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Methodenartikel

Eine Mixture-Pipeline zur Generierung molekularer operationeller taxonomischer Einheiten (MOTUs) bei Ufer- und Wasserkäfern

914 Ansichten

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DOI:

10.3791/68323

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11. Juli 2025

 ,  , 
1Ateneo Biodiversity Research Laboratory, Department of Biology, School of Science and Engineering, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University, 2Ateneo Institute of Sustainability, Ateneo de Manila University, 3Ateneo School of Medicine and Public Health, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, die Benutzer bei der computergestützten Verarbeitung von Cytochrom-c-Oxidase-Subunit-I-Gensequenzen (COI) zu unterstützen, die aus Käfern erzeugt wurden, so dass die Arten-Clustering-Hypothese, die als molekulare operationale taxonomische Einheiten (MOTUs) bezeichnet wird, aus DNA generiert werden kann.

Zusammenfassung

Der Rückgang der biologischen Vielfalt vollzieht sich in unvorstellbarem Ausmaß, doch die Überwachung der biologischen Vielfalt wird durch eine Vielzahl von Faktoren behindert, darunter die unvollständige Bestandsaufnahme der Basisdiversität und die schwindende Population qualifizierter Taxonomen. Die Überbrückung dieses Hindernisses im Arteninventar von "dunklen Taxa" oder hyperdiversen Gruppen, die in der Taxonomie oft zu wenig untersucht werden, ist besonders wichtig in den Tropen, die unüberwindlichen Umweltbelastungen ausgesetzt sind. Während die morphologiebasierte Alpha-Taxonomie nach wie vor der Goldstandard bei der Identifizierung von Arten ist, haben DNA-basierte Methoden ein enormes Potenzial gezeigt, um die Abgrenzung und Entdeckung von Arten zu beschleunigen. Hier beschreiben wir eine Concride-Pipeline zur Generierung molekularer operationeller taxonomischer Einheiten (MOTUs) mit sechs molekularen Artabgrenzungsansätzen, die an zwei sehr unauffälligen Käfergattungen durchgeführt wurden, nämlich Byrrhinus Motschulsky, 1858 aus der Familie Limnichidae und Anacaena Thomson, 1859 aus der Familie Hydrophilidae, von den Philippinen. Da sich dieses Protokoll auf die Verarbeitung von DNA-Barcodes konzentriert und diese genetischen Daten entweder durch Sequenzierung oder durch Herunterladen aus Online-Datenbanken gewonnen werden können, sind der Ausgangspunkt für das hier beschriebene Protokoll die DNA-Sequenzen. Angesichts der COI-Barcodes verwendet die Pipeline eine Kombination aus drei schwellenwertbasierten Ansätzen zur Abgrenzung molekularer Spezies, nämlich TaxonDNA, K2P und ASAP, die die Sequenzausrichtung als Eingabedaten verwenden. Darüber hinaus geht die Pipeline mit drei koaleszenzbasierten Ansätzen vor, nämlich PTP-ML, PTP-BI und mPTP, die eine Baumdatei als Eingabedaten erfordern. Einige Ansätze beinhalten die Verwendung von Webservern, während andere lokale Software verwenden. Mit der Auswahl der vorgestellten algorithmischen Methoden können MOTUs identifiziert werden, sei es im Konsens oder per Mehrheit. Bemerkenswert ist, dass diese Pipeline fast auffällige Käferarten von den Philippinen abgrenzte, sogar solche, die aus denselben oder angrenzenden Fundorten dokumentiert waren.

Einleitung

Mit den beispiellosen Raten des weltweiten Artenrückgangs in verschiedenen Taxa 1,2,3,4 wird der Anstoß, ein umfassendes Biodiversitätsinventar zu erstellen, das bisher unentdeckte und unbeschriebene Arten umfasst, zu einem Wettlauf gegen die Zeit 2,5. Zum einen macht der Erhalt der biologischen Vielfalt nur im Lichte des richtigen taxonomischen Wissens Sinn 6,7. Daher ist die Identifizierung der Biodiversität auf der Ebene der Arten notwendig, da eng verwandte, aber unterschiedliche Arten einzigartige fundamentale Nischen haben können8.

