Fluorophor-basierte genetisch kodierte Biosensoren für die ratiometrische Fluoreszenzbildgebung in Mikroben

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von fluorophorbasierten genetisch kodierten Biosensoren in Mikroben für die quantitative ratiometrische Fluoreszenzbildgebung unter kontrollierten Bedingungen. Durch die Integration dieser Biosensorstrategien mit fortschrittlichen Bildgebungstechniken ermöglicht die Methode eine hochauflösende Echtzeitanalyse auf Einzelzellebene und ermöglicht so tiefere Einblicke in die Dynamik kleiner Moleküle.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der Dynamik kleiner Moleküle in Mikroben ist für umfassende Studien der mikrobiellen Funktion unerlässlich. Sowohl die Dynamik kleiner Moleküle innerhalb als auch zwischen Organismen spielt eine entscheidende Rolle bei der mikrobiellen Physiologie, Symbiose und Krankheit. Die Überwachung dieser Dynamik ist jedoch mit den meisten bestehenden Techniken nach wie vor eine große Herausforderung. Fluorophor-basierte genetisch kodierte Biosensoren sind leistungsstarke Werkzeuge zur Verfolgung der Dynamik kleiner Moleküle in vivo und bergen ein hohes Potenzial für neue Entdeckungen. Diese Biosensoren werden am häufigsten in der Fluoreszenzbildgebung eingesetzt, oft in Kombination mit Perfusionsgeräten, die eine präzise Kontrolle der Umgebungsbedingungen ermöglichen. In Kombination mit fortschrittlichen bildgebenden Verfahren liefert dieser Ansatz hochauflösende, räumlich und zeitlich aufgelöste Daten, die Einblicke in die mikrobielle Reaktion einzelner Zellen ermöglichen. Trotz ihres Versprechens bleibt die Implementierung solcher Biosensoren eine technische Herausforderung. Das Verständnis der wichtigsten Schritte ist entscheidend für eine breitere Akzeptanz. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das den effektiven Einsatz neu entwickelter Biosensoren in Mikroben für die quantitative ratiometrische Fluoreszenzbildgebung unter kontrollierten Bedingungen unterstützen soll.

Einleitung

Auf Einzelfluorophoren basierende und duale Fluorophor-Biosensoren werden von Forschern häufig für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt¹. In einigen Studien wurden Multiplex-Biosensoranalysen eingesetzt, um mehrere Signale innerhalb derselben Zellen gleichzeitig zu verfolgen². Viele dieser Biosensoren beruhen auf Ligandenbindungsdomänen, in denen Bindungsereignisse Konformationsänderungen induzieren, die die Fluoreszenzeigenschaften verändern ^3,4. Genetisch kodierte Biosensoren sind zu unverzichtbaren Werkzeugen für die In-vivo-Bildgebung in einer Reihe von Systemen^{geworden 5} und ermöglichen eine hochauflösende Überwachung der Ionen- und Metabolitenkonzentration in Raum und Zeit¹. Frühe Biosensoren waren jedoch in ihrem Dynamikbereich und ihrem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)⁶ begrenzt. Jüngste Fortschritte bei intensiometrischen Einzelfluorophor-Biosensoren, die auf konformationsempfindlichen Fluoreszenzproteinen (csFPs) basieren, haben die Leistung erheblich verbessert. Nichtsdestotrotz können sich Schwankungen in der Proteinexpression auf In-vivo-Messungen mit genetisch kodierten Fluorophor-basierten Biosensoren^{auswirken 6}, die üblicherweise zur Visualisierung von Signalmolekülen und Metaboliten in lebenden Zellen eingesetzt werden ^7,8. Einzelne intensiometrische Fluorophor-Biosensoren erlauben keine Normalisierung der Biosensor-Expressionsniveaus, die in vivo schwanken können. Durch den Einbau eines fluoreszierenden Referenzproteins können jedoch Einzelfluorophor-Biosensoren in ratiometrische Dual-Fluorophor-Versionen umgewandelt werden, was zuverlässigere Quantifizierungen ermöglicht⁹. Aufgrund des Energieverlusts durch nicht-strahlende Prozesse wird das Fluoreszenzemissionsspektrum relativ zum Absorptionsspektrum verschoben, ein Phänomen, das als Stokes-Verschiebung¹⁰ bekannt ist. Large Stokes Shift Fluorescent Protein (LSSFPs) wurden als optimale Referenzfluorophore in ratiometrischen Dual-Fluorophor-Biosensoren^{eingesetzt 9,11}. Ein aktueller Fortschritt ist die Entwicklung von monochromatisch erregbaren Green-Apple (GA) Matryoshka-Biosensoren, bekannt als GA-MatryoshCaMP6s, die einen roten LSSFP namens LSSmApple¹² enthalten. In Kombination mit Mikrogeräten wie mikrofluidischen Systemen bieten fluorophorbasierte genetisch kodierte Biosensoren einen minimalinvasiven Ansatz für die quantitative ratiometrische Bildgebung mit Techniken wie der konfokalen Mikroskopie. Diese Integration ermöglicht eine Hochgeschwindigkeitsbildgebung und Echtzeitüberwachung der Dynamik kleiner Moleküle in einzelnen Zellen unter Umweltstress. So wurden beispielsweise cAMP- und Glukose-Biosensoren erfolgreich in Hefe eingesetzt. In Verbindung mit mutierten Stämmen haben diese Biosensoren dazu beigetragen, wichtige regulatorische Netzwerke aufzuklären, die die Zuckeraufnahme steuern^13,14. Trotz erheblicher Fortschritte haben diese Technologien ihr volles Potenzial für die Untersuchung kritischer biologischer Fragen im Zusammenhang mit der Dynamik kleiner Moleküle in vivo noch nicht ausgeschöpft ¹⁵. Infolgedessen ist ihre breite Akzeptanz in Laboratorien nach wie vor begrenzt, und es fehlen immer noch standardisierte Methoden für eine breitere Implementierung.

Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, die auf nicht-ratiometrischen Einzelfluorophor-Biosensoren oder Messungen auf Bulk-Ebene basieren, ermöglicht unser auf GA Matryoshka-Biosensoren basierendes Protokoll eine hochauflösende Einzelzell-Bildgebung mit quantitativer ratiometrischer Analyse. Durch die Integration des großen Stokes-Shift-Fluorophors als interne Referenz kompensiert die Methode die Variabilität in der Biosensorexpression, eine wesentliche Einschränkung früherer Designs. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination mit mikrofluidischen Geräten eine präzise Kontrolle der Umgebungsbedingungen, was eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Perfusionskammern oder statischen Kultursystemen darstellt¹². Dieser Ansatz bietet auch deutliche Vorteile für die Untersuchung dynamischer Interaktionen zwischen Mikroben und ihren Wirten, wie z. B. Pflanzen-Pathogen-Interaktionen und symbiotische Assoziationen wie Mykorrhiza, bei denen die räumliche und zeitliche Auflösung auf zellulärer Ebene für die Aufdeckung der molekularen Mechanismen der Kommunikation und des Nährstoffaustauschs unerlässlich ist.

In diesem Zusammenhang stellen wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die ratiometrische Biosensor-Bildgebung in Mikroben vor. Obwohl dieses Protokoll speziell für die Implementierung in Hefe optimiert wurde, kann es für den Einsatz in anderen Mikroben, einschließlich Bakterien, angepasst und auf Nicht-Modellorganismen wie pflanzenassoziierte Mikroben ausgeweitet werden. So können Biosensoren beispielsweise in Verbindung mit mikrofluidischen Systemen für die quantitative Fluoreszenzbildgebung der Kalziumsignalübertragung in Hefe verwendet werden, was eine Echtzeitüberwachung der Kalziumreaktionen unter Umweltstress ermöglicht¹⁴.

Dieses Protokoll soll Forscherinnen und Forscher dabei unterstützen, neu entwickelte Biosensoren effektiv einzusetzen und so die Erforschung biologischer Prozesse durch biosensorbasierte Fluoreszenzbildgebung in mikrobiellen Systemen voranzutreiben. Es enthält praktische Empfehlungen zu den Bedingungen der Hefekultur, zu optimalen Anregungs-/Emissionseinstellungen und zur Kompatibilität mit häufig verwendeten Hefestämmen (z. B. K601 und W303-1A MAT-a). Zu den bemerkenswerten Einschränkungen gehören das Photobleaching während längerer Bildgebungssitzungen und Herausforderungen im Zusammenhang mit der Expression von Biosensoren in biologischen Proben. Da zahlreiche Faktoren das Ergebnis von In-vivo-Biosensor-Bildgebungsexperimenten beeinflussen können, soll dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll den Forschern auch dabei helfen, potenzielle Herausforderungen zu antizipieren und zu bewältigen und so reproduzierbare Implementierungen zu ermöglichen.

