfohlene Sorte	Konz. [mM]	MW	pro 1 l	Pro 2 L
NaCl	Sigma (S9625)	126	58.4	7.36	14.7
Kcl	Sigma (P4504)	5.4	74.6	0.4	0.8
Traubenzucker	Sigma (G7021)	10	180	1.8	3.6
HEPES	Sigma (H4034)	10	238	2.383	4.766
MgCl2.7H2O	Sigma (M9272)	1	203	1 mL	2 mL
				Bestand 1 M	Bestand 1 M
CaCl2.2H2O	Sigma (C3881)	2	147	1 mL	2 mL
				Bestand 2 M	Bestand 2 M
NaH2PO4	Sigma (S0751)	0.39	120	1 mL	2 mL
				Bestand 0,39 m	Bestand 0,39 m

Tabelle 1: Lösungskomponenten von HEPES Tyrode.

Diskussion

Mit diesem Protokoll wurden die ex vivo Rattenherzplattform (Abbildung 1A) und das I/R-Modell eingeführt, um schnelle und bequeme elektrophysiologische Studien auf Organebene zu ermöglichen, um den schnell wachsenden Forschungsbemühungen und Anforderungen in der Bioelektronik gerecht zu werden³⁸. Es wurde die Herstellung und Validierung von drei Bauelementsystemen detailliert beschrieben, nämlich nanoporöses Silizium, flexible Multielektroden-Arrays und nanoporöser Kohlenstoff (Abbildungen 1B-D), als Maßstab für bidirektionale elektrophysiologische Abfragen. Nanoporöses Silizium ermöglicht eine niedrige, kapazitive und hohe räumlich-zeitliche Stimulation, flexible Multielektroden-Arrays ermöglichen die Mehrkanalaufzeichnung und Kartierung von epikardialen Aktivitäten, und nanoporöser Kohlenstoff führt in Kombination mit MEAs zu einer Niederspannungsstimulation und einer hohen SNR-Aufzeichnung²⁷.

Die optische Stimulation wurde bereits mit Hilfe der Optogenetik demonstriert, einer Methode, die eine genetische Modifikation erfordert, um lichtempfindliche Ionenkanäle in Zielgeweben zu exprimieren³³. Die Optogenetik ist zwar wirksam, führt jedoch aufgrund des Bedarfs an viralen Vektoren oder transgenen Ansätzen zu erheblicher Komplexität, was Sicherheits-, ethische und regulatorische Bedenken aufwirft, insbesondere für klinische Anwendungen. Im Gegensatz dazu bietet die halbleiterbasierte, nicht-genetische Biostimulation eine einfachere und translational praktikablere Alternative 39,40,40,42. Materialien wie Silizium und andere organische Halbleiter ermöglichen die direkte optoelektronische Modulation von Geweben ohne genetische Veränderung und nutzen kapazitive Photoströme für eine biosichere und ladungsausgeglichene Stimulation. Dieser Ansatz erreicht eine vergleichbare oder sogar überlegene Leistung wie die Optogenetik in Bezug auf die Stimulationsintensität und arbeitet weit unter den Lasersicherheitsschwellen, um Gewebeschäden zu minimieren^31,32 (Abbildung 8). Die nicht-genetische Natur der halbleiterbasierten Biostimulation beseitigt die mit der genetischen Veränderung verbundenen Barrieren und ebnet den Weg für eine breitere Einführung im klinischen Umfeld und für vielfältige Anwendungen im Tissue Engineering und in der bioelektronischen Medizin. Die Geräte müssen jedoch sorgfältig so konzipiert werden, dass sie sich in das Gewebe integrieren lassen, wobei die Biokompatibilität sowie der Ort der Schnittstelle für eine effiziente Stimulation und Aufzeichnung sorgfältig berücksichtigt werden müssen (Abbildung 8A-B). Darüber hinaus kann das Vorhandensein von Material auf der Gewebeoberfläche die Möglichkeit der Echtzeit-Bildgebung behindern, es sei denn, eine Vorrichtung kann so konstruiert werden, dass sie für das Anregungs-Emissions-Fenster bestimmter bildgebender Mittel transparent ist.