In der Käfersystematik ist die Alpha-Taxonomie oder traditionelle Taxonomie der Goldstandard bei der Artenbestimmung, ähnlich wie bei den meisten, wenn nicht sogar allen Tiergruppen9. Dieser Ansatz stützt sich auf morphologische Merkmale, um Organismen in einer höheren Taxonomie zu klassifizieren und eine Identifizierung auf Artebene zu ermöglichen10,11. In vielen Fällen kann die Identifizierung von Familie12 oder sogar auf Gattungsebene13 allein anhand äußerer morphologischer Merkmale wie Körperform und spezialisierter Anpassungen erfolgen. In der Zwischenzeit erfolgt die Identifizierung auf Artebene bei Käfern in der Regel durch den Vergleich der strukturellen Details des Aedeagus oder der männlichen Genitalien 14,15,16.

Trotz der breiten Akzeptanz dieser morphologiebasierten Alpha-Taxonomie wird dieser Ansatz zur Artenentdeckung durch zahlreiche "taxonomische Hindernisse" behindert6,17,18, insbesondere bei wirbellosenTieren 19. In der Käfersystematik steht die Identifizierung und/oder Entdeckung von Arten mit Hilfe der Alpha-Taxonomie vor der Herausforderung, dass nur eine begrenzte Anzahl qualifizierter Taxonomen zur Verfügung steht20,21, kurze und wenig informative frühere Beschreibungen22 und logistische Probleme im Zusammenhang mit dem Zugang zu Literatur und Typusexemplaren23 auftreten.

Dies wird sogar noch verschärft, wenn das betreffende Taxon kryptisch oder höchst unauffällig ist. Kryptische Arten beziehen sich auf die Gesamtheit von Arten derselben Gattung oder sogar verschiedener Gattungen, die aufgrund subtiler interspezifischer phänetischer Unterschiede nicht leicht durch vergleichende Morphologie abgegrenzt werdenkönnen 24. Einige kryptische Taxa, die als "dunkle Taxa" angesehen werden25,26,27, leiden zusätzlich darunter, dass sie hyperdivers sind, aber stark untererforscht sind. Leider ist dies bei Ufer- und Wasserkäfern nicht ungewöhnlich 8,28. Das Versäumnis, sich mit der Artenabgrenzung zwischen kryptischen dunklen Taxa zu befassen, bedroht die biologische Vielfalt, da Organismen mit potenziell unterschiedlichen Nischen und ökologischen Anforderungen eine einheitliche Schutzmaßnahme gewährt wird 8,29.

Angesichts dieser Herausforderungen hat die "integrative Taxonomie"23 oder der Ansatz, die Alpha-Taxonomie mit einer anderen Evidenzlinie zu koppeln, in den letzten zwei Jahrzehnten als Mittel zur Etablierung neuer Arten an Bedeutung gewonnen 30,31,32. Eine solche Beweislinie, die in integrativen taxonomischen Studien an Käfern 33,34,35,36,37,38,39 und anderen Insektenordnungen 40,41,42,43,44,45 verwendet wird, ist die DNA-Sequenz. Insbesondere wird das mitochondriale Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit I (COI)-Gen aufgrund seiner mäßig konservativen Natur verwendet, um eine Vielzahl von Tieren mit Barcodes zu codieren46,47,48. Während sein 658bp langes 5'-Ende (COI-5'), das auch als "Barcoding-Fragment" oder "Folmer-Fragment" bekannt ist, als "diagnostische" Sequenz49 vorgeschlagen wurde, wird das 723 bp-lange COI-3' auch aufgrund eines robusten Satzes von Primern für das 3'-Ende 50,51,52 verwendet.