Protokoll

1. Rationales Design von ratiometrischen Biosensoren (Abbildung 1)

HINWEIS: Das interessierende Bindungsprotein wird auf der Grundlage relevanter Kriterien ausgewählt, einschließlich (i) Spezifität, (ii) Affinität, (iii) Strukturinformation und (iv) Konformationsumlagerung bei Ligandenbindung. Die Spezifität stellt sicher, dass der Biosensor selektiv auf das Zielmolekül reagiert, ohne dass es zu einer Kreuzreaktivität kommt. Es wird davon ausgegangen, dass die Affinität mit dem erwarteten Konzentrationsbereich des Zielmoleküls im biologischen Kontext übereinstimmt. Strukturelle Informationen, abgeleitet aus experimentellen Daten oder Computermodellen, wie sie von AlphaFold generiert werden, geben Einblicke in die dreidimensionale Organisation des sensorischen Bereichs und die ligandeninduzierten Konformationsänderungen. Diese Erkenntnisse werden genutzt, um geeignete Insertionspunkte für die Fluorophore zu identifizieren. Anschließend wird eine Validierungsstrategie entwickelt, um die Reaktionsfähigkeit und den Dynamikbereich des Biosensors in Abhängigkeit von den beabsichtigten Anwendungen zu bewerten.

1. Konstruieren Sie das Matroschka-Design in silico, indem Sie die Green-Apple Matryoshka^12-Kassette so in die sensorische Domäne einführen, dass das zirkulär permutierte Green Fluorescent Protein (cpGFP), das empfindlich auf Konformationsänderungen reagiert, auf durch Ligandenbindung induzierte Umlagerungen der sensorischen Domäne reagiert.
   1. Verwenden Sie molekulare Visualisierungssoftware wie Chimera, um die Struktur der Bindungsdomäne zu analysieren. Wenn die dreidimensionale Struktur nicht verfügbar ist, verwenden Sie AlphaFold, um ein zuverlässiges Modell zu generieren.
   2. Identifizieren Sie flexible Schleifen innerhalb der Proteinstruktur als Schwachstellen und potenzielle Insertionsstellen für die Dual-Fluorophor-Kassette, die ausgewählt wurden, um eine Störung der Gesamtfunktion oder Stabilität des Proteins zu vermeiden.
   3. Verwenden Sie AlphaFold erneut, um die Struktur des chimären Proteins vorherzusagen, das die eingefügte Dual-FP-Kassette enthält, und bestätigen Sie, dass die Insertion keine ungünstigen strukturellen Veränderungen mit sich bringt.
   4. Klonen Sie die Biosensor-Konstrukte in Plasmid-DNA, die die Expression in Hefezellen ermöglicht. Insbesondere wird das Gen, das für den neu entwickelten Biosensor kodiert, unter Verwendung einer geeigneten Klonierungstechnik 12,13,14 in den Hefe-Shuttle-Vektor pAG416 eingefügt, der geeignete Elemente für die Hefeexpression enthält.
   5. Wandeln Sie das rekombinante Plasmid nach der Klonierung in Bakterienzellen um, um die Plasmid-DNA zu amplifizieren. Verwenden Sie gereinigte Plasmid-DNA für die Hefetransformation.
   6. Führen Sie das gereinigte Plasmid durch Polyethylenglykol (PEG)-vermittelte Transformation in Hefezellen ein, wie veröffentlicht¹⁶. Plattentransformierte Hefezellen auf Uracil-defizienten Medien, die nach positiven Klonen selektieren, die das Plasmid enthalten, das den URA3-Selektionsmarker trägt.

2. Vorbereitung der Probe

1. Streifen Sie Hefe-Transformanten, die GA-Matryoshka-Biosensoren exprimieren, auf selektive Medienplatten (d. h. SC-Ura) und inkubieren Sie 2-3 Tage lang bei 30 °C, um das Koloniewachstum zu ermöglichen.
   HINWEIS: Der Hefestamm trägt eine ura3-Auxotrophie, die durch das URA3-Gen auf dem Plasmid ergänzt wird, was eine Selektion auf Uracil-defizienten Medien ermöglicht. Das Plasmid, das den Biosensor kodiert, enthält eine Kassette, die die Auxotrophie ergänzt (z. B. pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
2. Erzeugung von Hefe-Transformanten aus dem Stamm K601/W303-1A MAT-a (Genotyp: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Führen Sie die Transformation mit einem Expressionsvektor durch, der häufig für Saccharomyces cerevisiae verwendet wird, z. B. pAG416¹².
3. Nach der Transformation werden Hefezellen bei 30 °C auf SC-Ura-Medium kultiviert, die pro Liter wie folgt zubereitet werden, bis unabhängig transformierte Kolonien erscheinen: 0,77 g CSM-Ura, 6,7 g Hefestickstoffbase (YNB) mit Ammoniumsulfat, 20 g Glukose, 20 g Agar und Adenin, die bis zu einer Endkonzentration von 150 μM zugegeben werden.
4. Bereiten Sie kompetente Hefezellen vor und führen Sie eine PEG 3350-vermittelte Transformation gemäß einem etablierten Protokoll^{durch 16}.
5. Für mikrofluidische Zellfallen-Experimente werden 25 % Glycerinbestände auf SC-Ura-Platten gestreift und 2 Tage lang bei 30 °C inkubiert, um das Wachstum unabhängiger Einzelkolonien zu ermöglichen. Einzelne Kolonien werden in 5 mL flüssigem SC-Ura-Medium resuspendiert und bei 30 °C unter Schütteln inkubiert, bis der OD600 0,5-1,0 erreicht, wodurch sie für das Laden in das Perfusionssystem geeignet sind.