Nanoporöses Silizium sticht unter den Halbleiter-Photostimulatoren hervor, da es im Gegensatz zu den zuvor berichteten Materialien keine künstliche Rückführungselektrode benötigt²⁶. Diese einzigartige Eigenschaft ergibt sich aus seiner Fähigkeit, ortsaufgelöste Kathoden- und Anodenbereiche basierend auf der Größe und dem Standort des Lichtflecks zu bilden. Die beleuchtete Fläche dient als kathodische Injektionsstelle, während die umgebenden peripheren Bereiche die anodische Stromrückführung ermöglichen. Dieser Mechanismus ermöglicht die Stimulation mehrerer Standorte auf monolithischen, pixellosen Membranen und ermöglicht so eine präzise und lokalisierte Stimulation. Insbesondere ist die lokale Lichtstimulation anstelle der globalen Beleuchtung entscheidend für die Erstellung effizienter bipolarer Stimulationsprofile. Darüber hinaus wirkt sich die Gerätegröße erheblich auf die Leistung aus. Größere Geräte erzeugen bei gleichen Stimulationsbedingungen höhere Ströme, was ihre Funktionsvielfalt weiter erhöht.

Das Versagen der optischen Stimulation kann auch in gesunden biologischen Modellen auf verschiedene Faktoren zurückzuführen sein, die hauptsächlich mit der Integrität des Geräts und der Biogrenzflächenkopplung zusammenhängen. Erstens ist eine gründliche Lichtstromcharakterisierung vor der Herzstimulation von entscheidender Bedeutung. Niedriger als erwartete Photoströme können durch Materialdegradation⁴³, Oxidpassivierung nach längerer Lagerung, Überätzen während des Fleckenätzprozesses, Brüche der Vorrichtung während der Handhabung oder Übertragung oder falsche Ausrichtung der Vorrichtung während der Einlegeschicht entstehen. Um mechanische Beschädigungen zu mildern, wurde PDMS als weiches Substrat für die Aufnahme der nanoporösen Siliziummembranen verwendet, das Schutz vor möglichen Schäden durch direkte Handhabung mit einer Pinzette bietet. Zweitens ist es wichtig, eine nahtlose Grenzfläche mit dem Epikard zu schaffen, das in diesem Aufbau mit Bioflüssigkeiten durchblutet ist. Eine dicke Biofluidschicht kann die korrekte Befestigung behindern und die Wirksamkeit der Stimulation beeinträchtigen. Um die Kopplung der Biogrenzfläche zu verbessern, können Bioadhäsive^42,43 oder Nähte eingesetzt werden, um die Verbindung zu stabilisieren und eine zuverlässige Stimulation zu gewährleisten. Bemerkenswert ist, dass das in unserer Studie verwendete nanoporöse Silizium biologisch abbaubar ist und temporäre Stimulationsanwendungen unterstützt, aber unter physiologischen Bedingungen innerhalb von 1-2 Tagen an Leistung verliert. Für eine längerfristige Stabilität sollte eine Oberflächenpassivierung⁴⁴ oder die Verwendung haltbarerer Halbleitermaterialien in Betracht gezogen werden.

Während der ex vivo-Stimulation resultiert der allmähliche LVP-Anstieg (Abbildung 8E) bei höheren Frequenzen (z. B. 4 Hz) wahrscheinlich aus einer erhöhten Myokardkontraktilität, einer Kalziumakkumulation und dem Frank-Starling-Mechanismus⁴⁵. Erhöhte Stimulationsraten verbessern den intrazellulären Kalziumzyklus und die ventrikuläre Füllungsdynamik und erhöhen die Vorspannung und die Kontraktionsstärke⁴⁶. Dies kann zwar den myokardialen Sauerstoffbedarf und das Risiko von Herzrhythmusstörungen erhöhen, aber diese Auswirkungen können durch eine ausreichende Präoxygenierung, eine engmaschige EKG-Überwachung und kontrollierte Stimulationsparameter gemildert werden. In unseren Experimenten wurden keine signifikanten Nebenwirkungen beobachtet.

Bei der Multielektrodenaufzeichnung ist die Angabe der Elektrodenpositionen am Herzen und ihrer relativen Positionen zur Stimulationselektrode entscheidend für eine aussagekräftige Analyse. Es ist wichtig, das Übersprechen zwischen Elektroden zu eliminieren, um die Erfassung unterschiedlicher Wellenformen und zeitlich aufgelöster Muster zu gewährleisten. Flexible Elektrodenarrays stellen in der Regel eine gute Grenzfläche zum Epikard her; Die Adhäsion kann jedoch durch ionisch leitfähige Klebstoffbeschichtungen, wie z. B. dünne Hydrogelschichten^28,43, weiter verbessert werden, um die Stabilität und Signalqualität zu verbessern.