Während das DNA-Barcoding unter Verwendung von COI für die Identifizierung auf Speziesebene konzipiert wurde, es durch ein a priori Sequenzrepository53, wie GenBank54 und BOLD55, begrenzt ist, legen molekulare Speziesabgrenzungsansätze Speziesgrenzen fest, indem nur die bereitgestellten DNA-Sequenzen ohne erforderliches Repositorium56 verwendet werden. Es gibt zwei Klassen von Ansätzen zur Abgrenzung molekularer Spezies, die auf der Eingabedatei basieren. Erstens, unter Verwendung des Sequenzalignments als Eingabe, verwenden schwellenwertbasierte Ansätze Cut-off-Werte, um die Divergenz zwischen und innerhalb der Spezies zu bestimmen 48,57,58. Als abstandsbasierte Methoden stützen sich diese Ansätze auf einen beobachteten maximalen intraspezifischen Abstand von 3 % für Insekten, der als "Barcoding-Lücke" bezeichnet wird51,59. Einige der schwellenwertbasierten Ansätze sind SpeciesIdentifier, das in TaxonDNA60 implementiert ist, genetische Distanz über Kimura 2-Parameter (K2P)61 und Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP)62.

Zweitens identifizieren koaleszenzbasierte Ansätze unter Verwendung des Baums als Eingabedatei Artengrenzen und sortieren unabhängige Abstammungslinien, indem sie die Änderung der Abstammungsverzweigungsrate 63,64,66 bestimmen. Koaleszenzbasierte Ansätze, die sich oft auf das phylogenetische Artenkonzept67 stützen, umfassen Poisson-Baumprozesse (PTP)68 und ihre Variation, Multi-Rate-PTP69. In jedem Fall werden die Cluster, die durch die Ansätze zur Abgrenzung molekularer Spezies gebildet werden, zusammenfassend als molekulare operationelle taxonomische Einheiten (MOTUs) bezeichnet.

Hier stellen wir Methoden für eine Concoction-Pipeline zur Generierung von MOTUs vor, die drei schwellenwertbasierte Ansätze und drei koaleszenzbasierte Ansätze umfassen (Abbildung 1). Die Pipeline wird an zwei Datensätzen getestet, nämlich (1) COI-3'-Sequenzen des Uferkäfers Byrrhinus Motschulsky, 1858, die aus zwei veröffentlichten Arten35 bestehen, die zuvor unter Verwendung der integrativen Taxonomie aufgestellt wurden, und zusätzlichen Sequenzen von unbeschriebenen Arten, und (2) COI-5'-Sequenzen von Anacaena Thomson, 1859 Käfern, die aus Sequenzen von zwei veröffentlichten Artenbestehen 70 Zuvor unter Verwendung der Alpha-Taxonomie und zusätzlicher Sequenzen von unbeschriebenen Arten errichtet.

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Abbildung 1: Flussdiagramm der Zubereitungspipeline zur Generierung von MOTUs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

Die Ausgangsmaterialien für diese Zubereitungspipeline sind DNA-Sequenzen, die entweder von Online-Repositorien (z. B. BOLD, GenBank) heruntergeladen oder aus der Sanger-Sequenzierung71 generiert werden können. In Tabelle 1 und Tabelle 2 sind die Zugangsnummern für die Datensätze aufgeführt, deren repräsentative Ergebnisse in diesem Beitrag vorgestellt werden.

1. Vorbereitender Schritt für schwellenwertbasierte Ansätze: Sequenz-Alignment

  1. Ladesequenzen in MEGA X72.
    HINWEIS: MEGA X kann von https://www.megasoftware.net/ heruntergeladen werden
    1. Klicken Sie auf Ausrichten , um ein Dropdown-Menü zu öffnen. Klicken Sie auf Achse bearbeiten/erstellen und wählen Sie Neue Achse erstellen. Klicken Sie auf OK , um diese Auswahl zu bestätigen. Wählen Sie DNA als Datentyp für die Ausrichtung aus.
    2. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Registerkarte "Bearbeiten " und wählen Sie "Sequenz aus Datei einfügen" aus. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis mit den Sequenzen und wählen Sie sie aus, die in MEGA geladen werden sollen.
  2. Richten Sie die Sequenzen aus, indem Sie auf Ausrichtung klicken, und dann auf Ausrichten nach ClustalW73. Fahren Sie mit den Standardeinstellungen fort und klicken Sie auf OK.
  3. Bearbeiten Sie die Sequenzen manuell, indem Sie beide Enden kürzen und alle Einfügungen oder Streichungen entfernen.
    1. Um Einfügungen zu löschen, klicken Sie auf die eingefügten Basen und/oder Positionen und drücken Sie die Entf-Taste auf der Tastatur.
    2. Um Löschungen zu korrigieren, klicken Sie auf die Position, die mit "-" gekennzeichnet ist. Löschen Sie das "-" und geben Sie die gewünschte Basis ein.
    3. Ermitteln Sie die früheste Position, an der alle Sequenzen ein Zeichen enthalten. Klicken Sie auf das leere Feld in der Zeilenüberschrift der Position links von der ermittelten Position und ziehen Sie, bis die überzähligen Positionen für alle Sequenzen bis zum Startende ausgewählt sind. Drücken Sie die Entf-Taste , um zu trimmen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.3.3, indem Sie nach der letzten Position suchen, an der alle Sequenzen ein Zeichen haben. Klicken Sie auf das leere Feld in der Kopfzeile der Position rechts von der ermittelten Position, ziehen Sie, bis die überzähligen Positionen für alle Sequenzen bis zum Terminalende ausgewählt sind. Drücken Sie die Entf-Taste.
      HINWEIS: Abbildung 2A zeigt eine gute Ausrichtung der DNA-Sequenzen. Der endgültige Datensatz ist eine Matrix von Sequenzen gleicher Länge. Dabei ist die Sequenzlänge kein Faktor, der die Ergebnisse der Studie beeinflusst. Die Referenzsequenzen dienen als Grundlage für die endgültige Länge der Alignment-Matrix.
  4. Übersetzen Sie die Sequenz, um nach Stoppcodons zu suchen, da COI eine proteinkodierende Sequenz ist.
    1. Wählen Sie alle Sequenzen aus und klicken Sie dann auf die Registerkarte Übersetzte Proteinsequenzen .
    2. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, überprüfen Sie den genetischen Code als Wirbellose Mitochondrien. Wenn der genetische Code unterschiedlich ist, klicken Sie auf Nein, und es erscheint ein Menü, in dem Sie das Kontrollkästchen für den mitochondrialen genetischen Code für wirbellose Tiere ankreuzen können.
    3. Wenn Stopp-Codons, wie durch Sternchen im Alignment-Körper gekennzeichnet, für eine ganze Spalte vorhanden sind, klicken Sie auf DNA-Sequenzen und löschen Sie die erste Position für alle Sequenzen.
    4. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, wenn in einer beliebigen Sequenz noch Stopp-Codons vorhanden sind.
    5. Wenn noch Stopp-Codons vorhanden sind, stellen Sie die zuvor gelöschten Positionen wieder her. Wählen Sie alle Sequenzen aus, fahren Sie dann mit der Maus über die Registerkarte Daten und klicken Sie auf Umkehren.
    6. Wiederholen Sie Schritt 1.4.1. Wenn noch Stopp-Codons vorhanden sind, wiederholen Sie die Schritte 1.4.3 und 1.4.4.
      HINWEIS: Abbildung 2B zeigt eine gute Ausrichtung der Codons.
  5. Klicken Sie auf DNA-Sequenzen und speichern Sie die Sequenzausrichtung in .mas/x. Exportieren Sie die Sequenz in andere relevante Dateitypen, z. B. .meg-Dateien und .fasta-Dateien.
    HINWEIS: Bestimmte Ansätze zur Abgrenzung molekularer Spezies funktionieren besser ohne die Fremdgruppe. Daher ist es möglich, eine Kopie der Achsdatei ohne die Outgroup zu generieren.

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Abbildung 2: Sequenzausrichtung in MEGA X. (A) Manuell bereinigter endgültiger DNA-Sequenzabgleich und (B) translatierter Proteinsequenzabgleich des Byrrhinus-Datensatzes , der keine Insertionen, Deletionen und Lücken zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Abgrenzung nach Taxon-DNA-Modul in Species Identifier 1.8

HINWEIS: Der Artenidentifikator kann von https://taxondna.sourceforge.net/ heruntergeladen werden.

  1. Öffnen Sie TaxonDNA. Klicken Sie auf Importieren und dann auf FASTA. Laden Sie die Ausrichtung im .fasta-Format hoch.
  2. Klicken Sie auf Module und dann auf Cluster. Legen Sie den Schwellenwert auf 3 % fest. Aktivieren Sie dann die Option Informationen über einzelne Cluster generieren (Abbildung 3).
  3. Klicken Sie auf Cluster jetzt erstellen!. Speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie einen Screenshot erstellen.

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Abbildung 3: TaxonDNA im Fenster Species Identifier 1.8 mit dem vom Benutzer identifizierten Schwellenwert von 3 % für die Abgrenzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Abgrenzung durch Kimura 2-Parameter (K2P) in MEGA X

  1. Öffnen Sie in MEGA die .meg-Datei, indem Sie auf Datei und dann auf Datei/Sitzung öffnen klicken. Klicken Sie auf Entfernung und dann auf Paarweise Entfernungen berechnen. Bestätigen Sie die MEG-Datei für die Abgrenzung.
  2. Bewegen Sie den Mauszeiger über das gelbe Feld neben Modell/Methode und klicken Sie dann auf den Pfeil, der rechts neben dem Feld angezeigt wird.
  3. Wählen Sie Kimura 2-Parameter-Modell aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf OK , um das Programm auszuführen. Öffnen Sie das Datenausgabefenster (Abbildung 4).
  4. Klicken Sie auf Datei und dann auf Entfernungen exportieren/drucken.
  5. Öffnen Sie das Dropdown-Menü neben Ausgabeformat und wählen Sie XL: Microsoft Excel-Arbeitsmappe. Wählen Sie für Dezimalstellen die Option 4 aus.
  6. Speichern Sie die resultierende Tabelle in Microsoft Excel. Verwenden Sie die bedingte Formatierung, um diejenigen mit einem Abstand von weniger als 0,03 % (oder 3 %) hervorzuheben.
    HINWEIS: Im Gegensatz zu den anderen Ansätzen, die in diesem Artikel besprochen werden, stellt K2P das Clustering nicht sofort bereit, da es vom benutzerdefinierten Schwellenwert abhängig ist. Diese Pipeline geht davon aus, dass der Schwellenwert bei 3 % liegt, was bedeutet, dass jedes Sequenzpaar, dessen genetischer Abstand weniger als 3 % beträgt, zum selben molekularen Cluster gehört.

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Abbildung 4: Resultierendes Fenster in MEGA X, das die Ergebnisse des Kimura-2-Parameters zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Abgrenzung nach zusammengesetzten Arten durch automatische Partitionierung (ASAP)

  1. Gehen Sie zum ASAP-Webserver: https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
  2. Laden Sie die Ausrichtung hoch, indem Sie auf das orangefarbene Feld mit der Bezeichnung Datei auswählen... klicken und die .fasta-Datei auswählen. Alternativ können Sie die .fasta-Datei in das orangefarbene Feld ziehen. Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf Los.
  3. Um das Clustering herunterzuladen, klicken Sie auf die Liste für die Zeile mit dem niedrigsten ASAP-Score und dem höchsten p-val-Rang (Abbildung 5).
    HINWEIS: Die Ergebnisausgabe ist eine .txt Datei, die Teilmengen der Molekülcluster darstellt.

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Abbildung 5: Resultierendes Fenster in ASAP, das die möglichen Abgrenzungen anzeigt. Das erste Ergebnis (blaues Kästchen) wird aufgrund des niedrigsten ASAP-Scores (rotes Kästchen) und des höchsten P-val-Ranges (gelbes Kästchen) akzeptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Vorbereitender Schritt für koaleszenzbasierte Ansätze: Baumschätzung

  1. Öffnen Sie die .meg-Datei, indem Sie auf Daten und dann auf Datei/Sitzung öffnen klicken. Testen Sie das am besten geeignete Substitutionsmodell.
    1. Klicken Sie auf Modelle und suchen Sie dann nach Beste DNA/Protein-Modelle (ML). Bestätigen Sie die .meg-Datei für die Analyse.
    2. Klicken Sie im Menü "Analyseeinstellungen" auf OK (Abbildung 6A). Achten Sie darauf, welches Modell am besten geeignet ist und den niedrigsten BIC- und AICc-Wert verwendet (Abbildung 6B).
      HINWEIS: Dies ist in der Regel das erste in der Liste der Modelle im resultierenden Fenster. Die vollständigen Namen der abgekürzten Modellnamen finden Sie im unteren Teil des resultierenden Fensters.
  2. Generieren Sie den Baum.
    1. Klicken Sie auf Phylogenie und dann auf Maximum-Likelihood-Baum erstellen/testen.
    2. Verwenden Sie das am besten geeignete Nukleotidsubstitutionsmodell. Klicken Sie dazu auf das gelbe Kästchen neben Modell/Methode. Wählen Sie das Modell aus dem Dropdown-Menü aus.
    3. Wenn das am besten geeignete Nukleotidsubstitutionsmodell "+G" oder "+I" oder beides aufweist, klicken Sie auf das Kästchen neben "Raten zwischen Standorten" und wählen Sie die Parameter (G, I, G + I) aus dem Dropdown-Menü aus (Abbildung 6C).
    4. Klicken Sie unter Phylogenietest auf das Kästchen neben Test of Phylogenie und wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Bootstrap-Methode aus. Klicken Sie auf das Kästchen neben "Nein. of Bootstrap Replications" und geben Sie 1000 ein (Abbildung 6C). Klicken Sie auf OK , um die Analyse auszuführen.
  3. Sobald sich ein Fenster mit der resultierenden Struktur öffnet (Abbildung 6D), speichern Sie die Baumsitzung als .mts/x. Speichern Sie die Ausgabe als .nwk-Datei. Speichern Sie den Baum auch als .png Bilddatei.

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Abbildung 6: Baumschätzung in MEGA X als vorbereitender Schritt für koaleszenzbasierte Ansätze. (A) Einstellung zur Bestimmung des am besten geeigneten Nukleotidsubstitutionsmodells. (B) Für den Byrrhinus-Datensatz ist GTR + I aufgrund der niedrigsten BIC- und AICc-Werte (roter Kasten) das am besten geeignete Modell. (C) Beim Ausführen des Maximum-Likelihood-Baums wurden GTR (gelbes Feld) + I (blaues Feld) als Parameter festgelegt. (D) Der resultierende rohe ML-Baum, der in den nachfolgenden Analysen verwendet werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Abgrenzung durch Poisson-Baum-Prozesse (PTP)

HINWEIS: Die folgenden Schritte führen zu den Ergebnissen von PTP-ML und PTP-BI.

  1. Rufen Sie den PTP-Webserver auf: https://species.h-its.org/ptp/
  2. Laden Sie eine newick-Datei hoch, indem Sie auf Datei auswählen klicken. Wählen Sie unter Meine Struktur ist die Option Rooted (Abbildung 7A) aus.
  3. Geben Sie die Parameter für die Analyse ein. Geben Sie unter Nr. MCMC-Generationen 100000 ein. Geben Sie unter Ausdünnung den Wert 100 ein. Geben Sie unter Burn-In den Wert 0.1 ein. Geben Sie unter Seed den Wert 123 ein.
  4. Geben Sie die Outgroup ein, indem Sie den Namen der Spitzen in das Feld unter Outgroup-Taxa-Namen (falls vorhanden) eingeben. Anweisungen zum Formatieren der Eingabe befinden sich rechts neben dem Eingabefeld.
  5. Geben Sie die E-Mail-Adresse in das entsprechende Feld ein und klicken Sie auf Senden. Klicken Sie im Ergebnisfenster der PTP-Speziesabgrenzung hier , um das Ergebnisfenster zu öffnen.
  6. Laden Sie unter der Maximum-Likelihood-Lösung die Ergebnisse von PTP-ML herunter, indem Sie auf Abgrenzungsergebnisse herunterladen klicken (Abbildung 7B).
  7. Laden Sie unter der Bayes'schen Lösung die Ergebnisse von PTP-BI herunter, indem Sie auf Abgrenzungsergebnisse herunterladen klicken.
    HINWEIS: Die Ergebnisse zeigen Gruppen von Sequenzen in Partitionen an. Diese werden als nummerierte Arten gekennzeichnet, gefolgt von einem Unterstützungswert, wobei 1.000 ideal ist.

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Abbildung 7: Abgrenzung molekularer Spezies durch Poisson-Baum-Prozesse. (A) Fenster mit den Eingabeparametern. (B) Resultierendes Fenster im PTP-Webserver mit einem Link mit den Abgrenzungsergebnissen (roter Kasten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Abgrenzung durch Multi-Raten-Poisson-Baum-Prozesse (mPTP)

  1. Rufen Sie den mPTP-Webserver auf: https://mptp.h-its.org/#/tree
  2. Laden Sie die Newick-Datei hoch, indem Sie sie auf das graue Rechteck ziehen oder auf das Rechteck klicken. Sobald die Daten auf derselben Seite geladen werden, klicken Sie auf Weiter zur Outgroup-Auswahl (Abbildung 8A).
  3. Wählen Sie auf der Seite "Outgroup-Spezifikation" die Outgroup aus, indem Sie auf das Kästchen neben den Taxa-Beschriftungen der Outgroup-Exemplare klicken. Klicken Sie auf die Option "Outgroup zuschneiden " am unteren Rand der Sequenz. Klicken Sie auf Modellauswahl.
  4. Klicken Sie auf MPTP und dann auf Visualisierungsoptionen. Übernehmen Sie auf der Seite Visualisierungsoptionen die Standardeinstellungen.
    HINWEIS: Alternativ kann die Gesamtbildgröße angepasst werden, indem Sie einen Wert (in px) unter SVG-Breite eingeben. Schriftart und Abstand des Textes können angepasst werden, indem die gewünschten Größen (in px) unter SVG-Schriftgröße, Abstand zwischen den Spitzen, Linker Rand, Rechter Rand, Oberer Rand und Unterer Rand eingegeben werden.
  5. Klicken Sie auf Kontaktdaten. Geben Sie die E-Mail-Adresse ein, um die Ergebnisse später nachschlagen zu können (optional).
  6. Klicken Sie auf Übersicht. Stellen Sie sicher, dass Sie die Anzahl der eingegebenen Taxa und die ausgewählten Außengruppen überprüfen.
  7. Klicken Sie auf Senden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Dateien unter Herunterladbare Dateien (Abbildung 8B), und wählen Sie Speichern unter... aus, um die Ergebnisse zu speichern.
    HINWEIS: In der Ausgabetextdatei wird die Gesamtzahl der durch Trennzeichen getrennten Arten am Anfang der Ergebnisse angezeigt. Anschließend wird dargestellt, welche Sequenzen unter jeden der Cluster fallen. Diese Cluster und die entsprechenden Sequenzen sind ähnlich wie der generierte Baum in der .svg Datei angeordnet. Die mPTP-SVG-Datei zeigt das Clustering der Sequenzen an. Cluster werden durch Gruppen von Sequenzen dargestellt, die durch rote Äste entlang des Baums verbunden sind. Jeder isolierte Satz roter Äste zeigt eine singuläre MOTU an.

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Abbildung 8: Molekulare Speziesabgrenzung durch mehrstufige Poisson-Baumprozesse. (A) Fenster, die die mPTP-gelesenen Informationen bezüglich des hochgeladenen Baums anzeigen. (B) Resultierendes Fenster im mPTP-Webserver mit einem Link mit den Abgrenzungsergebnissen (roter Kasten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. MOTU-Generierung

  1. Öffnen Sie den Baum mit einem Bildbearbeitungsprogramm oder mit PowerPoint.
  2. Erstellen Sie einen Balken, um die Ergebnisse der einzelnen Ansätze zur Abgrenzung molekularer Spezies darzustellen (siehe Abbildung 9 und Abbildung 10 für Beispiele). Stellen Sie sicher, dass jeder einzelne Balken mit den Sequenzen ausgerichtet ist, die er in seinem molekularen Cluster enthält.
  3. Bestimmen Sie den MOTU mit einem dieser beiden Ansätze74
    1. Wenn alle Ansätze identische Ergebnisse für einen gegebenen Molekülcluster liefern, errichten Sie den Molekülcluster als MOTU im Konsens.
    2. Wenn die meisten Ansätze identische Ergebnisse für einen gegebenen Molekülcluster liefern, errichten Sie den Molekülcluster mehrheitlich als MOTU.

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Ergebnisse

In diesem Artikel wurde eine molekulare Pipeline zur Speziesabgrenzung implementiert, die TaxonDNA, K2P, ASAP, zwei Varianten von PTP und mPTP, für Wasser- und Uferkäfer umfasst. Das Ergebnis jedes der sechs Ansätze wird als "molekulare Cluster" bezeichnet, während die Zusammenfassung als "molekulare operationelle taxonomische Einheiten" oder MOTUs75 bezeichnet wird.

Die Concoction-Pipeline wurde an zwei Datensätzen getestet. Der erste Datensatz (Tabelle 1,

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Diskussion

Während DNA-Sequenzen, insbesondere COI49, mit Referenzsequenzen 22,53,78 in öffentlichen Online-Repositorien 54,55,79,80 für ein Bioidentifizierungssystem46 verglichen werden können, ist ein solcher Ansatz durch die ver...

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Offenlegungen

Wir haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken dem Bureau of Fisheries and Aquatic Resources (BFAR) und den betroffenen lokalen Regierungseinheiten für die Erteilung einer vorherigen Einwilligung nach Inkenntnissetzung zur Durchführung von Probenahmen zur biologischen Vielfalt. Wir danken Dr. Hendrik Freitag für die Anleitung zur taxonomischen Arbeit. Wir danken auch den Gutachtern und Redakteuren für ihre hilfreichen, konstruktiven Kommentare. Abschließend danken wir dem University Research Council Big Project Grant (URC 2022-09) und dem Open Access Publication Grant der Ateneo de Manila University, dem SC Johnson Student Research and Development Fund for Environmental Leadership des Ateneo Research Institute of Science and Engineering und dem LinnéSys: Systematics Research Fund der Linnean Society of London und der Systematics Association für die Finanzierung dieser Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
So schnell wie möglich;Spart explorerhttps://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
ComputerJede Verarbeitungseinheit
MEGA X MEGA Softwarehttps://www.megasoftware.net/
mPTP-Webserverhttps://mptp.h-its.org/#/tree
PTP-WebserverHeidelberger Institut für Theoretische Studien (HITS)https://species.h-its.org/ptp/
Identifikator der Spezies   https://taxondna.sourceforge.net/

Referenzen

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