3. Vorbereitung des Perfusionssystems (Abbildung 2)

1. Bereiten Sie die mikrofluidische Platte für haploide Hefezellen vor, indem Sie sie mit 50 μl Hefezellen beladen, die GA-Matryoshka-Biosensoren exprimieren, zusammen mit dem endgültigen SC-Ura-Medium für das Wachstum und einer gepufferten Lösung für die Behandlung (z. B. NaCl oder Sorbit).
   1. Entfernen Sie die Speicherlösung aus den Vertiefungen 1-8. Aspirieren Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) aus den Vertiefungen und fügen Sie 400 μl steriles Wasser hinzu.
   2. Waschen Sie die Vertiefungen 1-6 und 8. Waschgang 1: Aspirieren Sie die sterile Wasserlösung aus den Vertiefungen 1-8 und fügen Sie 400 μl steriles Wasser hinzu. Waschgang 2: Wiederholen Sie den Waschgang, indem Sie 400 μl steriles Wasser absaugen und hinzufügen. Waschgang 3: Wiederholen Sie den Vorgang erneut mit 400 μl sterilem Wasser.
   3. Abschließende Füllung für die Vertiefungen 1-6: Aspirieren Sie die wässrige Lösung und fügen Sie 300 μl endgültige Perfusions-/Wachstumslösungen hinzu, wie z. B. SC-Ura für das Hefewachstum oder eine gepufferte Lösung, die die für die Behandlung interessierenden Analyten enthält.
   4. Zellbeladung in Vertiefung 8: Fügen Sie 50 μl Hefezellsuspension (OD600=0,5-1,0) hinzu.
2. Versiegeln Sie die Platten mit dem temperaturgesteuerten Verteiler der mikrofluidischen Plattform und verbinden Sie ihn mit dem Lebendzell-Imaging-System. Die Verteiler sorgen für eine stabile thermische Umgebung bei einer Temperatur von 28 °C, während Schläuche und eine Pumpe für eine ordnungsgemäße Abdichtung und kontinuierliche Durchblutung sorgen.
   1. Richten Sie die Platte auf dem Verteiler aus. Schalten Sie den Staubsauger ein. Schalten Sie die mikrofluidische Plattform ein.
   2. Drücken Sie auf Siegel und warten Sie, bis das grüne Licht aufleuchtet. Öffnen Sie die Software für die mikrofluidische Plattform, erstellen Sie ein neues Experiment und wählen Sie die geeignete Hefeplatte aus der Dropdown-Liste aus.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Run Liquid Priming Sequence . Klicken Sie auf die Run Cell Loading Sequence , um Hefezellen aus Vertiefung 8 in die Kulturkammer zu laden, wo sie gefangen und unter kontinuierlicher Perfusion des selektiven Mediums SC-Ura über Nacht bei 10 kPa bei 28 °C gezüchtet werden.
   4. Klicken Sie auf der Registerkarte "Manueller Modus" auf "Benutzerdefinierte Sequenz ausführen " oder verwenden Sie den Protokolleditor, um experimentelle Parameter wie die Temperatur bei 30 °C, die Durchflussrate bei 10 kPa, die Schrittdauer (z. B. 10 min) und die für die Perfusion zu öffnenden Kanäle festzulegen.
3. Die Zellen werden über Nacht in der Kulturkammer unter kontinuierlicher Perfusion mit dem selektiven Medium SC-Ura bei 28 °C und einem Druck von 10-17 kPa gezüchtet.