Nanostrukturierte Graphen/Kohlenstoff-Materialien mit großen Oberflächen für die Ladungsspeicherung und -injektion können die Leistung bioelektronischer Bauelemente verbessern, indem sie die Impedanz an Elektroden-Kochsalz-Übergängen verringern und die Ladungsinjektionsfähigkeiten erhöhen³⁵. Zu den derzeitigen Verfahren zum Strukturieren von Graphenmaterialien auf flexible Elektroden (z. B. Au) gehören die Elektroabscheidung, die Schleuderbeschichtung und der Siebdruck⁴⁷. Diese Methoden sind jedoch in der Regel mit komplexen Herstellungsprozessen, eingeschränkten Strukturierungsmöglichkeiten und verminderter Leistung aufgrund des Totvolumens von Bindemitteln verbunden. Eine Lasersynthesemethode wurde verwendet, um nanostrukturierte Kohlenstoffmuster auf Zellulosesubstrat zu erzeugen und sie dann auf andere weiche Schichten zu übertragen, um eine konforme Bioschnittstelle zu schaffen, die einen einfachen und effektiven Weg für die Herstellung von Bioelektronik darstellt. Die Kombination von strukturierten Kohlenstoffbeschichtungen mit kleinen geometrischen Größen bis hinunter zur Einzelzellebene, die das lokalisierte elektrische Feld erhöhen würde, und hochporösen Strukturen der Kohlenstoffmembran zur Verringerung des Widerstands an der Elektroden-Gewebe-Grenzfläche wird in Zukunft synergetisch eine effiziente biologische Stimulation und Aufzeichnung erreichen⁴⁸.

Obwohl es sich um ein praktisches Krankheitsmodell handelt, fehlen dem Langendorff-Ex-vivo-I/R-Modell systemische Wechselwirkungen, wodurch das Herz von neurohormonellen und Immunreaktionen isoliert wird, und es beruht auf künstlicher Perfusion mit Puffern, die physiologische Bedingungen wie die Sauerstoffzufuhr und die Endothelfunktion verändern können. Seine begrenzte Durchführbarkeit beschränkt die Studien auf akute Ereignisse. Nichtsdestotrotz bietet das Modell eine hochgradig kontrollierte Umgebung mit präzisen Parameteranpassungen und guter Reproduzierbarkeit. Es ermöglicht auch die Echtzeit-Messung der Herzfunktion und ist damit ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung neuartiger therapeutischer Strategien für ischämische Herzkrankheiten. Zum Beispiel könnten elektrozeutische Geräte ins Auge gefasst werden, um das Herz vorzukonditionieren, es darauf zu trainieren, schwere Umgebungen mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu ertragen, oder um den ROS-Spiegel für eine verbesserte Genesung zu mildern. Die Wirksamkeit solcher Behandlungen könnte anhand von Metriken wie Herzschlagmustern, EKG-Wellenformen und Leitungsgeschwindigkeit bewertet werden. Darüber hinaus könnte eine Multisite-Stimulationsplattform räumliche Informationen über den Myokardinfarkt liefern, die eine detailliertere Beurteilung der betroffenen Regionen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte auch verbesserte Stimulationsschwellen aufweisen, die mit der Schwere des Infarkts korrelieren, und bietet einen umfassenden Rahmen für die therapeutische Bewertung und Optimierung.

Während das Protokoll die Verwendung der drei Geräte in bidirektionalen ex vivo-Herzmodellen hervorhebt, geht ihre Anwendbarkeit weit über Herzgewebe hinaus. Diese Geräte können leicht für den Einsatz mit anderen elektrisch erregbaren Geweben oder Organen angepasst werden, wie z. B. Nervengewebe, Skelettmuskulatur und Magen-Darm-System, bei denen eine präzise elektrische Modulation entscheidend ist, was sie zu vielseitigen Werkzeugen sowohl für die Forschung als auch für translationale Anwendungen in der bioelektronischen Medizin macht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16-Kanal-Kopfstufe	Intan Technologien	Nr. C3334
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid	Sigma Aldrich	T8877-5G	Triphenyltetrazoliumchlorid
2-Propanol (IPA)	Fischer Scientific	Nr. A451-4
635 nm Laser, 500 mW	Laserglühen	NA
Aceton	Fischer Scientific	Nr. A18-4
Angström Evovac E-Beam-Verdampfer	Ångström	NA
AZ 300MIF Entwickler	Mikrochemikalien	18441123163	Entwickler
AZ nlof 2020	Mikrochemikalien	Nr. 1A002020
AZ NMP	Mikrochemikalien	NA	Fotolack-Entferner
AZ40XT-11D	Mikrochemikalien	1000300	Fotolack
Gepuffertes HF	Thermo Scientific	AA44627K2
CaCl2.2H2O	Sigma Aldrich	(C3881)
CO2Laser	Universelle Lasersysteme	VLS 4.60
Leitfähige Silberfarbe	PELCO	16062	Leitfähige Adhäsion zwischen Elektrode und verbindendem Cu-Draht
Kupferdraht gekapselt 0,1 mm	Amazonas	https://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/ B09TNM51S5/ref=asc_df_B09 TNM51S5?mcid=155de761ea4 c389ea86d45ba61a83e8d& Tag =Hyprod-20& linkCode=df0& hvadid =693675076770& hvpos=& hvnetw =g& hvrand=664358781094905 4431& hvpone=& hvptwo=& hvqmt =& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9021716& hvtargid= pla-1878323158943& PSC=1
Digidata 1550 Digitalisierer	Molekulare Bauelemente	NA
Traubenzucker	Sigma Aldrich	Nr. G7021
HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot	Thermo Scientific	14175095
Heidelberg MLA150 Direktschreiber	Heidelberg	NA
Heparin (1000 IE/kg)	Sagent Pharmazeutika	1009655
HEPES	Sigma Aldrich	(H4034)
Hexan	Sigma Aldrich	Artikel-Nr.: 52750-10ML	Lösungsmittel
HF	Fisher Scientific	Nr. A513-500	Spurenmetall-Qualität
HMDS Vapor Prime Ofen	Yield Engineering Systeme	NA
HNO3	Fisher Scientific	A509P500	Spurenmetall-Qualität
Heißlaminiergerät	Büro Depot	L410-A	Mehrschichtige Verkapselung
Intan RHD-Systeme	Intan Technologien	Nr. C3100
iWorx EKG	iWorx	IA-400D
iWorx LVD-Sonde	iWorx	BP-100
iWorx Vorverstärker	iWorx	C-ISO-256
Kcl	Sigma Aldrich	(Seite 4504)
Latex-Ballon (Größe 4)	Radnoti	170404
MgCl2.7H2O	Sigma Aldrich	Elektronikartikel (M9272)
NaCl	Sigma Aldrich	(S9625)
Nafion 117 enthaltende Lösung	Sigma Aldrich	31175-20-9	Fixierreagenz für nanoporöses Kohlenstoffmuster
NaH2PO4	Sigma Aldrich	(S0751)
NaOH	Sigma Aldrich	221465
PDMS	Fisher Scientific	NC9285739
Plasma-Therm Fluoridätzer mit induktiv gekoppeltem Plasma	Plasma-Therm	NA
PMMA (495 A6)	Mikrochemikalien	M130006
Poly (pyromellitisches Dianhydrid-co-4,4'-oxydianilin)	Sigma Aldrich	575801	PI-Vorläufer
Poly(ethylen-co-vinylacetat)	Sigma Aldrich	Artikel-Nr.: 437247-250G	Polymer für die Versickerung
Poly(vinylalkohol)	Sigma Aldrich	341584-25G
Polyethylenterephthalat (PET)	Amazonas	Artikel-Nr.: KS-6304-21-11	Typ D Durchsichtige PET-Folie .0005" Dick x 27" Breite x 10 Ft Länge 1 Stück
Potentiostat	Biologischen	SP-200	Elektrische Stimulation
Widerstand Ofen	Entsenden	LCC1-15-5
Rasterelektronenmikroskopie	Carl Zeiss	Merlin	Instrument zur morphologischen Charakterisierung
Siliziumscheibe	NOVA Elektronische Materialien	HS39626
Silikon-Kleber	WPI	KWIK-SIL-S	Verkapselung
Natriumborat	Sigma Aldrich	SX0355
SOI-Wafer	Ultrasil	3-10541	Typorientiert:P/B(100) DT:7+/-1um DR:<. 005 Ohmcm HT:300+/-10um HR:1-30 Ohmcm Gehäuse:1um+/-5% UD-13998/UH-13962
SU-8 2002	Mikrochemikalien	SU-8 2000 Serie
SU-8 Entwickler	Mikrochemikalien	SU-8 2000 Serie
Nasser Tuchkleber	3M	1469SB
Whatman qualitatives Filterpapier, Klasse 1	Sigma Aldrich	WHA1001150	Substrat für die Carbonstrukturierung