4. Ratiometrische Fluoreszenzbildgebung (Abbildung 3, Abbildung 4 und Video 1)

1. Beurteilen Sie Zellwachstum und Fluoreszenz durch eine schnelle mikroskopische Visualisierung.
   1. Platzieren Sie die mikrofluidische Platte auf dem Tisch eines inversen Mikroskops. Fokussieren Sie sich auf die Mitte des Anzeigebereichs, um die Zellen zu lokalisieren.
   2. Verwenden Sie Hellfeld- und/oder Fluoreszenzmikroskopie, um die Zellmorphologie, Viabilität und Biosensorexpression zu beurteilen.
2. Untersuchen Sie die stationäre Dynamik von Kalzium unter genau kontrollierten Bedingungen mit dem mikrofluidischen System und kompatiblen mikrofluidischen Platten 4,12,13,14.
3. Führen Sie die Bildgebung lebender Zellen mit einem inversen konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit einer 100-fachen Vergrößerung und einer numerischen Apertur (NA) von 1,40 durch. Überwachen Sie die Dual-Fluorophor-Biosensoren, indem Sie GFP und LSSmApple bei 488 nm mit einem Argonlaser anregen. Sammeln Sie Emissionssignale bei 520 nm für GFP und 610 nm für LSSmApple (Abbildung 5) und führen Sie ratiometrische Fluoreszenzbildgebungsexperimente durch, um die dynamischen Reaktionen des Biosensors zu quantifizieren. Messen Sie das Verhältnis der Emissionsintensitäten (GFP/LSSmApple) über die Zeit, um analytinduzierte Änderungen zu überwachen.

5. Bildanalyse mit Open-Source-Software (Abbildung 6)

1. Holen Sie sich den CellProfiler oder eine ähnliche Software aus dem offiziellen Repository und installieren Sie sie auf einer lokalen Workstation.
2. Organisieren Sie die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopiebilder in sequenzieller Reihenfolge (z. B. img_001.tif, img_002.tif usw.), um die Kompatibilität mit der automatisierten Stapelverarbeitung zu gewährleisten.
3. Starten Sie die Software, und initialisieren Sie eine neue Analysepipeline, indem Sie Neues Projekt auswählen. Importieren Sie die Zeitraffer-Bildsequenz in den Arbeitsbereich der Pipeline.
4. Integrieren Sie das IdentifyPrimaryObjects-Modul, um einzelne Zellen innerhalb jedes Frames basierend auf Fluoreszenzsignalen oder morphologischen Kriterien zu erkennen.
5. Fügen Sie das TrackObjects-Modul hinzu, um zeitliche Entsprechungen zwischen Zellen über Frames hinweg herzustellen und so die Verfolgung einzelner Zellen im Zeitverlauf zu ermöglichen.
6. Fügen Sie das Modul MeasureObjectIntensity hinzu, um die Fluoreszenzintensitätsparameter (z. B. Mittelwert, Median und integrierte Intensität) für jede verfolgte Zelle zu quantifizieren.
7. Verwenden Sie das ExportToSpreadsheet-Modul, um quantitative Daten für die nachgelagerte Analyse zusammenzustellen und in ein Tabellenformat (z. B. CSV) zu exportieren.
8. Analysieren Sie die exportierten Daten mit Statistik- oder Datenvisualisierungstools wie Tabellenkalkulationssoftware.

Ergebnisse

Um eine erfolgreiche ratiometrische Bildgebung von Biosensoren in mikrobiellen Systemen zu erreichen, müssen mehrere technische Herausforderungen bewältigt werden.

Ausdruckssystem: Die erste Herausforderung liegt in der Auswahl des Ausdruckssystems; ob plasmidbasiert, chromosomal integriert, angetrieben von konstitutiven oder induzierbaren Promotoren und mit oder ohne subzelluläre Targeting-Tags. Diese Faktoren können die Stabilität, Toxizität und Lokalisierung des Biosensors in den Zellen erh...

Diskussion

Genetisch kodierte Fluorophor-basierte Biosensoren ermöglichen die Echtzeitüberwachung der intrazellulären Analytkonzentrationen in lebenden Zellen¹. Diese Biosensoren funktionieren in der Regel, indem sie Konformationsänderungen in optische Signale umwandeln, die entweder ratiometrisch oder intensivometrisch detektiert werden können. Tensiometrische Biosensoren beruhen auf Änderungen der Fluoreszenzintensität von einem einzigen FP, wodurch sie empfindlich auf Sch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
CellASIC ONIX Platte für haploide Hefezellen	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-Glucose	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-Sorbit	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Zur Expression der GA-MatryoshCaMP6s in Hefe
TCS SP8 STED	Leica	NA
Hefestamm K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
	YNB BocaScientific	GCM16.0500
α-Mating Factor acetate salt	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG